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¶ 90-60-0060 Cultures en mycologie médicale J. Waller Les laboratoires effectuant des analyses de mycologie

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Cultures en mycologie médicale

J. Waller

Les laboratoires effectuant des analyses de mycologie médicale doivent s’astreindre à choisir et à respecter un protocole d’isolement et d’identification rigoureux, tant analytique que diagnostique. La mise en culture de produits d’origine humaine, animale ou environnementale est la base de l’isolement et de l’identification de champignons, potentiellement pathogènes. En fonction du prélèvement, un choix du milieu d’isolement est nécessaire. Dans un certain nombre de cas, le recours à des milieux d’identification est indispensable.

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Mots clés : Levures ; Champignons filamenteux ; Milieux de culture ; Milieux d’identification ; Protocole de laboratoire

Plan

Introduction

Choix du milieu en fonction du prélèvement Milieux pour hémocultures Milieux pour dermatophytes Milieux pour les autres produits

Ensemencement des cultures sur milieux d’isolement Hémocultures Dermatophytes Autres prélèvements

Lecture des cultures d’isolement Hémocultures Dermatophytes Autres ensemencements

Identification des isolats Champignons filamenteux Dermatophytes Levures

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Introduction

La recherche d’agents fongiques d’origine humaine, animale ou environnementale se fait par mise en culture de différents types de prélèvements sur des milieux favorables à leur développement [1-5] . Elle nécessite une méthodologie de laboratoire qui doit être précise, chronologique, reproductible et permettre l’isolement du plus grand nombre de champignons, puis leur identification. En effet, il est souvent difficile d’effectuer, sur un même milieu, à la fois l’isolement et l’identification d’un champignon. D’où la nécessité d’utiliser à bon escient un certain nombre de milieux disponibles (ou non) sur le marché. Dans la plupart des cas, l’analyse mycologique comporte deux temps : l’isolement puis l’identification. Récemment sont apparus, pour les levures, des milieux permettant l’identification immédiate de certaines espèces, dès leur isolement.

Dans la mesure des moyens disponibles, il est souhaitable de travailler le plus stérilement possible, lors de l’ensemencement ; entre deux becs bunsen au minimum, sous hotte à flux lami- naire (poste de sécurité microbiologique), idéalement. Des mesures de protection de la personne chargée de l’ense-

mencement des milieux sont à prévoir (gants, sarrau,

Un examen direct est réalisé conjointement à l’ensemence- ment du produit.

).

Choix du milieu en fonction du prélèvement

On peut distinguer trois types de milieux d’isolement, en fonction du prélèvement :

• milieux pour hémocultures (prélèvements de sang) ;

• milieux pour dermatophytes (prélèvements d’origine cuta- née) ;

• milieux pour les autres produits (prélèvements d’autres origines).

Milieux pour hémocultures

Il existe de nombreux milieux pour hémocultures, mais la tendance actuelle est au suivi des hémocultures sur automates.

• Milieu type Castaneda.

• Milieu de Sabouraud diphasique.

• Milieux pour automates (mis à la disposition par les fabri- cants d’automates). La culture se fait en étuve réglée à 35-37 °C. Sur ces milieux, il est aussi concevable d’ensemencer des liquides profonds habituellement stériles (liquide céphalorachi- dien, liquide articulaire, liquide péritonéal, divers liquides de collections non purulentes).

Milieux pour dermatophytes

Dans la mesure où le temps de culture des dermatophytes est long, de quelques jours à plusieurs semaines, l’ensemencement se fait préférentiellement sur gélose inclinée en tube, pour limiter la dessiccation de la gélose. Les milieux les plus utilisés pour leurs isolements sont les :

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• milieu de Sabouraud + antibiotique (chloramphénicol +++ ) ;

