UNIVERSIDAD EL BOSQUE

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
PROFESORA SUSANA LARA

Extracción de proteínas y determinación de la actividad enzimática de Pinca mayor y

Festuca spp.
Ardila-Higuera, Juliana ; Garnica-Henao, Gabriela

RESUMEN

Las enzimas son proteínas que tienen poder catalítico para degradar un sustrato determinado y
convertirlo en producto, y actúan bajo determinadas características de actividad enzimática;
por esto, la práctica de laboratorio se dividió en dos partes: la primera consistió en la extracción
de proteínas y la segunda en la determinación de la actividad enzimáticas de estas. Para la
primera parte, se utilizaron dos muestras vegetales ( Festuca spp y Pinca mayor), estas se
lavaron y se pesó 0,5 g de cada una, posteriormente se colocaron cada una en un mortero, y se
maceraron con cuidado, después se les agregó a cada una un buffer y estas mezclas se
trasladaron a un tubo Falcon, se llevaron a la nevera y finalmente, se centrifugaron durante 35
min, al finalizar el centrifuge se extrajo el sobrenadante de cada mezcla y se puso en un
eppendorf para guardarlas en el congelador. En esta parte se obtuvo como resultado dos
eppendorf con las muestras vegetales que se utilizaron en la segunda parte del laboratorio. La
primera parte del laboratorio se realizó con el fin de familiarizarnos con algunos metodos de
extraccion de proteinas. Para la segunda parte del laboratorio se hizo una mezcla con guayacol,
peróxido de hidrógeno y tampón fosfato, se dejó en un vaso de precipitado recubierto con
aluminio, luego se procedió a llevar las muestras generadas en la primera parte del laboratorio
junto con la del vaso de precipitado al espectrofotómetro, allí se hizo lectura de la absorbancia
durante 1 min en intervalos de 10 segundos. Estos resultados se vieron reflejados con un cambio
de coloración naranja que representa la actividad enzimática, que posteriormente se va a ver
reflejada por medio una gráfica extraída con los datos obtenidos por el espectrofotómetro.
Esta parte del laboratorio se hizo con el fin de identificar la presencia y función de las enzimas
de cada una de las muestras obtenidas.
Palabras clave: Actividad enzimática , Centrifugado, Enzima, Espectrofotómetro,
Precipitado

INTRODUCCIÓN eficaces para catalizar una gran diversidad

de reacciones químicas, ya que tienen la
Las enzimas son catalizadores de sistemas
capacidad de unirse a un gran número de
biológicos, intervienen en la
moléculas. La catálisis de las reacciones
transformación de una energía a otra. Se
tiene lugar en el centro activo de la enzima,
caracterizan principalmente por su poder
además estas estabilizan los estados de
catalítico y alta especificidad. Las enzimas
son proteínas, macromoléculas muy
transición (Berg, Stryer & Tymoczko,
2007)
La peroxidasa es una enzima que tiene una
amplia distribución en la naturaleza, esta
tiene la labor de oxidar a donadores de
hidrógeno. Esta enzima pertenece al grupo
de las oxidorreductasas, que se encargan de
catalizar un amplio rango de sustratos
orgánicos e inorgánicos, usando el peróxido
de hidrógeno para ello (Sakharov, Ardila, &
Sakharova, 1999).
La peroxidasa desempeña un papel
catalítico en el proceso de lignificación del
xilema, participan en otros procesos
fisiológicos como la superación, el
metabolismo de las auxinas, ensamblaje de
las proteínas de la pared celular, tolerancia
a sales y estrés hídrico (Matos et al., 2017).
La importancia de las proteínas y su acción
como enzimas es evidente, pues participan
en diversos procesos que ocurren en los
organismos, por ello su estudio es
indispensable. Para el estudio de estas es
indispensable su aislamiento y extracción,
en este caso, en muestras vegetales. Es por
ello que este estudio se plantea como
objetivo aplicar un método de extracción de
proteínas para posteriormente identificar la
presencia y función de la enzima
peroxidasa, a través de una prueba de
cinética enzimática.
MATERIALES Y MÉTODOS
Esta práctica de laboratorio se divide en dos
partes; la extracción de proteínas y la
determinación de la actividad enzimática.
Para la primera parte se trajeron dos
muestras vegetales diferentes (Festuca spp
y Pinca mayor), estas se lavaron, y se pesó
0,5 g de cada una, posteriormente se
pusieron cada una por aparte en un mortero
para macerarlas junto con arena fina lavada,
a cada una se le agregó Buffer citrato 1:5
P/V, se mezclaron bien y se colocaron en
tubos Falcon de 15 ml marcados, después
se llevaron a la nevera por 5 minutos y
finalmente se llevaron a centrifugar por 35
minutos a 4000 rpm, luego se sacó con
ayuda de una pipeta Pasteur el
sobrenadante, con el fin de colocar cada
sobrenadante en un tubo Eppendorf y
conservarlos en el congelador.
Para la segunda parte, inició con la
elaboración de una mezcla que contenía 5
ml de Guayacol, 2 ml de peróxido de
hidrógeno y 2,5 ml de tampón fosfato, esta
se depositó en un vaso de precipitado de 50
ml recubierto por papel aluminio, luego se
procedió a llevar las mezclas al
espectrofotómetro, allí, se calibro el
espectrofotómetro y se emplearon
Micropipetas de 100/1000 µl, con punta
azul para la mezcla del vaso precipitado y
punta amarilla para cada de las mezclas
obtenidas en la primera parte, luego se
realizó la lectura de la absorbancia a 470
nm y se hizo durante 1 minuto en intervalos
de 10 segundos para cada de las muestras.
RESULTADOS Y ANÁLISIS
Parte 1
Pinca mayor
Vi: 3 ml
Vf / sobrenadante: 1,5 ml + 0,6 ml
Volumen total : 0,9 ml
Festuca spp.
Vi: 2,5 ml
Vf / sobrenadante: 1,5 ml

