BIOTECNOLOGIA

UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÉ
FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN
ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
MONOGRAFÍA
“Técnicas de purificación de enzimas:
Purificación de enzimas por el método de electroforesis de proteínas”
PRESENTADO POR:
Quevedo Ipince Martha Elena del Rosario.

DEDICATORIA
Dedico este trabajo principalmente a Dios, por

haberme dado la vida y por permitirme seguir
adelante en mi formación profesional.
A mi madre por ser el pilar más importante y

por darme su cariño, apoyo y amor en cada
etapa de mi vida.
Purificación de enzimas Página 1

ÍNDICE GENERAL
1. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS………………………………………………………8
A. ESQUEMA GENERAL DE UN MÉTODO DE PURIFICACIÓN………..…9

B. RUPTURA DE LAS CÉLULAS………………………………………………..9
C. ALGUNOS METODOS DE RUPTURAS DE CÉLULAS………………..…..9
2. MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE ENZIMAS…………………...………………10
a) MOLIENDA POR ABRASIVOS……………………………………………...10

b) CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN………………………………….10
c) LARGOS PERÍODOS DE MEZCLADO…………………………………….10
d) ADICIÓN DE PERLAS DE VIDRIO DURANTE EL MEZCLADO………10
e) ENZIMAS HIDROLÍTICA……………………………………………………10
f) HOMOGENIZACIÓN (HOMOGENEIZADOR POTTER- ELVENHJEM)
g) SOLUCIONES HIPOTÓNICAS………………………………………………10
h) VIBRACIONES ULTRASÓNICAS…………………………………………..10
i) ALTERACIÓN DEL PH DE LA SOLUCIÓN………………………………10
j) SOLVENTES ORGÁNICOS………………………………………………….10
3. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS…………………………………..10
3.1.POR EL TAMAÑO DE LA MASA……………………………………………….10

3.2.POR LA CARGA…………………………………………………………………...11
3.3. POR EL CAMBIO DE SOLUBILIDAD…………………………………………12
3.4.POR SITIOS DE ENLAZAMIENTO ESPECÍFICO……………………………12
3.5.OTROS MÉTODOS DE PURIFICACIÓN…………………………………….13

4. ELECCIÓN DE LOS METODOS DE PURIFICACION…………………………...13
4.1 EL VOLUMEN DEL EXTRACTO CRUDO…………………………………..13

4.2. LA INSTRUMENTACIÓN REQUERIDA……………………………………..13
4.3. EL PERÍODO DE TIEMPO DISPONIBLE…………………………………...13
4.4. LA ECONÓMICA DEL PROCESO INVOLUCRADO……………………….13
4.5. LA PUREZA REQUERIDA……………………………………………………..13
5. TÉRMINOS RELACIONADOS CON LA PURIFICACIÓN……………………….14
5.1.RENDIMIENTO……………………………………………………………………14
5.2.ACTIVIDAD ESPECÍFICA……………………………………………………….14
5.3.FACTOR DEPURIFICACIÓN……………………………………………………14
6. DESARROLLO DE ENZAYOS………………………………………………………14
6.1.ENSAYOS CUALITATIVOS……………………………………………………..14
6.2.ENSAYOS CUANTITATIVOS……………………………………………………14
6.3.ENSAYOS CINÉTICOS…………………………………………………………...14
7. ESTABILIZACIÓN Y CRISTALIZACIÓN DE ENZIMAS………………………..14
7.1.ESTABILIZACIÓN………………………………………………………………..14
7.2.CRISTALIZACIÓN………………………………………………………………..14
8. MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE LAS ENZIMAS PURIFICADAS…………15
8.1.LA TÉCNICA MÁS EFECTIVA ES LA CRIOGÉNICA……………………….15

8.2.PRECAUCIONESPARA EL ALMACENAMIENTO…………………………...15

9. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS………………………………..15
10. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS POR EL MÉTODO DE ELECTROFORESIS DE

PROTEÍNAS……………………………………………………………………………16
10.1. REQUERIMIENTOS BÁSICOS……………………………………………....17

10.2. VISUALIZACIÓN……………………………………………………………...17
10.3. APLICACIONES……………………………………………………………….18
11. EJEMPLO DE LA UTILIZACIÓN DEL MÉTODO TRATADO………………….18
11.1. ¿POR QUÉ ES IMPORTANTE LA ELECTROFORESIS DE

PROTEÍNAS?............................................................................................................18
11.2. CUANTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA-M CON ELECTROFORESIS…19
11.3. ¿QUÉ ES UNA PROTEÍNA MONOCLONAL?..............................................20
11.4. ¿CÓMO SE EMPLEARÍA LA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS?.....21
12. CONCLUSIONES
13. GLOSARIO
14. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

LISTA DE FIGURAS
FIGURA01: Esquema general de un método de purificación………………………………...8
FIGURA 02: Esquema del depósito utilizado en una electroforesis de proteínas……….15
FIGURA 03: Representación de un resultado normal de una Electroforesis de Proteínas