• milieu de Sabouraud + antibiotique + actidione. Pour limiter le développement de bactéries présentes dans le produit de prélèvement qui peuvent, par leur présence ou leur abondance, gêner, modifier ou limiter le développement de la flore fongique, l’utilisation d’un milieu contenant des antibio- tiques est préconisé. L’ensemencement sur milieu contenant de l’actidione (cyclo- heximide) permet d’inhiber un certain nombre de champignons saprophytes. En effet, les prélèvements provenant de la peau et des phanères sont très souvent porteurs de spores telluriques ou de l’environnement. Il arrive fréquemment que, lors de leur mise en culture, ces spores environnementales se développent plus rapidement que le dermatophyte suspecté, sur ces milieux favorables au développement de n’importe quel champignon. Leur développement peut donc gêner, limiter, recouvrir ou même inhiber le développement d’un dermatophyte. La majo- rité des dermatophytes est peu sensible à l’actidione. Les milieux contenant de l’actidione permettent d’obtenir une sélection entre les dermatophytes et les moisissures contami- nant les cultures, regroupées sous le terme générique de contaminants (de cultures). Il existe d’autres milieux d’isolement qui peuvent être utilisés en fonction des signes cliniques ou des résultats de l’examen direct (ex. milieu cœur-cerveau pour Trichophyton verrucosum). La culture se fait à une température préférentielle de 25 °C.

Milieux pour les autres produits

Dans bon nombre de laboratoires en France, le milieu de Sabouraud additionné d’antibiotiques (et d’actidione) reste le milieu le plus utilisé. Il est coulé en gélose inclinée en tubes cotonnés ou à vis, ou en boîtes de Petri de 5 cm ou 9 cm. L’utilisation de milieux en tube a l’avantage de limiter les contaminations environne- mentales lors de l’ensemencement et de permettre une conser-

vation des cultures plusieurs mois. Le stockage est aussi facilité. L’utilisation de boîtes, bien plus aisée que les tubes lors des manipulations ultérieures des souches, présente cependant quelques inconvénients : dessiccation rapide en étuve des boîtes, contamination environnementale plus fréquente de par la surface exposée, problème de stockage et numérotation double (sur couvercle et base). Depuis une bonne dizaine d’années sont apparus sur le marché des milieux enzymatiques, appelés aussi milieux sélectifs ou milieux chromogènes. Ces milieux ont l’avantage de per- mettre à la fois :

• l’isolement de toutes les levures ;

• l’isolement des champignons filamenteux ;

• l’identification rapide de Candida albicans et l’orientation diagnostique vers d’autres espèces (C. tropicalis, C. glabrata ). Ces milieux sont de plus en plus utilisés.

La culture sur milieux traditionnels se fait surtout à 25-27 °C, mais requiert, pour le virage colorimétrique des milieux sélectifs, une température de 35-37 °C. Si l’examen direct du produit met en évidence des éléments

fongiques (levures, filaments,

) une réponse, pouvant com-

porter une indication semi-quantitative des éléments retrouvés, est adressée au prescripteur.

Ensemencement des cultures sur milieux d’isolement

Pour des raisons de gains de temps, l’ensemencement d’un produit se fait en même temps que la confection de l’examen direct. Le manipulateur porte des gants et un sarrau ou une surblouse.

Hémocultures

Sur milieux de Sabouraud ou de Castaneda, l’ensemencement se fait soit au moyen de la seringue ayant servi au prélèvement soit par ensemencement secondaire à partir d’un vacutainer.

Pour les milieux pour automate, le flacon est ensemencé au lit du malade. Il n’est pas pratiqué d’examen direct des prélèvements sanguins lors de la mise en culture. Les hémocultures sont mises en étuve à 37 °C ou en armoire thermostatée du système d’automate disponible.

Dermatophytes

Les squames et les ongles sont dilacérés en petits fragments puis ensemencés en quinconce sur le milieu utilisé au labora- toire. Le choix des cheveux à ensemencer est fonction de la clinique et souvent basé sur la taille des cheveux prélevés (cheveux cassés, courts). L’examen direct est systématique et primordial. Plusieurs techniques sont possibles (KOH, lactophénol). Les ensemencements sont mis à 25-27 °C ou à défaut laissés à la température du laboratoire. Une température supérieure à 30 °C peut limiter ou inhiber la pousse des champignons se développant sur la peau.

