Antibióticos dirigidos a ARN bacterianos

Resumen
Los ARN tienen diversas estructuras que incluyen protuberancias y bucles internos capaces de formar
contactos terciarios o servir como sitios de unión a ligandos. El reciente aumento en la información
estructural y funcional relacionada con los ARN los ha puesto en el centro de atención como un
objetivo farmacológico para la terapia de moléculas pequeñas. Además, el reconocimiento de la
marcada diferencia entre el ARNr procariota y eucariota ha llevado al desarrollo de antibióticos que
se dirigen específicamente al ARNr bacteriano, reducen la traducción de proteínas y, por lo tanto,
inhiben el crecimiento bacteriano. Para facilitar el desarrollo de nuevos antibióticos dirigidos al ARN,
aquí revisamos la literatura relacionada con tales antibióticos, ARNm, ribos de bruja y ARNt y las
metodologías clave utilizadas para su detección.
PALABRAS CLAVE
ARN; Antibióticos; Focalización de drogas; Las bacterias
1. Introducción
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es el principal material genético en eucariotas y generalmente
existe en forma de hélices bicatenarias. En contraste, el ácido ribonucleico (ARN) puede plegarse en
innumerables estructuras terciarias que reflejan sus diversas funciones. Por lo tanto, sirve como
material genético en algunos virus, como mediador de la información genética del ADN a las
proteínas, como componente estructural en muchas ribonucleoproteínas (RNP) y, en algunos casos,
como catalizador. El ARN generalmente se asocia con proteínas de unión a ARN (RBP) que sirven
para protegerlo, estabilizarlo o transportarlo y regular su interacción con otra molécula. El ARN
desempeña muchos papeles cruciales en la síntesis de proteínas, la regulación transcripcional y la
replicación retroviral que lo convierten en un objetivo principal para la acción del fármaco.
La reciente publicación de estructuras cristalinas de alta resolución de subunidades de ARNr
procariotas ha transformado nuestra comprensión del ARN. Las estructuras del ARN solo y de los
complejos ARN-proteína revelan una variedad de estructuras terciarias y patrones de interacción
ARN-proteína. El ARN puede plegarse en estructuras tridimensionales complejas que comprenden
bucles, seudonudos, protuberancias y vueltas que proporcionan sitios de unión específicos para
moléculas pequeñas.
En comparación con el ADN, el ARN no solo es más flexible, sino que carece de mecanismos de
reparación que mejoren su susceptibilidad a la acción de la terapéutica. Estos incluyen compuestos
tanto naturales como sintéticos que pueden influir en la actividad biológica del ARN al cambiar su
configuración o inhibir su función catalítica.
Se sabe que muchos antibióticos se dirigen al ARNr en procariotas y, por lo tanto, alteran la
traducción de proteínas. Sus diversas estructuras (Fig. 1A y B) dan testimonio tanto de la importancia
atribuida a esta clase de drogas como del largo período de su desarrollo desde su descubrimiento en
la década de 1930. Concomitante con la comercialización de antibióticos
potentes, ha surgido el fenómeno de la resistencia a los antibióticos, que representa una grave
amenaza para la salud humana. La reciente desaceleración en el ritmo del desarrollo de nuevos
antibióticos17,18 ha complicado aún más el problema de salud global. Sin embargo, los antibióticos
siguen siendo un área atractiva para la inversión y representan el tercer área terapéutica más grande
con un financiamiento global de más de $ 34 mil millones en 200619. Para ayudar en el
descubrimiento de nuevos antibióticos, aquí resumimos los medicamentos más comúnmente
utilizados para el ARNr bacteriano en el desarrollo clínico.
2. Antibióticos dirigidos a ARNr
El ARNr es el objetivo de ARN más comúnmente explotado para moléculas pequeñas. El ribosoma
bacteriano comprende subunidades de ribonucleoproteína 30S y 50S, contiene varios sitios de unión
para antibióticos conocidos y es un objetivo atractivo para nuevos agentes antibacterianos. La gran
diferencia entre el ARNr procariótico y eucariótico permite la selección de rRNA contra un amplio
espectro de bacterias patógenas. Los ribosomas bacterianos tienen dos subunidades de
ribonucleoproteína, de las cuales aproximadamente dos tercios son ARN.
