UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

E SAÚDE PÚBLICA

JUSCELINO RODRIGUES FILHO

Formulação de Culicinomyces clavisporus para controle de

Aedes aegypti

Goiânia
2014
i
 JUSCELINO RODRIGUES FILHO

Formulação de Culicinomyces clavisporus para controle de

Aedes aegypti

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do Título
de Mestre em Medicina Tropical e Saúde
Pública.

Orientador: Prof. Dr. Wolf Christian Luz

Goiânia
2014

ii
iii
iv
“As lutas duram o quanto tiverem que durar.”

Chuck Palahniuk

v
Dedico este trabalho à minha família.

vi
 AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Christian Luz, Professor do Departamento de Microbiologia,
Imunologia, Parasitologia e Patologia (DMIPP) pela orientação.

Ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical do Instituto de Patologia

Tropical e Saúde Pública daUniversidade Federal de Goiás pela oportunidade.

Ao Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto do Laboratório Farmatec - Faculdade de

Farmácia/UFG pelo auxilio na produção dos pellets.

Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida.

A todos os membros da equipe do Laboratório de Patologia de Invertebrados –

IPTSP/UFG, em especial ao Prof. Dr. Éverton k. k. Fernandes, Nathália A. de Sousa,
Luciana Silva Lobo, Cíntia Bernado, Crislaini Marques, Lucas Barreto, Glennyha
Duarte, Fabrício Moreira Alves, Flávia R. S. Paixão, Priscilla Rodrigues Borges, Renan
Nunes Leles, Elen Muniz, Walmirton D’Alessandro Bezerra, Francesca Chapadense,
Rayssa de Fátima Hubner Campos, Luís Fernando Rocha e João Antônio Machado
pelo apoio, auxílio e companherismo.

À todos os membros da equipe do Laboratório Farmatec – FF/UFG, em especial

ao mestrando Rodrigo Alencar pelo apoio, auxílio e companherismo.

Ao Dr. Richard Humber e USDA/ARS Culture Collection of Entomopathogenic

Fungi pelo fornecimento do isolado ARSEF 644.

À equipe do Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical, professores,

diretoria e técnicos-administrativos.

vii
 SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS E TABELAS ................................................................................ix

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ...................................................................xi

RESUMO ...................................................................................................................... xiii

ABSTRACT ...................................................................................................................xiv

1 INTRODUÇÃO ..............................................................................................................1

1.1 Dengue ..................................................................................................................... 2

1.2 Aedes aegypti ...........................................................................................................3

1.2.1 Aspéctos biológicos ......................................................................................... 3

1.2.2 Aspectos morfológicos ....................................................................................5

1.3 Fungos entomopatogênicos ..................................................................................... 7

1.3.1 Fungos entomopatogênicos em mosquitos ...................................................... 8

1.3.2 Culicinomyces clavisporus ..............................................................................8

1.4 Formulação de micoinseticidas .............................................................................11

1.5 Peletização .............................................................................................................12

1.5.1 Mistura de pós e malaxagem .........................................................................13

1.5.2 Extrusão .........................................................................................................13

1.5.3 Esferonização.................................................................................................14

1.5.4 Secagem .........................................................................................................15

2 JUSTIFICATIVA .........................................................................................................16

3 OBJETIVOS .................................................................................................................17

3.1 Objetivo geral ........................................................................................................17

3.2 Objetivos específicos ............................................................................................. 17

4 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 18

4.1 Origem e criação de Aedes aegypti e preparação de larvas ...................................18

4.2 Origem, manutenção e produção de conídios de Culicinomyces clavisporus .......18

viii
 4.3 Avaliação do efeito larvicida de Culicinomyces clavisporus em Aedes aegypti ...19

4.4 Produção de pellets ................................................................................................ 20

4.5 Avaliação da estabilidade de pellets em água ....................................................... 22

4.6 Avaliação de larvas de Aedes aegypti alimentadas com pellets ............................ 22

4.7 Avaliação da atividade larvicida de pellets contendo conídios de Culicinomyces

clavisporus em Aedes aegypti.......................................................................................... 22

4.8 Avaliação do efeito da temperatura sobre a viabilidade de conídios de

Culicinomyces clavisporus .............................................................................................. 23

4.9 Análise de resultados ............................................................................................. 24

5 RESULTADOS ...........................................................................................................25

5.1 Efeito larvicida de Culicinomyces clavisporus em Aedes aegypti ........................ 25

5.2 Secagem, estrutura dos pellets e a sua estabilidade em água ................................ 27

5.3 Desenvolvimento e mortalidade de larvas de Aedes aegypti alimentadas com

pellets sem conídios .........................................................................................................30

5.4 Atividade larvicida de Culicinomyces clavisporus formulado em pellets .............32

5.5 Efeito da temperatura sobre a viabilidade de conídios de Culicinomyces

clavisporus ....................................................................................................................... 33

6 DISCUSSÕES ..............................................................................................................35

7 CONCLUSÕES ............................................................................................................37

8 REFERÊNCIAS ...........................................................................................................38

ix
 FIGURAS E TABELAS

Figura 1. Mapa global de locais com risco de transmissão da dengue (WHO 2008). ..3

Figura 2. Fases evolutivas de Aedes aegypti: ovo, quatro estádios larvais, pupa e
mosquito adulto (modificado) (Fonte: www.prdu.unicamp.br/dengue/ mosquito.html;
Acesso em 19 de julho de 2013)........................................................................................6

Figura 3. Conidios e hifas de C. clavisporus corados com solução de

Ammam...........................................................................................................................10

Figura 4. Etapas do processo de peletização por extrusão/esferonização. .................13

Figura 5. Modelo de um extruso de rolos (A). Esquema do processo de esferonização

(B). Mecanismos de formação de pellets durante a esferonização, modelos sugerido
por Rowe (1985) (C) e Baert & Remon (1993) (D). Adaptado de Santo et al. (2004) e
Aulton (2005).. ................................................................................................................. 14

Figura 6. Massa obtida após a malaxagem (A). Extrusor de rolos (B). Material em
processo de extrusão (C). Esferonizador (D). Pellets formados após o processo de
esferonização (E).............................................................................................................21

Figura 7. Mortalidade relativa acumulada de larvas de terceiro estádio de Aedes

aegypti expostas à conídios de Culicinomyces clavisporus em diferentes
concentrações (3,3x104, 105, 3,3x105, 106, 3,3x106 ou 107 conídios/ml) por até 10
dias... ............................................................................................................................... 25

Figura 8. Larva de terceiro estádio de Aedes aegypti morta por infecção por
Culicinomyces clavisporus (A). Estruturas fúngicas, hifas e conídios (seta vermelha),
coradas por solução de Amann (B, C).............................................................................27

Figura 9. Extrusado de celulose microcristalina momentos antes do processo de

esferonização (A). Pellets após a secagem em leito fluidizado (B). Pellets na forma
esférica (seta branca), halteres (seta vermelha) ou bastonete (seta verde) (C e D).........28

x
Figura 10. Pellets sem ou com farinha de soja (10 ou 20%) sem alterações (A),
rachados (B) ou erodidos/desintegrado (C) expostos à água por até 15
dias...................................................................................................................................29

Figura 11. Desenvolvimento de larvas de primeiro (L1) ou terceiro estádio (L3)

alimentadas com 40 mg de ração ou pellets com ou sem farinha de soja (10 ou 20%) e
incubados a 25 ºC por até 15 dias. Controle feito apenas com água de
torneira.............................................................................................................................31

Tabela 1. Mortalidade acumulada (% ± erro padrão da média; EM) de larvas de Aedes

aegypti expostas a diferentes concentrações de conídios de Culicinomyces clavisporus e
incubadas1 por até 10 dias, e tempos letais para matar 50 (TL50) e 90% (TL90) de larvas
com os seus respectivos intervalos de confiança (95% IC) e slope (± EM).. ..................26

Tabela 2. Número relativo de pellets de celulose com ou sem farinha de soja (10 ou
20%) sem alterações estruturais (SA; %), rachados (R; %) ou erodidos/desintegrado
(E/D; %) expostos à água e incubados por até 15 dias1...................................................29

Tabela 4. Mortalidade acumulada (% ± EM) de larvas de Aedes aegypti expostas a

pellets secos em leito fluidizado1 ou estufa2 (0 ou 10% farinha de soja) contendo
conídios de Culicinomyces clavisporus (108 conídios/g) e incubadas por até 15 dias3.
.........................................................................................................................................32

Tabela 4. Conídios de Culicinomyces clavisporus germinados (G; %) ou não

germinados (NG; %) e germinação relativa ao controle (GR; %) de conídios expostos à
diferentes temperaturas1 e posteriormente incubados sobre meio BDAL por até 72
horas2. .............................................................................................................................. 43

xi
 SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

OPAS Organização Panamericana da Saúde

pH Potencial hidrogeniônico

Fig Figura

mm Milímetro

ºC Graus Celsius

µm Micrómetro

ml Mililítro

ARSEF ARS Collection of Entomopathogenic Fungi

cm Centímetro

UR Umidade relativa

l Litro

g Grama

BDA Batata, dextrose e agar

USA United States of America

ML Milho e levedura

RPM Rotações por minutos

PVC Policloreto de polivinila

L1 Larva de primeiro estádio

L2 Larva de segundo estádio

xii
L3 Larva de terceiro estádio

L4 Larva de quarto estádio

ANOVA Analise de variância

TL50 Tempo letal de 50% das larvas

TL90 Tempo letal de 90% das larvas

CL50 Concentração letal de 50% das larvas

CL90 Concentração letal de 50% das larvas

Tab Tabela

IC Intervalo de confiança

EM Erro padrão da média

G Conídio germinado

NG Conídio não germinado

GR Germinação relativa

SA Pellets sem alteração

R Pellets rachados

E/D Pellets erodidos ou dissolvidos

xiii
 RESUMO

A Febre Dengue, transmitida pelo mosquito Aedes aegypti, é uma das doenças de
transmissão vetorial mais importantes no mundo. Por não existir vacinas, a principal
forma de controle desta doença é através do combate do vetor, que é feito
principalmente com produtos químicos. Entretanto, com o aparecimento de populações
de mosquitos resistentes, aumentou o interesse pelo combate integrado. Bioinseticidas à
base de fungos entomopatogênicos são boas alternativas para integrar esta política de
combate. Formulados fûngicos protegem os propágulos de fatores abióticos e são
específicos ao vetor alvo. Culicinomyces clavisporus possui especificidade para larvas
de dípteros e infecta o hospedeiro por via oral. Portanto, formulados deste fungo devem
conter aditivos palatáveis, garantindo assim a ingestão pela larva. O presente trabalho
avaliou a atividade de conídios de C. clavisporus em larvas de A. aegypti; a preparação
e estabilidade de pellets de celulose; formulado ou não com aditivo (10 ou 20% de
farinha de soja) e/ou conídios de C. clavisporus; e a viabilidade de conídios expostos a
diferentes temperaturas. Os pellets sem conídios foram avaliados quanto à estabilidade
em água e a capacidade de promover o desenvolvimento de larvas, já pellets com
conídios foram avaliados quanto a sua atividade larvicida. Os resultados obtidos
mostraram que concentrações ≥ 105 conídios/ml são suficientes para matar todas as
larvas. Pellets contendo 10% de farinha de soja parecem ser ideais para formulação
fúngica e aplicação, já que se desintegram em água e não promovem o desenvolvimento
rápido das larvas. Porém, pellets formulados com conídios apresentaram baixo efeito
larvicida, o que pode ser explicado devido uma possível inviabilização dos conídios por
calor durante o processo de secagem.

Palavras – chave: Aedes aegypti, fungos entomopatogênicos, formulação

xiv
 ABSTRACT

The dengue fever, transmitted by the mosquito Aedes aegypti, is of one of the most
important vector-borne diseases in the world. Since there is no vaccine, the main way to
control this disease is by combating the vector, which is mainly made with chemicals.
However, with the emergence of resistant mosquito populations the interest in
integrated control increased. Biopesticides based on entomopathogenic fungi are good
alternatives to incorporate this policy to combat. Formulations protect fungal propagules
against abiotic factors and are specific to the target vector. Culicinomyces clavisporus
possesses specificity to dipteran larvae and their hosts infected orally get. Therefore,
formulation of this fungus should contain palatable adjuvants, thus ensuring the
ingestion by the larvae. This study evaluated the activity of conidia of C. clavisporus on
larvae of A. aegypti, the preparation and evaluation of cellulose pellets formulated with
or without adjuvant (10 or 20% soy flour) and / or conidia of C. clavisporus, and the
viability of conidia exposed to different temperatures. The pellets without conidia were
evaluated for stability in water and the ability to promote the development of larvae,
while pellets with conidia were evaluated regarding their larvicidal activity. The results
showed that concentrations ≥ 105 conidia / ml were sufficient to kill all of the larvae.
Pellets containing 10% soybean flour seem to be ideal for fungal formulation and
application, they disintegrate in water and do not promote a rapid development of
larvae. However, pellets formulated with conidia had no larvicidal effect, which can be
explained by a possible inviability of conidia by heat during the drying process.

