UNIVERSIDAD CENTRAL DE ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERIA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERIA QUÍMICA

BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL

PRÁCTICA 3

TÉCNICAS DE TINCIÓN

Nombre:

 Alex Landa

CURSO:

 5to Semestre “P1”

AYUDANTE DE CÁTEDRA:

 Isaac Calle

Quito, 24 de Octubre del 2019

 RESUMEN

Aplicación de técnicas de tinción y observación de diferentes cultivos tintados en el

microscopio. . El técnico de laboratorio procedió a la explicación de los diferentes tipos de
tinción y la forma adecuada de efectuarlas, posteriormente se procedió a la preparación de
cinco placas tomando una pequeña cantidad de cultivo, se lo colocó sobre la placa se realizó
una extensión, fijación y finalmente se aplicó una técnica de tinción diferente para cada placa
con cultivo se llevó al microscopio y se observó con el lente de mayor aumento. Se obtuvo
los conocimientos y técnicas adecuadas para la realización de tinción simple, diferencial y
específica además de las respectivas observaciones de coloraciones que tomaron los
microorganismos al ser sometidos a tinción. Se concluyó que la tinción Gram y de ácido-
alcohol resistente son tinciones de tipo diferencial debido que permiten clasificar a los
microrganismos por sus características en función de las diferentes coloraciones que toman
siendo necesario emplear más de un tinte.

PALABRAS CLAVE:

PREPARACIÓN_FIJA/TÉCNICAS_DE_TINCIÓN/TINCION_NEGATIVA/TINCIÓN_G
RAM/TINCIÓN_ÁCIDO_RESISTENTE/COLORANTES
 PRACTICA 3

TÉCNICAS DE TINCION

1. OBJETIVOS
1.1.Observar en el microscopio diferentes cultivos aplicando tinción.
1.2.Aplicar diferentes técnicas de tinción.
1.3.Determinar el tipo de microorganismos observados.

2. TEORÍA
2.1.Tinción.
“Es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista
al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología
y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la
ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados
para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras
musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes
células sanguíneas) o incluso para resaltar organelas dentro de células individuales.”
(Espinoza, J. 2014)

2.2.Frotis
“Método de exploración microscópica de un fragmento de tejido o secreción que consiste en
realizar una extensión sobre un portaobjetos y examinarla con el microscopio.” (Presnell, J.
1997)

2.3.Tipos de tinción.
2.3.1. “Tinción Simple: utiliza un solo colorante.
2.3.2. Tinción de Gram: Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con
alcohol, Safranina 30 seg)
2.3.3. Tinción Ácido Resistente: Una vez teñidos, conservan su color resistiendo al lavado
con ácido mineral reducido. En esta tinción las bacterias ácido resistentes conservan
el colorante primario color rosa o rojo, los demás microorganismos son decolorados
por el ácido y toman el color azul.
2.3.4. Tinción de Giensa: El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se
sospeche de protozoos en la sangre para observar materias núcleos de las células.
2.3.5. Tinción de Esporas: Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.
2.3.6. Tinción de Cápsula: Colorante nigrosuna, aquí se observa microorganismos
encapsulados creando resistencias.
2.3.7. Tinción de Flagelos: Se usa mordiente el cual aumenta el tamaño del
microorganismo.” (Aulton Michael E. 2004)

2.4.Tinción Gram
“Es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias,
sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853-
1938), que desarrolló la técnica en 18841. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología
celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación
bacteriana, considerándose bacterias grampositivas a las que se visualizan de color morado, y
bacterias gramnegativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.” (Díaz R. 1999)
2.5.Tinción Flagelar
“Es una tinción para lograr observar flagelos de bacterias. Es usada en laboratorios, pero no
de rutina. Los pasos que sigue son el de usar pararosanilina sirve como tinción principal, y
ácido tánico es agregado a la solución como mordiente.” (Espinoza, J. 2014)

2.6.COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO DE LOEFFLER (coloración de

gránulos metacromáticos)
“Es una coloración simple y de gran utilidad para el género Corynebacterium. Muchos
microorganismos, tanto procarióticos como eucarióticos, pueden acumular gránulos de
volutina, que se tiñen con colorantes básicos tales como azul de metileno. Estos cuerpos de
denominan también gránulos metacromáticos, porque presentan un efecto metacromático,
viéndose rojos cuando se tiñen con un colorante azul. En las micrografías electrónicas
aparecen como cuerpos extraordinariamente densos a los electrones. Los gránulos deben su
comportamiento metacromático a la presencia de grandes cantidades de polifosfato inorgánico
que constituyen una fuente de reserva intracelular de fosfato.” (Díaz R. 1999)

2.7.Tinción negativa
“Es una técnica de microscopía que permite contrastar las muestras mediante una sustancia
opaca a los fotones (microscopía óptica) o a los electrones (microscopía electrónica).” (Aulton
Michael E. 2004)

2.8.Tinción ácido resistente.

