FACULTAD DE QUÍMICA-UNAM

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL 1515-04
SEMESTRE 2018/2
NOMBRE: Pérez Orozco Mercedes Guadalupe EQUIPO 08
NÚMERO Y NOMBRE DE LA PRÁCTICA:
Práctica 6: Condiciones de desarrollo bacteriano
FECHA(S) DE REALIZACIÓN: 2, 4 y 9 de abril del 2018
FECHA DEL REPORTE: 16 de abril del 2018
COMENTARIOS DEL PROFESOR:

Resultados:

Fecha de observación: 02 de abril del 2018

Muestra: Staphylococcus aureus muestra inicial
Tinción: Gram
Aumento total: 1000 veces
Breve descripción: Se observan cocos inmóviles en forma de racimos de uvas
y glomerulados de un color morado, y responde a la tinción como bacteria Gram
positiva.

Tabla 1. Efecto de factores físicos en el desarrollo microbiano.

Factores Desarrollo microbiano
Físicas/ Cepas
Staphylococcus aureus
Tiempo (turbidez)
Temperatura 4 +
°C 28 ++
37 ++++
42 +++
55 -
pH 3 +
5 ++
7 ++++

9 ++++
11 +++
 %NaCl 0.9 +++++
4 +++
7 ++++
10 ++
15 +

Tabla 2. Efecto letal y mutagénico de las radiaciones UV en el desarrollo microbiano.

Caja Tiempo de Nombre científico de la cepa de referencia:
exposición Staphylococcus aureus
(seg)
Desarrollo Características coloniales
0 ++++ Crecimiento liso en toda la superficie del cuadrante
de pigmento blanco.
1
20 +++ Crecimiento abundante de colonias en forma de
(con sol) bolitas blancas.
45 ++ Crecimiento regular de colonias en forma de bolitas
medianas color blancas.
90 + Muy poco crecimiento de colonias aisladas en la
orilla del cuadrante en forma de bolitas color
blancas.
0 +++ Crecimiento liso en toda la superficie del cuadrante
de pigmento blanco y cremoso.
2
20 ++ Crecimiento de muchas colonias pequeñas en forma
(sin sol) de bolitas color blancas y de consistencia cremosa.
45 + Crecimiento de colonias en menor cantidad que el
anterior cuadrante, en forma de bolitas medianas
color blancas y de consistencia cremosa.
90 - No hubo crecimiento.

Tabla 3. Efecto biocida y biostático de diferentes agentes químicos en el desarrollo microbiano.

Agentes químicos Formación de halos de inhibición

Staphylococcus aureus

Alcohol (frasco azul) No hubo efecto.

Lysol 21.15 mm
NaClO 30.20 mm
Safranina 8.45 mm
Lugol 26.30 mm
Cristal violeta 23.00 mm
Tabla 4. Efecto biocida y biostático de antibióticos en el desarrollo microbiano.
Nombre y concentración del Formación de halos de inhibición
antibiótico (sensidisco) Pseudomonas aeruginosa
Cefepime 30 µg No hubo efecto.
Ceftazidima 30 µg 29.5 mm
Ofloxacina 5 µg 18.3 mm
Piperacilina 100 µg 21.4 mm

Tabla 5. Resultados en caja Petri de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa en antibióticos.

Técnica Efectos de factores Resultado Errores

Medio: BHI Agar físicos y químicos
Masivo Radiación UV con sol Hubo crecimiento homogéneo en el Ninguno.
control y a mayor tiempo de exposición
de radiación UV disminuye el
crecimiento microbiano.
Masivo Radiación UV sin sol Hubo crecimiento homogéneo en el Ninguno.
control y a mayor tiempo de exposición
de radiación UV disminuye el
crecimiento microbiano.
Masivo Desinfectantes y En cada agente químico se observa la En dos cuadrantes se
colorantes presencia de un halo de inhibición de juntaron los halos de
diferente magnitud o tamaño. inhibición de los
colorantes.
Masivo Antibióticos En cada uno de los antibióticos se Ninguno.
observa un diferente efecto de
inhibición.