Key words: Aedes aegypti, formulation, entomopathogenic fungi

xv
1 INTRODUÇÃO

Aedes aegypti, mosquito de hábitos antropofílicos, está intimamente ligado ao

habitat humano. É encontrado em domicílios e peridomicílios, principalmente em locais
onde há criadouros propícios para o seu desenvolvimento e procriação (Braga & Valle
2007a; Jansen & Beebe 2010). A. aegypti é responsável pela transmissão dos vírus da
dengue, expondo grande parte da população humana ao risco de contrair esta doença
(Keating 2001). A dengue tem grande importância no Brasil e em outros países das
Américas (Guzman & Kouri 2003). No Brasil cerca de um milhão de pessoas foram
infectadas pelo vírus da dengue em 2010, e foram relatados 572 óbitos (Ministério da
Saúde 2011). Em 2013, foram registrados 160.090 casos de infecção em todo o estado de
Goiás, um aumento de 401% em relação ao ano de 2012. Já o número de óbitos em 2013
aumentou 25% em relação ao anterior, sendo registrados 65 casos (Secretaria Estadual de
Saúde 2013).
O combate do vetor é realizado com medidas de saneamento do domicílio e
peridomicílio, ações de conscientização da população (OPAS 1995) e campanhas de
combate utilizando produtos químicos, como organofosforados, piretróides (Macoris et al.
1999; Braga & Valle 2007b), reguladores de crescimento e bioinseticidas (Borges et al.
2004). Porém, o uso constante e indiscriminado de inseticidas químicos afeta o meio
ambiente e prejudica a saúde do homem, além de poder gerar populações de vetores
resistentes, o que pode diminuir a eficácia das campanhas (Rodriguez et al. 2002; Lima et
al. 2003; Braga et al. 2005; Cunha et al. 2005; Beserra et al. 2007; Melo-Santos et al.
2009). Uma das alternativas ao controle químico é o uso de bioinseticidas à base de micro-
organismos entomopatogênicos. Bioinseticidas, como Bacillus thuringiensis israelensis e
B. sphaericus, já são utilizados no combate de mosquitos (Fontes 1992). Ambos são
produtores de toxinas que agem sobre a fase larval desse inseto (Fernández et al. 2005).
Entretanto também já foram relatadas populações resistentes a estes bioinseticidas
(Tabashnik 1994).
Novos bioinseticidas, especialmente micoinseticidas, à base de fungos
entomopatogênicos, estão em fase de estudo e desenvolvimento, já que apresentam alta
especificidade e segurança para o homem e meio ambiente (Almeida & Batista Filho 2001;

1
Scholte et al. 2004; Zimmermann 2007). Fungos entomopatogênicos atualmente são
empregados no combate de pragas agrícolas (Alves 1998), entretanto, ainda não existem
produtos comercializados para o combate de mosquitos. Espécies como, Culicinomyces
clavisporus (Cooper & Sweeney 1986), Tolypocladium cylindrosporum (Matha et al. 1992)
e Coelomomyces illiciens (Lastra & Garcia 1997) infectam larvas, e Beauveria bassiana e
Metarhizium anisopliae são efetivos contra ovos, larvas e adultos (Scholte et al. 2004; Luz
et al 2007; Santos et al. 2009; Leles et al. 2010; Sousa et al. 2013).
Apesar de serem efetivos, fungos são sensíveis a fatores abióticos estressantes do
meio ambiente como, baixa umidade, alta temperatura, pH desfavorável e radiação
ultravioleta (Batta 2003), o que pode afetar sua persistência no ambiente e reduzir a
virulência para o vetor alvo. Estes fatores limitantes podem ser contornados com
formulações e estratégias de aplicações específicas. Sendo assim, a busca por novos
métodos de formulação e aplicação é necessária para garantir o sucesso de micoinseticidas
para o controle de vetores.

1.1 Dengue

A dengue é hoje a arbovirose de maior importância no mundo, com cerca de 2,5

bilhões de pessoas vivendo em países onde a doença ocorre de forma endêmica (Fig. 1; San
Martin et al. 2010). É uma doença febril aguda, e pode se manifestar de duas formas: como
dengue clássica (DC) ou febre hemorrágica da dengue (FHD). Elas são transmitidas por
algumas espécies de mosquitos do gênero Aedes, sendo a espécie aegypti a de maior
importância na transmissão urbana da doença. O seu agente etiológico pertence à família
Flaviviridae e ao gênero Flavivirus, sendo conhecidos quatro sorotipos distintos
antigenicamente: DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4 (Gubler 2002; Figueiredo 2007). No
hospedeiro vertebrado estes vírus se replicam dentro de células do sistema mononuclear
fagocitário (macrófagos, monócitos e células B) (King et al. 2000).
Depois da picada do vetor infectado, o período médio de incubação da doença no
homem é de 4 a 7 dias (variação de 3 a 14 dias). Podendo ser sintomático ou não de acordo
com a cepa do vírus, idade e estado imunológico do paciente. Após o período de
incubação, segue-se a viremia, que está associada ao surgimento repentino de febre e

2
sintomas específicos, que duram de 5 a 6 dias (variação de 2 a 12 dias) (Singhi et al. 2007).
O período de transmissibilidade da doença compreende dois ciclos: um intrínseco, que
ocorre no ser humano, e outro extrínseco, que ocorre no vetor. A transmissão do ser
humano para o mosquito ocorre enquanto houver presença de vírus no sangue (período de
viremia). Esse período começa 1 dia antes do aparecimento da febre e vai até o 6º dia da
doença (Singhi et al. 2007).

Figura 1 – Mapa global de locais com risco de transmissão da dengue (WHO 2009).

1.2 Aedes aegypti

1.2.1 Aspectos biológicos

A. aegypti é um artrópode pertencente à ordem Díptera, família Culicidae e

subfamília Culicinae. Originário da África, hoje é encontrado principalmente em regiões
tropicais do mundo inteiro (Fig 1; Jansen & Beebe 2010). Machos e fêmeas adultos
alimentam-se de seiva de plantas, mas somente as fêmeas são hematófagas, sendo assim,
responsáveis pela transmissão do vírus da dengue. Uma vez infectada com o vírus da

3
dengue, a fêmea permanece assim pelo resto de sua vida. Pode ocorrer transmissão
transovariana, com produção de ovos já infectados (Rosen et al. 1983).
Alimenta-se durante o dia, e constitui fonte de repasto para as fêmeas de A. aegypti
a maior parte dos vertebrados, inclusive o homem. Prefere picar regiões mais baixas do
corpo humano, como pernas e pés (Consoli & Oliveira 1998). O sangue é essencial para a
formação e maturação de ovos, já que serve como fonte de proteína. Após maturação dos
ovos, as fêmeas buscam criadouros para realizar a oviposição. O sítio escolhido para
oviposição é de grande importância para a sobrevivência e dinâmica populacional do
mosquito. Seus criadouros são geralmente temporários, encontrados em domicílios e
peridomicilios. Podem servir de criadouros os vasilhames abandonados pelo homem e
condicionados pelas chuvas, ou utilizados para armazenar água para uso doméstico.
A seleção dos sítios para oviposição se inicia com estímulos visuais, olfatórios e
táteis no ambiente, que determinam o comportamento da fêmea durante a procura por locais
apropriados para oviposição, preferencialmente recipientes escuros e sombreados, com
superfície áspera (Consoli & Oliveira 1998). Os estímulos para oviposição incluem a cor,
densidade óptica, textura e refringência do substrato e gradientes de umidade e temperatura
(Badano & Regidor 2002). Além de estímulos químicos, com a ação de semioquímicos
(feromônios e cairomônios), como por exemplo, água que já abrigou larvas pode aumentar
a atratividade para fêmeas grávidas de A. aegypti (McCal & Cameron 1995; Darriet &
Corbel 2008).
Os ovos são depositados na parede do recipiente, próximos à superfície da água ou
sobre substratos úmidos adjacentes a ela (Roberts & Hsi 1977; Madeira et al. 2002). Cada
fêmea põe, durante dois meses, até oitenta ovos (Micieli & Campos 2003). Em um mesmo
ciclo gonotrófico a fêmea coloca ovos em vários criadouros, garantindo assim a
sobrevivência e melhor dispersão de sua prole (Reiter 1991).
Após a ovipostura a embriogênese se completa em 24 a 48 horas em temperaturas
em torno de 27 ºC. O tempo médio entre a postura dos ovos e eclosão das larvas é variável
e depende da exposição dos ovos à água. Sem contato dos ovos com água, as larvas prontas
dentro dos ovos entram em diapausa e sobrevivem por até 450 dias em ambiente ressecado
(Silva et al. 1994; Luz et al. 2008). Esta característica contribui para a dispersão passiva
desses ovos para outras regiões através do transporte de materiais utilizados como

4
criadouros (Pates & Curtis 2005), além de promover flutuação da densidade populacional
de mosquitos no ciclo anual, que é controlado pela quantidade de chuvas.
As larvas possuem quatro estádios evolutivos, que são essencialmente aquáticos e
com grande mobilidade, passam a maior parte do tempo se alimentando de materiais
suspensos ou acumulados nas paredes e fundo dos criadouros, fazendo a ingestão não
seletiva de partículas (FUNASA 2001). As larvas adquirem os alimentos de duas formas,
por filtragem ou raspagem e trituração. Na filtragem, antes de serem ingeridas, as s
substância atravessam filtros representados pelas escovas situadas ao redor da cavidade
bucal. Assim, quando a larva está se alimentando, essas escovas movem-se de maneira
rítmica, produzindo corrente que carreia as partículas alimentares para o orifício oral
(Forattini 2002). Sua alimentação consiste indistintamente de microplancton presente em
seu habitat, constituído de algas, rotíferos, bactérias, esporos de fungos, ou outras partículas
de matéria orgânica (FUNASA 2001). O diâmetro máximo da partícula deglutida
normalmente não ultrapassa o tamanho correspondente a 20% da largura da cabeça larval.
Porém, este valor varia consideravelmente, podendo incluir desde partículas de dimensões
inferiores a 1 µm até o tamanho de 1 mm. Estas partículas são classificadas em grande (1
mm), fina (<1 mm a > 50 µm) e ultrafina (<50 µm a >0,5 µm) (Consoli & Oliveira 1998;
Forattini 2002 ).
Em recipientes favoráveis, temperatura ideal e boa disponibilidade de alimento, as
larvas completam os quatro estádios larvais em torno de 7 dias, chegando à fase de pupa e
emergência dos adultos após mais 2,5 dias (Silva et al. 1994).

1.2.2 Aspectos morfológicos

A. aegypti possui desenvolvimento holometabólico, com fases de ovo, larva (quatro

estádios larvários), pupa e adulto (Fig. 2; Forattini 1996). Os ovos medem
aproximadamente 1 mm de comprimento, são fusiformes com contorno alongado. As larvas
apresentam aspecto vermiforme e corpo nitidamente dividido em cabeça, tórax e abdômen.
A cabeça e tórax têm formato globoso. O abdômen é dividido em dez segmentos. No
oitavo segmento está inserido o sifão ou tubo de ar para a respiração na superfície da água.
O sifão é curto, grosso e mais escuro que o resto do corpo. As pupas têm aspecto de

5
“vírgula” e dividem-se em cefalotórax e abdômen, ambos providos de cerdas. No final do
abdômen há um par de pás ou paletas que ajudam a pupa na locomoção (Consoli &
Oliveira, 1998).

Figura 2 - Fases evolutivas de Aedes aegypti: ovo, quatro

estádios larvais, pupa e mosquito adulto (Fonte:
www.prdu.unicamp.br/dengue/ mosquito.html; Acesso em 19
de julho de 2013).

