TÉCNICAS DE LABORATORIO.

MICROSCOPÍA.

La microscopía óptica supuso grandes avances para la biología a partir de

1665, cuando Robert Hooke examinó un trozo de corteza, llegando a observar
que estaba dividido en pequeñas celdas a las que llamó células.
El microscopio óptico cuenta con varios aumentos (x10, x20, x40 y x100), el
x100 es necesario utilizarlo con un aceite de inmersión entre el objetivo y la
muestra que impide la refracción y hace más nítida la imagen.

● Contraste de fases.
Se utiliza para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras sin
colorear. Ideal para especímenes delgados o células alisadas.

● Diferencial de contraste de interferencia. DIC.

Utiliza dos rayos de luz polarizada de modo que las imágenes aparecen combinadas como si la muestra proyectase una sombra. Se ven
“en perspectiva y con relieve”. Se utiliza para especímenes gruesos en los que no se puede aplicar contraste de fases.

● Fluorescencia.
El microscopio de fluorescencia se utiliza para observar sustancias que emiten colores, denominadas fluoróforos. Esta técnica nos permite
utilizar más de un fluoróforo para detectar varias moléculas tisulares de forma simultánea siempre que el espectro de emisión de estos
fluoróforos no se solape. Según la frecuencia con la que estimules el fluoróforo se pueden observar unos colores u otros.

La microscopía electrónica utiliza electrones para iluminar los objetos. Estos poseen una longitud de onda mucho menor que la de la luz,
por lo que pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas. La λ más corta de la luz visible es 4000Å mientras que la de los electrones
utilizados es de 0,5A.

● Microscopio electrónico de transición (MET).

Permite la observación de una muestra de cortes ultrafinos, unos electrones rebotan en ésta y otros la atraviesan formando una imagen
aumentada del espécimen. Se coloca una placa fotográfica o una pantalla fluorescente tras el objeto para registrar la imagen aumentada.

● Microscopio electrónico de barrido. (MEB).

Crea una imagen ampliada de la superficie del objeto. El SEM explora la superficie de la imagen. Su funcionamiento se basa en recorrer la
muestra con un haz muy concentrado de electrones, los cuales pueden dispersarse de la muestra o provocar electrones secundarios. Los
electrones perdidos y secundarios son recogidos por un dispositivo situado al lado de la muestra.

TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS.

Se trata de reacciones químicas en las que intervienen moléculas

pertenecientes al propio tejido (glúcidos, proteínas, nucleótidos…). El
objetivo de la histoquímica es poner de manifiesto moléculas presentes en
una sección histológica (tejido) y estudiar su distribución tisular “in situ”.
Las reacciones químicas se basan en la modificación de las moléculas del
tejido para después colorearlas. La más utilizada es el PAS ( Periodic
Acid Schiff) utilizada para la detección de hidratos de carbono. La
modificación química del tejido consiste en la oxidación de los enlaces de
C que contienen grupos hidroxilo (-OH) mediante el ácido periódico. Esto
provoca la formación de grupos aldehídos, que son reconocidos por el
reactivo Schiff que se combina con ellos tiñéndolos de rojo.

Pasos de la tinción hostoquímica PAS-Hematoxilina sobre cortes de

parafina.
1º. Se incrusta la muestra en la parafina. Con el mitocromo de parafina se obtiene un corte muy fino de la muestra a observar.
2º. Desparafinado: consiste en quitar la parafina para obtener únicamente la muestra a observar. Se utiliza Xileno.
3º. Hidratación: Se baña la muestra en alcoholes de mayor a menor graduación, hasta finalmente bañarla en agua destilada.
4º Tinción: Se realiza un baño en ácido periódico que oxidará los carbonos que contienen grupos hidroxilo. Posteriormente se baña en H2O
destilada y se continua con el reactivo de Schiff, que reconoce y se une a los grupos aldehídos formados. Volvemos a poner la muestra en
agua destilada y después en hematoxilina que lo teñirá de rojo. Se baña en agua de grifo y luego en agua destilada.
5º. Deshidratación: Se baña la muestra en alcoholes de menor a mayor graduación, hasta finalmente bañarla en xileno.
6º. Ya tenemos la muestra lista. Se realiza el montado con el porta y el cubreobjetos y se procede a su observación.
TÉCNICAS DE FRACCIONAMIENTO CELULAR.