Séricas…………………………………………………………………………………………..18
FIGURA 04: Estructura de las inmunoglobulinas…………………………………………...19
FIGURA. 05: Representación de un resultado anormal de una Electroforesis de Proteínas

Séricas, con células del mieloma produciendo una proteína-M, que da lugar a un pico-M en
la zona beta-2…………………………………………………………………………………....21

INTRODUCCÍON
En general, las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas,

usualmente en el interior de células que además poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar
parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas, proteínas inertes, ácidos
nucleicos, polisacáridos o lípidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces
un proceso de purificación.
Hoy en día el empleo de las enzimas en la industria con en la salud ha cobrado vital
importancia.
En la industria por cuanto la implementación de procesos tales como la clarificación e

hidrólisis enzimática representa beneficios para varios de sus sectores, entre los que se cuenta el
textil, el papelero y, de manera especial, el de alimentos (Carrera, 2003). Sin embargo, la
dificultad en el acceso a diferentes tipos de enzimas limita el uso de estos procesos en las
industrias de los países en vía de desarrollo (García y Ramírez, 2008).
En la salud se ha podido estudiar enzimas que ayudan a la detección de ciertas

enfermedades (cáncer).
El primer requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de

actividad mediante el cual pueda valorársela convenientemente. Para decidir si un paso de la
purificación tiene sentido, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas
antes y después de ese paso, y comparar los resultados de varios procedimientos posibles. Sólo
en términos cuantitativos se puede saber si se ha producido algún progreso. Puesto que una gran
parte del tiempo empleado en el aislamiento de una enzima está dedicado a determinar la
actividad de las distintas fracciones, es deseable que ésta sea una operación rápida; es preferible
sacrificar precisión por rapidez en las determinaciones.
La naturaleza del ensayo dependerá del tipo de reacción que cataliza la enzima. A veces
resultará conveniente la medición de la aparición de un producto y otras la medición de la
desaparición de sustrato.

La actividad de una enzima depende de condiciones tales como temperatura, pH,
concentración; por lo tanto es necesario especificarlas y usar las mismas condiciones para
comparar actividades. La elección del sustrato es muy importante: debe ser barato, de fácil
determinación, estable en ausencia de enzima y no sufrir reacciones laterales. Es necesario usarlo
en concentración tal que sature la enzima, de modo que la velocidad sea independiente de la
concentración de sustrato y proporcional a la cantidad de enzima.
En general, en los tejidos, una enzima puede estar presente en una proporción de 1/10 a
1/100 del material total. Es necesario definir una unidad enzimática arbitraria para poder
expresar, en forma cuantitativa, la pureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas
durante la purificación. La unidad enzimática se define en forma particular para cada reacción
según sea conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formación de una determinada
cantidad de producto (desaparición de reactivo) en un tiempo dado.
La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad específica que es el cociente de

actividad enzimática (expresada en unidades enzimáticas) y la cantidad total de proteínas.
La electroforesis es un método de separación basado en la tasa diferencial de migración

de especies cargadas al estar en un campo eléctrico de DC.
La tasa de migración
 Depende de la carga y del tamaño

 La separación se basa en explotar las diferencias en las proporciones
carga-tamaño
Es una serie de métodos muy eficientes y que dan altas resoluciones.

1. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS
Para estudiar detalladamente las propiedades de cualquier proteína es preciso

contar con una muestra homogénea que solo contenga células de un solo tipo.
Una célula tiene millones de proteínas distintas, separarlas y determinar su

estructura es extremadamente difícil.
Las técnicas de purificación se concentran en el tamaño, la carga y la polaridad,

que es donde residen las diferencias delas moléculas.
La purificación depende de lo que se va a determinar en una proteína:

 Peso molecular
 Punto isoeléctrico.
 Número de subunidades.
 Número de aminoácidos.
 Tipos de aminoácidos.
 Secuencia de aminoácidos.
El método de purificación debe ser diseñado desde el primer momento teniendo en

cuenta la cantidad de proteína que se requerirá.
Se aplican muchas técnicas para eliminar contaminantes y lograr una muestra pura
de la proteína de interés.
El porcentaje de recuperación indica cuánto de la proteína de interés se ha

conservado en cada paso.
El grado de pureza necesario dependerá del uso que se le dará a la proteína. Si el

interés está puesto en la proteína y no en el organismo que la origina pues es conveniente
buscar una fuente fácil de obtenerla, barata y que contenga dicha proteína en abundancia.

A. ESQUEMA GENERAL DE UN MÉTODO DE PURIFICACIÓN
Separacion de las celulas
Si la proteina es intracelular, ruptura

celular
Concentración
Aislamiento primario
Purificación de
alta resolución
"Pulido"
del
producto
final
Figura. 01: Esquema general de un método de purificación
B. RUPTURA DE LAS CÉLULAS
Las células o tejidos deben romperse para extraer la proteína de interés,

pero esta ruptura solo debe ser la necesaria, no excesiva para evitar la extracción
inútil de proteínas contaminantes.
C. ALGUNOS METODOS DE RUPTURAS DE CÉLULAS
 Mortereado con arena, alúmina, vidrio, carburo de silicio.