El rRNA bacteriano incluye 5S, 16S y 23S rRNA, siendo el más pequeño (5S rRNA) un ARN de 120
nt. La subunidad 30S más pequeña contiene un solo ARN de 1500 nt (ARNr 16S) y aproximadamente
20 proteínas diferentes, mientras que la subunidad 50S más grande contiene un ARN de 2900 nt
(ARNr 23S) y aproximadamente 30 proteínas diferentes. Recientemente, la aplicación de la
cristalografía de rayos X ha aclarado muchos sitios de unión a antibióticos en la subunidad ribosómica
que facilita el diseño de nuevos antibióticos Fig. 2.
2.1. Antibióticos aminoglucósidos
Los aminoglucósidos son un grupo de antibióticos bien conocidos que se han utilizado con éxito
durante más de medio siglo. La estreptomicina y la espectinomicina son ejemplos típicos que
funcionan uniéndose a sitios específicos en el ARNr procariota y afectando la fidelidad de la síntesis
de proteínas. El sitio ARNa aminoacil-ARNt (sitio ARNr A) es un objetivo principal para los
aminoglucósidos que, debido a la diferencia entre el ARN procariota 16S y el 18S humano, mata
selectivamente las células bacterianas. La unión del fármaco a la subunidad 16S cerca del sitio A de
la subunidad 30S conduce a una disminución en la precisión traduccional e inhibición de la
translocación del ribosoma. La unión directa al ARNr 16S se ha demostrado mediante RMN,
espectroscopía de masas, resonancia de plasmones de superficie y cristalografía de rayos X. Los
efectos terapéuticos y adversos de los aminoglucósidos se han estudiado intensamente. El problema
principal en la práctica clínica se relaciona con su toxicidad y el rápido aumento en la aparición de
cepas resistentes. Con suerte, la modificación y reconstrucción de los restos de azúcar conducirán a
nuevos derivados de aminoglucósidos que superarán las propiedades indeseables de los compuestos
naturales. Se ha establecido una pequeña biblioteca de cuatro aminoglucósidos que se unen a un rRNA
bacteriano de 16384 miembros. Se ha establecido un bucle interno similar a un sitio para reconocer
los motivos de ARN utilizando un cribado combinatorio bidimensional (2DCS). Esto puede permitir
el diseño racional y modular de pequeñas moléculas dirigidas al ARN.

2.1.1. Estreptomicina
La estreptomicina perturba varios pasos de la síntesis de proteínas que conducen a errores de
traducción y ralentización de la translocación. Se une firmemente a un solo sitio en 16S rRNA sin
unirse a la ribonucleoproteína como lo respaldan los estudios de huellas y mutaciones. Los estudios
de huellas mostraron que la estreptomicina protege los residuos específicos de 16S rRNA dentro de
la subunidad 30S y puede vincularse a porciones específicas de 16S rRNA41. Además, una mutación
en el ARNr de Euglena cloroplasto 16S resultó en resistencia a la estreptomicina y las mutaciones en
diferentes regiones de ARNr de Escherichia coli 16S cambiaron la respuesta ribosómica a la
estreptomicina. La estreptomicina también interactúa con las proteínas ribosómicas en la subunidad
30S y las mutaciones en las proteínas ribosómicas S4, S5 y S12 se muestran que influyen en su unión.
2.1.2. Espectinomicina
La espectinomicina es un antibiótico aminociclitol producido por Streptomyces spectabilis que inhibe
el crecimiento de muchas bacterias Gramnegativas y es particularmente útil en el tratamiento de la
gonorrea.
La huella química ha demostrado que la espectinomicina se une a la posición N-7 del ARNr 16S de
E. coli y el hecho de que varias mutaciones en el ARN y la proteína conducen a la resistencia a la
espectinomicina implica un sitio de unión probable en el ARNr 16S. Dicha unión puede bloquear la
unión del factor de alargamiento G y, por lo tanto, evitar la translocación de peptidil-tRNAs desde el
sitio A ribosómico al sitio P. El sitio A (aminoacilo) cerca del extremo 3 'del ARNr 16S es muy
importante en el proceso de decodificación, de modo que la unión de un aminoglucósido conduce a
una síntesis de proteínas errónea y muerte bacteriana. Se usó un conjunto de oligoribonucleótidos 2
'-O-metil (OMe) 10-mer complementarios superpuestos para apuntar al sitio A en subunidades
ribosómicas 30S purificadas de E. coli y se demostró que eran inhibidores casi ideales de la traducción
in vitro. Sin embargo, la correlación de la actividad de inhibición con la fuerza de unión al sitio A fue
limitada.