Os adultos (3-6 mm), machos e fêmeas, possuem o corpo delgado, sendo dividido
em cabeça, tórax e abdômen. Apresentam pernas longas com manchas prateadas e dois
pares de asas sendo o primeiro par funcional e outro transformado, chamado balancins, que
regulam o equilíbrio do inseto durante o vôo.
A cabeça tem um par de antenas de 15 artículos cada, probóscida e um par de palpos
maxilares, que são mais curtos que a probóscida nas fêmeas e mais longos que a probóscida
nos machos. Os olhos compostos ocupam grande parte da porção ântero-lateral da cabeça e
são constituídos de pequenos omatídeos, responsáveis pela captação da luz (Consoli &
Oliveira 1998). As fêmeas se diferenciam dos machos por possuírem antenas pilosas e

6
aparelho bucal do tipo picador (sugador-pungitivo), já os machos possuem antenas
plumosas e aparelho bucal do tipo sinfonador-sugador.
O tórax é dividido em protórax, mesotórax, no qual está inserido o primeiro par de
asas e metatórax, com os balancins. O escudo característico de A. aegypti apresenta uma
nítida faixa curva, branco-prateada de cada lado do tórax (mesonoto) e outra mais fina e
reta, longitudinal, central, formando assim a figura de uma lira. O abdome é composto por
oito segmentos evidentes e dois segmentos reduzidos modificados em ânus e genitália
externa (Consoli & Oliveira 1998).

1.3 Fungos entomopatogênicos

Os primeiros estudos sobre fungos patogênicos para insetos (entomopatogênicos)

foram feitos pelo cientista italiano Agostino Bassi a partir de 1834, que infectava lagartas
de Bombyx mori com um fungo, hoje conhecido por Beauveria bassiana (Alves 1998).
Mais de 700 espécies de fungos já foram descritas como patogênicas para insetos e outros
artrópodes, e estima-se que este número seja apenas 5% do total de fungos
entomopatogênicos existentes (Hawksworth 1991; Destéfano et al. 2004). Esses fungos
causam 80% das doenças naturais em insetos (Alves 1998), e são de grande interesse no
controle de pragas e insetos de importância em saúde pública (Luz et al. 2003, 2007). O uso
destes agentes apresenta vantagens como, em geral, não serem prejudiciais à saúde humana
e ao meio ambiente (Ward et al. 1998; Zimmermann 2007), além da especificidade e
capacidade de dispersão e multiplicação do fungo. Micoinseticidas permitem diminuir a
utilização de compostos químicos, e assim reduzem a contaminação do ambiente.
Amplamente utilizado no controle de pragas agrícolas, especialmente no Brasil,
estes fungos são comprovadamente patogênicos para diversos tipos de vetores como os
triatomíneos Triatoma infestans, T. sordida e Rhodnius prolixus (Luz et al. 1998, 2003;
Rocha et al. 2011), carrapatos das espécies Rhipicephalus microplus, R sanguineus e
Amblyomma cajennense (Fernandes & Bittencourt 2008), barata Periplaneta Americana
(Hubner–Campos et al. 2013), além dos mosquitos dos gêneros Aedes, Culex e Anopheles
(Scholte et al. 2004).

7
1.3.1 Fungos entomopatogênicos em mosquitos

Na década de 1960 começaram estudos sobre fungos entomopatogênicos para

controle de mosquitos (Scholte et al. 2004), principalmente para controle de larvas, com os
gêneros Culicinomyces, Lagenidium e Coelomomyces (Federici 1995). Porém, Laginex® à
base de Lagenidium giganteum, hoje classificado como Chromalveolata, foi o único
micoinseticida registrado e comercializado para controle de larvas de mosquitos. A partir
da década de 1970 foram usados preferencialmente bioinseticidas à base de bactérias da
espécie B. thuringiensis para controle larval. Porém com o aumento da resistência de larvas
de mosquitos vetores a inseticidas e o avanço na produção e formulação de fungos,
aumentou novamente o interesse por micoinseticidas (Scholte et al. 2004).
C. clavisporus, por exemplo, é efetivo contra larvas de mosquitos dos gêneros
Aedes, Culex e Anopheles (Sweeney 1979). Outras espécies de fungos, como Beauveria
bassiana e Metarhizium anisopliae, são efetivas contra larvas e adultos dos mesmos
gêneros de mosquitos (Alves et al. 2002; Scholte et al. 2003; Mnyone et al. 2009; Bukhari
et al. 2010). Fungos dos gêneros Isaria, Paecilomyces e Lecanicillium também mostraram
ter potencial contra adultos de A. aegypti (Leles et al. 2010) e fungos dos gêneros de
Paecilomyces, Isaria, Penicillium e Metarhizium, em condições de laboratório, atacaram
ovos desse mosquito (Luz et al. 2007).

1.3.2 Culicinomyces clavisporus

C. clavisporus foi isolado pela primeira vez no ano de 1972 em dois países
diferentes, Austrália e EUA. Ambos os isolados foram obtidos a partir de larvas de
anofelínos provenientes de criação de laboratório (Scholte et al. 2004). No início era
chamada de C. clavosporus, porém em 1982 esta espécie foi renomeada para C. clavisporus
(Sweeney et al. 1982). Ainda nesse mesmo ano, Cooper & Sweeney (1982) demostraram
que larvas de A. aegypti são susceptíveis à infecção por C. clavisporus, conseguindo re-
isolar o patógeno a partir de larvas que foram infectadas em laboratório.
C. clavisporus é um fungo aquático que acomete facultativamente várias espécies de
larvas de dípteros (Scholte et al. 2004). Estudos de laboratório e de campo demostraram

8
que larvas de Simuliidae, Chaoboridae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Ephydridae,
Syrphidae e Culicidae são susceptíveis a este fungo, especialmente larvas dos gêneros
Aedes, Anopheles e Culex (Knight 1980; Sweeney 1979). Geralmente a infecção se dá por
via oral, entretanto em altas concentrações, conídios podem se aderir à cutícula da cabeça,
tórax e abdome, mas apenas foi observada penetração através da papila anal (Sweeney
1979).
O ciclo biológico assexuado de C. clavisporus ocorre basicamente em cinco etapas:
ingestão de conídios, adesão, germinação, penetração e colonização da larva infectada. Por
via de regra, a infecção se inicia após ingestão de conídios (Fig. 3), que se aderem na
parede do intestino médio ou posterior. A germinação começa algumas horas após a
ingestão, com a formação de tubo germinativo e hifas. A penetração na parede do intestino
é favorecida pela pressão exercida pelas hifas associadas a enzimas como proteases,
quitinases, e lipases (Goettel 1988). Após a invasão da hemocele, inicia-se o processo de
colonização de toda a cavidade corporal das larvas com hifas. A morte das larvas ocorre
dentro de dois a sete dias, porém, se houver a ingestão de uma elevada quantidade de
conídios, as larvas morrem antes da hemocele ser colonizada pelas hifas (Sweeney 1981a;
Federici 1981). A razão para esta morte rápida ainda não é muito bem conhecida, mas
estudos apontam que pode ser provocada por substâncias tóxicas associadas com a
germinação e o crescimento de hifas invasoras, que só é letal quando se ingere uma grande
quantidade de conídios (Sweeney 1983). Após a morte da larva, hifas se externalizam
através da cutícula, formando uma camada de conidióforos na parte externa do cadáver,
com maior frequência nos segmentos abdominais posteriores. Estes conidióforos produzem
conídios, que podem infectar larvas saudáveis. Ocasionalmente, larvas infectadas podem se
desenvolver e o patógeno transmitido aos sucessivos estágios do hospedeiro, inclusive
adultos, que morrem alguns dias depois de emergir e podem produzir conídios, portanto,
adultos podem ser responsáveis pela dispersão de C. clavisporus (Debenham & Russel
1977; Goettel et al. 1984). Apesar da infecção por via de regra ser oral, não há relatos de
testes feitos para se verificar a atividade ovicida ou adulticida deste fungo.

9
 Figura 3 – Conidios (seta vermelha) e hifas de C.
clavisporus corados com solução de Amann.

Fatores como estádio de desenvolvimento e espécies de larvas podem influenciar no

grau de virulência de C. clavisporus. Larvas de primeiro ou segundo estádio são
consideravelmente mais suscetíveis à infecção do que os estádios mais avançados
(Sweeney 1981b, 1983). Larvas de A. aegypti são mais expostas ao fungo que larvas de
espécies do gênero Anopheles (Cooper & Sweeney 1982). Esta diferença ocorre devido à
sedimentação de conídios, que se acumulam no fundo dos recipientes, local onde são mais
acessíveis às larvas de A. aegypti, já que estas se alimentam preferencialmente de materiais
presentes no fundo, diferentemente de larvas do gênero Anopheles, que buscam alimentos
na superfície da água (Sweeney 1981b; Cooper & Sweeney 1982). A temperatura também
pode influenciar na ação de C. clavisporus, já que a 30ºC a infectividade é bastante
limitada, sendo considerado 25 e 27ºC as temperaturas ótimas para germinação e infecção,
respectivamente (Sweeney 1978).
Apesar da seletividade de C. clavisporus para matar larvas de mosquitos, pesquisas
com este fungo diminuiram significativamente em meados da década de 1980. A
diminuição do interesse por este grupo de fungos foi devido a resultados obtidos em poucos
estudos, onde se constatou a necessidade de altas concentrações de conídios para um

10
controle mais efetivo, além do baixo tempo de prateleira, quando os conídios são estocadas
em suspensões aquosas, e do baixo efeito residual no sitio de aplicação (Scholte et al.
2004). Para aumentar o potencial de C. clavisporus no controle biológico de mosquitos,
esforços devem focalizar no desenvolvimento de formulados de baixo custo e de fácil
aplicação. Estas formulações devem garantir a estabilidade das formas infectantes e o
contato destas com o vetor alvo

1.4 Formulações de micoinseticidas

A formulação visa aumentar a eficiência de ação e persistência de fungos

entomopatogênicos no meio de aplicação. Para tanto, considera-se o comportamento da
praga alvo e as características dos micro-organismos. O formulado é preparado misturando
aditivos aos propágulos fúngicos. Estes aditivos podem ser líquidos, tais como, água, óleo
puro ou emulsões óleo-água, ou podem ainda ser sólidos na forma de pós e granulados de
diferentes tamanhos (Burgues 1998).
Aditivos em formulações de conídios auxiliam a ação do fungo sobre o vetor alvo.
A adição de óleos aumenta a proteção de conídios contra efeitos de estresse devido a
fatores abióticos no meio ambiente como, umidade, alta temperatura, pH e radiação
ultravioleta (Batta 2003). Testes com formulações oleosas de conídios de B. bassiana e M.
anisopliae em triatomíneos demonstraram que esses formulados permitem melhor
impregnação de conídios causando uma infecção e morte mais rápida dos insetos tratados
(Luz & Batagin 2005). Além disso, os conídios permaneceram viáveis por mais tempo
quando comparados aos conídios preparados em formulados aquosos (Luz et al. 1998;
Batta 2003; Maranga et al. 2005).
Formulados secos de conídios, combinam propriedades absorventes e abrasivas de
pós com a atividade entomopatogênica de fungos (Faulde et al. 2006; Batta 2008). A terra
diatomácea tem origem de resíduos fósseis de algas diatomáceas, ricos em silício, sendo
um produto natural que não produz resíduos tóxicos. O modo de ação se baseia na adesão à
superfície do inseto e abrasão da cera epicuticular. A epicutícula protege o inseto contra
perda de líquido corporal através da superfície. A morte do inseto ocorre principalmente
por desidratação (Quarles 1992; Korunic 1998; Alves et al. 2006). A terra diatomácea pode

11
provocar um efeito sinérgico com o fungo quando combinados, matando o inseto mais
rapidamente (Akbar et al. 2004; Athanassiou & Steenberg 2007). Terra diatomácea
combinada com óleo vegetal e M. anisopliae mostrou-se altamente eficiente ao eliminar
ninfas de T. infestans mesmo em condições desfavoráveis de umidade (Luz et al. 2012) .
Formulações granuladas imobilizam as formas infectantes dos fungos dentro de
uma matriz de celulose ou outros tipos de polímeros. Apresentam vantagens por serem de
fácil manuseio e aplicação, já que não necessitam de nenhum preparo prévio momentos
antes da aplicação, como acontece com os formulados emulsionáveis. Também é possível a
adição de aditivos capazes de promover a ingestão do formulado pelo vetor/praga alvo,
quando o fungo utilizado age por via oral (Burgues 1998).