Análisis de los resultados:

En esta práctica se evaluó el efecto de pH, temperatura, concentración de solutos, radiaciones y el efecto de
ciertos agentes químico, donde estás variables sobre el desarrollo microbiano permite controlar el crecimiento
de los mismos, ya sea para favorecer o limitar su desarrollo o bien, para eliminarlos de un área o producto
contaminado.

Primeramente, se evaluó el efecto de los factores físicos en el desarrollo bacteriano. Para la concentración
de soluto se tenían 5 tubos con caldo nutritivo suplementado con NaCl en distintas concentraciones, y con el
microorganismo inoculado con el que se trabajó, siendo Staphylococcus aureus la cepa de referencia, se
llevo a incubar a 37° C ya que es la temperatura óptima de crecimiento y por 48 horas, esto para poder
observar en que condición de concentración es el óptimo para el desarrollo del microorganismo, lo cual se
identifico al observar en cual de los tubos había mayor turbidez, que fue en la concentración de 0.9% y del
7% de NaCl, seguida de la de 4%, luego en la de 10% y finalmente en la de 15% que presentaba muy poca
turbidez. Esto nos quiere decir que la bacteria en estudio es osmotolerante, ya que resiste a altas
concentraciones de soluto.

Con respecto al pH, se tenían 5 tubos con diferentes valores de pH (3, 5, 7, 9 y 11) los cuales al dejarlos
incubar a 37°C por 48 horas con el microorganismo inoculado, de igual manera se evaluó la turbidez que
presentaba cada tubo, y se observo que a un pH de 7 y 9 hubo mayor crecimiento (turbidez) seguido del pH
de 11, luego en el de 5 y finalmente en el de 3 que casi no se observaba turbio debido al poco desarrollo de
crecimiento, por lo que observe que su pH optimo de crecimiento es de 7-9 y a un pH de 11 es su limite
superior, lo cual indica que esta bacteria es neutrófilo, por lo que es importante destacar que la acidez o
alcalinidad del ambiente en donde se desarrollan los microorganismo es importante para la función celular,
sobre todo por la actividad enzimática, que es muy sensible a las variaciones de pH.

Finalmente se observó el efecto de la temperatura, el cual es uno de los parámetros ambientales más
importantes que condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos. Para ello se tenia
caldo nutritivo en el que fue inoculada la suspensión bacteriana y se mandó a incubar por 48 horas a
diferentes temperaturas ( 4, 28, 37, 42 y 55) °C, en donde como en los otros factores se evaluó la turbidez
que presentaba cada uno de los tubos, en donde la temperatura de 37°C fue la que presento mayor turbidez
seguida de la de 42°C, luego la de 28°C y finalmente en el tubo de 4 °C, que presento muy poco crecimiento
bacteriano, así mismo, en el de 55°C no se observó ningún cambio, por lo que no presento crecimiento
microbiano. De acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento, se clasifica como Mesófilo, que son los que
crecen de forma óptima a temperaturas de 15-43 °C. La temperatura óptima para el crecimiento de una
especie microbiana determinada, está relacionada con la temperatura del hábitat normal del organismo. Así
mismo, la temperatura puede acelerar o retrasar la actividad enzimática, lo que incide directamente en el
metabolismo del microorganismo. Sin embargo, si la temperatura es excesiva puede afectar estructuras y
moléculas hasta su desnaturalización irreversible o calcinación y las temperaturas que son muy bajas
retardan el crecimiento.

