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Cultures en mycologie médicale


J. Waller

Les laboratoires effectuant des analyses de mycologie médicale doivent s’astreindre à choisir et à
respecter un protocole d’isolement et d’identification rigoureux, tant analytique que diagnostique. La
mise en culture de produits d’origine humaine, animale ou environnementale est la base de l’isolement et
de l’identification de champignons, potentiellement pathogènes. En fonction du prélèvement, un choix du
milieu d’isolement est nécessaire. Dans un certain nombre de cas, le recours à des milieux d’identification
est indispensable.
© 2006 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Levures ; Champignons filamenteux ; Milieux de culture ; Milieux d’identification ;


Protocole de laboratoire

Plan Dans la mesure des moyens disponibles, il est souhaitable de


travailler le plus stérilement possible, lors de l’ensemencement ;
entre deux becs bunsen au minimum, sous hotte à flux lami-
¶ Introduction 1
naire (poste de sécurité microbiologique), idéalement.
¶ Choix du milieu en fonction du prélèvement 1 Des mesures de protection de la personne chargée de l’ense-
Milieux pour hémocultures 1 mencement des milieux sont à prévoir (gants, sarrau, ...).
Milieux pour dermatophytes 1 Un examen direct est réalisé conjointement à l’ensemence-
Milieux pour les autres produits 2 ment du produit.
¶ Ensemencement des cultures sur milieux d’isolement 2
Hémocultures 2
Dermatophytes 2 ■ Choix du milieu en fonction
Autres prélèvements 2
¶ Lecture des cultures d’isolement 2
du prélèvement
Hémocultures 2 On peut distinguer trois types de milieux d’isolement, en
Dermatophytes 3 fonction du prélèvement :
Autres ensemencements 3 • milieux pour hémocultures (prélèvements de sang) ;
¶ Identification des isolats 3 • milieux pour dermatophytes (prélèvements d’origine cuta-
Champignons filamenteux 3 née) ;
Dermatophytes 3 • milieux pour les autres produits (prélèvements d’autres
Levures 3 origines).

Milieux pour hémocultures


Il existe de nombreux milieux pour hémocultures, mais la
■ Introduction tendance actuelle est au suivi des hémocultures sur automates.
• Milieu type Castaneda.
La recherche d’agents fongiques d’origine humaine, animale • Milieu de Sabouraud diphasique.
ou environnementale se fait par mise en culture de différents • Milieux pour automates (mis à la disposition par les fabri-
types de prélèvements sur des milieux favorables à leur cants d’automates).
développement [1-5]. La culture se fait en étuve réglée à 35-37 °C.
Elle nécessite une méthodologie de laboratoire qui doit être Sur ces milieux, il est aussi concevable d’ensemencer des
précise, chronologique, reproductible et permettre l’isolement liquides profonds habituellement stériles (liquide céphalorachi-
du plus grand nombre de champignons, puis leur identification. dien, liquide articulaire, liquide péritonéal, divers liquides de
En effet, il est souvent difficile d’effectuer, sur un même milieu, collections non purulentes).
à la fois l’isolement et l’identification d’un champignon. D’où
la nécessité d’utiliser à bon escient un certain nombre de
milieux disponibles (ou non) sur le marché.
Milieux pour dermatophytes
Dans la plupart des cas, l’analyse mycologique comporte deux Dans la mesure où le temps de culture des dermatophytes est
temps : l’isolement puis l’identification. long, de quelques jours à plusieurs semaines, l’ensemencement
Récemment sont apparus, pour les levures, des milieux se fait préférentiellement sur gélose inclinée en tube, pour
permettant l’identification immédiate de certaines espèces, dès limiter la dessiccation de la gélose.
leur isolement. Les milieux les plus utilisés pour leurs isolements sont les :