1.5 Peletização

Pellets são formas farmacêuticas sólidas multiparticuladas para administração por

via oral, e geralmente preenchem cápsulas de gelatina dura, podendo também ser
compactados na forma de comprimidos (Aulton 2005; Pezzini et al. 2007). São
microgrânulos de geometria esférica, e é originado após a mistura e aglomeração de pós
(ativos e excipientes). Por apresentarem diversas vantagens tecnológicas e terapêuticas, os
pellets geram grande interesse por parte das indústrias farmacêuticas (Santos et al. 2004).
Dentre estas vantagens, destacam-se a possibilidade de se fazer revestimentos para
liberação prolongada, retardada, sustentada ou conferir resistência a um determinado pH e
assim a liberação em local específico, a estreita distribuição no tamanho das partículas,
além da possibilidade de combinação de pellets com ativos diferentes (Santos et al. 2004;
Pezzini et al. 2007)
Os pellets produzidos na indústria farmacêutica possuem tamanhos que variam de
500 e 1500 μm, e o método de fabricação mais utilizado atualmente é o de
extrusão/esferonização. Está técnica desenvolvida por Nakahara e aplicada a partir da
década de 1970 na indústria farmacêutica, é constituída basicamente por cinco operações
unitárias: mistura dos pós, aglomeração úmida, extrusão, esferonização e secagem (Fig. 3;
Sousa et al 2002; Trivedi et al. 2007).

12
Figura 4 – Etapas do processo de peletização por extrusão/esferonização.

1.5.1 Mistura dos pós e malaxagem

A mistura é uma operação onde é feita a homogeneização dos pós a serem

utilizados na preparação dos pellets, devendo garantir a homogeneidade da formulação. A
malaxagem consiste na umidificação dos pós através da adição de um líquido de
granulação. O líquido de granulação deve ser compatível com todos os componentes da
mistura de pós, e a sua quantidade deve ser aquela que garanta uma massa umidificada e
plástica, ideal para o processo de extrusão. Para obter um bom fluxo durante os processos
seguintes e evitar perdas de materiais, a malaxagem deve garantir a distribuição homogênea
do líquido e a diminuição da quantidade de pós em suspensão. O tempo e a velocidade da
malaxagem devem ser controlados a fim de ser evitar aumento excessivo de temperatura e
perda de umidade da massa (Santos et al. 2004).

1.5.2 Extrusão

Na extrusão, a massa úmida, originada na malaxagem, sofre compactação sendo

modelada sob a forma geométrica de cilindros com diâmetro uniforme. Os aparelhos de
extrusão são classificados de acordo com o design dos orifícios e com os mecanismos de
alimentação. Dentre os extrusores utilizados na indústria farmacêutica destacam-se:
extrusor de parafuso-sem-fim, extrusor de tamis (peneira) e de cesto, extrusor de pistão e
extrusor de rolos. O extrusor de rolos é formado por um orifício de alimentação, rolos de
compactação e uma rede circular com perfurações, sendo o tamanho dos pellets
determinado pelo diâmetro das perfurações desta rede (Fig 5A). A extrusão tem início com
a alimentação da massa umidificada para o interior do aparelho de extrusão, que segue para
a superfície interna da rede de extrusão. A ação dos rolos força a passagem da massa para o

13
exterior da rede através dos seus orifícios, formando, assim, o produto de extrusão, também
chamado de extrusado (Fig 5A ; Santos et al. 2004).

Figura 5 – Modelo de um extrusor de rolos (A). Esquema do processo de

esferonização (B). Mecanismos de formação de pellets durante a
esferonização, modelos sugerido por Rowe (1985) (C) e Baert & Remon
(1993) (D). Adaptado de Santo et al. (2004) e Aulton (2005).

1.5.3 Esferonização

Esta operação consiste em processar uma quantidade pré-determinada de produto de

extrusão até que sejam alcançados a forma e o grau de esferonização desejados. Os
esferonizadores consistem em uma placa rotatória, contendo ranhuras perpendiculares ou

14
radiais, dentro de uma câmara cilíndrica (Fig. 4B). O diâmetro desta placa rotatória é
variável conforme de acordo com a quantidade de material que se deseja processar. Todos
os esferonizadores possuem a parede do interior do cilindro lisa e polida. O processo tem
início quando, por ação da placa de esferonização, o produto de extrusão é quebrado em
comprimentos uniformes e gradualmente moldado em forma esférica (Santos et al. 2004).
A esferonização pode ser dividida em diferentes estágios seqüenciados, como descrita por
Rower (1985): numa primeira fase o extrusado cilíndrico é quebrado em dimensões
menores e de comprimento igual ao seu diâmetro; segue-se a formação de uma estrutura em
forma de haltere, que é moldada em forma elíptica e finalmente modelada em forma
esférica (Fig. 4C). Outro mecânimo descrito por Baert & Remon (1993) sugere que o
extrusado sofre uma torção central, seguida de quebra e por seguinte a formação das esferas
(Fig. 4D; Santos et al. 2004). Nesta etapa, fatores como tempo de esferonização,
velocidade e carga de materiais podem influeciar nas caracterisiticas finais dos pellets.

1.5.4 Secagem

Os pellets produzidos na fase de esferonização são prontamente coletados e seguem

para a secagem. A secagem pode ser feita em leito estático (estufa) ou em leito fluidizado.
A escolha da temperatura em que é realizada a secagem é determinada pelas características
físico-químicas dos ativos e excipientes utilizados. A opção por secagem em leito
fluidificado requer a utilização de um sistema que permita a introdução de ar seco e
aquecido para dentro da câmara de secagem, promovendo, assim, a secagem do material e
produzindo, ao mesmo tempo, o constante movimento (Santos et al. 2004). O tempo de
secagem varia de acordo com o método escolhido e temperatura utilizada, podendo variar
de minutos (leito fluidizado) a horas (estufa).

15
2 JUSTIFICATIVA

Epidemias recorrentes de Dengue, com números alarmantes de casos notificados, têm

intensificado o combate a A. aegypti, atualmente seu principal vetor. As campanhas são
feitas com destruição de criadouros, conscientização da população e aplicações de
inseticidas químicos. Entretanto há relatos do aparecimento de populações de mosquitos
resistentes a inseticidas químicos utilizados, o que pode comprometer o sucesso das
campanhas. Por isso, a busca por métodos de combate integrado deve ser incentivada.
Fungos entomopatogênicos agem por mecanismos complexos de infecção, que envolvem
diversas etapas, portanto, o aparecimento de mosquitos resistentes a fungos parece
improvável. C. clavisporus, espécie que infecta principalmente larvas de dípteros, não
apresenta risco para o homem ou outros animais, inclusive outras famílias de insetos.
Atualmente esta espécie é pouco estudada, e tem grande interesse para o desenvolvimento
como micoinseticida. Para este fungo ser mais efetivo no campo, devem ser feitas
formulações adaptadas ao comportamento do vetor alvo. Além disso, estes formulados,
granulados por exemplo, devem proteger o fungo de condições estressantes de fatores
abióticos. Ainda é desconhecido o efeito de formulados granulados contendo conídios de C.
clavisporus contendo aditivo palatável para larvas de A. aegypti. Acredita-se que este
aditivo estimula as larvas a ingerirem o formulado contendo conídios. A padronização da
preparação de pellets contendo conídios de C. clavisporus e o conhecimento acerca da sua
estabilidade e ação em larvas irá contribuir para o desenvolvimento de um micoinseticida à
base deste fungo para combate de A. aegypti.

16
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral

Contribuir com o desenvolvimento de uma formulação granulada contendo conídios de C.

clavisporus para controle de larvas de A. aegypti.

3.2 Objetivos específicos

- Testar a patogenicidade e a virulência de C. clavisporus ARSEF 644 em larvas de A.

aegypti.
- Padronizar a produção de pellets de celulose microcristalina contendo aditivo palatável
para larvas.
- Estudar a estabilidade em água de pellets de celulose com ou sem aditivo.
- Verificar o desenvolvimento de larvas de A. aegypti alimentadas com pellets com ou sem
aditivo.
- Produzir pellets formulados com conídios de C. clavisporus e testar o efeito em larvas de
A. aegypti
- Avaliar o efeito da temperatura sobre a viabilidade de conídios de C. clavisporus.

17
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Origem e criação de Aedes aegypti e preparação de larvas

A colônia de A. aegypti, originária de larvas coletadas em ovitrampas em Goiânia,

no ano de 2012, é mantida no Laboratório de Patologia de Invertebrados a 27 ± 5 ºC,
umidade relativa (UR) 75 ± 10 % e fotofase natural. Os machos e fêmeas adultos foram
criados em gaiolas teladas (50 cm de altura, 40 cm de largura e 50 cm de profundidade)
seguindo a metodologia descrita por Lima et al. (2009). No interior das gaiolas foram
colocados recipientes (100 ml) âmbar contendo papel filtro e água, local onde as fêmeas
fizeram a postura de ovos. Duas vezes por semana os papeis filtro contendo ovos foram
retirados e postos em câmara úmida (UR > 98%) por dois dias para completar a
embriogênese, e depois foram estocados dentro de caixa de plástico (12 cm de altura, 26 cm
de largura e 33 cm de profundidade) em BOD a 27 ± 1 ºC e UR 75 ± 10 % até a utilização.
Para manutenção da colônia e produção de larvas para ensaios, ovos foram
transferidos para bacias redondas de plástico (29 cm de largura e 15 cm de altura) contendo
em torno de 1,5 l de água de torneira. Após a eclosão, as larvas foram alimentadas com
ração triturada para gatos (Bom Preço®, Salto de Pirapora, Brasil). Larvas utilizadas nos
experimentos foram transferidas para um copo de plástico contendo 150 ml de água e
mantidas em jejum por até 24 horas. Larvas não utilizadas nos experimentos foram
alimentadas até a muda para pupas, que foram transferidas para potes de plástico contendo
150 ml de água de torneira, e estes foram colocados dentro da gaiola para a emergência de
adultos.

4.2 Origem, manutenção e produção de conídios de Culicinomyces clavisporus

C. clavisporus (ARSEF 644) foi obtido da coleção do USDA-ARS Biological

Integrated Pest Management Research, Robert W. Holley Center for Agriculture and
Health, Ithaca, EUA. ARSEF 644 foi isolado a partir de larva de Anopheles amictus hilli
em 1981 na cidade de Sydney, Austrália. O fungo foi repicado rotineiramente em placas de
Petri (100 mm de largura e 15 mm de altura) contendo 50 ml do meio BDA (amido de

18
batata 4 g, dextrose 20 g e ágar 15 g; Difco®, Becton, Dickinson and Company, Sparks,
USA) e incubado a 25 ± 1 ºC, 75 ± 10 % de UR e fotofase de 12 horas por 15 dias. Depois
foi mantido em geladeira a 4 ºC até a utilização.
Para produção de conídios foi utilizado meio pobre em nutrientes contendo milho e
extrato de levedura (ML) acrescido de cloranfenicol. Para a preparação do meio ML, foram
autoclavados 20 g de grãos de milho (Ecobio®, Salet Ltda, Coronel Biaco, Brasil) em 200
ml de água destilada por 20 minutos a 121 ºC. Os grãos de milho foram peneirados e
desprezados, e o líquido centrifugado a 4200 rotações por minuto (rpm) por 2 minutos. O
sobrenadante foi transferido para béquer e o material sólido obtido no sedimento foi
desprezado. O volume foi ajustado com água destilada para um litro e em seguida foram
acrescentados 1 g de extrato de levedura (Bacto®, Becton, Dickinson and Company) e 0,5 g
de cloranfenicol (Farmácia Officinal, Goiânia, Brazil). Em seguida, o meio foi agitado em
agitador magnético por 3 minutos. Aliquotas de cento e cinquenta ml do meio ML foram
transferidos para frascos de Erlenmeyer de 250 ml e autoclavados por 20 minutos a 121 ºC.
O meio foi estocado em geladeira a 4 ºC até a utilização.
Rotineiramente cubos de aproximadamente 1 cm2 foram cortados de culturas
fúngicas de C. clavisporus e adicionados a frascos contendo meio ML e em seguida os
frascos foram incubados em “Shaker” a 100 rpm e 25 ± 1 ºC. Após 15 dias de agitação, a
cultura foi filtrada em algodão hidrófilo e centrifugada a 4200 rpm por 4 minutos. O
sobrenadante foi desprezado e os conídios sedimentados, por duas vezes, suspensos em 30
ml de água deionizada estéril e a suspensão novamente centrifugada. Posteriormente, os
conídios foram ressuspendidos em 10 ml de água destilada estéril e quantificados com
câmara de Neubauer. As suspensões de conídios foram então ajustadas para as
concentrações (conídios/ml) necessitadas.

