Las lactonas de N-acil-homoserina (AHL), también conocidas como autoinductores, son

moléculas de señal ampliamente conservadas que están presentes en los sistemas de detección
de quórum de muchas bacterias gramnegativas. Las bacterias liberan, detectan y responden a
la acumulación de estas moléculas de señal para sincronizar la expresión de conjuntos
particulares de genes y para coordinar las actividades celulares. Se ha encontrado que los AHL
están involucrados en la regulación de una variedad de funciones biológicas, incluida la
bioluminiscencia en especies de Vibrio (4, 13), la transferencia conyugal de plásmido Ti en
Agrobacterium tumefaciens (32), inducción de genes de virulencia en Burkholderia cepacia,
Erwinia carotovora, Erwinia chrysanthemi, Erwinia stewartii, Pseudomonas aeruginosa y
Xenorhabdus nematophilus (3, 6, 12, 17, 20–23, 25), regulación de la producción de antibióticos
en Pseudomonas aureofaciens y E. carotovora (6, 25), motilidad enjambrante en Serratia
liquifaciens (14) y formación de biopelículas en Pseudomonas fluorescens y P. aeruginosa (1, 8).
Se sabe que más especies bacterianas producen AHL, pero no se han investigado las funciones
biológicas relevantes (2, 5, 11).

Las señales de detección de quórum AHL son un grupo fascinante de objetivos moleculares para
la manipulación genética y química. Estas moléculas están altamente conservadas; tienen el
mismo resto homoserina lactona pero difieren en la longitud y estructura de la cadena lateral
del acilo. Aunque diferentes genes objetivo están regulados por AHL, los mecanismos básicos de
la biosíntesis de AHL y la regulación genética parece estar conservada en diferentes especies
bacterianas. La característica general de la regulación génica mediada por AHL es la regulación
dependiente de la población celular, que se conoce como la detección de quórum. La
concentración de un AHL aumenta a lo largo con el crecimiento de células bacterianas. Cuando
la concentración de AHL alcanza un nivel umbral, desencadena la expresión del gen objetivo.

Las funciones biológicas reguladas por AHL son de considerable importancia científica y
económica. Nuevos enfoques para la regulación hacia arriba o hacia abajo de los sistemas de
detección de quórum bacteriano sería de gran interés no solo para fines científicos sino también
para aplicaciones prácticas.

Recientemente informamos sobre la clonación de un nuevo gen, aiiA240B1 que codifica una
enzima inactivadora de AHL (AiiA240B1), de la bacteria grampositiva Bacillus sp. cepa 240B1 (9).
AiiA240B1 inactiva un AHL hidrolizando su enlace lactona y fue designado AHL lactonasa (10).
Expresión de aiiA240B1 en E.carotovora cepa transformada SCG1, un patógeno que causa la
enfermedad de pudrición blanda en muchas plantas, reduce significativamente la liberación de
AHL, disminuye el electrolítico extracelular actividades enzimáticas y atenúa la patogenicidad de
la papa, la berenjena, la col china, la zanahoria, el apio, la coliflor y el tabaco (9) Las plantas
transgénicas que expresan AHL lactonasa exhiben una resistencia significativamente mejorada
a la infección por E. carotovora y retraso en el desarrollo de síntomas de podredumbre blanda
(10). Los mecanismos de inactivación de AHL parecen estar ampliamente distribuidos. Un aislado
Se ha informado que Variovorax paradoxus utiliza moléculas de AHL como fuentes de energía y
nitrógeno, lo que indica que las enzimas degradantes de AHL están presentes en este organismo
(19). En esto En el estudio, nos centramos en la biodiversidad de las enzimas inactivadoras de
AHL y las cepas bacterianas. Identificamos más de 20 cepas y cepas bacterianas capaces de
inactivar AHL obtenidas de muestras de suelo y plantas y de un laboratorio bacteriano colección
de cultura. Nueve genes que codifican la inactivación de AHL (aiiA) fueron clonados de especies
de Bacillus gram-positivas y caracterizado. Los análisis bioquímicos y moleculares mostraron que
las enzimas codificadas por estos genes pertenecen a la misma familia de AHL lactonasas.
Aislamiento de bacterias capaces de inactivar AHL.

Se seleccionaron más de 800 aislamientos bacterianos obtenidos del suelo y las plantas para la
actividad de inactivación de AHL. Al incubar cultivos bacterianos frescos con OHHL,
Identificamos más de 20 aislamientos bacterianos que exhibieron actividad inactivadora de AHL
durante el examen preliminar. Ocho de estos aislamientos que muestran una fuerte actividad
fueron seleccionados y caracterizados a nivel bioquímico y molecular. Las actividades
inactivadoras de AHL fueron variable, que varía de 480 a 680 pmol / h / unidad de OD600 (Fig.
1A). Para caracterizar estos aislamientos, su ADN ribosómico 16S (ADNr) las secuencias se
analizaron por amplificación por PCR y secuenciación posterior. Los resultados mostraron que
el ADNr 16S las secuencias de estos aislamientos son altamente homólogas a la secuencia de
ADNr 16S de B. thuringiensis (datos no mostrados). Para confirmar la similitud de la secuencia
de 16S rDNA, secuenciamos el 16S rDNA de una cepa conocida de B. thuringiensis, B.
thuringiensis subsp. thuringiensis BGSC 4A3. Una comparación de secuencia reveló que los
niveles de identidad entre el ADNr BGSC 4A3 y el ADNr de estos aislamientos fue del 97,8 al
98,1%. El otro las características exhibidas por estos aislamientos (gram positivo, peritrico,
varillas rectas, formación de endosporas) también indicaron que son los miembros del grupo B.
cereus en el género Bacilo.