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• milieu de Sabouraud + antibiotique (chloramphénicol +++ ) ; Pour les milieux pour automate, le flacon est ensemencé au
• milieu de Sabouraud + antibiotique + actidione. lit du malade.
Pour limiter le développement de bactéries présentes dans le Il n’est pas pratiqué d’examen direct des prélèvements
produit de prélèvement qui peuvent, par leur présence ou leur sanguins lors de la mise en culture.
abondance, gêner, modifier ou limiter le développement de la Les hémocultures sont mises en étuve à 37 °C ou en armoire
flore fongique, l’utilisation d’un milieu contenant des antibio- thermostatée du système d’automate disponible.
tiques est préconisé.
L’ensemencement sur milieu contenant de l’actidione (cyclo- Dermatophytes
heximide) permet d’inhiber un certain nombre de champignons Les squames et les ongles sont dilacérés en petits fragments
saprophytes. En effet, les prélèvements provenant de la peau et puis ensemencés en quinconce sur le milieu utilisé au labora-
des phanères sont très souvent porteurs de spores telluriques ou toire. Le choix des cheveux à ensemencer est fonction de la
de l’environnement. Il arrive fréquemment que, lors de leur clinique et souvent basé sur la taille des cheveux prélevés
mise en culture, ces spores environnementales se développent (cheveux cassés, courts).
plus rapidement que le dermatophyte suspecté, sur ces milieux L’examen direct est systématique et primordial. Plusieurs
favorables au développement de n’importe quel champignon. techniques sont possibles (KOH, lactophénol).
Leur développement peut donc gêner, limiter, recouvrir ou Les ensemencements sont mis à 25-27 °C ou à défaut laissés
même inhiber le développement d’un dermatophyte. La majo- à la température du laboratoire. Une température supérieure à
rité des dermatophytes est peu sensible à l’actidione. Les 30 °C peut limiter ou inhiber la pousse des champignons se
milieux contenant de l’actidione permettent d’obtenir une développant sur la peau.
sélection entre les dermatophytes et les moisissures contami-
nant les cultures, regroupées sous le terme générique de Autres prélèvements
contaminants (de cultures).
Il existe d’autres milieux d’isolement qui peuvent être utilisés Que le prélèvement soit liquide, filant ou solide, le milieu en
en fonction des signes cliniques ou des résultats de l’examen usage au laboratoire est ensemencé.
direct (ex. milieu cœur-cerveau pour Trichophyton verrucosum). La Il n’y a pas de standardisation de l’inoculum en mycologie
culture se fait à une température préférentielle de 25 °C. médicale, sauf pour les urines où un comptage de germes peut
être effectué.
L’ensemencement réalisé, un examen direct est effectué. On
Milieux pour les autres produits peut se contenter d’un simple dépôt entre lame et lamelle. En
Dans bon nombre de laboratoires en France, le milieu de général on ajoute un colorant pour mieux visualiser les élé-
Sabouraud additionné d’antibiotiques (et d’actidione) reste le ments fongiques présents. La lecture de l’examen direct n’est
milieu le plus utilisé. pas toujours aisée et peut, dans certaines préparations, soulever
Il est coulé en gélose inclinée en tubes cotonnés ou à vis, ou des doutes quant aux éléments d’allure fongique retrouvés. Ne
en boîtes de Petri de ∅ 5 cm ou ∅ 9 cm. L’utilisation de milieux répondre d’un examen direct que si l’on est certain de l’identi-
en tube a l’avantage de limiter les contaminations environne- fication des éléments fongiques visualisés. En cas de doute,