Para evaluar el efecto letal y mutagénico de la radiación UV se utilizaron dos placas Petri con agar BHI, en
las que se sembró masivamente la suspensión bacteriana de Staphylococcus aureus y cada caja se dividió
en 4 partes, en las que se les iba aplicando radiación UV, el primer cuadrante era el control, el cual no se
irradio y en los otros tres iba cambiando el tiempo de exposición de radiación a 20, 45 y 90 segundos, para
lo que una de las cajas quedo expuesta a la luz por una hora después de la radiación y otra inmediatamente
que se sometió a radiación fue cerrada, se mandaron a incubar por 24 horas a 37°C y luego se dejo en
refrigeración, al observarlas se logro ver en la caja que no estuvo en contacto con la luz que en el cuadrante
control hay crecimiento en toda la superficie, en el segundo cuadrante que estuvo por 20 segundos con
radiación UV hay desarrollo abundante pero no masivamente, el tercer cuadrante presento desarrollo medio
y en el último cuadrante que se sometió por 90 segundos no se observaba nada de crecimiento. La ausencia
o la presencia de crecimiento esta relacionado con el tiempo de exposición que se somete al microorganismo
a radiación, ya que esta proporciona una inactivación rápida y eficiente, así mismo, la radiación ultravioleta
actúa dañando los ácidos nucleicos, donde el ADN y el ARN celular absorben la energía alta asociada con la
energía UV y esta absorción forma nuevos enlaces entre nucleótidos adyacentes creando dobles enlaces o
dímeros. La dimerización de las moléculas adyacentes, especialmente de las timinas, constituye el daño
fotoquímico más frecuente. La formación de numerosos dímeros de timina en el ADN de bacterias impide la
replicación y la capacidad de infectar, aunque es posible que algunos microorganismos reparen el daño
fotoquímico causado por la luz UV, si su dosis es demasiado baja, mediante la fotorreactivación o reparación
oscura.
En la segunda caja que sí fue expuesta a la luz se observa que en el cuadrante control hubo crecimiento en toda
la superficie, en el segundo cuadrante también hubo crecimiento muy abundante, en el tercer cuadrante se observa
una disminución de crecimiento y en el ultimo se observan colonias aisladas pero de igual manera hubo desarrollo
del microorganismo, lo que puedo notar con respecto con la otra caja es que en la que estuvo expuesta a la luz
hay crecimiento más abundante en cada uno de los cuadrantes en comparación con la otra, así mismo como esta
estuvo expuesta a la luz puede tener el efecto de fotorreactivación, donde el efecto dañino por la radiación UV es
posible de revertir.

Por otra parte, para evaluar el efecto biocida y biostático de diferentes agentes químicos en el desarrollo
microbiano se sembró masivamente una caja Petri con Agar BHI, luego la placa se dividió en seis partes y en
condiciones asépticas se impregnaban discos de papel filtro (que previamente fueron esterilizados) con los
limpiadores, desinfectantes, antisépticos y colorantes a utilizar usando las pinzas de disección y al finalizar se
mandó a incubar a 37°C por 24 horas, después se dejo en refrigeración, al observar el resultado se observaban
diferentes diámetros de los halos de inhibición formados alrededor de los discos de papel filtro sobre el desarrollo
microbiano de la placa. En el primer cuadrante se utilizó Alcohol del envase azul y se observó que no se produce
un efecto inhibitorio, lo cual se puede justificar con que el alcohol etílico únicamente inhibe bacterias Gram
negativas, aunque teóricamente es un bactericida. En el caso del Lysol se obtuvo un halo de inhibición de tamaño
medio, que fue de 21.15 mm, y debido a que alrededor del halo hubo crecimiento microbiano se obtuvo un efecto
biostático, este agente químico, produce ruptura de las membranas celulares debido a su composición en
sales cuaternarias. En el NaClO se observa la formación de un halo de 30.20 mm, causando un efecto
inhibitorio muy grande, siendo este el agente químico que formo el halo de inhibición más grande, por lo que
su poder bactericida se debe a que produce radicales libres los cuales oxidan a los microorganismos dañando
la membrana o pared celular, así mismo se observa que tuvo un efecto biocida debido a que su alrededor no
hubo nada de crecimiento matando a todos los microorganismos. En el caso de los colorantes, en el siguiente
cuadrante se coloco safranina, presentando un halo de inhibición de 8.45 mm, por lo que presento un efecto
biostático y este colorante tiene una combinación especifica con ácidos nucleicos principalmente. Para el
Lugol también se observa un halo de inhibición grande (26.30 mm) teniendo un efecto biocida a causa de la
ausencia de crecimiento a su alrededor., así mismo, es un eficaz bactericida debido a que es una disolución
de yodo oxidante que altera las membranas celulares y debido a que forma iones triyodo aumenta su poder
germicida. Finalmente, en el último cuadrante se añadió cristal violeta, el cual formo un halo de 23.00 mm, lo
cual se debe a que este colorante se utiliza para inhibir microorganismo Gram positivos, su mecanismo
consiste en combinarse con los ácidos nucleicos de las bacterias debido a que este colorante es de tipo
básico. Por lo que tiene un efecto antiséptico, aunque pude observar que entre este cuadrante y el anterior
que contenía Lugol se juntaron y no se logra distinguir exactamente donde termina el halo del Lugol, por lo
que en estos casos se tiene que repetir ya que es posible que el efecto producido sea diferente, es por ello
que hay que ser cuidadosos al momento de colocar los discos justo al centro y procurando escurrir los discos
antes de ser colocados en la caja Petri. En el control no se observa algún efecto antimicrobiano debido a que
no se dispuso de ningún agente químico.