4.3 Avaliação do efeito larvicida de Culicinomyces clavisporus ARSEF 644 em Aedes

aegypti

Foram preparadas seis suspensões de conídios nas seguintes concentrações: 3,3x104;

105; 3,3x105; 106; 3,3x106 e 107 conídios/ml. Trinta e cinco ml de cada suspensão foram
colocadas em copo de plástico (50 ml) e em seguida adicionadas 10 larvas de terceiro

19
estádio (L3). Para o controle foram utilizados 35 ml de água deionizada autoclavada. Os
copos foram cobertos com filme de PVC contendo 10 furos feitos com agulha hipodérmica
(0,70 x 25 mm). As larvas foram incubadas a 25 ± 1 ºC e fotofase de 12 horas por até 10
dias, sendo alimentadas a cada dois dias. Diariamente a mortalidade de larvas foi
quantificada. Larvas mortas foram retiradas e colocadas em outro copo contendo 35 ml de
água destilada e incubadas nas mesmas condições por até 10 dias. Ao final de cada
experimento, e a fim de se comprovar a morte por infecção, larvas mortas foram colocadas
em lâmina e examinadas em lupa (20x). Em seguida, as larvas foram coradas com solução
de Amann diluída 1:1 com ácido lático e o desenvolvimento de hifas e a conidiogênese
foram observados em microscópio ótico (400 x). Foram feitas quatro repetições
independentes.

4.4 Produção de pellets

Os pellets foram produzidos no Laboratório Farmatec da Faculdade de

Farmácia/UFG. Foram preparados pellets contendo 100% de celulose microcristalina
(Mingtai Chemical Co Ltd., Bah - Der City, Taiwan; 30 g), 90% celulose (27 g) + 10%
farinha de soja (Viapaxbio, Joinville, Brasil; 3 g) ou 80% celulose (24 g) + 20% de farinha
de soja (6 g), contendo ou não conídios na concentração de 108 conídios/g de pellets.
Na preparação, a celulose foi pesada e misturada, ou não, com a farinha de soja. Em
pellets formulados com conídios, foi utilizado na malaxagem 30 ml de suspensão de
conídios na concentração 1,0x108 conídios/ml, em pellets sem conídios foi utilizado 30 ml
de água deionizada. A homogeneização de conídios e umidificação foram feitas
gradativamente e manualmente por mais ou menos 5 minutos. A massa úmida e homogênea
foi extrusada em um extrusor de rolos (20 Extruder, Caleva, Sturminster Newton,
Inglaterra) com malha de 0,5 mm a 25 rpm. Após toda massa ser extrusada (5 minutos em
média), o extrusado foi colocado em um esferonizador (Multi Bowl Spheronizer, Caleva),
com placa com ranhuras perpendiculares, por 5 minutos a 1500 rpm (Fig. 6). Os pellets
formados foram secos em leito fluidizado (Hüttlin, Bosch, Stuttgart, Alemanha) a 40 ºC por
30 minutos ou em estufa a 32 ºC por 24 horas. Após a secagem os pellets foram analisados

20
quanto ao seu teor de umidade utilizando uma balança de infravermelho (IV2000, Gehaka,
São Paulo, Brasil).

Figura 6 – Processo de preparado de pellets por extrusão-esferonização: Massa obtida após

a malaxagem (A). Extrusor de rolos (B). Material em processo de extrusão (C).
Esferonizador (D). Pellets formados após o processo de esferonização (E).

21
4.5 Avaliação da manutenção da estrutura de pellets em água

Quinze mg de pellets, sem conídios, contendo 0%, 10% ou 20% farinha de soja
foram quantificados, em seguida colocados em recipiente de plástico (50 ml) contendo 35
ml de água deionizada. Os copos foram cobertos com filme de PVC e incubados a 25 ± 1
ºC por 15 dias. Diariamente os pellets foram examinados e quantificados quanto a sua
inalteração, presença de rachaduras, erosão e/ou desintegração, sendo analisados 100
pellets por recipiente. Pellets foram considerados inalterados quando não foram observadas
modificações em sua estrutura, rachados quando haviam rupturas da superfície externa e
erodido e/ou desintegrados quando estavam parcialmente ou completamente
desestruturados. Foram feitas três repetições independentes.

4.6 Avaliação do desenvolvimento de larvas de Aedes aegypti alimentadas com pellets

Quarenta mg de pellets, sem conídios, contendo 0%, 10 % ou 20% farinha de soja

ou 40 mg de ração triturada para gatos foram colocados em recipientes de plástico (50 ml)
contendo 35 ml de água de torneira, e posteriormente foram adicionadas 10 larvas L1 ou
L3. Os recipientes foram cobertos com filme PVC contendo 10 furos feitos com agulha
hipodérmica (0,7 x 25 mm), e incubados a 25 ± 1 ºC e fotofase de 12 horas por até 15 dias.
Para o controle foi utilizada apenas água de torneira, sem nenhum tipo de alimentação.
Diariamente o desenvolvimento ou morte de larvas foram quantificados, e as exúvias
retiradas a fim de comprovar a mudança de estádio/estágio. Foram feitas três repetições
independentes.

4.7 Avaliação da atividade larvicida de pellets formulado com conídios de

Culicinomyces clavisporus em Aedes aegypti

Trinta e cinco mg de pellets formulado com conídios na concentração de 108

conídios/g, secos em leito ou estufa e contendo 0% ou 10% de farinha de soja foram

22
colocados em recipientes de plástico (50 ml) contendo 35 ml de água de torneira. Dez
larvas de terceiro estádio foram colocadas em cada copo, e os copos incubados a 25 ± 1 ºC
e fotofase de 12 horas por até 15 dias. Os controles foram feitos utilizando 35 ml de água
de torneira ou 35 ml de suspensão de conídios na concentração de 105 conídios/ml. Está
concentração de conídios foi calculada levando em consideração que 35 mg de pellets
contém 3,5 x 106 conídios, e em 35 ml de água a concentração final seria de 105
conídios/ml. O desenvolvimento e mortalidade de larvas foram quantificados diariamente.
Larvas mortas foram retiradas e colocadas em outro recipiente contendo 35 ml de água
deionizada e incubadas nas mesmas condições. A fim de se comprovar a morte por
infecção, ao final de cada experimento, larvas mortas foram colocadas em lâmina e
examinadas em lupa (20x). Em seguida, as larvas foram coradas com solução de Amann
diluída 1:1 com ácido lático e o desenvolvimento de hifas e a conidiogênese foram
observados em microscópio ótico (400 x). Foram feitas duas repetições com duas réplicas
cada para cada método de secagem de pellets de utilizado.

4.8 Avaliação do efeito da temperatura sobre a viabilidade de conídios de

Culicinomyces clavisporus

Foi preparada suspensão de conídios na concentração de 105 conídios/ml. Alíquotas

de 5 ml da suspensão foram colocadas em tubos de ensaio com rosca (16  125 mm) e em
seguida expostas em banho-maria a 40 ± 1 ºC por 30 minutos, 32 ± 1 ºC, 27 ± 1 ºC ou 25 ±
1 ºC por 24 horas. Após a exposição, 20 µl das suspensões foram inoculadas em 4 ml de
meio BDA acrescido de extrato de levedura (1 g/l) e cloranfenicol (0,5 g/l), e as placas
incubadas por períodos de 24, 48 ou 72 horas a 25 ± 1 ºC, 75 ± 10 % UR e fotofase de 12
horas. O controle foi feito inoculando a suspensão de conídios sobre o meio BDAL sem a
exposição prévia e incubados nas mesmas condições. Após a incubação, uma gota de
solução de Amann diluída 1:1 com ácido lático foi adicionada à placa e a germinação foi
quantificada em microscópio ótico. Conídios foram considerados germinados quando o
tamanho do tubo germinativo era maior que o comprimento mínimo do conídio. Foram
contados 300 conídios por placa (entre germinados e não germinados) e o percentual
relativo de germinação foi calculado através da relação com a germinação dos conídios

23
expostos às temperaturas (Gt) com a germinação de conídios do controle (Gc), utilizando-
se a seguinte equação: Germinação Relativa (%) = (Gt/Gc)  100 (Braga et al. 2001).
Foram feitas três repetições independentes.

4.9 Análise de resultados

Resultados percentuais da mortalidade e germinação foram transformados em arcsin

e examinados com análise de variância (ANOVA) e teste de comparação multiple Student-
Newman-Keuls. Médias foram consideradas significativamente diferentes com P < 0,05.
Os tempos letais necessários para matar 50 e 90% das larvas (TL50 e TL90) e seus intervalos
de confiança (IC 95%) e concentrações letais para matar 50 e 90% das larvas (CL50 e CL90)
foram calculados com análise de Probit para valores dependentes e independentes,
respectivamente (Preisler & Robertson 1989, Throne et al. 1995).

24
5 RESULTADOS
5.1 Efeito larvicida de Culicinomyces clavisporus em Aedes aegypti
Houve efeito significativo da concentração de conídios na mortalidade de larvas
(F6,21 ≥ 131,1; P < 0,001), que variou entre 62,5% (3,3x104 conídios/ml) a 100% (≥ 105
conídios/ml; Tab. 1). Quando expostas à concentração ≥ 106 conídios/ml, pelo menos
77,5% das larvas haviam morrido com três dias de incubação (Tab. 1; Fig. 7). Nestes três
primeiros dias, não houve mortalidade das larvas expostas a conídios nas concentrações de
≤ 3,3x104 conídios/ml e no controle. No sexto dia de incubação, 100% das larvas haviam
morrido nas concentrações ≥ 3,3x105 conídios/ml (Tab. 1; Fig. 7). A mortalidade
acumulada do controle foi ≤ 5% ao final dos experimentos. Já os tempos letais para matar
50 e 90% (TL50 e TL90) das larvas foram menores na concentração 107 conídios/ml (1,7 e
2,6 dias) e maiores na concentração 3,3x104 conídios/ml (8,6 e 13,1 dias; Tab. 1).

Figura 7 – Mortalidade relativa acumulada de larvas de terceiro estádio de

Aedes aegypti expostas à conídios de Culicinomyces clavisporus em
diferentes concentrações (3,3x104, 105, 3,3x105, 106, 3,3x106 ou 107
conídios/ml) por até 10 dias.

25
Tabela 1 – Mortalidade acumulada (% ± erro padrão da média; EM) de larvas de Aedes aegypti expostas a diferentes concentrações de
conídios de Culicinomyces clavisporus e incubadas1 por até 10 dias, e tempos letais para matar 50 (TL50) e 90% (TL90) de larvas com
os seus respectivos intervalos de confiança (95% IC) e slope (± EM).

Concentração Mortalidade acumulada (% ± EM) Tempo letal (95% IC)

(conídios/ml) 3° dia 6° dia 10° dia TL50 TL90 Slope ±EM
Controle2 0a 0a 5 ± 3,3a 3 3
-
3,3x104 0a 17,5 ± 7,3b 62,5 ± 15,2b 8,6 (6,0 - 13,6)d 13,1 (10,2 - 28,6)c 0,3 ± 0,05
105 0a 45 ± 3,3c 100c 6,2 (4,8 - 7,6)d 8,6 (7,3 - 11,6)c 0,5 ± 0,07
3,3x105 40 ± 8,2b 100d 100c 3,2 (2,6 - 3,6)c 4,7 (4,2 - 5,5)b 0,8 ± 0,16
106 77,5 ± 7,3c 100d 100c 2,7 (2,1 - 3,1)b 4,6 (3,9 - 5,8)b 0,6 ± 0,12
3,3x106 92,5 ± 5,5d 100d 100c 2,4 (1,9 - 2,7)b 3,7(3,3 - 4,5)b 0,9 ± 0,16
107 100e 100d 100c 1,7 (1,2 - 2,1)a 2,6(2,2 - 2,9)a 0,9 ± 0,16
F6,21 131,1 184,1 56,1 - - -
P <0,001 <0,001 <0,001 - - -

1 - 25 ± 1 ºC e fotofase de 12 horas
2 - Água destilada estéril sem conídios
3 - Valores insuficientes para o cálculo dos tempos letais.
Valores na mesma coluna seguidos por letras diferentes (a - e) foram significativamente diferentes entre si (P < 0,05).