mentales lors de l’ensemencement et de permettre une conser- plutôt répondre par défaut que par excès. Malgré la fréquence
vation des cultures plusieurs mois. Le stockage est aussi facilité. des levures retrouvées en culture, l’examen direct reste souvent
L’utilisation de boîtes, bien plus aisée que les tubes lors des négatif.
manipulations ultérieures des souches, présente cependant Les cultures sont mises à 25-27 °C pour les ensemencements
quelques inconvénients : dessiccation rapide en étuve des sur milieu de Sabouraud. Pour les milieux contenant un substrat
boîtes, contamination environnementale plus fréquente de par colorimétrique ou enzymatique, la culture se fait à 35-37 °C.
la surface exposée, problème de stockage et numérotation En règle générale, tout examen direct positif doit être signalé
double (sur couvercle et base). au clinicien. Au vu du contexte clinique et de ce résultat, il peut
Depuis une bonne dizaine d’années sont apparus sur le démarrer un traitement sans attendre l’isolement du champi-
marché des milieux enzymatiques, appelés aussi milieux sélectifs gnon. Ce traitement pourra être modifié secondairement, en
ou milieux chromogènes. Ces milieux ont l’avantage de per- fonction de l’identification définitive du champignon. Les
mettre à la fois : examens directs négatifs peuvent ne pas être notifiés, sauf si
• l’isolement de toutes les levures ; l’isolement doit prendre plusieurs jours (dermatophytes par
• l’isolement des champignons filamenteux ; exemple).
• l’identification rapide de Candida albicans et l’orientation
diagnostique vers d’autres espèces (C. tropicalis, C. glabrata).
Ces milieux sont de plus en plus utilisés.
■ Lecture des cultures d’isolement
La culture sur milieux traditionnels se fait surtout à 25-27 °C, Les lectures se font si possible sous hotte à flux laminaire
mais requiert, pour le virage colorimétrique des milieux sélectifs, pour éviter des contaminations environnementales des souches
une température de 35-37 °C. isolées ou inversement des disséminations vers
Si l’examen direct du produit met en évidence des éléments l’environnement.
fongiques (levures, filaments, ...) une réponse, pouvant com- Hormis les champignons filamenteux, le risque de contami-
porter une indication semi-quantitative des éléments retrouvés, nation du manipulateur lors de la manipulation des tubes ou
est adressée au prescripteur. des boîtes de culture est minime. Le port de gants ou de sarrau
n’est pas indispensable, la blouse étant suffisante. Se méfier
cependant des aérosols générés lors de l’ouverture du support de
■ Ensemencement des cultures culture. Il ne faut jamais renifler un tube ou une boîte.
sur milieux d’isolement Hémocultures
Pour des raisons de gains de temps, l’ensemencement d’un La lecture des hémocultures ensemencées sur milieux dipha-
produit se fait en même temps que la confection de l’examen siques ou de type Castaneda est manuelle. Elles sont lues tous
direct. Le manipulateur porte des gants et un sarrau ou une les jours, durant au moins 8 jours et sont souvent conservées
surblouse. une quinzaine de jours.
La lecture des hémocultures sur automate est fonction du
programme et des capacités de l’appareil. Elles sont conservées
Hémocultures une semaine en général.
Sur milieux de Sabouraud ou de Castaneda, l’ensemencement En cas de positivité, la mise en évidence d’éléments fongiques
se fait soit au moyen de la seringue ayant servi au prélèvement par examen direct du milieu de culture est un préalable indis-
soit par ensemencement secondaire à partir d’un vacutainer. pensable à toute identification.

