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Principes de mesure de la sensibilité aux


antibiotiques. CMI/CMB
C. Huet

L’activité des antibiotiques sur les bactéries rencontrées en pathologie est évaluée in vitro. L’effet
bactériostatique est étudié par la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI). Les
méthodes de référence sont des méthodes de dilution en gélose ou en milieu liquide. En pratique courante,
la sensibilité aux antibiotiques est étudiée par des méthodes de diffusion en milieu solide comme
l’antibiogramme ou par des techniques automatisées. La concentration minimale bactéricide (CMB) rend
compte de l’effet bactéricide des antibiotiques. Il est cependant préférable d’étudier la bactéricidie de
manière cinétique en fonction du temps. Les principes de ces différentes méthodes peuvent aussi être
utilisés pour l’étude d’associations d’antibiotiques.
© 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : CMI ; Catégorisation clinique ; Antibiogramme ; CMB ; Bactéricidie

Plan 24 heures. Les conditions techniques sont disponibles sur le site


de la Société française de Microbiologie (www.sfm.asso.fr).
¶ Concentration minimale inhibitrice (CMI) 1 Dilution en milieu liquide
Méthodes de mesure 1
Interprétation des résultats : catégorisation des souches en S, I, R 2 C’est la méthode de référence du NCCLS (National Commit-
Antibiogramme par diffusion en gélose (méthode des disques) 2 tee for Clinical Laboratory Standards), à côté de la méthode de
Antibiogramme automatisé 2 dilution en gélose. La gamme de concentrations d’antibiotique
CMI50 et CMI90 2 est réalisée en bouillons nutritifs ensemencés avec la souche à
tester. La CMI correspond au tube dans lequel il n’y a pas de
¶ Effet bactéricide des antibiotiques 2 croissance visible.
Concentration minimale bactéricide (CMB) 2 Cette méthode peut être automatisée en utilisant des plaques
Cinétique de bactéricidie 2 de microtitration (microdilution en milieu liquide).
Étude du pouvoir bactéricide du sérum 2 Des souches de contrôle doivent être incluses dans toute
¶ Étude des associations d’antibiotiques 2 étude de CMI.
Méthodes en point fixe 3 La méthode de dilution fournit une bonne appréciation de
Méthodes cinétiques 3 l’activité d’un produit, mais elle est relativement imprécise [1].
Cette précision peut être améliorée en réalisant des gammes de
concentrations plus serrées, en progression géométrique de
raison 1,25 par exemple.
■ Concentration minimale
Diffusion en milieu solide : E-test
inhibitrice (CMI) Le E-test est une technique d’étude de la sensibilité des
C’est le test le plus utilisé pour évaluer in vitro l’activité d’un bactéries par diffusion en gélose, donnant une lecture directe de
antibiotique sur une bactérie. la CMI [1]. Le principe technique repose sur l’utilisation d’une
La CMI est la plus faible concentration d’antibiotique capable bandelette imprégnée avec un gradient de concentrations
d’inhiber toute croissance visible de la souche bactérienne d’antibiotique. Elle est déposée sur une gélose préalablement
étudiée (bactériostase) exprimée en mg/l ou µg/ml [1]. ensemencée avec la souche bactérienne, selon des recomman-
dations précises indiquées par le fournisseur (AB BIODISK).
Après 18-24 heures d’incubation, il se forme une zone d’inhibi-
Méthodes de mesure tion de croissance bactérienne en forme d’ellipse autour de la
bandelette. La CMI est lue à l’intersection entre l’ellipse et la
Dilution en milieu solide (méthode de dilution en
bandelette.
gélose) Cette technique permet de fournir des résultats de CMI en
C’est la méthode de référence en France (CA-SFM Comité de général bien corrélés avec les techniques de référence. Elle ne
l’Antibiogramme de la Société française de Microbiologie). Elle remplace cependant pas ces techniques et son coût élevé en
consiste à incorporer des quantités croissantes de l’antibiotique limite l’utilisation. D’autre part, des variations importantes
dans la gélose coulée en boîte de Petri, réalisant une gamme de peuvent être observées selon la composition des milieux utili-
concentrations en progression géométrique de raison 2. Les sés [3]. Elle est cependant intéressante lorsqu’il est recommandé
souches bactériennes sont ensemencées en strie ou en spot (en de déterminer rapidement la CMI d’un antibiotique de manière
« tache ») à l’aide d’un ensemenceur multiple de type Steers relativement précise (pneumocoque de sensibilité diminuée à la
(inoculum de 104 bactéries par spot) [2]. La lecture se fait à 18 et pénicilline G, Staphylococcus aureus et glycopeptides).