Autres prélèvements

Que le prélèvement soit liquide, filant ou solide, le milieu en usage au laboratoire est ensemencé. Il n’y a pas de standardisation de l’inoculum en mycologie médicale, sauf pour les urines où un comptage de germes peut être effectué. L’ensemencement réalisé, un examen direct est effectué. On peut se contenter d’un simple dépôt entre lame et lamelle. En général on ajoute un colorant pour mieux visualiser les élé- ments fongiques présents. La lecture de l’examen direct n’est pas toujours aisée et peut, dans certaines préparations, soulever des doutes quant aux éléments d’allure fongique retrouvés. Ne répondre d’un examen direct que si l’on est certain de l’identi- fication des éléments fongiques visualisés. En cas de doute, plutôt répondre par défaut que par excès. Malgré la fréquence des levures retrouvées en culture, l’examen direct reste souvent négatif. Les cultures sont mises à 25-27 °C pour les ensemencements sur milieu de Sabouraud. Pour les milieux contenant un substrat colorimétrique ou enzymatique, la culture se fait à 35-37 °C. En règle générale, tout examen direct positif doit être signalé au clinicien. Au vu du contexte clinique et de ce résultat, il peut démarrer un traitement sans attendre l’isolement du champi- gnon. Ce traitement pourra être modifié secondairement, en fonction de l’identification définitive du champignon. Les examens directs négatifs peuvent ne pas être notifiés, sauf si l’isolement doit prendre plusieurs jours (dermatophytes par exemple).

Lecture des cultures d’isolement

Les lectures se font si possible sous hotte à flux laminaire pour éviter des contaminations environnementales des souches isolées ou inversement des disséminations vers l’environnement. Hormis les champignons filamenteux, le risque de contami- nation du manipulateur lors de la manipulation des tubes ou des boîtes de culture est minime. Le port de gants ou de sarrau n’est pas indispensable, la blouse étant suffisante. Se méfier cependant des aérosols générés lors de l’ouverture du support de culture. Il ne faut jamais renifler un tube ou une boîte.

Hémocultures

La lecture des hémocultures ensemencées sur milieux dipha- siques ou de type Castaneda est manuelle. Elles sont lues tous les jours, durant au moins 8 jours et sont souvent conservées une quinzaine de jours. La lecture des hémocultures sur automate est fonction du programme et des capacités de l’appareil. Elles sont conservées une semaine en général. En cas de positivité, la mise en évidence d’éléments fongiques par examen direct du milieu de culture est un préalable indis- pensable à toute identification.

Toute hémoculture positive entre immédiatement en proto- cole d’identification et le service clinique est prévenu de la positivité. Quelques gouttes de l’hémoculture positive sont ensemencées sur milieu d’isolement pour levures. Après déve- loppement, identification selon le protocole du laboratoire.

Dermatophytes

Les cultures de dermatophytes sont lues régulièrement, si possible deux fois par semaine. Il est important de noter les caractères de développement macroscopique qui évoluent au fil du temps. Dès que la souche s’est suffisamment développée (et si l’identification microscopique n’est pas possible sur le milieu d’isolement), ensemencer des milieux d’identification en fonction des caractères culturaux relevés (Cf. infra). En cas de négativité, les tubes de culture sont conservés au moins 1 mois (souvent 6 semaines à 2 mois) avant d’être éliminés, certains dermatophytes étant de développement lent.

Autres ensemencements

Les cultures peuvent se lire dès la 24 e heure, en particulier pour les isolats de C. albicans sur milieux sélectifs. Mais il faut privilégier une lecture à 48 heures. En effet, le turn-over de certaines souches de levures est relativement lent. Pour obtenir un recrutement optimal, la lecture à 48 heures est recommandée. Bien regarder la macroscopie des colonies de levures qui se sont développées. Se baser sur cette morphologie pour effectuer des repiquages sur milieux d’identification. Conserver ces milieux d’isolement lus, pendan t 8 à 15 jours. Les relire avant élimination. Quel que soit le milieu d’isolement, dans la majorité des cas, les levures ne peuvent pas être identifiées à leur isolement. Il faut passer par des tests rapides ou des subcultures sur milieu d’identification pour les identifier. Un grand nombre de champignons filamenteux peut être identifié par prélèvement direct de la culture d’isolement (carré de gélose ou technique du drapeau), puis lecture entre lame et lamelle. Dans certains cas, un repiquage sur milieux d’identifi- cation est indispensable pour préciser les caractères microscopiques. Toute identification immédiate et définitive, dès la culture, doit faire l’objet d’une réponse. Une réponse intermédiaire, en particulier s’il n’y a pas eu de réponse lors d’un examen direct négatif, faisant état de l’isole- ment de levures ou de champignon filamenteux, peut s’avérer bénéfique pour le traitement du patient. Le clinicien pourra initialiser un traitement au vu de ces résultats, sans attendre l’identification définitive.