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Toute hémoculture positive entre immédiatement en proto- (ex. milieu au malt ou de Czapek pour l’identification d’un
cole d’identification et le service clinique est prévenu de la Aspergillus spp. mal formé sur le milieu d’isolement).
positivité. Quelques gouttes de l’hémoculture positive sont
ensemencées sur milieu d’isolement pour levures. Après déve- Dermatophytes
loppement, identification selon le protocole du laboratoire.
Pour la majorité des dermatophytes, des subcultures sur
différents milieux sont nécessaires en fonction de la macrosco-
Dermatophytes pie de la culture et des caractères microscopiques.
Les cultures de dermatophytes sont lues régulièrement, si L’identification d’un dermatophyte repose sur :
possible deux fois par semaine. Il est important de noter les • l’examen entre lame et lamelle d’un fragment de colonie (ou
caractères de développement macroscopique qui évoluent au fil par la technique du drapeau) avec adjonction de lactophénol
du temps. Dès que la souche s’est suffisamment développée (et incolore ou additionné de bleu. Elle permet, à partir d’une
si l’identification microscopique n’est pas possible sur le milieu colonie parvenue à maturité, de rechercher les éléments
d’isolement), ensemencer des milieux d’identification en caractéristiques d’une espèce, tels : macroconidies, microco-
fonction des caractères culturaux relevés (Cf. infra). nidies, chlamydospores et autres ornementations. L’examen
En cas de négativité, les tubes de culture sont conservés au direct de la culture est insuffisant si le mycélium est pauvre,
moins 1 mois (souvent 6 semaines à 2 mois) avant d’être atypique et de façon générale pour de nombreux dermato-
éliminés, certains dermatophytes étant de développement lent. phytes qui ne produisent leurs fructifications que sur milieux
spécifiques ;
Autres ensemencements • un repiquage sur milieux spécifiques, en réalisant parfois une
palette de repiquages, permet d’obtenir un diagnostic défini-
Les cultures peuvent se lire dès la 24e heure, en particulier tif :
pour les isolats de C. albicans sur milieux sélectifs. C milieux chromogènes : à l’urée, au bromocrésol pourpre ou
Mais il faut privilégier une lecture à 48 heures. En effet, le
agar Tween 80 ;
turn-over de certaines souches de levures est relativement lent.
C milieux favorisant la production de fructifications : eau
Pour obtenir un recrutement optimal, la lecture à 48 heures est
gélosée à 2 %, Sabouraud dilué, malt à 3 %, Baxter, Borelli,
recommandée. Bien regarder la macroscopie des colonies de
levures qui se sont développées. Se baser sur cette morphologie cœur-cerveau ;
pour effectuer des repiquages sur milieux d’identification. C milieux avec apports nutritifs particuliers : thiamine,
Conserver ces milieux d’isolement lus, pendant 8 à 15 jours. inositol, acide nicotinique, nitrate d’ammonium.
Les relire avant élimination.
Quel que soit le milieu d’isolement, dans la majorité des cas, Levures
les levures ne peuvent pas être identifiées à leur isolement. Il Les levures sont le « pain quotidien » d’un laboratoire de
faut passer par des tests rapides ou des subcultures sur milieu mycologie. De nombreux moyens d’identification sont mis à la
d’identification pour les identifier. disposition des biologistes pour leur identification. Il ne faut
Un grand nombre de champignons filamenteux peut être cependant pas croire que leur identification est toujours aisée.
identifié par prélèvement direct de la culture d’isolement (carré Bien au contraire, c’est pour ces identifications que l’on