26
 As concentrações letais para matar 50 e 90% (CL50 e CL90), calculadas com base na
mortalidade acumulada do terceiro dia foram 4,5x105 (Intervalo de confiança IC 95%:
3,6x105 - 5,8x105) conídios/ml e 1,4x106 (IC 95%: 9,7x105 - 2,3x106) conídios/ml,
respectivamente. As larvas mortas analisadas apresentaram coloração escura por todo o seu
corpo (Fig. 8A), e foram observados crescimento de hifas e conidiogênese de C.
clavisporus (Fig. 8B, C).

Figura 8 – Larva de terceiro estádio de Aedes aegypti morta por infecção por Culicinomyces
clavisporus (A). Estruturas fúngicas, hifas e conídios (seta vermelha), coradas por solução
de Amann (B, C).

5.2 Secagem, estrutura dos pellets e a sua estabilidade em água

Na Fig. 9A é apresentado o extrusado de celulose microcristalina, momentos antes

da esferonização. Após a secagem em leito fluidizado a 40 ºC por 30 minutos, os pellets,
independentemente do acréscimo ou não de farinha de soja, apresentaram umidade final ≤
3,5%, já a secagem em estufa a 32 ºC por 24 horas resultou em umidades de ≤ 5,7%. A
distribuição da forma dos pellets, sem ou com farinha de soja, foi heterogênea, com pellets
esféricos, na forma de bastonete ou de halteres (Fig. 9).
Após a colocação em água, a maior parte dos pellets imediatamente sedimentou e
ficou depositada no fundo do copo. Uma pequena parte (± 10%) flutuou na superfície da
água, mas também sedimentou em menos de 24 horas. No primeiro dia de exposição à
água, houve efeito significativo da porcentagem de farinha soja no aparecimento de
rachaduras nos pellets (F1,7 = 31,9; P < 0,001). Entre os dias 5 e 10 não foi observado efeito
significativo (F1,7 ≤ 5,1; P ≥ 0,2), porém, no dia 15 houve novamente efeito significativo
27
(F1,7 = 5,7; P = 0,04; Tab. 3; Fig. 9). Em relação à erosão/dissolução, houve efeito
significativo da porcentagem de soja (F1,7 ≥ 21; P < 0,001). Foram observados rachaduras
na superfície dos pellets um dia após serem expostos à água, sendo o maior número (≥
59,7%) em pellets contendo farinha de soja. A erosão/desintegração em 3% dos pellets
contendo 20% de farinha de soja começou no quinto dia de incubação (Tab. 2; Fig. 10). Ao
final dos experimentos não foram observados erosão/desintegração em pellets contendo
somente celulose, mas 80 ± 1,5% apresentaram rachaduras. Já nos pellets contendo farinha
de soja, houve a erosão/dissolução de 8,3 e 23% de pellets contendo 10 ou 20% de farinha
de soja, respectivamente (Tab. 2; Fig. 10). Após 10 dias de incubação, foi possível observar
um crescimento moderado de filme sobre os pellets.

Figura 9 - Extrusado de celulose microcristalina momentos antes do processo de

esferonização (A). Pellets após a secagem em leito fluidizado (B). Pellets na forma esférica
(seta branca), halteres (seta vermelha) ou bastonete (seta verde) (C e D).

28
 Figura 10 – Pellets sem ou com farinha de soja (10 ou 20%) sem alterações (A), rachados (B) ou erodidos/desintegrado (C) expostos à água por até
15 dias.

Tabela 2 – Número relativo de pellets de celulose com ou sem farinha de soja (10 ou 20%) sem alterações estruturais (SA; %), rachados (R; %) ou
erodidos/desintegrado (E/D; %) expostos à água e incubados por até 15 dias1.

1 - Os pellets foram considerados SA quando não eram observadas alterações em suas estruturas, R quando haviam rupturas na sua estrutura externa e
E/D quando estavam parcialmente ou completamente desintegrado.
3 - Foram pesados cerca de 15 mg de pellets e quantificados, em seguida colocados em 35 ml de água de torneira e incubados a 25 ± 1 ºC.
29
5.3 Desenvolvimento e mortalidade de larvas de Aedes aegypti alimentadas com pellets
sem conídios

Imediatamente após colocar larvas em contato com pellets, foi possível ver larvas se
alimentando dos pellets sedimentados, independente da presença ou não de farinha de soja.
A alimentação ocorreu basicamente por raspagem dos pellets, e não foi observada nenhuma
larva tentando ingerir um pellet inteiro, mesmo as que estavam em estádios mais avançados
de desenvolvimento.
Houve efeito significativo do alimento no desenvolvimento de larvas (F4,10 ≥ 205,1;
P < 0,001). As larvas alimentadas com ração desenvolveram mais rapidamente se
comparado com as que foram alimentadas com pellets sem ou com farinha de soja. L1
alimentadas com pellets sem soja se desenvolveram somente até L2, enquanto que 23,3% e
66,7% das larvas alimentadas com pellets acrescidos de 10% ou 20% de farinha de soja se
desenvolveram para adultos, respectivamente (Fig. 11). Nos experimentos iniciados com
L3, não houve mudança de estádio em larvas alimentadas com pellets sem farinha de soja,
já larvas que se alimentaram de pellets contendo 10% ou 20% de soja, houve mudança para
adultos em 36,7% e 83,3% delas, respectivamente (Fig. 11).
A mortalidade acumulada no 15º dia de larvas alimentadas com pellets (com ou sem
soja) foi maior nos experimentos iniciados com L1, se comparado com o experimento
inciado com L3, variando de 6,7% (pellets com 20% de farinha de soja) a 56,7% (pellets
0% farinha de soja). Já nos experimentos iniciados com L3, a mortalidade foi 3,3% (pellet
10% soja) e 51,3% (pellets 0% farinha de soja), não ocorrendo mortes de larvas
alimentadas com pellets com 20% de farinha de soja. Nos controles, sem ração ou pellets, a
mortalidade foi 100% e 73,3% nos experimentos iniciados com L1 e L3, respectivamente
ao final do experimento (Fig. 11).

30
Figura 11 – Desenvolvimento de larvas de primeiro (L1) ou terceiro estádio (L3) alimentadas com 40 mg de ração ou pellets com ou
sem farinha de soja (10 ou 20%) e incubados a 25 ºC por até 15 dias. Controle feito apenas com água de torneira.

31
5.4 Atividade larvicida de Culicinomyces clavisporus formulado em pellets

No quinto dia de incubação, a mortalidade acumulada de larvas variou de 0%

(pellets formulados com conídios e 10% de soja) a 45% (suspensão de conídios). No
décimo dia, 100% das larvas expostas à suspensão de conídios haviam morrido. Já em
larvas expostas a pellets (com ou sem soja) a mortalidade foi ≤ 15%. A mortalidade
acumulada de larvas expostas a pellets com conídios, sem ou com farinha de soja (10%),
foi ≤ 50% e ≤ 15% no 15º dia de incubação, respectivamente (Tab. 3). Foi observado
crescimento de hifas ou conidiogênese em cadáveres de larvas expostas à suspensão de
conídios, porém não foi possível observar em cadáveres de larvas expostas aos pellets (0 ou
10% de soja). Não houve desenvolvimento de larvas expostas à suspensão de conídios ou a
pellets sem soja. Entretanto, 30% das larvas expostas a pellets contendo farinha de soja se
desenvolveram até adulto (Tab. 3).

Tabela 3 – Mortalidade acumulada (% ± EM) de larvas de Aedes aegypti expostas a pellets

secos em leito fluidizado1 ou estufa2 (0 ou 10% farinha de soja; FS) contendo conídios de
Culicinomyces clavisporus (108 conídios/g) e incubadas por até 15 dias3.
Mortalidade acumulada ( % ± EM)
Secagem Formulado
5º dia 10º dia 15º dia
suspensão de conídios4 45 ± 5 100 100
Leito fluidizado pellet com conídios e 0% FS5 5±5 15 ± 5 50 ± 10
pellet com conídios e 10% FS 0 10 ± 5 10 ± 5

suspensão de conídios4 40 ± 10 100 100

Estufa pellet com conídios e 0% FS 10 15 ± 5 45 ± 5
pellet com conídios e 10% FS 5±5 5±5 15 ± 5

1 - 40º C por 30 minutos.

2 - 32º C por 24 horas.
3 - 35 mg de pellet foram colocados em 35 ml de água deionizada, em seguida adicionadas
10 L3 e incubadas a 25 ± 1 ºC e fotofase de 12 horas.
4 - 35 ml de suspensão de conídio a 105 conídios/ml.

32
5.5 Efeito da temperatura sobre a viabilidade de conídios de Culicinomyces clavisporus

Houve efeito significativo da temperatura sobre a germinação de conídios de C.

clavisporus (F4,10 ≥ 519,1; P < 0,001). Conídios do controle ou expostos à temperatura de
25 ºC ou 27 ºC obtiveram germinação semelhante nos três períodos de incubação, sendo ≥
78,4% (27 ºC) após 24 horas de incubação, ≥ 92,9 % (27 ºC) após 48 horas e ≥ 94,2% (25
ºC) após 72 horas (Tab. 4). Em conídios expostos a 32 ou 40 ºC foi observado germinação
≤ 5,3% (32 ºC) após 72 horas de incubação (Tab. 4). A germinação relativa calculada foi de
100% para as temperaturas de 25 ºC e 27 ºC, e < 0,6 ± 0,3% e 5,3 ± 0,5% para 32 e 40 ºC,
respectivamente (Tab. 4).

33
Tabela 4 – Conídios de Culicinomyces clavisporus germinados (G; %) ou não germinados (NG; %) e germinação relativa ao controle
(GR; %) de conídios expostos à diferentes temperaturas1 e posteriormente incubados sobre meio BDAL por até 72 horas2.
Tempo de incubação (horas)
Temperatura de 24 48 72
exposição (ºC)
G NG GR4 G NG GR4 G NG GR4
Controle3 78,4 ± 1,9a 21 ± 1,9a - 93 ± 0,4a 7 ± 0,4a - 94,8 ± 0,3a 5,2 ± 0,3a -
25 79,1 ± 1,2a 20,9 ± 1,2a 100 93,4 ± 0,6a 6,5 ± 0,6a 100 94,2 ± 0,5a 5,8 ± 0,5a 100
27 78,3 ± 1,7a 21,6 ± 1,7a 100 92,9 ± 0,4a 7,1 ± 0,4a 100 94,5 ± 0,3a 5,5 ± 0,3a 100
32 5,3 ± 0,5b 94,6 ± 0,5b 6,8 6,3 ± 0,7b 93,7 ± 0,7b 6,8 5,3 ± 1b 94,6 ± 1b 5,6
40 0,6 ± 0,3c 99,4 ± 0,3c 0,7 0,7 ± 0,3c 99,7 ± 0,1c 0,7 0,7 ± 0,1c 99,3 ± 0,1c 0,8
F4,10 > 519,1 > 840,6 > 1054
P < 0, 001 < 0,001 < 0,001

1 - Conídios foram expostos a 25 ºC, 27 ºC ou 32 ºC por 24 horas ou 40 ºC por 30 minutos.

2 - Após a exposição, os conídios foram inoculados sobre BDAL e incubados por 24, 48 ou 72 horas a 25 ºC e UR 75 ± 10%.
3 - Conídios foram inoculados sobre BDAL sem sofrer exposição prévia à nenhuma temperatura.
4 - A germinação relativa foi calculada através da formula: GR (%) = (Gt/Gc) x 100.
Valores na mesma coluna seguidos por letras diferentes (a - c) foram significativamente diferentes entre si (P < 0,05).