 Molinos de ruptura, por agitación con abrasivas.
 Uso de licuadoras u otros dispositivos con cuchillas.
 Congelación y descongelación.
 Descomposición explosiva.
 Aislamiento previo del organelo en que se encuentra la proteína.

2. MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE ENZIMAS
k) Molienda por abrasivos: Ruptura de la pared celular por tensión y corte (mortero
y pistilo).
l) Congelación y descongelación: La congelación causa una tensión en la
membrana celular (ruptura) y la descongelación causa la fusión del hielo
(homogenato crudo).
m) Largos períodos de mezclado: Se rompe por la colisión entre las paredes del
mezclador.
n) Adición de perlas de vidrio durante el mezclado: Amentar el esfuerzo
mecánico.
o) Enzimas hidrolítica: Las proteasas y lipasas forman poros o huecos, donde las
células y organelos rotos pueden ser puestos en solución.
p) Homogenización (Homogeneizador Potter- Elvenhjem): El tejido al ser
homogenizado es picado y mezclado (solución isotónica).
q) Soluciones hipotónicas: Las células se revientan por la absorción de agua
(hinchazón).
r) Vibraciones ultrasónicas: Alteración de las células y formación de un
homogenato.
s) Alteración del pH de la solución: Causa la coagulación de las proteínas,
formando poros, por donde las células rotas exudan un homogenato.
t) Solventes orgánicos: Se emplean para disolver los lipídicos conduciendo a la
formación de poros.
3. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS
3.1. POR EL TAMAÑO DE LA MASA

a) Centrifugación
 Se utiliza en moléculas grandes y pequeñas
 Remueve los restos celulares después de la homogenización

 Separa no solo proteínas, macromoléculas sino también organelos y
virus.
b) Filtración en gel
 Se utiliza en moléculas pequeñas.
 Es un método de separación dependiente del tamaño molecular.
 El gel debe ser químicamente inerte.
 Debe tener un número pequeño de grupos iónicos.
 Debe tener poro y el tamaño de la partícula uniformes.
 Alta rigidez mecánica.
 Los geles más usados son: Dextranos entrecruzados, geles
poliacrilamida, geles de agarosa, styragel, perlas de vidrio de poro
controlado.
c) Diálisis o ultrafiltración
 La membrana de diálisis (celofán) se usa para separar proteínas
globulares o moléculas (200000) Da.
 El método es usado para separar pequeñas moléculas orgánicas, sales y
solventes orgánicos de los extractos crudos.
 En la ultrafiltración las pequeñas moléculas e iones pasan por la
membrana de diálisis bajo la influencia de presión.
3.2. POR LA CARGA

a) Cromatografía de intercambio iónico
 Moléculas grandes y pequeñas.
 Intercambio reversible de iones en solución, con iones enlazados a un
medio de soporte inerte.
 Es útil en la separación de compuestos cargados y no cargados.
b) Electroforesis
 Moléculas pequeñas.
 Es la migración de moléculas cargadas en un medio.
 La movilidad electroforética se afecta por:

Carga: A mayor carga, más grande es la movilidad
Tamaño: Las partículas grandes se mueven más lentamente que las
pequeñas.
Forma: Los contornos redondos generan menor retardo friccional.
 Electroforesis de zona: En la separación, las moléculas son
inmovilizadas mediante fijación en diferentes zonas y son detectadas
tiñéndolas. Métodos para detectar las moléculas separadas.
c) Enfoque isoeléctrico
 Tiene un alto poder de resolución y resuelve en al menos 40 bandas.
 El pH se incrementa gradualmente del ánodo al cátodo.
3.3. POR EL CAMBIO DE SOLUBILIDAD

a) Cambio de pH
 El ajuste del pH se usa para precipitar la enzima.
b) Cambio en fuerza iónica
 A altas concentraciones de sal, la concentración de agua se reduce.
 Disminuyendo las interacciones soluto-solvente y la solubilidad de las
proteínas.
c) Disminución en la constante dieléctrica
 Al añadir solventes solubles en agua disminuirá la constante
dieléctrica e incrementará las fuerzas electrostáticas.
3.4. POR SITIOS DE ENLAZAMIENTO ESPECÍFICO

a) Cromatografía de afinidad
 Enlazamiento específico no covalente de las enzimas con moléculas
(ligandos).
b) Elución de afinidad
 Es más ventajosa que la cromatografía de afinidad.
 Reacciones complejas de enlazamiento.
 Las columnas son más baratas.