La estructura cristalográfica de rayos X del complejo entre la espectinomicina y la subunidad 30S de
Thermus thermophilus confirma que el sitio de unión a antibióticos se encuentra en el surco menor
cerca del extremo de la hélice 34 del ARNr 16S. La espectinomicina puede formar un complejo
estable con múltiples bases de ARN a través de enlaces de hidrógeno, lo que sugiere que otras
estructuras de ARN pueden servir como sitios de unión para la espectinomicina, ya sea por homología
con la hélice 34 o por diferentes conjuntos de interacciones. Se ha demostrado que la sobreexpresión
de fragmentos de ARNr 16S que contienen hélice 34 puede inducir cierta resistencia a la
espectinomicina in vivo.
2.2. Tetraciclina
La tetraciclina inhibe la unión del ARN a los ribosomas principalmente al influir en la unión al sitio
A, aunque algunos informes implican la unión de Ac-Phe-tRNA al sitio P. Existe un sitio de unión
fuerte en la subunidad 30S y muchos sitios más débiles en las subunidades 30S y 50S.
La tetraciclina puede incorporarse principalmente a las proteínas ribosómicas ya que, en ausencia de
ribonucleoproteína, el ARN 16S y las proteínas S3, S7, S8, S14 y S19 muestran una alta afinidad por
la tetraciclina, particularmente S7.
Además, utilizando un derivado de benzofenona fotorreactivo de tRNA [ARN de transferencia de 3-
(4-benzoilfenil) propionil-fenilalanina (BP PhetRNA)], la fotorreacción del ARN 23S fue
completamente inhibida por la tetraciclina y la propia tetraciclina interactuó eficientemente con la
región del bucle V de 23S ARN. El 16S RNA y el 23S RNA son objetivos de la tetraciclina y los
datos de actividad de las subunidades reticuladas han demostrado que la tetraciclina reticula con el
16S RNA en el sitio de unión fuerte.
2.3. Lincomicina y clindamicina
La lincomicina es un antibiótico de lincosamida que, junto con su derivado, clindamicina (7-cloro-7-
desoxilincomicina), inhibe el crecimiento bacteriano al prevenir la formación de enlaces peptídicos.
Los dos fármacos actúan dirigiéndose al bucle de peptidil transferasa en el dominio V del ARNr 23S
de la subunidad ribosómica 50S, que es el sitio de formación del enlace peptídico. El bucle de peptidil
tranferasa tiene una estructura terciaria compleja que probablemente contiene el bucle de horquilla
adyacente. El hecho de que una mutación de transición en la posición 2032 conduzca a la resistencia
a la clindamicina en E. coli y a la resistencia a la lincomicina en el cloroplasto de tabaco respalda este
mecanismo de acción. El hecho de que la clindamicina sea más potente que la lincosamida para inhibir
el crecimiento de bacterias Gram negativas es probablemente el resultado de su mayor solubilidad en
lípidos que le permite penetrar más fácilmente en la membrana externa bacteriana y unirse en el
mismo sitio objetivo ribosómico. La huella química in vitro indica que los dos antibióticos interactúan
con el ARNr 23S en los ribosomas de E. coli.
2.4. Cloranfenicol
El cloranfenicol es un antibiótico de amplio espectro que actúa como un potente inhibidor de la
biosíntesis de proteínas bacterianas. Tiene una larga historia clínica pero la resistencia bacteriana es
común. Los estudios de huella de cloranfenicol con nucleótidos específicos han revelado que los sitios
de unión se encuentran en la subunidad ribosómica 50S donde el cloranfenicol interactúa con el bucle
central del dominio V 23S rRNA para inhibir la actividad peptidil transferasa. Los estudios de rayos
X han revelado detalles de la unión a las subunidades 50S en Deinococcus radiodurans y Haloarcula
marismortui.
Las mutaciones en el ARN pueden afectar la unión del cloranfenicol.
3. La posibilidad de apuntar con ARN mensajero bacteriano
(ARNm)
Actualmente se están desarrollando algunos medicamentos novedosos para atacar los ARNm
eucariotas. Aunque la estructura del ARNm es menos complicada que la del ARNr, todavía incorpora
algunas estructuras especiales como horquillas y seudonudos que proporcionan sitios de unión para
moléculas pequeñas. Por ejemplo, el elemento de respuesta al hierro (IRE) presente en varios ARNm
implicados en la homeostasis del hierro e identificado en la proteína precursora

amiloide de Alzheimer se considera un objetivo para moléculas pequeñas. Otro es el elemento no

estructurado rico en AU (ARE) que regula espacialmente la traducción y la estabilidad del ARNm.