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Interprétation des résultats : catégorisation ■ Effet bactéricide


des souches en S, I, R des antibiotiques
La CMI est une caractéristique de la souche étudiée. Elle
permet, par comparaison aux concentrations critiques fixées Concentration minimale bactéricide (CMB)
annuellement pour chaque antibiotique et espèce bactérienne La CMB est la plus faible concentration d’antibiotique
par le CA-SFM, de classer la souche dans une des trois catégo- capable après 18 à 24 heures de contact avec une population
ries : sensible, intermédiaire ou résistante [1]. Les concentrations bactérienne, de laisser un pourcentage de bactéries survivantes
critiques sont des bornes supérieures et inférieures de sensibilité inférieur ou égal à 0,01 % en France ou 0,1 % dans les pays
ou de résistance fixées en fonction de caractères bactériologi- anglo-saxons. Elle s’effectue conjointement à la mesure de la
ques, pharmacocinétiques et des confrontations des données in CMI et peut, comme elle, être déterminée en milieu solide ou
vitro aux données cliniques. en milieu liquide [1]. Après détermination de la CMI, le pour-
Une souche est catégorisée comme sensible à un antibiotique centage de bactéries survivantes est apprécié après repiquage des
lorsque la CMI de l’antibiotique considéré est inférieure ou égale milieux où aucune culture n’est visible.
à la concentration critique inférieure (c) pour cet antibiotique. Beaucoup plus que la CMI, la CMB est sujette à des variations
Il y a alors une forte probabilité de succès thérapeutique dans qui dépendent de nombreux facteurs. Il s’agit du milieu de
le cas d’un traitement systémique à dose recommandée. culture, de l’inoculum, de la phase de croissance des bactéries,
La souche est résistante si la CMI de l’antibiotique est des conditions d’incubation (agitation, atmosphère d’incuba-
supérieure à la concentration critique supérieure (C). Il y a alors tion), de l’adhésion des bactéries à certains supports (plastique)
une forte probabilité d’échec thérapeutique avec cet qui diminuent l’effet bactéricide, ou du transport d’antibiotique
antibiotique. (« carry over ») [7].
La souche est intermédiaire quand la CMI de l’antibiotique La CMB permet de classer un antibiotique comme bactéricide
est comprise entre c et C, le succès thérapeutique étant alors ou bactériostatique en fonction du rapport CMI/CMB. Elle
imprévisible. permet aussi d’apprécier le phénomène de tolérance d’une
souche lorsque le rapport CMI/CMB est supérieur ou égal à
Antibiogramme par diffusion en gélose 32 [1].
(méthode des disques)
Cinétique de bactéricidie
Les méthodes de dilution ne sont pas réalisées en pratique
courante sur toutes les souches isolées au laboratoire, plusieurs Compte tenu des grandes variations observées dans la déter-
antibiotiques devant être testés. C’est la méthode de diffusion mination des CMB et de la différence de définition selon les
en gélose qui est couramment utilisée, son principe étant la pays, il est préférable d’étudier la bactéricidie de manière
détermination indirecte de la CMI [4]. cinétique en fonction du temps en présence d’une concentra-
Des disques de papier buvard imprégnés d’une quantité tion fixe d’antibiotique. Ceci permet d’apprécier la vitesse de
définie d’antibiotique sont déposés à la surface d’un milieu bactéricidie plutôt qu’une seule valeur à 18 heures, d’éviter les
gélosé préalablement ensemencée avec le germe à étudier. À phénomènes liés à la recroissance bactérienne après une phase