3.5.OTROS MÉTODOS DE PURIFICACIÓN
a) Precipitación fraccional mediante el calor
 Eliminar la contaminación no deseada de la proteína.
 Es útil como primera etapa en la purificación.
 El tiempo de calentamiento está entre 10 a 15 min.
b) Adsorción fraccional en geles de fosfato de calcio
 Los principales adsorbentes incluyen gel de fosfato de calcio y gel de
alúmina.
c) Métodos adicionales
 Cromatografía en hidroxiapatita.
 Cromatografía hidrofóbica.
 Concentración por liofilización.
 Las sales de metales pesados.
 Dan como resultado la precipitación y formación de cristales.
4. ELECCIÓN DE LOS METODOS DE PURIFICACION
4.1.El volumen del extracto crudo

Cuando una enzima es aislada y purificada el volumen inicial del homogenato es
grande
4.2.La instrumentación requerida
Métodos de fraccionamiento. La instrumentación es simple y de bajo costo
4.3.El período de tiempo disponible
Técnicas por afinidad sin matriz son y métodos de salado son rápidos.
4.4.La económica del proceso involucrado
4.5.La pureza requerida

La enzima aislada necesita ser ultra pura, para investigación, diagnóstico y
administraciones terapéuticas.

5. TÉRMINOS RELACIONADOS CON LA PURIFICACIÓN
5.1.Rendimiento = unidades de actividad enzimática en la fracción/ unidades de enzima

en el extracto crudo.
5.2.Actividad específica = Unidades de actividad de la enzima en solución/ Contenido
total de proteína en la fracción.
5.3. Factor de purificación = Actividad específica de la fracción / Actividad específica
del extracto crudo
6. DESARROLLO DE ENZAYOS
6.1.Ensayos cualitativos: Se usan para determinar que la enzima de interés está presente
en la fuente escogida para aislarla.
6.2.Ensayos cuantitativos: Se usa para medir la actividad de la enzima y el grado de
purificación.
6.3. Ensayo cinético: Al disminuir la concentración de sustrato, la velocidad de reacción
también decrece.
7. ESTABILIZACIÓN Y CRISTALIZACIÓN DE ENZIMAS
7.1.Estabilización
 Condiciones de pH, fuerza iónica, composición aniónica/catiónica.
 Para almacenamiento a largo plazo, se debe mantener a temperaturas
criogénicas de alrededor de -70 °C.
 Pueden desnaturalizarse y perder la actividad de la enzima.
7.2. Cristalización
 Pueden ser fácilmente empacados, almacenados y transportados.
 Menor opción de ataque microbiano y cambios espontáneos.
 Se utiliza en micro cantidades.
 Se pueden usar para estudios cristalográficos.

8. MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE LAS ENZIMAS PURIFICADAS
8.1.La técnica más efectiva es la criogénica

8.2.Precauciones para el almacenamiento
 El almacenamiento debe ser en microalícuotas.
 Evitar los materiales de vidrio y plástico.
 La preparación debe ser micro filtrado.
 Se recomiendan con frecuencia estabilizantes.
9. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS
9.1.Son sintetizadas en las células.

9.2.Funcionan como catalizadores.
9.3.En su mayoría son universales.
9.4.Son principalmente proteínas por naturaleza.
9.5.También son activas en sistemas libres de células.
9.6.Catalizan reacciones disminuyendo la energía de activación.
9.7.Son altamente sensibles a parámetros ambientales.
9.8.Pueden ser sintetizadas en formas precursoras.
9.9.Pueden ser dependientes de coenzima/cofactor.
9.10. Muchas enzimas son alostéricas en naturaleza.
9.11. Pueden mostrar preferencias direccionales mientras catalizan reacciones
reversibles.
9.12. Pueden reusarse efectivamente en sistemas libres de células.
9.13. Las enzimas son a veces mejores herramientas que al usar las células microbianas
completas.

10. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS POR EL MÉTODO DE ELECTROFORESIS DE
PROTEÍNAS
Una proteína a un pH mayor o menor que su potencial iónico tiene una carga neta
negativa o positiva. Si está situada en un medio viscoso y se somete a un campo eléctrico,
la proteína emigra hacia el ánodo o hacia el cátodo. La velocidad de traslación, para un
potencial determinado, es proporcional a la carga e inversamente proporcional al tamaño
de la molécula y a la viscosidad del medio. En esto se basa la separación de proteínas por
electroforesis (Primo, 1995).
F: Fuente de corriente contínua.