34
6 DISCUSSÃO

C. clavisporus ARSEF 644 foi patogênico para larvas de A. aegypti e altamente

virulento em concentrações ≥ 105 conídios/ml. Este resultado é compatível ao encontrado
por Cooper & Sweeney (1982), que determinaram que concentrações de 104 a 106
conídios/ml de outros isolados de C. clavisporus são suficientes para provocar 100% de
mortalidade de larvas de espécies dos gêneros Aedes, Anopheles e Culex. No presente
estudo em todas as larvas mortas foi observado conidiogênese de C. clavisporus. Em testes
de laboratório feito com L1 de C. quinquefasciatus por Cooper e Sweeney (1986), a
conidiogênese de C. clavisporus foi observada em 87 a 95% de cadáveres, após cinco dias
de exposição ao fungo.
As umidades obtidas após as secagens dos pellets, em leito fluidizado ou estufa,
foram adequadas para a sua conservação, pelo menos até serem utilizados nos experimentos
do presente estudo. Porcentagens elevadas de umidade em pellets podem promover o
crescimento de fungos e/ou bactérias saprobiônticas, que necessitam de maiores
quantidades de água para se desenvolver. Isso explica o crescimento moderado de micro-
organismos em alguns pellets após serem colocados em água, especialmente nos que
continham 20% de soja. Apesar de não ter sido notado problemas relacionados com o
crescimento destes micro-organismos, isso pode ser evitado com a adição de conservantes
que não afete a ação de C. clavisporus.
A forma esférica é a forma ideal para os pellets, já que assim a determinação da
dose de conídios presente em cada unidade seria mais precisa. Os seguintes fatores podem
ter influenciado na forma final dos pellets, como as propriedades físico-químicas da farinha
de soja, a quantidade de líquido de granulação ou o tempo de preparo. Porém, as formas de
bastonetes e halteres não influencia a ingestão de pellets pelas larvas. Os pellets
apresentaram densidade superior à da água (1g/cm3), já que houve 100% de sedimentação,
sendo favorável ao comportamento de larvas de A. aegypti, que se alimentam
preferencialmente de substâncias depositadas no fundo dos criadouros.
Pellets preparados somente com celulose apresentaram mais estabilidade em água,
não sendo observada nenhuma desintegração, enquanto pellets contendo 10 ou 20% de
farinha de soja foram mais instáveis. Isto pode ser explicado devido às características

35
adquiridas pela celulose microcristalina, que após a secagem, produz poros muito pequenos
nos pellets (0,2 µm), o que dificulta a entrada de água nos pellets (Alvares et al. 2009).
Com a adição da farinha de soja, estes poros provavelmente tiveram tamanhos maiores,
facilitando a entrada de água nos pellets. Esta entrada de água promove o intumescimento
dos pellets, enfraquecendo a sua estrutura, e consequentemente a sua erosão e desintegração
(Santos et al. 2006). O número de poros pode ter sido determinado pela quantidade de
farinha de soja acrescentada, já que houve maiores porcentagens de desintegração em
pellets contendo 20% de soja. Pellets com a sua estrutura enfraquecida são mais fáceis de
serem raspados e ingeridos pelas larvas, mesmo que não tenha ocorrido erosão ou
desintegração.
A soja promoveu o aumento da ingestão de pellets pelas larvas, porém forneceu
aporte necessário para o seu desenvolvimento. Entretanto, o desenvolvimento de larvas
alimentadas com pellets, especialmente os que continham 10% de soja, foi mais lento se
comparado com larvas alimentadas com ração. Portanto, pellets preparados com 10% de
farinha de soja são mais interessantes para a formulação fúngica, porque atraem as larvas,
mas não provocam o seu rápido desenvolvimento, além de se desintegrar com mais
facilidade, se comparado com pellets formulado somente com celulose.
Não houve a mortalidade esperada de larvas expostas aos formulados contendo
conídios de C. clavisporus. A mortalidade de 45% das larvas expostas aos pellets sem soja
pode ter ocorrido devido à falta de nutrientes e não por infecção, já que não foram
observados crescimento de hifas ou conidiogênese nos cadáveres. A ineficiência dos
formulados pode ser explicada devido à inviabilização dos conídios por calor no momento
da secagem. Fato comprovado pelos testes de termotolerância de conídios, que foram feitos
posteriormente aos testes com os formulados, onde a germinação não ultrapassou 6,3%,
após conídios terem sidos expostos à temperatura de 32 ou 40 °C. Testes feitos em
laboratórios por Sweeney (1978) mostraram que morte de larvas por infecção de C.
clavisporus ocorrem preferencialmente às temperaturas que variam entre 15 a 27,5 ° C. Já à
temperatura de 30 °C, ocorreu a germinação e penetração de hifas na parede intestinal por
hifas, porém não ocorreu a colonização da hemocele da larva (Sweeney 1978). Entretanto,
não há relatos da viabilidade de conídio de C. clavisporus após exposição in vitro à
temperaturas acima de 30 °C.

36
 Apesar dos bons resultados em relação à umidade final obtida, as temperaturas de
secagens (32 e 40 °C) se mostraram inviáveis de serem utilizadas nos formulados, pois os
conídios de C. clavisporus provavelmente foram inviabilizados. Portanto, para garantir a
efetividade destes formulados, devem ser feitos novos estudos utilizando temperaturas
abaixo de 30 °C.

37
7 CONCLUSÕES

C. clavisporus ARSEF 644 foi patogênico e virulento para larvas de A. agypti, além
de promover a conidiogênese em larvas mortas.
Pellets de celulose contendo 10% de farinha de soja são promissores para o
desenvolvimento de formulado contendo conídios de C. clavisporus, pois essa formulação
atrai as larvas e favoreceu a desintegração dos pellets e aumentou a ingestão de fragmentos
pelas larvas, porém, sem promover o desenvolvimento rápido de larvas.
As temperaturas utilizadas nas secagens dos pellets se mostraram inadequadas para
a produção de pellets com C. clavisporus, pois, inviabilizaram os conídios de C.
clavisporus.

38
REFEREÊNCIAS

Akbar W, Lord J, Nechols JR, Howard RW 2004. Diatomaceous earth increases the
efficacy of Beauveria bassiana against Tribolium castaneum larvae and
increases conidia attachment. J Econ Entomol 97: 273-280.
Almeida JEM, Batista Filho A 2001. Bando de microrganismos entomopatogênicos.
Biotecnologia Ciências & Desenvolvimento 20: 30-33.
Alvarez L, Concheiro A, GÓmez-Amoza JL, Souto C, MartÍnez-Pacheco R 2003.Powdered
cellulose as excipient for extrusion–spheronization pellets of a cohesive hydrophobic
drug. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 55: 291-295.
Alves SB 1998. Controle Microbiano de Insetos. Piracicaba FEALQ: pp 1163.
Alves SB, Alves LFA, Lopes RB, Pereira RM, Vieira SA 2002. Potential of some
Metarhizium anisopliae isolates for control of Culex quinquefasciatus (Dipt.,
Culicidae). J Appl Entomol 126: 504-509.
Alves LFA, Buzarello GD, Oliveira DGP, Alves SB 2006. Ação da terra de diatomácea
contra adultos do cascudinho Alphitobius diaperinus (Panzer, 1797) (Coleoptera:
Tenebrionidae). Arq Inst Biol 73: 115-118.
Athanassiou CG, Steenberg T 2007. Insecticidal effect of Beauveria bassiana (Balsamo)
Vuillemin (Ascomycota: Hypocreales) in combination with three diatomaceous
earth formulations against Sitophilus granarius (L.) (Coleoptera: Curculionidae).
Biol Control 40: 411-416.
Aulton ME 2005. Delineamento de formas farmacêuticas. 2. ed. Porto Alegre: Artmed
p.369-401
Badano EI, Regidor HA 2002. Selección de hábitat de oviposición en Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) mediante estímulos físicos. Ecol Aust 12: 129-134.
Batta YA 2003. Production and testing of novel formulations of the entomopathogenic
fungus Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin (Deuteromycotina:
Hyphomycetes). Crop Prot 22: 215-422.
Batta YA 2008. Control of main stored-grain insects with new formulations of
entomopathogenic fungi in diatomaceous earth dusts. Int J Food Engineering 4: 1-18.

39
Beserra EB, Fernandes CRM, Queiroga MFC, De Castro JRFP 2007. Resistência de
populações de Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) ao organofosforado temefós na
Paraíba. Neotrop Entomol 36: 303-307.
Borges RA, Cavasin GMO, Silva IG, Arruda W, Oliveira ESF, Silva HHG, Martins F 2004.
Mortalidade e alterações morfológicas provocadas pela ação inibidora do
diflubenzuron na ecdise de larvas de Aedes aegypti. Rev Pat Trop 33: 91-104.
Braga GUL, Flint SD, Miller CD, Anderson AJ, Roberts DW 2001a. Both solar UVA and
UVB radiation impair conidial culturability and delay germination in the
entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Photochemical Photobiology 74:
734-739.
Braga IA, Mello CB, Montella IR, Lima JBP, Martins Júnior A, Medeiros PFV, Valle D
2005. Effectiveness of methoprene, an insect growth regulator, against temephos
resistant Aedes aegypti populations from different Brazilian localities, under
laboratory conditions. J Med Entomol 42: 830-837.
Braga IA, Valle D 2007a. Aedes aegypti: inseticidas, mecanismos de ação e resistência.
Epidemiol Serv Saude 16: 279-293.
Braga IA, Valle D 2007b. Aedes aegypti: vigilância, monitoramento da resistência e
alternativas de controle no Brasil. Epidemiol Serv Saude 16: 295-302.
Bukhari T, Middelman A, Koenraadt CJ, Takken W, Knols BG 2010. Factors affecting
fungus-induced larval mortality in Anopheles gambiae and Anopheles stephensi.
Malar J 9: 22.
Burgues HD 1998. Formulation of microbial biopesticides. Klumer Ac Pub. Dordrecht: pp
412.
Consoli RAGB, Oliveira RL 1998. Principais mosquitos de importância sanitária no
Brasil. 1ª ed., Fiocruz, Rio de Janeiro, 228 pp.
Cooper R, Sweeney AW 1982. The comparative activity of the Australian and United
States strains of Culicinomyces clavosporus bioassayed in mosquito larvae of three
different genera. Journal of Invertebrate Pathology 40: 383-387.
Cooper RD, Sweeney AW 1986. Laboratory on the recycling potential of the mosquito
pathogenic fungus Culicinomyces Clavisporus. J Invertebr Pathol 48: 152-158.

40
Cunha MP, Lima JNP, Brongdon WG, Moya GE, Valle D 2005. Monitoring of resistance
to the pyrethroid cypermethrin in Brazilian Aedes aegypti (Diptera: Culicidade)
populations collected between 2001 and 2003. Mem Inst Oswaldo Cruz 100: 441-444.
Darriet F, Corbel V 2008. Propriétés attractives et modifications physicochimiques des
eaux de gîtes colonisées par des larves de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). C R

Biologies 31: 617- 622.

Debenham ML, Russell RC 1977. The insect pathogenic fungus Culicinomyces in adults of
the mosquitoes Anopheles amictis hilli. Journal of Australian Entomological Society
16: 46.
Destéfano RHR, Destéfano SAL, Messias CL 2004. Detection of Metarhizium anisopliae
var. anisopliae within infected sugarcane borer Diatraea saccharali (Lepidoptera,
Pyralidae) using specific primers. Gen Mol Biol 27: 245-252.
Faulde MK, Tisch EM, Scharninghausen JJ 2006. Efficacy of modified diatomaceous
earth on different cockroach species (Orthoptera, Blattellidae) and silverfish
(Thysanura, Lepismatidae). J. Pest Sci. 79: 155-161.
Federici BA 1981. Mosquito control by the Fungi Culicinomyces, Coelomomyces and
Coelomomyces. Microbial Control of Pests and Plant Diseases 29: 555-572.
Federici BA 1995. The future of microbial insecticides as vector control agents. J American
Mosq Control 11:260-268.
Fernandes EK, Bittencourt VR 2008. Entomopathogenic fungi against South American tick
species. Expe App Acarol 46: 71-93.
Fernández LE, Pérez C, Segovia L, Rodríguez MH, Gill SS, Bravo A, Soberón M 2005.
Cry11Aa toxin from Bacillus thuringiensis binds its receptor in Aedes aegypti
mosquito larvae through loop α-8 of domain II. FEMS Letters 579: 3508-3514.
Fontes EMG 1992. Controle biologic: uma desaffio para o país. Pesq. Agropec Bras 27: 1-
4.
Figueiredo LTM 2007. Emergent arboviruses in Brazil Arboviroses emergentes no Brasil.
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 40: 224-229.
Forattini OP 1996. Culicidologia Médica, vol. I, Ed USP, São Paulo, 548 pp.
Forattini OP 2002. Culicidologia Médica, vol. II, Ed USP, São Paulo, 860 pp.