partir du disque, l’antibiotique diffuse dans la gélose, y créant de bactéricidie initiale et les problèmes liés à la dégradation de
un gradient de concentrations. l’antibiotique dans le milieu [8].
Après incubation (18-24 h à 37 °C), chaque disque est Elle se réalise en milieu liquide. L’inoculum bactérien est mis
entouré d’une zone d’inhibition de la croissance bactérienne : la en contact avec une concentration d’antibiotique puis incubé à
culture s’arrête là où dans la gélose la concentration d’antibio- 37 °C. À des temps donnés, des aliquots sont prélevés pour
tique est égale à la CMI de la souche bactérienne étudiée. dénombrer les bactéries viables [7]. Il est recommandé d’effectuer
La réponse n’est pas formulée en termes de valeur de CMI, quatre repiquages à la phase précoce (soit au temps 0 - 1,5 ou
mais : souche sensible, intermédiaire ou résistante, résultant 2 heures, 3 ou 4 heures et 6 ou 8 heures) pour comparer les
d’une lecture interprétative. La CMI est estimée à partir de la antibiotiques à bactéricidie rapide et de détecter les antibioti-
mesure du diamètre d’inhibition par une relation établie au ques ayant une phase de latence dans leur activité bactéricide.
préalable sur un grand nombre de souches (courbe de concor- Un repiquage tardif à 18 ou 24 heures permet d’apprécier les
dance). Celle-ci permet de calculer des diamètres discriminants recroissances bactériennes. Les résultats sont exprimés sous
(critiques) correspondant aux CMI critiques. Le classement forme de courbe reliant le logarithme du nombre de survivants
sensible/intermédiaire/résistant de la bactérie est calculé par au temps.
rapport à des valeurs préétablies soit de diamètres d’inhibition
(D, d), soit de concentrations d’antibiotiques ou concentrations Étude du pouvoir bactéricide du sérum
critiques (C, c) : Cette méthode permet de vérifier que le traitement adminis-
• CMI ≤ c (diamètre ≥ D) : souche sensible ; tré au malade confère à son sérum une activité bactéricide. Des
• c < CMI ≤ C (d ≤ diamètre ≤ D) : souche intermédiaire ; dilutions croissantes de sérum prélevé au pic et à la vallée de
• CMI ≥ C (diamètre ≤ d) : souche résistante. l’administration de l’antibiotique sont mises en présence d’une
L’antibiogramme est une méthode simple, fiable et reproduc- suspension calibrée du germe responsable de l’infection. Après
tible mais sensible à certains facteurs [5] : 18 heures de contact, la dilution maximale inhibitrice est notée.
• milieu de culture : standardisé : Mueller-Hinton, épaisseur La bactéricidie est ensuite appréciée par la numération des
4 mm, pour les bactéries à croissance rapide sur milieux survivants.
usuels ;
• inoculum bactérien : standardisé : 2-3 106 bactéries par ml ;
• conservation des disques (+ 4 °C). ■ Étude des associations
d’antibiotiques
Antibiogramme automatisé Les effets antibactériens des associations d’antibiotiques
Les principes de l’antibiogramme automatisé sont développés observés in vitro sont définis de la façon suivante :
ailleurs (voir notamment [6]). • indifférence : l’activité de l’un des antibiotiques n’est pas
affectée par celle de l’autre ;
CMI50 et CMI90 • addition : l’effet de l’association est égal à la somme des effets
de chaque antibiotique étudié isolément à la même concen-
La CMI50 est calculée pour un ensemble de souches bacté- tration que dans l’association ;
riennes : c’est la CMI qui inhibe 50 % de la population étudiée. • synergie : l’effet de l’association est supérieur à la somme des
La CMI90 est la CMI qui inhibe 90 % de la population étudiée. effets de chaque antibiotique ;