C: Cátodo o Ánodo.
A: Ánodo o Cátodo.
ST: Solución tampón.
P: Disolución de la mezcla de proteínas.
G: Gel de acrilamina tamponado.
Figura. 02: Esquema del depósito utilizado en una electroforesis de proteínas
La fuerza iónica de la solución tampón tiene una importancia fundamental en la

electroforesis, puesto que cuando es baja, permite velocidades de migración de los
solutos más rápidas y con menor desprendimiento de calor.
Los aminoácidos al situarlos en el medio tamponado de pH característico,

adquirirán una determinada carga de acuerdo con la naturaleza ionizable de sus grupos
funcionales. Por tanto, la separación de una mezcla de aminoácidos por electroforesis
consistirá en la emigración de los aminoácidos cargados positivamente hacia el electrodo

denominado cátodo (polo negativo), o al electrodo opuesto llamado ánodo (polo positivo)
si están cargados negativamente, o no se desplazarán si la carga neta del aminoácido es
nula.
10.1. Requerimientos básicos

 Un medio conductor (buffer acuoso, electrolito, buffer de corrida).
 Poder aplicar un campo eléctrico.
 Especies cargadas positivamente, que se moverán hacia el cátodo.
 Especies cargadas negativamente, que se moverán hacia el ánodo.
10.2. Visualización
Una vez separadas las proteínas, deben fijarse y teñirse para poder
ser visualizadas. Hay diferentes protocolos en función de lo que se quiere
estudiar: fijación por calor o química y tinción en caso de estudios no
específicos (proteinograma y electroforesis Hb, por ejemplo) o fijación
mediante anticuerpos previa a la tinción en caso de estudiar proteínas
específicas (inmunofijación).
Por lo general para la tinción de geles de poliacrilamida se utiliza

tinción con plata, tinción de Coomassie o tinción fluorescente. Dependiendo
del fin de nuestro análisis. La tinción con plata no es utilizada si se desean
hacer análisis por espectrometría de masas (MS) pero es más sensible que la
tinción con Azul de Coomassie, por otro lado, la tinción fluorescente es muy
sensible y compatible con MS pero los costos de tinción son elevados.
Una tinción sensible y barata es la denominada "Blue Silver" o

Coomassie G250.1 Además, esta tinción es compatible con MS. Está
compuesta por azul de coomassie diluido en una solución coloidal y se
utiliza agua destilada para destiñir el gel de poliacrilamida.

10.3. Aplicaciones
Pueden analizarse las proteínas contenidas en diferentes líquidos
biológicos: sangre, plasma (el líquido sanguíneo sin células), suero (plasma
sin fibrinógeno), orina, LCR, líquido sinovial, saliva, lágrimas. Así como
alimentos, especialmente lácteos y cereales.
Este tipo de análisis electroforético tiene aplicaciones en

investigación y en clínica, tanto humana como animal. Además es una
técnica muy empleada para el análisis de proteínas alimentarias y
últimamente se empleando para realizar genotipado y detección de OMG
(organismos modificados genéticamente).
11. EJEMPLO DE LA UTILIZACIÓN DEL MÉTODO TRATADO
11.1. ¿Por qué es Importante la Electroforesis de Proteínas?
La razón principal es que la producción de una proteína monoclonal

(proteína-M) única es un rasgo característico del mieloma múltiple. La prueba
usada para medir la cantidad de proteína monoclonal en la sangre o la orina es la
electroforesis de proteínas.
Esta proteína-M es fabricada (sintetizada) por células plasmáticas

malignas (o células del mieloma). La cantidad de proteína producida y secretada
al suero (la parte líquida de la sangre que queda al eliminar las células
sanguíneas) y a veces a la orina, refleja el estado del mieloma presente en el
cuerpo en un momento dado. Esta proteína, que aparece en el suero o la orina, es
un marcador tumoral sérico o urinario. Sólo unos pocos cánceres tienen este tipo
de marcador que, en este caso, permite evaluar la extensión del mieloma en el
momento del diagnóstico inicial y controlar el mieloma durante la evolución de
la enfermedad. Uno puede determinar en la respuesta al tratamiento la intensidad

de la remisión, y, si es necesario, la recaída del paciente usando números
exactos, lo que es una ventaja única.
11.2. Cuantificación de la Proteína-M con Electroforesis
Si la proteína-M, que es característica del mieloma, está presente en el

suero, la electroforesis necesaria para detectarla se denomina Electroforesis de
Proteínas Séricas (SPE). De la misma forma, cuando la proteína monoclonal
aparece en la orina, la prueba se denomina Electroforesis de Proteínas Urinarias
(UPE). Para medir la cantidad de la proteína monoclonal o proteína-M son
necesarios dos datos: n ¿Cuál es la cantidad total de proteínas del suero o la
orina? n ¿Qué porcentaje del total corresponde a la proteína-M? La información
crucial se obtiene del SPE y/o UPE. Mediante el cálculo del tamaño del “pico”,
que representa la cantidad de proteína monoclonal (midiendo el área entre la
parte superior del pico y la línea de base de la curva), se obtiene el porcentaje de
las proteínas totales que corresponde a la proteína-M. P
Figura. 03: Representación de un resultado normal de una

Electroforesis de Proteínas Séricas

11.3. ¿Qué es una Proteína Monoclonal?
Las proteínas monoclonales son moléculas de inmunoglobulina