Finalmente se observó el efecto antibiótico en placa, por lo que se sembró masivamente en una caja Petri la
cepa de Pseudomonas aeruginosa y después se dispuso de sensidiscos de diferentes antibióticos y se llevó
a incubar por 24 horas a 37°C, y sucesivamente se dejó en refrigeración, al observar el efecto producido
pude ver que en el primer cuadrante que tenía Cefepime no se observó efecto, es decir, no se formó ningún
halo de inhibición, debido a que la bacteria es resistente a este antibiótico, ya que este antibiótico es una
cefalosporina que tiene gran afinidad por PBP-2 lo que explica que la cefepime puede ser activo frente a
bacterias Gram-negativas que son resistentes a las cefalosporinas. En el segundo cuadrante con Ceftazidima
se observa la formación de un halo de 29.5 mm, siendo este el antibiótico con un halo de inhibición de
crecimiento más grande, debido a que este antibiótico tiene un espectro más amplio que inhibe el crecimiento
contra las bacterias Gram negativas y es principalmente un bactericida. En el caso de la Ofloxacina se
observa un halo de inhibición de 18.3 mm, este es un antibiótico sintético del grupo de las quinolonas, efectiva
en contra de un gran número de bacterias Gram positivas y Gram negativas, por lo que se considera un
antibiótico de amplio espectro y un bactericida. Finalmente se utilizó la Piperacilina, el cual produjo un halo
inhibitorio de 21.4 mm, debido a que es un antibiótico de espectro extendido que actúa como inhibidor de
bacterias Gram positivas y Gram negativas y organismos aeróbicos como la Pseudomonas aeruginosa.

Conclusiones:
 Tanto las sustancias químicas como ciertos factores ambientales tienen un importante efecto en el
desarrollo de los microorganismos los cuales pueden ser estimulatorios o bien inhibitorios o
destructivos.
 El crecimiento bacteriano depende de varios factores, entre ellos se estudió el de la temperatura, el
pH y concentración de solutos, donde es posible observar cuales son las condiciones óptimas para
que se dé el crecimiento de un microorganismo en estudio y poder clasificarlo correctamente.
 Los efectos letales y mutagénicos de la radiación UV están relacionados con el tiempo de exposición,
habiendo una disminución de la carga microbiana a mayor tiempo de exposición, así como también
es posible revertir este efecto por fotorreactivación.
  A través de distintos agentes químicos y ciertos antibióticos fue posible observar los efectos biocidas
y biostáticos por medio de la formación de halos de inhibición que ejerce la bacteria en estudio.
 Es importante realizar correctamente las técnicas de siembra, así como seguir los pasos señalados y
las condiciones de tiempo e incubación para poder observar el efecto deseado que se quiere estudiar.