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• antagonisme : l’activité de l’un des antibiotiques est dimi- antibiotique isolé aux mêmes concentrations et sans antibioti-
nuée ; l’effet de l’association est inférieur à la somme des que (témoin). Une synergie est définie par un pourcentage de
effets de chaque antibiotique. survivants 100 fois inférieur avec l’association qu’avec l’antibio-
Plusieurs méthodes d’étude existent [1]. Les résultats sont tique le plus actif [7].
parfois difficiles à interpréter et peuvent être discordants d’une Cette méthode permet d’apprécier la bactéricidie de façon
technique à l’autre. quantitative ainsi que la vitesse de bactéricidie. De plus, elle
permet de comparer l’activité des antibiotiques isolés ou associés
sur des bactéries en phase exponentielle de croissance et sur des
Méthodes en point fixe bactéries quiescentes, comme elles peuvent l’être au site de
Le résultat des interactions est observé au bout de 18 à l’infection, et d’observer les effets de l’association sur des
24 heures d’incubation. phénomènes de recroissance secondaire.
La première méthode est une méthode de diffusion en gélose,
en utilisant soit des disques destinés à la réalisation des
antibiogrammes, soit des bandes de papier imprégnées de ■ Références
chacun des deux antibiotiques. L’antibiotique diffuse en [1] Soussy CJ. Antibiotiques, généralités. In: Freney J, Renaud F,
réalisant dans la gélose un gradient de concentrations. Hansen W, Bollet C, editors. Précis de bactériologie clinique. Paris:
La technique de l’échiquier est une technique de dilution en Eska; 2000. p. 557-76.
milieu liquide (plaque de microtitration), qui consiste à associer [2] Comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie.
entre elles les différentes concentrations de chaque antibiotique Rapport du comité de l’antibiogramme de la société française de
selon un schéma carré, en réalisant des gammes de concentra- microbiologie. Clin Microbiol Infect 1996;2(suppl1).
tions. Après 18 à 24 heures d’incubation, on note dans chaque [3] Leclercq R, Soussy CJ, Drugeon HB, Auzou M, Moniot-Ville N.
rangée la première cupule où se produit l’inhibition. La concen- Influence majeure des lots de Mueller-Hinton sur les CMI de la
tration de chaque antibiotique présent dans cette cupule est téicoplanine vis-à-vis des staphylocoques à coagulase négative. Paris:
convertie en fraction ou multiple de la CMI de cet antibiotique 21e Réunion Interdisciplinaire de Chimiothérapie Anti-infectieuse
agissant isolément (FIC : fractional inhibitory concentration). La (RICAI; 2001.
somme des deux FIC donne une valeur chiffrée dite index FIC. [4] Courvalin P, Goldstein F, Philippon A, Sirot J. L’antibiogramme. Paris:
Les valeurs des index FIC sont rapportées sur un graphique dont MPC Vidéom; 1985.
les axes portent les fractions et multiples de CMI. L’aspect des [5] Goldstein F. Limites de l’antibiogramme. In: Courvalin P, Goldstein F,
courbes permet de déduire la valeur de l’association. Philippon A, Sirot J, editors. L’antibiogramme. Paris: MPC Vidéom;
1985. p. 19-22.
La bactéricidie est appréciée par numération des survivants
[6] Leclercq R. Antibiogramme automatisé et expertise : concept et appli-
dans les cupules où il n’y a pas de croissance visible.
cation. Rev Fr Lab 1999;312:115-7.
[7] Drugeon H, Legallou F, Caillon J. Méthodes d’étude de l’activité
Méthodes cinétiques bactéricide. In: Courvalin P, Drugeon H, Flandrois JP, Goldstein F,
editors. Bactéricidie. Paris: Maloine; 1990. p. 113-26.
Des cinétiques de bactéricidie peuvent être réalisées en [8] Courvalin P, Leclercq R, Bingen E. Fiches techniques. In: Courvalin P,
dénombrant au cours du temps les bactéries survivantes en Leclercq R, Bingen E, editors. Antibiogramme. Paris: ESKA; 2007.
présence de l’association d’antibiotiques, en présence de chaque p. 619-52.

C. Huet.
Laboratoire de microbiologie, CHU Côte de Nacre, 14033 Caen cedex, France.

Toute référence à cet article doit porter la mention : Huet C. Principes de mesure de la sensibilité aux antibiotiques. CMI/CMB. EMC (Elsevier Masson SAS,
Paris), Encyclopédie Médico-Biologique, 90-60-0270, 2007.

Disponibles sur www.emc-consulte.com


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