(abreviada como”Ig”) o partes de ellas. Las células plasmáticas normales
producen inmunoglobulinas, que son los anticuerpos necesarios para combatir
las infecciones. Las células plasmáticas anormales – “células del mieloma” –
presentes en los pacientes con mieloma no producen anticuerpos en respuesta a
una infección. En cambio, producen una molécula de inmunoglobulina
monoclonal que no puede actuar como un anticuerpo. Esta inmunoglobulina está
formada por: dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras (Ver la Figura); sólo
cadenas ligeras; o fragmentos / combinaciones de esta molécula de
inmunoglobulina que son exclusivas de cada paciente de mieloma.
Figura. 04: Estructura de las inmunoglobulinas

11.4. ¿Cómo se emplearía la Electroforesis de Proteínas?
La electroforesis de proteínas es una prueba de laboratorio basada en la

separación de proteínas aplicando un campo eléctrico. Para realizar esta prueba,
los laboratorios pueden usar un medio sólido (como el gel de agarosa) o tubos de
sílice muy finos, llamados capilares, llenos de un líquido. Cuando una muestra
con una mezcla de proteínas diferentes es aplicada en un gel o dentro de un
capilar, las diferentes proteínas de la mezcla se separarán en función de su carga
eléctrica. Al buscar una proteína monoclonal, los laboratorios analizarán el suero
y la orina mediante la electroforesis de proteínas, que es la única prueba que
puede confirmar la monoclonalidad inequívocamente.
Electroforesis de Proteínas Séricas

El suero contiene una variedad de proteínas diferentes que serán
separadas mediante electroforesis en cinco o seis fracciones (según el método
usado por el laboratorio). Estas fracciones (también conocidas como “zonas” o
“regiones”) se denominan Albúmina, Alfa 1, Alfa 2, Beta (que puede separarse
en Beta 1 y Beta 2), y Gamma. Las inmunoglobulinas policlonales (normales) se
encuentran principalmente en la zona Gamma. Las inmunoglobulinas normales
presentes en el suero son diversas y presentan leves diferencias en su estructura
y carga eléctrica. Por esa razón, cuando son sometidas a electroforesis, forman
una zona grande, que es difusa y simétrica, sin ninguna deformación visible. Las
proteínas monoclonales son producidas por un clon de células plasmáticas, por
lo que todas las moléculas son idénticas y tienen la misma carga eléctrica. Esa es
la razón por la que en la electroforesis una proteína monoclonal migrará como
un pico estrecho (este pico aparece casi siempre en la zona gamma, pero a veces
puede estar presente en Beta 2 ó Beta 1, o incluso en la zona Alfa 2, aunque lo
último es poco frecuente). La electroforesis del suero puede usarse para buscar
una proteína monoclonal, así como para monitorizar la cantidad de proteína
monoclonal.

Figura. 05: Representación de un resultado anormal de una Electroforesis de
Proteínas Séricas, con células del mieloma produciendo una proteína-M, que da
lugar a un pico-M en la zona beta-2.
Electroforesis de Proteínas Urinarias

El riñón funciona como un filtro, eliminando sólo unas pocas moléculas y
conservando la mayoría de las proteínas en la sangre. Aunque algunas proteínas
pequeñas realmente pasan a través del filtro renal, son reabsorbidas
posteriormente y recicladas en forma de aminoácidos. Por eso, la orina
normalmente sólo contiene pequeñas cantidades de proteínas. En la orina pueden
aparecer diferentes proteínas en distintas enfermedades. Si el riñón está dañado,
varias proteínas séricas pueden pasar a la orina, y los resultados de la
electroforesis de orina puede parecerse a los de una electroforesis de proteínas
séricas, siendo visibles las cinco (o seis) fracciones. Cuando en el suero esté
presente una proteína monoclonal, a menudo el exceso de cadenas ligeras libres
aparecerá en la orina como proteína de Bence Jones (en forma de un pico
estrecho, normalmente en las zonas Gamma o Beta). La electroforesis de orina
se usa para investigar la presencia de la proteína de Bence Jones y para

monitorizar su concentración. También sirve para evaluar el daño renal (que es
una complicación habitual del mieloma múltiple).
Inmunofijación de Suero y Orina

Una vez que la electroforesis de proteínas ha detectado un pico estrecho
de proteína, se puede sospechar la presencia de una proteína monoclonal.
Entonces es necesario confirmar su presencia y determinar su tipo identificando
qué tipos de cadenas pesadas y cadenas ligeras forman su estructura. Conocer el
tipo de proteína-M es importante para establecer un diagnóstico y monitorizar al
paciente. Para hacer esto, se usará otro método de electroforesis denominado
inmunofijación (o IFE, electroforesis de inmunofijación). En la IFE, se usarán
reactivos específicos, llamados antisueros. Cada uno de estos antisueros
reacciona con un tipo particular de cadena pesada o ligera. Las proteínas
monoclonales reaccionarán normalmente con un antisuero anti-cadena pesada y
un antisuero anti-cadena ligera (aunque a veces las células plasmáticas puede
producir cadenas ligeras únicamente; en este caso la proteína monoclonal
reaccionará con antisueros dirigidos contra las cadenas ligeras libres). Los
métodos de inmunofijación son más sensibles a la presencia de proteínas
monoclonales débiles y pueden detectarlas incluso si la electroforesis no muestra
ninguna anomalía visible. Pero la inmunofijación no permite la cuantificación de
la proteína-M. Por lo tanto, ambos métodos se usan conjuntamente:
electroforesis para detectar la proteína monoclonal y cuantificarla, e
inmunofijación para identificar su tipo.