Algunas de estas interacciones son críticas para los procesos fisiológicos y se están explorando como
objetivos para el descubrimiento de fármacos.
Ciertos ARNm también usan control alostérico para mediar las respuestas reguladoras. Por ejemplo,
los ARNm que codifican las enzimas involucradas en la biosíntesis de tiamina (vitamina B1) en E.
coli pueden unirse a la tiamina o su derivado de pirofosfato sin la necesidad de cofactores de proteínas.
Además, los riboswitches bacterianos que consisten en dominios de ARN estructurados que
generalmente residen en la región no traducida de 50 ARNm pueden unirse directamente a
metabolitos específicos y servir como puertas lógicas que regulan su propia expresión sin la necesidad
de proteínas reguladoras. Los interruptores de ARN pueden servir como nuevos objetivos para el
descubrimiento de fármacos, ya que son ampliamente utilizados por las bacterias para detectar
cambios en la fisiología celular y regular las rutas metabólicas. Información detallada sobre este tema
está disponible en la literatura.
A pesar de lo anterior, existen grandes diferencias entre los ARNm procariotas y eucariotas. Estos
incluyen: (1) el hecho de que el ARNm procariota no necesita ser procesado o transportado para que
la traducción por el ribosoma pueda comenzar inmediatamente después del final de la transcripción
o junto con la transcripción. La división del ARN pre-mensajero en ARN mensajero maduro es un
paso esencial para la expresión de la mayoría de los genes en eucariotas y se está empleando para la
terapia de la enfermedad; (2) el hecho de que, en general, la vida útil del ARNm procariota es mucho
más corta que la del ARNm eucariota porque la ausencia de 50 cap y 30 poliA en el ARNm procariota
permite su degradación inmediata por exonucleasa.
4. Antibióticos relevantes para el ARNt bacteriano.
4.1. Puromicina
La puromicina es un antibiótico aminonucleósido derivado de Streptomyces alboniger que causa la
terminación prematura de la cadena durante la traducción en el ribosoma. Parte de la molécula de
puromicina se asemeja al extremo 30 del tRNA90 aminoacilado, de modo que ingresa al sitio A y se
transfiere a la cadena en crecimiento, lo que conduce a una cadena puromicilada inmadura y su
liberación prematura. Sin embargo, la falta de selectividad de la puromicina lo hace inadecuado como
antibiótico y ahora se usa principalmente como una herramienta bioquímica para estudiar la síntesis
de proteínas. También está bajo investigación como una droga contra el cáncer.
4.2. Mupirocina
La aminoacil tRNA sintetasa (aaRS) ha sido reconocida como un objetivo farmacológico útil y
muchos compuestos naturales se dirigen específicamente a ella para inhibir el crecimiento bacteriano.
De hecho, hay unos 20 aaRS esenciales, cada uno de los cuales puede representar un objetivo
potencial para nuevos antibióticos. Sin embargo, la mupirocina (ácido pseudomónico A) es el único
medicamento comercializado que se dirige a esta enzima. La mupirocina exhibe buena actividad
contra Enterococcus faecium coagulasa negativo, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis,
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae.

También se ha demostrado en estudios in vitro que inhibe el crecimiento de hongos patógenos como
los dermatofitos. La investigación genómica y bioquímica reciente ha proporcionado una gran
cantidad de información relevante para los aaRS, incluidas sus estructuras cristalinas y sitios activos.