“Separa a las bacterias en dos grupos, las que resisten la decoloración por ácido-alcohol de las
que se decoloran. Esta tinción es muy importante porque muchas de las bacterias ácido-
alcohol resistentes son patógenas, como Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium
leprae, con lo que permite distinguirlas fácilmente.” (Espinoza, J. 2014)

3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Material y Equipos
3.1.1. Lámpara de alcohol
3.1.2. Microscopio
3.1.3. Porta y Cubre objetos.

3.2. Sustancias y reactivos

3.2.1. Cultivos.
3.2.2. Agua destilada H2O(l)
3.2.3. Tinta china
3.2.4. Alcohol Cetona
3.2.5. Lugol
3.2.6. Azul de metileno C16H18ClN3S (l)
3.2.7. Cristal violeta C24H28N3Cl (l)
3.2.8. Safranina C20H19N4+·Cl- (l)
3.2.9. Tushina Fenica C20H17N3Na2O9S3 (l)
3.2.10. Alcohol-Ácido
3.2.11. HCl
3.3. Procedimiento
3.3.1. Tinción Flagelar
3.3.1.1.Preparar una ligera concentración del M.O. en agua.
3.3.1.2.Colocar en un portaobjeto limpio con ácido. Dejar secar. Marcar con un lápiz
dermográfico la parte opuesta donde se realizó el extendido.
3.3.1.3.Cubrir con colorante de Leifson.
3.3.1.4.Colorear de 5 a 15 minutos (se formará un precipitado).
3.3.1.5.Lavar el precipitado y enjuagar el portaobjeto y dejar secar
3.3.2. COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO DE LOEFFLER (coloración de
gránulos metacromáticos)
3.3.2.1.Efectuar un extendido fino. Fijar a la llama.
3.3.2.2.Lavar con metanol para desengrasar dejar secar a ambiente.
3.3.2.3.Cubrir con azul de metileno durante un minuto.
3.3.2.4.Lavar el portaobjeto con agua. Y secar al mechero y observar
3.3.3. Tinción negativa.
3.3.3.1.1. Se coloca en el portaobjetos una pequeña gota de tinta china, esta no debe
sobrepasar los 4 milímetros.
3.3.3.1.2. Se coloca el inóculo sobre la gota de tinta china.
3.3.3.1.3. Con otra placa de vidrio se realiza el frotis se deja secar por 1 minuto.
3.3.3.1.4. Se coloca safranina como contraste y se deja actuar por 3 minutos se lava con agua
destilada y se fija al mechero
3.3.3.1.5. Observar al microscopio..
3.3.4. Tinción Gram
3.3.4.1.Se realiza un frotis dependiendo si el medio es sólido o líquido.
3.3.4.2.Se cubre la muestra con violeta de genciana o cristal violeta por 10 segundos.
3.3.4.3.Lavar por con agua destilada, cuidando que no se arrastre la muestra y sacudir para
eliminar el exceso de agua.
3.3.4.4.Se coloca la solución de yodo. 10 segundos
3.3.4.5.Lavar por con agua destilada, remover el exceso de agua
3.3.4.6.Decolorar alcohol cetona 70% /30% por 5 segundos.
3.3.4.7.Lavar con agua
3.3.4.8.Cubrir con Safranina durante 10 segundos.
3.3.4.9.Lavar con agua remover el exceso de agua usando papel absorbente.
3.3.4.10. Dejar secar al aire
3.3.4.11. Observar al microscopio con 40 x y 100 x usando aceite de inmersión.
3.3.5. Tinción Ácido resistente.
3.3.5.1. Se realiza un frotis dependiendo si el medio es sólido o líquido.
3.3.5.2.Colocar Fucsina fenica por 10 segundos, luego colocar al calor del mechero hasta que
se note la presencia de vapores blancos
3.3.5.3.Dejar reposar por 10 minutos.
3.3.5.4.Lavar con Alcohol ácido.
3.3.5.5.Colocar Azul de metileno.
3.3.5.6.Lavar con agua destilada.
3.3.5.7.Fijar y observar en 40x y 100x con aceite de inmersión.
4.1 Datos Experimentales.