12. CONCLUSIONES
Para fines científicos es importante purificar un preparado de enzimas para

llegar lograr extraer las enzimas indeseables. Cada tipo de enzima y tejido requieren un
tipo de tratamiento distinto. Algunos métodos que se utilizan son la precipitación
fraccionada, la diálisis y la precipitación mediante el calentamiento moderado, con algún
acido o con concentraciones de alcohol o acetona.
Para la realización de la pureza de una enzima es necesario realizar la

técnica de purificación de una proteína algunas de estas son: el análisis por
ultracentrífuga, el electroforético y otros pero se debe tomar en cuenta que durante este
transcurso se llegan a perder gran parte de ella.
También este se puede realizar mediante el sometimiento de la enzima a

fraccionamientos sensitivos como en el caso de la electroforesis en gel de almidón o de
acrilamida y así demostrar que la enzima como tal está compuesta por varias proteínas, y
que algunas presentan la misma actividad enzimática pero a causa de la sus estructuras y
propiedades distintas se les consideran isoenzimas.
La purificación de las enzimas se realiza a una baja temperatura para así

disminuir la perdidas por desnaturalización en algunos casos esta puede ser calentada
durante unos minutos más sin embargo este no tendrá ningún pérdida de su actividad
enzimática. Existe también el proceso de electroforesis que consiste en la aplicación de
un campo eléctrico a la solución.
Aun sabiendo que las propiedades de las enzimas pueden llegar a ser muy
diferentes es necesario tener preparaciones puras para poder hacer el estudio completo de
su actividad. Hoy en día se ha llegado a cristalizar o purificar de una manera correcta,
cerca de unas 200 enzimas, y es posible que en unos años más, esto llegue a aumentar
considerablemente.

El método de electroforesis tratado en este trabajo nos mostró parte de su
importancia en la detección de enfermedades en la vida del ser humano.

13. GLOSARIO
 Anticuerpo: una proteína producida por ciertos leucocitos (células plasmáticas)

para luchar contra las infecciones y enfermedades causadas por antígenos tales
como bacterias, virus, toxinas, o tumores.
 Cadenas ligeras libres: Una parte de la proteína monoclonal de peso molecular

bajo que puede medirse con una prueba sensible
 Células plasmáticas: Leucocitos especiales que producen anticuerpos. La célula

plasmática es la célula maligna del mieloma. Las células plasmáticas normales
producen anticuerpos para luchar contra las infecciones.
 Electroforesis: Una prueba de laboratorio en la que los componentes del suero

(sangre) del paciente o moléculas de la orina son separadas en función de su
tamaño y carga eléctrica.
 Inmunofijación: Una prueba inmunológica del suero o la orina usada para

identificar proteínas de la sangre. Es la técnica de inmunodetección de rutina más
sensible, e identifica el tipo exacto de cadena pesada y ligera de la proteína-M.
 Inmunoglobulina (Ig): Una proteína producida por las células plasmáticas; una
parte esencial del sistema inmunitario corporal.
 Marcador tumoral: Una sustancia presente en la sangre u otros fluidos

corporales que puede indicar que una persona tiene cáncer.
 Monoclonal: Un clon o duplicado de una única célula. El mieloma se desarrolla a

partir de una única célula plasmática maligna (un clon).
 Proteína de Bence Jones: Una proteína monoclonal del mieloma presente en la

orina. La cantidad de proteína de Bence Jones se expresa en términos de gramos
por 24 horas.

 Reactivo: Una sustancia química que reacciona de una forma específica. Un
reactivo se usa para detectar o sintetizar otra sustancia en una reacción química.
 Remisión o respuesta: Desaparición completa o parcial de los signos y síntomas

del cáncer. Remisión y respuesta son términos intercambiables.

14. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Tesis
Rojas, V. (2009). Evaluación de métodos de extracción y purificación de enzimas
pectinolíticas obtenidas por fermentación en estado semisólido del
Aspergillus Niger (Tesis de pregrado). Recuperado de
https://repository.eafit.edu.co/bitstream/handle/10784/373/VictorRene_Rojas
Mu%F1oz_2009.pdf;jsessionid=D47C659986A53BB3EC649E3005FF6FCE?
sequence=1
Blog
Valle, J. (06 / 12 /2017). Aislamiento y purificación de enzimas [Blog]. Recuperado
de https://www.mindmeister.com/es/910925169/aislamiento-y-purificaci-n-
de-enzimas
Blog
Pérez, A. (10 / 04 / 2011). Preparación y purificación de las enzimas [Blog].
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Revista
International Myeloma Foundation. (2011). Entendiendo la Electroforesis de
Proteínas. (Xii 11) Recuperado de
http://www.myelomala.org/upload/arquivos/%7B1B86D8A1-B71E-4973-
A57D-6D4F1AB67017%7D_Eletroforesis%20de%20proteinas.pdf
Enciclopedia
Gonzales, J. (2017). Electroforesis protéica. [Versión electrónica]. Wikipedia: La
enciclopedia libre., https://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_proteica
Libro
Primo, E. (1995). Química orgánica básica y aplicada. De la molécula a la
industria. Recuperado de
https://books.google.com.pe/books?id=aU_aBXvAB3MC&printsec=frontcov
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Libro
Freifelder, D. (1981). Técnicas de bioquímica y biología molecular. Recuperado de
https://books.google.com.pe/books?id=iW0yHGmE-
JwC&pg=PA228&dq=PURIFICACION+DE+ENZIMAS&hl=es-
419&sa=X&ved=0ahUKEwj-
8u2s5f3dAhXpzVkKHfHLDEcQ6AEIMTAC#v=onepage&q=PURIFICACI
ON%20DE%20ENZIMAS&f=false

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UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÉ

FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA

Quevedo Ipince Martha Elena del Rosario.

Dedico este trabajo principalmente a Dios, por

A mi madre por ser el pilar más importante y

Purificación de enzimas Página 1

A. ESQUEMA GENERAL DE UN MÉTODO DE PURIFICACIÓN………..…9

2. MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE ENZIMAS…………………...………………10

a) MOLIENDA POR ABRASIVOS……………………………………………...10

3. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS…………………………………..10

3.1.POR EL TAMAÑO DE LA MASA……………………………………………….10

Purificación de enzimas Página 2

4.1 EL VOLUMEN DEL EXTRACTO CRUDO…………………………………..13

5. TÉRMINOS RELACIONADOS CON LA PURIFICACIÓN……………………….14

7. ESTABILIZACIÓN Y CRISTALIZACIÓN DE ENZIMAS………………………..14

8. MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE LAS ENZIMAS PURIFICADAS…………15

8.1.LA TÉCNICA MÁS EFECTIVA ES LA CRIOGÉNICA……………………….15

Purificación de enzimas Página 3

10. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS POR EL MÉTODO DE ELECTROFORESIS DE

10.1. REQUERIMIENTOS BÁSICOS……………………………………………....17

11. EJEMPLO DE LA UTILIZACIÓN DEL MÉTODO TRATADO………………….18

11.1. ¿POR QUÉ ES IMPORTANTE LA ELECTROFORESIS DE

14. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Purificación de enzimas Página 4

FIGURA01: Esquema general de un método de purificación………………………………...8

FIGURA 02: Esquema del depósito utilizado en una electroforesis de proteínas……….15

FIGURA 03: Representación de un resultado normal de una Electroforesis de Proteínas

FIGURA 04: Estructura de las inmunoglobulinas…………………………………………...19

FIGURA. 05: Representación de un resultado anormal de una Electroforesis de Proteínas

Purificación de enzimas Página 5

En general, las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas,

En la industria por cuanto la implementación de procesos tales como la clarificación e

En la salud se ha podido estudiar enzimas que ayudan a la detección de ciertas

El primer requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de

Purificación de enzimas Página 6

La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad específica que es el cociente de

La electroforesis es un método de separación basado en la tasa diferencial de migración

 Depende de la carga y del tamaño

Es una serie de métodos muy eficientes y que dan altas resoluciones.

Purificación de enzimas Página 7

Para estudiar detalladamente las propiedades de cualquier proteína es preciso

Una célula tiene millones de proteínas distintas, separarlas y determinar su

Las técnicas de purificación se concentran en el tamaño, la carga y la polaridad,

La purificación depende de lo que se va a determinar en una proteína:

El método de purificación debe ser diseñado desde el primer momento teniendo en

El porcentaje de recuperación indica cuánto de la proteína de interés se ha

El grado de pureza necesario dependerá del uso que se le dará a la proteína. Si el

Purificación de enzimas Página 8

Separacion de las celulas

Si la proteina es intracelular, ruptura

Figura. 01: Esquema general de un método de purificación

B. RUPTURA DE LAS CÉLULAS

Las células o tejidos deben romperse para extraer la proteína de interés,

C. ALGUNOS METODOS DE RUPTURAS DE CÉLULAS

 Mortereado con arena, alúmina, vidrio, carburo de silicio.

Purificación de enzimas Página 9

3. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS

3.1. POR EL TAMAÑO DE LA MASA

Purificación de enzimas Página 10

3.2. POR LA CARGA

Purificación de enzimas Página 11

3.3. POR EL CAMBIO DE SOLUBILIDAD

3.4. POR SITIOS DE ENLAZAMIENTO ESPECÍFICO