41
FUNASA 2001. Dengue instruções para pessoal de combate ao vetor : manual denormas
técnicas,3º ed, Brasília, 84 pp.
Goettel MS, Sigler L, Carmichael JW 1984. Studies on the mosquito pathogenic
hyphomycete Culicinomyces clavisporus. Mycologia 76: 614-625.
Goettel MS 1988. Pathogenesis of the hyphomycete Tolypocladium cilindrosporum in the
mosquito Aedes aegypti. J Invertebr Pathol 51: 259-274.
Gubler DJ 2002. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health, social and
economic problem in the 21st century. Trends Microbiol 10: 100-103.
Guzman MG, Kouri G 2003.Dengue and dengue hemorrhagic fever in the Americas:
lessons and challenges. J Clin Virol 27: 1-13.
Hawksworth DL 1991. The fungal dimension of biodiversity: magnitude, significance, and
conservation. Mycol Res 95: 641-655.
Hubner-Campos RF, Leles RN, Rodrigues J, Luz C 2013 . Efficacy of entomopathogenic
hypocrealean fungi against Periplaneta americana. Parasitol Inter 62: 517-521.
Jansen CC, Beebe NW 2010. The dengue vector Aedes aegypti: what comes next. Micro
infec 12: 272-279.
Keating J 2001. An investigation into the cyclical incidence of dengue fever. Soc Sci Med
53: 1587-1597.
King CA, Marshall JS, Alshurafa H, Anderson R 2000. Release of vasoactive cytokines by
antibody-enhanced dengue virus infection of a human mast cell/basophil line. J Virol
74: 7146-7150.
Knight AL 1980. Host range and temperature requirements of Culicinomyces clavosporus.
Journal of Invertebrate Pathology 36: 423-425.
Korunic Z 1998. Diatomaceous earth, a group of natural insecticides. J Stored Products Res
34: 87-98.
Lastra CCL, Gárcia JJ 1997. Presencia del hongo Coelomomyces iliensis var. indus
(Chytridiomycetes: Blastocladiales) como patógeno de larvas de mosquitos (Diptera:
Culicidae) em la República Argentina. Rev Iberoam Micol 14: 69-71.

42
Leles RN, Sousa NA, Rocha LFN, Santos AH, Silva HHG, Luz C 2010. Pathogenicity of
some hypocrealean fungi to adult Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Parasitol Res
107: 1271-1274.
Lima JBP, Cunha MP, Silva JRC, Galardo AKR, Soares SS, Braga IA, Ramos RP, Valle D
2003. Resistance of Aedes aegypti to organophosphates in several municipalities in
the state of Rio de Janeiro e Espírito Santo, Brazil. Am J Trop Med Hyg 68: 329-333.
Lima WP, Neto FC, Macoris MLG, Zuccari DAPC, Dibo MR 2009. Estabelecimento de
metodologia para alimentação de Aedes aegypti (Diptera-Culicidae) em camundongos
swiss e avaliação da toxicidade e do efeito residual do óleo essencial de Tagetes
minuta L (Asteraceae) em populações de Aedes aegypti. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina 42: 638-641.
Luz C, Batagin I 2005. Potential of oil-based formulations of Beauveria bassiana to control
Triatoma infestans. Mem Inst Oswaldo Cruz 93: 839-846.
Luz C, Tigano MS, Silva IG, Cordeiro CM, Alianabi SM 1998. Selection of Beauveria
bassiana and Metarhizium anisopliae isolates to control Triatoma infestans. Mem Inst
Oswaldo Cruz 93: 839-846.
Luz C, Rocha LFN, Humber RA 2003. Record of Evlachovaea sp (Hyphomycetes) on
Triatoma sordida in the State of Goiás, Brazil, and its activity against Triatoma
infestans (Reduviidae, Triatominae). J Med Entomol 40: 451-454.
Luz C, Tai MHH, Santos AH, Rocha LFN, Albernaz DAS, Silva HHG 2007. Ovicidal
activity of entomopathogenic Hyphomycetes on Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)
under laboratory conditions. J Med Entomol 44: 799-804.
Luz C, Tai MHH, Santos AH, Silva HHG 2008. Impact of moisture on survival of Aedes
aegypti eggs and ovicidal activity of Metharizhium anisopliae under laboratory
conditions. Mem Inst Oswaldo Cruz 103: 214 – 215.
Luz C, Rodrigues J, Rocha LFN 2012. Diatomaceous earth and oil enhance effectiveness of
Metarhizium anisopliae against Triatoma infestans. Acta Tropica 122: 29–35.
Macoris MLG, Camargo MF, Silva IG, Takaku L, Andrighetti MT 1995. Modificação da
suscetibilidade de Aedes (Stegomyia) aegypti ao temephos. Rev Pat Trop 24; 31-40.

43
Madeira NG, Macharelli CA, Carvalho LR 2002. Variation of the oviposition preferences
of Aedes aegypti in function of substratum and humidity. Mem Inst Oswaldo Cruz 97:
415-420.
Maranga RO, Kaaya GP, Mueke JM, Hassanali A 2005. Effects of combining the fungi
Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae on the mortality of the tick
Amblyomma variegatum (Ixodidae) in relation to seasonal changes. Mycopathologia
159: 527-532.
Matha V, Jegorov A, Weiser J, Pillai JS 1992. The mosquitocidal activity of conidia of
Tolypocladium tundrense and Tolypocladium terricola. Cytobios 69: 163-170.
McCall PJ, Cameron MM 1995. Oviposition pheromones in insect vectors. Parasitol Today
11: 352-355.
Melo Santos A, Varjal-Melo MA, Araujo AP, Gomes TC, Paiva MH, Regis LN, Furtado
AF, Magalhaes T, Macoris MLG, Andriguetti MTM, Ayres CFJ 2009. Resistance to
the organophosphate temephos: Mechanisms, evolution and reversion in an Aedes
aegypti laboratory strain from Brazil. Acta Tropica 30: 180-89.
Micieli MV, Campos RE 2003. Oviposition activity and seasonal pattern of a population of
Aedes (Stegomyia) aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) in Subtropical Argentina Mem
Inst Oswaldo Cruz 98: 659-663.
Ministério da Saúde, 2011. [página da internet; acesso em 3 de agosto de 2013]. Disponível
em: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/informe_de ngue_2011_37_39.pdf
Mnyone LL, Russell TL, Lyimo IN, Lwetoijera DW, Kirby MJ, Luz C, 2009. First report
of Metarhizium anisopliae IP 46 pathogenicity in adult Anopheles gambiae s.s. and
An. arabiensis (Diptera; Culicidae). Parasite Vector 2: 59.
OPAS – Organização Panamericana de Saúde, 1995. Dengue y dengue hemorrágico em las
Américas: Guias para su prevencion y control. Washington DC: OPS. Publicacion
Cientifica.
Pates H, Curtis C 2005. Mosquito behavior and vector control. Annu Rev Entomol 50: 53-
70.

44
Pezzini BR, Silva MAS, Ferraz HG 2007. Formas farmacêuticas sólidas orais de liberação
prolongada: sistemas monolíticos e multiparticulados. Revista Brasileira de Ciências
Farmacêuticas 43: 491-502.
Preisler HK, Robertson JL 1989. Analysis of Time-Dose-Mortality Data. Journal of
Economic Entomology 82: 1534-1542.
Quarles, W 1992. Diatomaceous earth for pest control. IPM Practitioner 14: 1-11.
Reiter P 1991. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of
Aedes aegypti populations. J Am Mosq Control Assoc 7: 52-55.
Roberts DR, Hsi BP 1977. A method of evaluating ovipositional attractants of Aedes
aegypti (Diptera: Culicidae) with preliminary results. J Med Ent 14: 129-131.
Rocha LF, Silva IG, Luz C 2011. Activity of some hypocrealean fungi collected in a
Cerrado ecosystem against Rhodnius spp. (Hemiptera: Reduviidae) under laboratory
conditions. Acta Trop 118: 63-66.
Rodriguez MM, Bisset J, Ruiz M, Soca A 2002. Cross-resistance to pyrethroid and
organophosphorus insecticides induced by selection with temephos in Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) from Cuba. J Med Entomol 39: 882-888.
Rosen L, Shroyer DA, Tesh RB, Freier JE, Lien JC 1983. Transovarial transmission of
dengue viruses by mosquitoes: Aedes albopictus and Aedes aegypti. Am J Trop Med
Hyg 32: 1108-1119.
Rosen L, Shroyer DA, Tesh RB, Freier JE, Lien JC 1983. Transovarial transmission of
dengue viruses by mosquitoes: Aedes albopictus and Aedes aegypti. Am J Trop Med
Hyg 32: 1108-1119.
Rowe RC 1985. Spheronisation: a novel pill-making process. Pharm Int 6: 119-123.
San Martin JL, Brathwaite O, Zambrano B, Solorzano JO, Bouckenooghe A, Dayan GH,
Guzman MG 2010. The epidemiology of dengue in the americas over the last three
decades: a worrisome reality. Am J Trop Med Hyg 82, 128-135.
Santos AH, Tai MHH, Rocha LFN, Silva HHG, Luz C 2009. Dependence of Metarhizium
anisopliae on high umidity for ovicidal activity on Aedes aegypti. Biol Cont 50: 37-
42.

45
Santos HMM, Veiga FJB, Pina MET, Sousa JJMS 2004 Obtenção de pellets por extrusão e
esferonização farmacêutica. Parte I. Avaliação das variáveis tecnológicas e de
formulação. Braz J Pharm Sci 40: 455-470.
Santos HMM, Veiga FJB, Pina MET, Sousa JJMS 2006. Obtenção de pellets por extrusão e
esferonização farmacêutica. Parte II. Avaliação das características física de pellets.
Braz J Pharm Sci 42: 309-318.
Scholte EJ, Njiru BN, Smallegange RC, Takken W, Knols BGJ 2003. Infection of malaria
(Anopheles gambiae ss) and filariasis (Culex quinquefasciatus) vectors with the
entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Malar J 2: 1-8.
Scholte EJ, Knols BGJ, Samson RA, Takken W 2004. Entomopathogenic fungi for
mosquito control: A review. J Insect Sci 4: 1 – 24.
Secretaria Estadual de Saúde de Goiás 2013. Boletim semanal de Dengue [página da
internet; acesso em 15 de janeiro de 2014]. Disponível em:
http://www.sgc.goias.gov.br/upload/links/arq_429_RelatorioABoletimASemanalASE
-52.pdf
Silva IG, Camargo MF, Elias CN, Isac E, Santos AH 1994. Metodologia de criação de
Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera, Culicidae) em condições de
laboratório. Rev Goiana Med 39: 23-26.
Singhi S, Kissoon N, Bansal A 2007. Dengue and dengue hemorrhagic fever: management
issues in an intensive care unit. J pediatric 83, S22-35.
Sousa NA, Lobo LS, Rodrigues J, Luz C 2013. New insights on the effectiveness of
Metarhizium anisopliae formulation and application against Aedes aegypti eggs.
Applied Microbiology 57: 193-199.
Sweeney AW 1978. The effects of temperature on the mosquito pathogenic fungus
Culicinomyces. Australian Journal of Zoology 26: 47-53.
Sweeney AW 1979. Further observations on the host range of the mosquito fungus
Culicinomyces. Mosquito News 39: 140-142.
Sweeney AW 1981a. Fungal pathogens of mosquito larvae. In: Davidson EW, editor. Patho
Invert Microb Dis 14.

46
Sweeney AW 1981b. Preliminary field tests of the fungus Culicinomyces against mosquito
larvae in Australia. Mosq News 41: 470-476.
Sweeney AW 1983. The time-mortality response of mosquito larvae infected with the
fungus Culicinomyces. J Invert Pathol 42: 162-166.
Sweeney AW, Couch JN, Panter C 1982. The identity of an Australian isolate of
Culicinomyces. Mycol 74: 162-165.
Tabashnik BE 1994. Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis. Annu. Rev Entomol
39: 47-79.
Throne JE, Weaker DK, Chew V, Baker, JE 1995. Probit analysis of correla data: multiple
observations over time at one concentration. J.,Econ. Entom 88: 1510–1512.
Trivedi NR, Rajan MG, ohnson JR, Shukla AJ 2007. Pharmaceutical Approaches to
Preparing Pelletized Dosage Forms Using the Extrusion-Spheronization Process.
Therap Drug Carrier Systems 24:1-40.
Ward MDW, Sailstad DM, Selgrade MK 1998. Allegic responses to the biopesticide
Metarhizium anisopliae in Balb/c mice. Toxicol Sci 45: 195-203.
WHO 2009. International Travel And Health 2009.
Zimmermann G 2007. Review on safety of the entomopathogenic fungus Metarhizium
anisopliae. Biocont Sci Technol 17: 879-920.

47