Tabla 4.1-1
Observaciones de técnicas de Tinción
Técnica de Tinción Observación.
Tinción Flagelar Al colocar la fucsina con ácido tánico la placa presenta una
coloración morada rosácea y al realizar el lavado tomó una
coloración violeta
COLORACIÓN DE Al aplicar el colorante la placa con la muestra toma un color
AZUL DE METILENO azul intenso y al realizar el lavado queda sobre la placa una
DE LOEFFLER pequeña región de color azulada morada.

Tinción Negativa Al aplicar la tinta china y extenderla la placa toma una

coloración negra.

Tinción Gram Al colorear la placa con el primer colorante se torna de una

coloración violeta y al lavarlo se reduce la coloración al
agregar el segundo colorante se torna de una coloración
rosácea-rojiza y al lavarla presenta una coloración rosácea con
pequeños puntos violetas.
Al colorearlo con el primer colorante la placa se torna de un
colorante violeta muy oscuro al calentarlo se emana gas y al
Tinción ácido-
lavarlo la coloración pierde coloración al aplicar el segundo
alcohol resistente
colorante toma una coloración azul muy intensa y al lavarla la
coloración se torna morada rojiza.

4. RESULTADOS.
Tabla 4.1-1
Observaciones en el microscopio

Técnica de Tinción Observación

Tinción Flagelar Se observó una coloración morada y la presencia
de un pequeño apéndice alrededor de los
microorganismos que sugería la presencia de
flagelo.
COLORACIÓN DE AZUL Se observa una coloración morada casi azulada,
DE METILENO DE las bacterias presentan una morfología en forma
LOEFFLER de bacilo agrupados entre ellos.

Tinción Negativa Se observó una coloración negra alrededor de

puntos de coloración casi blanca, presentan una
morfología regular redonda lo que corresponde a
cocos.
Tinción Gram Se observó una coloración violeta en
microorganismos con forma redonda en grandes
agrupaciones lo que corresponde a cocos Gram
 positivos.

Tinción ácido-alcohol Se observó una coloración rosa en

resistente microorganismos con morfología de forma
redondeada correspondiente a cocos, la
coloración rosácea indica bacterias con ácido –
alcohol resistente.

5. DISCUSIÓN
El método cualitativo empleado fue válido debido que se pudo aplicar las diferentes tipos de
tinciones sobre cultivos bacterianos además de poder identificar características de las bacterias
como la presencia de flagelos o cápsulas, su morfología al aumentar su contraste con el medio,
empleando tinción negativa, flagelar y clasificarlas por sus características de acuerdo con las
coloraciones que presentaron después de aplicar los colorantes en las tinciones diferenciales
Gram y ácido-alcohol resistente. Durante el desarrollo de la práctica se presentaron errores
aleatorios y sistemáticos como al tomar la muestra de la caja Petri con el asa debido que
además del tomar el cultivo bacteriano se tomó parte del agar, otro error fue el empleo de
alcohol-ácido por parte del operador en el lavado de las placas para retirar el exceso de
colorante derivando en problemas de retención del colorante en las células bacterianas debido
que el alcohol-ácido se llevó la mayoría del colorante siendo difícil la visualización de colores
característicos al observarlos con el microscopio. Se recomienda tener especial cuidado al
realizar el lavado de las placas en el retiro del exceso de colorante, hacerlo de forma
perpendicular a la placa para así evitar retirar completamente el colorante de la placa afectando
las observaciones posteriores.

6. CONCLUSIONES
6.1. Se determinó que la tinción Gram y de ácido-alcohol resistente son tinciones de tipo
diferencial debido que permiten clasificar a los microrganismos por sus características en
función de las diferentes coloraciones que toman siendo necesario emplear más de un tinte.
6.2. Se concluyó que la tinción flagelar, la tinción negativa y coloración de azul de metileno
de Loeffler son tinciones de tipo específicas, debido que permitieron identificar la
presencia de estructuras características que poseen cierto tipo de bacterias como los
flagelos o cápsulas.
6.3. Se determinó que las bacterias Gram-Positivas se tornan de una coloración violeta-
azulada por la presencia de una pared celular gruesa de peptidoglicano lo que permite que
al decolorar la placa el colorante principal no se vaya con el alcohol, a diferencia de las
Gram negativas que presentaron una coloración rosácea dada por el colorante contraste
que se aplica luego de la decoloración
6.4. Se determinó que las bacterias ácido- alcohol resistentes se caracterizan por tener una
pared celular gruesa de cera que contiene ácido micólico lo que permite que retengan el
colorante básico al agregarles alcohol-clorhídrico a diferencia de las no ácido-alcohol
resistentes que presentan la coloración del colorante contraste.