Claramente representan objetivos prometedores para nuevos antibióticos. La mupirocina inhibe la
sintetasa iso-leucil-ARNt (IleRS) y representa el punto de partida para el desarrollo de otros
inhibidores de aaRS. Pseudomonas fluorescens tiene un grupo de genes de 74 kb que codifica la
mupirocina que incluye policétido sintetasa y un sistema de ácido graso sintetasa. La mupirocina es
un metabolito secundario producido durante la fase estacionaria tardía que inhibe la síntesis de
proteínas al unirse específicamente a IleRS bacterianos e inhibir la formación de ARNt de Ile. Los
estudios de selectividad han demostrado que la mupirocina inhibe los IleRS bacterianos,
arqueológicos y fúngicos, pero no sus ortólogos de mamíferos. Hay dos genes (ileRS1 e ileRS2) en
P. fluorescens que muestran diferencias notables100. IleRS2 no tiene sensibilidad a la mupirocina y
exhibe características eucariotas que sugieren que, en P. fluorescens, el gen ileRS2 funciona para
proteger a las bacterias del ataque de la mupirocina. Una mutación en E. coli thrS, una ligasa Thr-
tRNA, puede resistir un inhibidor de la desacetilasa LpxC, uno de los objetivos más prometedores
para el tratamiento de infecciones por gramnegativos resistentes a múltiples fármacos. Los aspectos
estructurales y energéticos de la unión de aristololactamβ-D-glucósido y daunomicina a tRNA (phe)
se han investigado utilizando diversas técnicas biofísicas.
5. Técnicas cruciales para el descubrimiento de fármacos dirigidos al ARN
Se han logrado grandes avances en el descubrimiento de fármacos dirigidos al ARN. La RMN de alta
resolución, la espectroscopía de masas con electrospray (ESIMS), la resonancia de plasmón
superficial (SPR), junto con otras tecnologías, han facilitado el descubrimiento en este campo. Por
ejemplo, la estructura de un ARN de 27 nucleótidos complejado con un antibiótico aminoglucósido
se ha determinado mediante espectroscopía de RMN; una técnica basada en ESI-MS (IBIS
Therapeutics) puede detectar decenas de miles de compuestos en un día, pero su alto costo limita su
aplicación más amplia; SPR es una técnica sensible y conveniente para controlar la unión al ARN de
hasta 100 moléculas pequeñas por día.
También hay métodos para establecer la situación de unión de moléculas pequeñas al ARN en
ausencia de proteínas de unión al ARN.
Por ejemplo, el ensayo de proximidad de centelleo (SPA) es un medio de detección de inhibidores de
la interacción ARN-proteína. La técnica utiliza oligonucleótidos complementarios marcados para
controlar los cambios en el equilibrio entre el estado plegado y desplegado de una estructura de bucle
de tallo de ARN producida por la unión de una molécula pequeña. En las células, la interacción entre
el ARN y las proteínas se puede medir utilizando la fusión del gen informador. Además, un método
novedoso para identificar nuevos compuestos que interrumpen la función de los ribosomas en
Mycobacterium tuberculosis ha identificado dos compuestos (T766 y T054) con potente actividad
específica contra M. tuberculosis y baja toxicidad para ratones y otras cepas bacterianas.

6. El futuro de los antibióticos dirigidos a los ARN bacterianos La revolución genómica ha revelado
muchos ARN como objetivos potenciales para nuevos antibióticos. Dirigirse al ARN es desafiante y
complementario al descubrimiento de fármacos tradicional que se centra en las proteínas y puede
tener algunas ventajas. Primero, se puede acceder a más sitios a nivel de ARN, mientras que el
objetivo de las proteínas generalmente se limita a sus sitios activos. En segundo lugar, es rentable
someter los ARN a pruebas de detección de alto rendimiento. Con los desarrollos en nuevas
tecnologías de descubrimiento de fármacos, la selección de ARN para obtener mejores antibióticos
se está convirtiendo en una nueva frontera en el descubrimiento de fármacos.
Figura 1 Las estructuras de los antibióticos (estreptomicina, espectinomicina, tetraciclina y
puromicina) cuyo mecanismo de acción está relacionado con el ARNr. A: estreptomicina,
espectinomicina y tetraciclina diana bacteriana 16S rRNA; La puromicina se asemeja al extremo 30
del tRNA aminoacilado. B: Lincomicina, clindamicina y cloranfenicol diana bacteriana 23S rRNA;
La mupirocina se dirige a la aminoacil tRNA sintetasa.
Figura 2 A: Las estructuras secundarias del ARNr 16S parcial (los números indican las posiciones de
nucleótidos). Los nucleótidos que interactúan con la espectinomicina, la tetraciclina y la
estreptomicina están marcados con círculos rojos, verdes y amarillos, respectivamente. B: Las
estructuras secundarias de 23S rRNA parcial. Los nucleótidos que interactúan con cloranfenicol,
lincomicina y clindamicina, puromicina y tetraciclina están marcados con círculos morados, verdes,
amarillos y rojos, respectivamente.