Identification des isolats [6-12]

Si lors de leur isolement les souches fongiques ne peuvent être immédiatement identifiées, il faut avoir recours à des tests d’identification rapide ou à un repiquage sur milieu d’identification. Pour les champignons filamenteux, comme pour les derma- tophytes et les levures, des protocoles d’identification précis sont mis en place.

Champignons filamenteux

Ils sont très souvent identifiés dès leur isolement par examen

direct de la culture. Un prélèvement par la technique du drapeau suffit la plupart du temps à leur identification. L’aspect macroscopique (couleur, mode de développement, vitesse de

pousse,

Sur des cultures plus anciennes, souvent très sporifères, un prélèvement d’un morceau de culture avec un peu de gélose, écrasé entre lame et lamelle, s’avère dans certains cas plus informatif. Il est important de visualiser l’ensemble des caractè- res qui permettront une identification du genre et de l’espèce, en faisant bien apparaître la conidiogenèse sur la préparation. Dans certains cas il devra être procédé à un repiquage du filamenteux sur un milieu plus approprié à son identification

) peut aussi orienter le diagnostic.

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(ex. milieu au malt ou de Czapek pour l’identification d’un Aspergillus spp. mal formé sur le milieu d’isolement).

Dermatophytes

Pour la majorité des dermatophytes, des subcultures sur différents milieux sont nécessaires en fonction de la macrosco- pie de la culture et des caractères microscopiques. L’identification d’un dermatophyte repose sur :

• l’examen entre lame et lamelle d’un fragment de colonie (ou par la technique du drapeau) avec adjonction de lactophénol incolore ou additionné de bleu. Elle permet, à partir d’une colonie parvenue à maturité, de rechercher les éléments caractéristiques d’une espèce, tels : macroconidies, microco-

nidies, chlamydospores et autres ornementations. L’examen direct de la culture est insuffisant si le mycélium est pauvre, atypique et de façon générale pour de nombreux dermato- phytes qui ne produisent leurs fructifications que sur milieux spécifiques ;

• un repiquage sur milieux spécifiques, en réalisant parfois une palette de repiquages, permet d’obtenir un diagnostic défini- tif :

C

milieux chromogènes : à l’urée, au bromocrésol pourpre ou agar Tween 80 ;

C

milieux favorisant la production de fructifications : eau gélosé e à 2 %, Sabouraud dilué, mal t à 3 %, Baxter, Borelli, cœur-cerveau ;

C

milieux avec apports nutritifs particuliers : thiamine, inositol, acide nicotinique, nitrate d’ammonium.

Levures

Les levures sont le « pain quotidien » d’un laboratoire de mycologie. De nombreux moyens d’identification sont mis à la

disposition des biologistes pour leur identification. Il ne faut cependant pas croire que leur identification est toujours aisée. Bien au contraire, c’est pour ces identifications que l’on rencontre le plus de problèmes. Il est indispensable de disposer d’une méthodologie d’identi- fication bien codifiée. Les critères d’identification sont à la fois morphologiques et physiologiques. Deux notions sont importantes à préciser :

C.

albicans est la levure la plus fréquemment isolée chez

l’homme (en moyenne 75 %, tous prélèvements confondus) ;

les associations de levures peuvent s’évaluer entre 15 et 25 %

des isolements. L’utilisation des techniques d’identification

rapide doit tenir compte de ce paramètre si l’on choisit de les employer. Une seule composante du mélange de levure risque d’être identifiée !

C. albicans doit être identifié en première intention, selon des

techniques codifiées. Pour les autres espèces, dites « non albicans », il est impératif de procéder en deux étapes, l’identi- fication du genre puis de l’espèce.

Identification après isolement sur milieux de Sabouraud

L’isolement a permis d’obtenir des levures. Il faut les identifier.