Se intentan aislar estructuras de las células mediante el fraccionamiento celular, como

cloroplastos, núcleo y mitocondrias. Esta técnica se usa para estudiar la bioquímica y
fisiología de los orgánulos fuera del ambiente complejo de la célula intacta.
- Homogenización: Debemos suspender el producto en un medio adecuado (solución
amortiguadora, salina o azúcar isotónica). Para mantener la integridad de los
orgánulos y enzimas la cristalería y sustancias utilizadas han de mantenerse frías. La
suspensión de células constituyentes se denomina homogenado, para los tejidos de
las plantas la homogeneización se realiza en un mortero, al cual se le añade arena
como abrasivo.
- Centrifugación: Debido a las diferencias de tamaño y densidad cada componente
celular está sujeto a una fuerza centrífuga. La fuerza realizada por la centrífuga se
expresa como fuerza centrífuga relativa en unidades de g. La RFC es una función de
velocidad en rpm.
- Centrifugación diferencial: Se centrifuga el homogenado repetidas veces a
diferentes velocidades (cada vez mayor), de modo que las primeras veces se
depositan las partículas de mayor densidad o tamaño y luego las de menor densidad.

TÉCNICAS DE CULTIVOS CELULARES.

Se debe diferenciar entre el cultivo de órganos y tejidos, y el cultivo de células. El primero se puede definir como el mantenimiento de
pequeños fragmentos de tejido u órganos completos “in vitro”. El cultivo celular es la propagación de células dispersas tanto en suspensión
como en monocapas sobre cristal o plástico. El cultivo se ha de realizar en laboratorios, con los equipos adecuados y cumpliendo las
normas de bioseguridad, intentando prevenir problemas como la contaminación.

Los primeros cultivos celulares se basaron en embriones, médulas espinales embrionarias, plasma… En los años 40 los cultivos celulares
comenzaron a utilizarse para obtener antibióticos (tripsina, factor de crecimiento nervioso, antibióticos antimicrobianos, suero, anticuerpos).
Una de las primeras líneas celulares humanas, HeLa (imagen teñida de azul mediante el reactivo hoescht que se une al ADN).
Actualmente se realizan cultivos primarios o especializados (diferenciados), así como biotecnología de tejidos y células madre.

Se entiende por cultivo celular el conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de células “in vitro”, manteniendo al máximo sus
propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

- Ventajas.
Control preciso y fino del medio ambiente en el que se realiza
el cultivo. Homogeneidad y caracterización de la muestra.
Economía y motivaciones éticas (ya que estás ayudando a
investigar algo que supondrá un avance para la humanidad).
- Desventajas.
Es una técnica sensible e inestable que hay que cuidar, se
necesita un material de calidad muy específico el cual conlleva
costes económicos, el modelo es válido “in vitro” pero puede
que no siga exactamente el mismo desarrollo “in vivo”.

Mantener un cultivo celular es relativamente fácil, pero cultivar

solo es posible para aquellas células o sustancias que
proliferan.
● Tipos de cultivos de tejidos.
▪ Cultivo de órganos: mantiene los tipos celulares pero no su propagación, se limita a la periferia y a los tipos celulares embrionarios.
▪ Explantes primarios: fragmentos de tejidos u órganos que se adhieren a la superficie y en la que proliferan las células de la periferia.
▪ Cultivo celular: se mantiene en suspensión en el cultivo. Este tipo consigue la proliferación de las células y se pierde la heterogeneidad.

El medio de cultivo debe cumplir unas condiciones:

El sustrato se refiere a los materiales y recipientes utilizados, que deben ser de vidrio, plástico, microsoportes, metálicos, superficies
tratadas, matrices tridimensionales, interfases, haces microcapilares permeables, “feeder layeers”…
Se necesita la fase gaseosa en la que estén presentes el oxígeno y el dióxido de carbono.
Ciertas condiciones fisicoquímicas y fisiológicas, como el pH, Tª, osmolaridad, viscosidad, bss, aa, vitaminas, glúcidos, hormonas, factores
de crecimiento, antibióticos, antifúngicos, suero…

Clonar: reprogramar una célula somática del organismo para que desarrolle el programa embrionario.