de gélose ou technique du drapeau), puis lecture entre lame et rencontre le plus de problèmes.
lamelle. Dans certains cas, un repiquage sur milieux d’identifi- Il est indispensable de disposer d’une méthodologie d’identi-
cation est indispensable pour préciser les caractères fication bien codifiée.
microscopiques. Les critères d’identification sont à la fois morphologiques et
Toute identification immédiate et définitive, dès la culture, physiologiques.
doit faire l’objet d’une réponse. Deux notions sont importantes à préciser :
Une réponse intermédiaire, en particulier s’il n’y a pas eu de • C. albicans est la levure la plus fréquemment isolée chez
réponse lors d’un examen direct négatif, faisant état de l’isole- l’homme (en moyenne 75 %, tous prélèvements confondus) ;
ment de levures ou de champignon filamenteux, peut s’avérer • les associations de levures peuvent s’évaluer entre 15 et 25 %
bénéfique pour le traitement du patient. Le clinicien pourra des isolements. L’utilisation des techniques d’identification
initialiser un traitement au vu de ces résultats, sans attendre rapide doit tenir compte de ce paramètre si l’on choisit de les
l’identification définitive. employer. Une seule composante du mélange de levure risque
d’être identifiée !
C. albicans doit être identifié en première intention, selon des
■ Identification des isolats [6-12]
techniques codifiées. Pour les autres espèces, dites « non
albicans », il est impératif de procéder en deux étapes, l’identi-
Si lors de leur isolement les souches fongiques ne peuvent
fication du genre puis de l’espèce.
être immédiatement identifiées, il faut avoir recours à des tests
d’identification rapide ou à un repiquage sur milieu Identification après isolement sur milieux
d’identification. de Sabouraud
Pour les champignons filamenteux, comme pour les derma-
tophytes et les levures, des protocoles d’identification précis L’isolement a permis d’obtenir des levures. Il faut les
sont mis en place. identifier.
Méthodes d’identification rapide
Champignons filamenteux Filamentation en sérum (test de blastèse, de germination, de
Ils sont très souvent identifiés dès leur isolement par examen Taschdjian) : une pointe de pipette Pasteur de la culture est
direct de la culture. Un prélèvement par la technique du déposée dans du sérum et mise à 37 °C. Moins de 3 heures
drapeau suffit la plupart du temps à leur identification. L’aspect après, s’il s’agit de C. albicans, apparaît une germination d’une
macroscopique (couleur, mode de développement, vitesse de partie des levures.
pousse, ...) peut aussi orienter le diagnostic. Inconvénients :
Sur des cultures plus anciennes, souvent très sporifères, un • certaines souches de C. tropicalis peuvent présenter un début
prélèvement d’un morceau de culture avec un peu de gélose, de filamentation ;
écrasé entre lame et lamelle, s’avère dans certains cas plus • les associations de levures sont très difficilement visibles par
informatif. Il est important de visualiser l’ensemble des caractè- cette technique.
res qui permettront une identification du genre et de l’espèce, Galeries d’identifications rapides : il existe différentes techni-
en faisant bien apparaître la conidiogenèse sur la préparation. ques qui permettent une identification immédiate ou en
Dans certains cas il devra être procédé à un repiquage du quelques heures de certaines espèces. Elles sont soit enzymati-
filamenteux sur un milieu plus approprié à son identification ques (Fongiscreen 4H®, Biorad), soit des tests au latex basés sur