Volumen total: 1 ml Parte 2

El aislamiento de proteínas inicia con la

lisis celular, pues estas se encuentran
contenidas en las células y al generar un
rompimiento de estas son liberadas al
medio haciendo más fácil el acceso a estas,
en este caso se usó el mortero, un método
de rompimiento por fricción, para ayudar al
proceso de trituración se adiciono arena,
un material abrasivo que al friccionar
facilita la liberación de las proteínas. Sin
embargo, este método no permite tener un
control total de la cantidad de fricción que
se genera y esto puede causar una elevación Figura 1. Cambio de coloración por
en la temperatura, lo cual genera calor que actividad enzimática en Festuca spp
puede alterar las proteínas a extraer
Tabla 1. Absorbancia de Festuca spp. de
(Alvarado, 2009).
10𝜇𝑙en un minuto
A su vez, es necesario congelar las muestras
después de realizar la extracción, ya que de Tiempo Absorbancia Absorbancia Absorbancia

esta forma se va a impedir una degradación

temprana de la proteína, además que 10 0,072 0,006 0,013
permite mantener la actividad enzimática
en un lapso de reposo que va a facilitar su 20 0,081 0,007 0,022

observación posterior sin cambios

30 0,091 0,010 0,029
significativos (Escorcia et al., 2009).

Luego de esto se coloca el buffer que 40 0,102 0,011 0,038

permite también que la célula termine de
vaciar su contenido y además proporciona 50 0,112 0,011 0,042

un pH adecuado para el proceso. La

60 0,122 0,013 0,047
centrifugación es un proceso que permite la
separación de materiales más grandes y Tabla 2. Absorbancia de Pinca mayor de
pesados de aquellos que son más ligeros, en 10𝜇𝑙en un minuto
el fondo del tubo quedan los materiales
como restos de células, moléculas enteras, Tiempo Absorbancia
orgánulos grandes y membranas, mientras
en en el sobrenadante quedan pequeños 10 0,011
orgánulos, proteínas, ADN y ARN
(Mendoza-Rodríguez, Sánchez, Leiva-Mora,
Acosta-Suárez, Rojas, Jiménez & Portal, 2006).
 20 0,012 0,018 0,0003

30 0,015

40 0,016

50 0,017

60 0,018

En las tablas 1 y 2 se muestra la variación Gráfica 1. Absorbancia de Pinca mayor

de la absorbancia por una unidad de tiempo en función del tiempo (s).
ocasionada por la actividad enzimática.
Para la toma de esta se utilizó un método
cinético, que nos permite medir la
absorbancia varias veces en intervalos de
tiempo definidos; que permite comprobar
que se encuentra en la zona lineal de la
curva, ideal para la determinación; si se
detectan desvíos en la linealidad.