7. CUESTIONARIO.
7.1. ¿Cuál es la aplicación de las preparaciones en fresco?
“La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico es hacer una
preparación en fresco. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos
vivos. Existen dos técnicas, una preparación en fresco simple ("entre porta y cubre") consiste
en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a
continuación cubrirla con un cubreobjetos.
Una preparación en gota pendiente se realiza colocando una gota del material en un
cubreobjetos y cubriéndolo con un portaobjetos (invertido) con una excavación central
(portaobjetos excavado). Hay que sellar la preparación con vaselina alrededor de la
excavación. La ventaja de esta última técnica es que la preparación no se seca y puede ser
observada durante un tiempo más largo.” (Aula virtual, 2017, p.1)

7.2.¿Qué grupos microbianos se observan con las preparaciones en fresco?

“Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por ejemplo,
para la búsqueda de Tlricre homonas vaginalis en secreciones vaginales. Este protozoo de
gran movilidad causa inflamación de la vagina y la uretra. Si en la preparación se observan
células en forma de huso que se mueven mediante contracciones o sacudidas cruzando el
campo, probablemente se tratará de T. vaginalis, pudiéndose efectuar el diagnóstico sin
embargo, el inconveniente de la observación en fresco es que no permite aumentar el contraste
de la preparación. Por tanto, su uso, con un microscopio óptico de campo claro, está bastante
limitado. Normalmente, para observar microorganismos vivos se utiliza alguno de los otros
microscopios ópticos que hemos mencionado anteriormente.” (García, 2001, p.1)

7.3. ¿Porque se fija una muestra? ¿Cuándo se lo hace con calor y cuando sin calor?
“Se fija una muestra para la preservación de la morfología y composición química de la célula.
Durante la fijación, las sustancias albuminoides del tejido pasan del estado sol, como se
encuentran en vida, al de gel, cuyo contenido de agua es menor. De esta manera, se detienen
los procesos posmortem y las estructuras se conservan con un mínimo de artificios,
preparándolas para tratamientos ulteriores.” (García, 2001, p.1)
“El calor es un agente fijador. Los reactivos fijadores se clasifican de acuerdo con la acción
que ejercen sobre el tejido, los cuales se dividen en dos grandes grupos en función a los
eventos físicos y/o químicos que producen.
Calor seco se realiza flameando el frotis celular sobre la llama de un mechero; este método es
muy empleado en bacteriología. El Calor húmedo se utiliza en forma de agua hirviente para
estudiar pequeños invertebrados, organismos unicelulares y en ensayos microcitoquímicos.
El calor no se aplica cuando los microorganismos son fijados por otros métodos o cuando los
mismos no son resistentes al calor.” (García, 2001, p.1)

7.4. ¿Cómo están constituidos los colorantes?

Según Sanz Ascensión, 2016 afirma:
“Para que un colorante funcione es su estructura química debe tener determinados grupos
funcionales denominados cromóforos, que hacen que la molécula absorba en la región visible
del espectro electromagnético. Por ejemplo: C=C, N=N, NO2, C=O, C=S. Un auxocromo
("aumentar color"), es decir son grupos cargados positivamente que intensifican una sustancia
o cromóforo en la síntesis de colorantes. Por ejemplo: -OH, - OR, -NH2, NHR, NR2, -X”

7.5. ¿Qué es una tinción diferencial?

Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera más
explícita los microorganismos. Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales, que se
componen de más de una sustancia tintórea. En algunas técnicas de coloración, las tinciones
diferenciales más importantes que se emplean en bacteriología son las de Gram y la tinción
ácido-resistente. Ambas tinciones se utilizan para obtener información acerca de la
composición de las capas de la pared celular de las células bacterianas.