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des réactions d’anticorps monoclonaux (Krusei-Color® pour Il ne reste plus qu’à identifier les isolats qui ne présentent pas
l’identification de C. krusei ou Bichro-Latex-Albicans® pour les critères d’identification de C. albicans, en suivant le même
l’identification de C. albicans, Fumouze). protocole que précédemment.
Test de détection de la théhalase : il permet d’identifier Après identification des isolats, une réponse écrite doit être
rapidement C. glabrata. faite au praticien demandeur. Elle peut faire mention de
l’abondance de l’isolement. Un commentaire peut accompagner
Diagnostic de genre cette réponse.
Pour l’analyse des caractères morphologiques microscopiques, Dans certains cas (hémoculture positive, isolement d’un
dont en particulier la recherche d’une pseudofilamentation ou Cryptococcus neoformans, mise en évidence de filaments mycé-
d’une chlamydosporulation : liens dans des prélèvements d’origine pulmonaire), une réponse
• sur milieu RAT (Riz-Agar-Tween 80), en boîte de Petri de ∅ 5, immédiate doit être faite au clinicien. Elle se fait en général par
mise à l’étuve à 27 °C avec lecture à 24 h et/ou 48 h ; téléphone ou par fax mais doit obligatoirement être suivie d’une
• sur milieu PCB (pomme de terre-carottes-bile), en tube, en réponse écrite.
boîte de Petri de ∅ 5 ou sur lame, mise à l’étuve à 27 °C avec
lecture à 24 h et à 48 h.
Pour C. albicans on obtiendra une pseudofilamentation et des ■ Références
chlamydospores caractéristiques permettant d’affirmer le [1] Hazen KC. New and emerging yeast pathogens. Clin Microbiol Rev
diagnostic. En cas de levures « non albicans », la morphologie 1995;8:462-78.
oriente vers un diagnostic de genre (présence ou absence de [2] Barnett JA, Payne RW, Yarrow D. Yeasts: characteristics and identifi-
pseudofilamentation, taille, type de filamentation). cation. Cambridge: University Press, Cambridge; 1983 (1002p).
[3] Kurtzman CP, Fell JW. The Yeasts: a taxonomic study. Amsterdam:
Diagnostic d’espèces
Elsevier; 1998 (1055p).
Il ne doit et ne peut être posé qu’après avoir effectué un [4] Koenig H. Guide de mycologie médicale. Paris: Ellipses; 1995 (284p).
diagnostic morphologique de genre. [5] De Hoog GS, Guarro J, Gene J, Figtueras MJ. Atlas of clinical fungi.
Ce diagnostic d’espèces de levures autres que C. albicans est Utrecht: CBS; 2000 (1126p).
fait actuellement sur des galeries d’identification dites physio- [6] Lin CC, Fung DY. Conventional and rapid methods for yeast identifi-
logiques. Les plus utilisées sont : ATB ID 32 C et ApiCandida® cation. CRC Crit Rev Microbiol 1987;14:273-89.
(bioMérieux) Auxacolor ® (BioRad), Fongiscreen ® (BioRad), [7] Pfaller MA, Houston A, Coffmann S. Application of CHROM agar
RapID Yeast Plus system ® (Innovative Diagnostic System, Candida for rapid screening of Clinical specimens for Candida
albicans, C. tropicalis, C. krusei and C. (Torulopsis) glabrata. J Clin
Norcross, GA), VITEK YBC system® (bioMérieux) ou VITECK
Microbiol 1996;34:58-61.
2 ID-YST system® (bioMérieux), Fungichrom® (International
[8] Schuffeneeker J, Freydiere A, De Montclos H, Gille Y. Evaluation of
Microbio). four commercial systems for identification of medically important
Ces galeries reposent sur l’utilisation de différents sucres et de yeasts. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1993;12:255-60.
quelques autres paramètres propres à chacune des galeries. [9] Quindos G, Lipperheide V, Ponton J. Evaluation of two commercialized
Il est impératif d’ensemencer ces galeries d’identification à systems for the rapid identification important yeasts. Mycoses 1993;36:
partir de souches pures, monospécifiques. La présence dans 299-303.
l’inoculum d’une association de levures ou de germes va [10] Fenn JP, Segal H, Barland B, Denton D, Whisenant J, Chun H, et al.
interférer avec l’utilisation des sucres et peut donner un résultat Comparison of updated vitek yeast biochemical card andAPI 20C yeast
inexact qui aboutit à une identification erronée. Seule une identification system. J Clin Microbiol 1994;32:1184-7.
lecture préalable sur milieu d’identification peut éviter cet [11] Fricker-Hidalgo H, Vandapel O, Duchesne MA, Mazoyer MA,
écueil. Monget D, Lardy B, et al. Comparison of the new API Candida system
to the ID 32C system for identification of clinically important yeast
Identification après isolement sur milieu sélectif species. J Clin Microbiol 1996;34:1846-8.
[12] Campbell CK, Davey KG, Holmes AD, Szekely A, Warnock DW.
L’avantage des milieux chromogènes est de permettre à la fois Comparison of the API Candida system with the AUXACOLOR
l’isolement des levures et l’identification concomitante de C. system for identification of common yeast pathogens. J Clin Microbiol
albicans. 1999;37:821-3.

J. Waller, Médecin Biologiste, Maître de conférences des Universités, praticien hospitalier (jocelyn.waller@medecine.u-strasbg.fr).
Université Louis-Pasteur, Faculté de Médecine, Institut de Parasitologie et Pathologie Tropicale de Strasbourg, 3, rue Koeberlé, 67000 Strasbourg, France.

Toute référence à cet article doit porter la mention : Waller J. Cultures en mycologie médicale. EMC (Elsevier Masson SAS, Paris), Encyclopédie
Médico-Biologique, 90-60-0060, 2006.

Disponibles sur www.emc-consulte.com


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