Méthodes d’identification rapide

Filamentation en sérum (test de blastèse, de germination, de Taschdjian) : une pointe de pipette Pasteur de la culture est déposée dans du sérum et mise à 37 °C. Moins de 3 heures après, s’il s’agit de C. albicans , apparaît une germination d’une partie des levures. Inconvénients :

• certaines souches de C. tropicalis peuvent présenter un début de filamentation ;

• les associations de levures sont très difficilement visibles par cette technique. Galeries d’identifications rapides : il existe différentes techni- ques qui permettent une identification immédiate ou en quelques heures de certaines espèces. Elles sont soit enzymati- ques (Fongiscreen 4H ® , Biorad), soit des tests au latex basés sur

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des réactions d’anticorps monoclonaux (Krusei-Color ® pour l’identification de C. krusei ou Bichro-Latex-Albicans ® pour l’identification de C. albicans, Fumouze). Test de détection de la théhalase : il permet d’identifier rapidement C. glabrata .

Diagnostic de genre

Pour l’analyse des caractères morphologiques microscopiques, dont en particulier la recherche d’une pseudofilamentation ou d’une chlamydosporulation :

• sur milieu RAT (Riz-Agar-Tween 80), en boîte de Petri de 5, mise à l’étuve à 27 °C avec lecture à 24 h et/ou 48 h ;

• sur milieu PCB (pomme de terre-carottes-bile), en tube, en boîte de Petri de 5 ou sur lame, mise à l’étuve à 27 °C avec lecture à 24 h et à 48 h. Pour C. albicans on obtiendra une pseudofilamentation et des chlamydospores caractéristiques permettant d’affirmer le diagnostic. En cas de levures « non albicans », la morphologie oriente vers un diagnostic de genre (présence ou absence de pseudofilamentation, taille, type de filamentation).

Diagnostic d’espèces

Il ne doit et ne peut être posé qu’après avoir effectué un diagnostic morphologique de genre. Ce diagnostic d’espèces de levures autres que C. albicans est fait actuellement sur des galeries d’identification dites physio- logiques. Les plus utilisées sont : ATB ID 32 C et ApiCandida ® (bioMérieux) Auxacolor ® (BioRad), Fongiscreen ® (BioRad), RapID Yeast Plus system ® (Innovative Diagnostic System, Norcross, GA), VITEK YBC system ® (bioMérieux) ou VITECK 2 ID-YST system ® (bioMérieux), Fungichrom ® (International Microbio). Ces galeries reposent sur l’utilisation de différents sucres et de quelques autres paramètres propres à chacune des galeries. Il est impératif d’ensemencer ces galeries d’identification à partir de souches pures, monospécifiques. La présence dans l’inoculum d’une association de levures ou de germes va interférer avec l’utilisation des sucres et peut donner un résultat inexact qui aboutit à une identification erronée. Seule une lecture préalable sur milieu d’identification peut éviter cet écueil.

Identification après isolement sur milieu sélectif

L’avantage des milieux chromogènes est de permettre à la fois l’isolement des levures et l’identification concomitante de C. albicans .

Il ne reste plus qu’à identifier les isolats qui ne présentent pas les critères d’identification de C. albicans , en suivant le même protocole que précédemment. Après identification des isolats, une réponse écrite doit être faite au praticien demandeur. Elle peut faire mention de l’abondance de l’isolement. Un commentaire peut accompagner cette réponse. Dans certains cas (hémoculture positive, isolement d’un Cryptococcus neoformans, mise en évidence de filaments mycé- liens dans des prélèvements d’origine pulmonaire), une réponse immédiate doit être faite au clinicien. Elle se fait en général par téléphone ou par fax mais doit obligatoirement être suivie d’une réponse écrite.

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J. Waller, Médecin Biologiste, Maître de conférences des Universités, praticien hospitalier (jocelyn.waller@medecine.u-strasbg.fr). Université Louis-Pasteur, Faculté de Médecine, Institut de Parasitologie et Pathologie Tropicale de Strasbourg, 3, rue Koeberlé, 67000 Strasbourg, France.

Toute référence à cet article doit porter la mention : Waller J. Cultures en mycologie médicale. EMC (Elsevier Masson SAS, Paris), Encyclopédie Médico-Biologique, 90-60-0060, 2006.

Disponibles sur www.emc-consulte.com

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