7.6. ¿Cuál es la diferencia entre tinción Gram y tinción Ziehl Neelsen y cuál es su
importancia?
“La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada
para la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR), como M. tuberculosis o
el Phylum Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros. Mientras que La tinción de Gram
o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la
visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas.
De qué color se observan las bacterias ácido alcohol resistente, indique la causa.
Si la tinción es positiva las bacterias bacilares se tiñen de rojo contra un fondo azul claro. Es
la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la fucsina básica
(rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor.” (Atilano V. 2017)

7.7. De qué color se observan las bacterias ácido alcohol resistentes, indique la causa.
“De color azul y rojas, ya que esta tinción separa a las bacterias en dos grupos, las que resisten
la decoloración por ácido-alcohol de las que se decoloran. Esta tinción es muy importante
porque muchas de las bacterias ácido-alcohol resistentes son patógenas, como Mycobacterium
tuberculosis o Mycobacterium leprae, con lo que permite distinguirlas fácilmente.” (Espinoza,
J. 2014)

7.8. ¿Qué tienen en común y en que se diferencian las paredes celulares de las Gram + y
Gram -?
“Las bacterias gram positivas posee una pared celular interna y una pared de peptidoglicano
en cambio las bacterias gram negativas poseen una pared celular más completa.
Las bacterias gram positivas no cuentan con una membrana externa en cambio las gram
negativas tiene membrana externa que forma un saco rígido alrededor de la bacteria.
Las bacterias gram positivas no tienen espacio periplasmático, en cambio las gram negativas
tienen espacio periplasmático entre la superficie externa de la membrana citoplasmática y la
interna de la membrana externa.
Las bacterias gram positivas tiene una red de mureína que está bien desarrollada y puede llegar
a tener hasta 40 capas, en cambio las gram negativas cuenta solamente con una capa.” (Atilano
V. 2017)

8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
8.1. Aula virtual. (2017). Preparaciones en fresco. Recuperado de:
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/
cap304.htm
8.2. Yaqui J, Peralta M, Santos X, Cuellar M & Adolfo L. (2016). Coloración de Gram y Ziehl
Neelsen. Recuperado el 3 de diciembre de 2017 de https://prezi.com
8.3. García 2001. Fijación de muestras biológicas. Recuperado de:
http://educacionhistotecnologiafijacion.blogspot.co.id/2008/11/fijacin_25.html?m=1
8.4. Sanz Ascensión. (2016), La industria de los colorantes y pigmentos. Recuperado el 3 de
diciembre de 2017 de https://www.eii.uva.es
8.5. Atilano Víctor. (2017). Tinción Diferencial. Recuperado el 3 de diciembre de 2017 de
https://es.scribd.com
8.6. Suarez, A (2011). Bacterias acido-alcohol resistentes. Recuperado de:
https://microral.wikispaces.com/18.+Bacterias+acido-alcohol+resistentes.
8.7. Patrick R. Murray, Ken S. Rosenthal, Michael A, Pfaller. (2009). Microbiología Médica,
España: 6ta Edition.
8.8.Espinoza, J. (2014). Tesis de licenciatura en biología. Instituto Tecnológico de Los
Mochis. Los Suárez, Sinaloa.
8.9.Presnell, J. K., Schreibman MP (1997). Humason's Animal tissue Techniques. 5th ed.
Baltimore: Johns Hopkins University Press
8.10. Aulton Michael E. (2004): Ciencia y diseño de formas farmacéuticas. España:
Elsevier, segunda edición.
8.11. Díaz R. Gamazo C y López Goñi I. (1999). Manual práctico de microbiología. Edición
Masson

9. ANEXOS
9.1. Diagrama del equipo.
9.2. Reporte fotográfico de las observaciones realizadas.
ANEXO 1
9.1. Diagrama del equipo.

Figura 9.1-1 Diagrama de equipo

2 3
4

5
1

Fuente: Laboratorio de biotecnología

Tabla 8.1-1
# Parte
1 Agua
2 Portaobjetos
3 Caja Petri
4 Microscopio
5 Cubreobjetos

Nombre: Fecha: Universidad Central del Ecuador

Dib: Alex Landa 18/10/2019 Facultad de Ingeniería Química
Rev: Isaac Calle 24/10/2019 Escuela de Ingeniería Química

TÉCNICAS DE TINCIÓN 1/2

ANEXO 2
9.2. Reporte fotográfico de las observaciones realizadas.

Figura 9.2-1 Reporte fotográfico de las observaciones realizadas

TINCIÓN DE GRAM TINCIÓN NEGATIVA

COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO

TINCIÓN FLAGELAR

Fuente: Laboratorio de biotecnología

Nombre: Fecha: Universidad Central del Ecuador

Dib: Alex Landa 18/10/2019 Facultad de Ingeniería Química
Rev: Isaac Calle 24/10/2019 Escuela de Ingeniería Química

TÉCNICAS DE TINCIÓN 2/2