Problema:
De una muestra en un matraz, que contiene tres bacterias (A coco Gram positivo, B bacilo largo Gram positivo
y C bacilo corto Gram negativo), se sometió a los siguientes tratamientos obteniendo los resultados
correspondientes:

1) Se tomó una muestra que se incubó a 24oC, en ella se observó un crecimiento de cocos y bacilos largos.
2) Otra muestra se incubó a 37oC viendo el desarrollo de las tres bacterias.
3) En otra serie de medios se incubó con pH de 3, 5, 7, 9 y 11, teniendo desarrollo de A en los primeros tres,
B del segundo en los últimos 4 tubos y para C hubo desarrollo en los tubos 3 y 4.
4) Con la concentración se tuvo un abundante desarrollo de los tres microorganismos en un medio con 0% y
0.85% de NaCl, en el tubo con 9% de NaCl sólo desarrolló el microorganismo A.
5) Al hacer una siembra masiva en caja y aplicar antibióticos no hubo resultados concluyentes.
6) Lo mismo sucedió en radiaciones, aunque si se observó disminución de la carga microbiana conforme
aumenta el tiempo de exposición.

I) ¿Cómo se clasificarían las bacterias según su temperatura de desarrollo?

Bacteria A: Mesófilo
Bacteria B: Mesófilo
Bacteria C: Mesófilo

II) ¿Qué tendría que hacer para poder establecer las temperaturas cardinales de cada microorganismo?
Se tendría que someter el microorganismo inoculado en un medio nutritivo a distintas temperaturas y en la
muestra que no se haya desarrollado crecimiento seria la temperatura cardinal, es decir que por debajo de
esa no es posible que se de el crecimiento.

III) ¿Cuál de los microorganismos es alcalótolerante y cómo lo justifico?

El microorganismo del tubo B, ya que según la información dada este se desarrollo en pH de 5, 7, 9 y 11, lo
cual indica que puede soportar pH’s alcalinos, aunque no sea su pH óptimo de crecimiento.

IV) ¿En qué pH garantizo el crecimiento de los tres microorganismos?

En el pH de 7.
V) Si tengo la mezcla ¿habría algún pH en donde pueda tener el desarrollo de cada microorganismo por
separado? Explica.
Sí, ya que cada una de las bacterias tiene límites mínimos y máximos de crecimiento, por ejemplo, la Bacteria
A es la única que presenta crecimiento a un pH de 3, la bacteria B también fue la única que presento
crecimiento a un pH de 11 y la bacteria C tiene crecimiento a un pH de 7 y 9 únicamente por lo que se podría
tener crecimiento de cada una por separado.

VI) ¿Cómo puedo establecer que uno de los microorganismos es halotolerante?

Sí un microorganismo se puede adaptar por osmorregulación a condiciones altas de salinidad esta seria
halotolerante.

VII) Indica las tres condiciones para que crezca cada uno de los microorganismos por separado.
-Temperatura
-pH
-Concentración de solutos

VIII) ¿Por qué no son concluyentes los resultados de agentes químicos y cómo podría resolverlo?
Debido a que posiblemente se juntaron los halos de inhibición de los agentes químicos por lo que se tendría
que repetir nuevamente la técnica procurando no juntar mucho la sustancias a evaluar.

IX) ¿Cómo puedo asegurar que en los puntos 1, 2, 3 y 4 tengo el desarrollo de las bacterias reportadas?
Tomando la muestra y haciendo una observación microscópica por una Tinción de Gram y se tendrían que
observar las características indicadas en la información.

X) En las cajas por siembra masiva ¿Cuál sería la temperatura a la cual debería incubarlas?
A una temperatura de 37°C.

Bibliografía:
Ramírez, R., Luna, B., et. All. Manual de Prácticas de Microbiología General, 6ª ed.; Universidad Nacional

 E. Vega-Portocarrero y A. López-
Malo,
Autónoma de México: México, 2013; pp. 291-292.
Tortora G., et all. Introducción a la Microbiología, 9na ed.; Editorial Panamericana: Argentina, 2007; pp. 144.
E. Vega-Portocarrero y A. López-Malo, Agentes microbianos presentes en especies y hierbas.
Departamento de Ingeniería de Química y Alimentos, Universidad de las Américas de Pueblas., México.
Temas Selectos de Ingeniería de (2009): pp. 85-95.
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4c_ControlCrecimiento_19904.PDF. Consultado el 15 de
abril del 2018 a las 4:41 pm