Tabla 3. Tabla de absorbancia vs valores de

unidades de actividad enzimática.

Promedio UAE:
absorbancia Δabs/Δtiempo Gráfica 2. Absorbancia de Festuca spp. en
función del tiempo (s).

0,011 0,0011 Para la constante Vm

b : 0,0247
0,012 0,0006
1 1
0,0247: 𝑙𝑙 Vm : 0,0247
0,015 0,0005
Vm: 40,48

0,016 0,0004 Para la Km

𝑙𝑙
m : 0,0006 0,0006 : 𝑙𝑙
0,017 0,00034
𝑙𝑙
0,0006 : 40,48 Km: 0,024288

La Vmax corresponde al valor máximo al
que tiende la curva experimental, y la KM
corresponde a la concentración de sustrato
a la cual la velocidad de la reacción es la
mitad de la Vmax. De esta forma la Km
describe la velocidad de reacción de la
reacción enzimática, evidenciando la
relación enzima sustrato conforme una
unidad de tiempo específico (Johnson, K.
A., & Goody, R. S. 2011).
En las gráficas se puede observar la
velocidad de reacción como una función de
la concentración del sustrato, y brinda
información acerca de la actividad
enzimática, esta se ve representada por
medio de la absorbancia, La absorbancia
indica que tanta luz se absorbe, si el
producto absorbe luz a una longitud de
onda determinada es posible analizar la
desaparición del sustrato de acuerdo al
incremento de absorbancia (Salve, Amich,
Prieto & Casas, 1994).
Justo en el primer momento en el que se
combina el sustrato con la enzima, está
cataliza la reacción tan rápido como sea
posible dependiendo de la cantidad de
sustrato (porque la velocidad de reacción
disminuirá a cero conforme se usa el
sustrato), se podrá medir la cantidad de
producto sintetizado por unidad de tiempo
al inicio de la reacción, cuando la
concentración de producto aumenta en
forma lineal. Este valor, la cantidad de
producto sintetizado por unidad de tiempo
al inicio de la reacción, se llama Vinicial 0
para esa concentración, pero si la cantidad
de sustrato disminuye drásticamente la
velocidad de reacción también lo hará
proporcionalmente modificando la
actividad enzimática. La unidad enzimática
(UI) es la cantidad de enzima que cataliza
la transformación de 1 µmol de sustrato en
un minuto, por lo que cualquier molécula
adicional de sustrato tendrá que esperar
hasta que una enzima se desocupe, por lo
que la velocidad de reacción está limitada
por la concentración de enzima (Matute,
2006 ).
CONCLUSIONES
El proceso de extracción de enzimas se
inicia vaciando el contenido celular, por
medio de un rompimiento generado por
fricción, luego de esto las proteínas quedan
libres. Es importante generar condiciones
propicias para evitar su degradación por lo
que se adiciona el Buffer, por último la
centrifugación facilita la separación de
moléculas pesadas y livianas, dejando a
disposición las proteínas en el sobrenadante
del tubo.
La actividad enzimática se puede observar
mediante el espectrofotómetro, en donde se
mide que tanta luz se absorbe en la
reacción, esto permite saber que tanto
sustrato está desapareciendo. En este caso
la cinética enzimática observada es en el
momento de la unión enzima-sustrato.
El cambio de coloración a marrón indica la
presencia suficiente de la enzima
peroxidasa para llevar a cabo su labor de
óxido-reducción del sustrato peróxido de
hidrógeno.
El valor máximo de tendencia de la curva
experimental es de 40,48 valor que junto
con la pendiente de la gráfica permite
obtener la constante de Michaelis-Menten
que describe la velocidad en la que ocurre
la reacción enzimática que corresponde a intercelular en hojas de banano, cultivar
un valor de 0,024. ‘Grande naine’(Musa AAA). Biotecnología
Vegetal, 6(1).
REFERENCIAS
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