Todas las B. thuringiensis y cepas estrechamente relacionadas analizadas tuvo actividad

inactivadora de AHL. El grupo de B. cereus incluye B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides y B.
anthracis (29). Seleccionamos 14 cepas conocidas de Bacillus, incluidas 9 cepas de B.
thuringiensis, 2 cepas de B. cereus, 1 cepa de B. mycoides, 1 B. cepa fusiformis y 1 cepa B.
sphaericus, para comprobar si estas especies tienen la capacidad de inactivar AHL. Toda la las
cepas bacterianas probadas excepto las cepas de B. fusiformis y B. sphaericus eliminaron AHL
con niveles de actividad enzimática (rango, 534 a 674 pmol / h / unidad de OD600) (Fig. 1B)
similar a los de los aislados bacterianos inactivadores de AHL recientemente identificados (Fig.
1A). Se sabe que muchas cepas de B. thuringiensis contienen plásmidos. Nuestros datos sugieren
que los genes inactivadores de AHL se encuentran en el ADN cromosómico y no en los plásmidos,
porque B. thuringiensis subsp. Kurstaki cepa B2 (BGSC 4D1) y su derivado sin plásmido, cepa
B22, exhibió niveles similares de actividad. Una segunda cepa sin plásmidos, cepa B23 ( BGSC
4T7) (http://bacillus.biosci.ohio-state.edu/), perteneciente a B. thuringiensis subs. pags.
israelensis, también fue capaz de inactivar AHL (Fig. 1B).

Clonación funcional del gen aiiACOT1.

Las células bacterianas de la cepa COT1 eliminaron OHHL (20 M) completamente después de 2
h de incubación a 28 ° C, pero las células bacterianas mueren por ebullición durante 5 min no
pudieron inactivar OHHL (Fig. 2), lo que indica que hay un mecanismo de inactivación enzimática.
Para identificar el gen codificando la inactivación de AHL en COT1, una biblioteca de cósmidos
fue construido y utilizado para la detección funcional. Un clon (pLARF3-aiiACOT1) que muestra
actividad inactivadora de AHL en el bioensayo se identificó después de que seleccionamos
aproximadamente 1,000 cósmidos clones El análisis de restricción mostró que este clon contenía
un inserto de 24 kb. Los cinco fragmentos generados por digestión completa con EcoRI se
subclonaron en el vector pGEM-7.

Un bioensayo con los subclones mostró que un subclón, pGEM-aiiACOT1 con un inserto de 5 kb,
confirió actividad inactivadora de AHL. Subclonación adicional condujo a la identificación del
clon pBS-aiiACOT1 que contiene un fragmento BamHI de 1.3 kb que códigos para la inactivación
de AHL. El análisis completo de la secuencia del clon pBS-aiiACOT1 mostró que había un ORF de
750 pb que codificó una proteína de 250 aminoácidos. Expresión de esto ORF en E. coli confirmó
que codificaba una enzima AHLinactivadora funcional, denominada AiiACOT1. A nivel de
secuencia peptídica, AiiACOT1 exhibió 91% de identidad con AiiA240B1 (9), que recientemente
se ha identificado como una novela AHL lactonasa (10).

Se detectó por transferencia de homólogos de aiiACOT1 en especies de Bacillus. Como todos los
aislamientos y cepas bacterianas capaces de inactivar AHL que se probaron pertenecen a B.
thuringiensis o taxones estrechamente relacionados y los genes aiiA240B1 y aiiACOT1 mostró
un alto nivel de similitud, es muy probable que el gen aiiA esté altamente conservado en B.
thuringiensis y especies estrechamente relacionadas. El análisis de hibridación de ADN se realizó
utilizando el gen aiiACOT1 como sonda. ADN genómico fueron aislados de 18 cepas y
aislamientos bacterianos seleccionados, incluyendo 13 cepas de B. thuringiensis, 1 cepa de B.
cereus, 1 cepa de B. sphaericus y 3 aislamientos. Los resultados (Fig. 3) mostraron que todas las
cepas analizadas produjeron claramente una banda de hibridación excepto B. sphaericus B29,
que no pudo inactivar AHL (Fig. 1B).

Estos resultados indican que hay un homólogo aiiACOT1 en todas las cepas de B. thuringiensis y
los estrechamente relacionados especies B. cereus probadas. Esto es consistente con el
bioensayo datos (Fig. 1). Para detectar AHL lactonasa en estas cepas bacterianas inactivadoras
de AHL, las proteínas solubles extraídas de las cepas se sometieron a análisis de transferencia
Western usando un conejo antisuero anti-AHL lactonasa. Como se muestra en la Fig. 4A, se
detectaron señales de inmunotransferencia en las cepas.

Clonación de genes aiiA de otras cepas de Bacillus seleccionadas. Como los genes para la
inactivación de AHL en cepas de Bacillus 240B1 y COT1 están altamente conservados, se utilizó
un enfoque de PCR para clonar los genes AHL lactonasa de B. thuringiensis seleccionada y cepas
de B. cereus. ADN genómico aislado de cepas de B. thuringiensis B1, B2, B17, B18, B20, B21 y
B22 y B. cepa B25 se utilizaron como plantillas. Los fragmentos de PCR purificados se clonaron
en el vector pGEM-T (Promega). Los ocho clones resultantes, que mostraron actividad
inactivadora de AHL en el bioensayo, se utilizaron para obtener las secuencias de ambos hebras
Las secuencias de los ocho genes inactivadores de AHL clonado de las cepas B1, B2, B17, B18,
B20, B21, B22 y B25 todos contenían un ORF de 750 pb que codificaba un aminoácido de 250
proteína. El análisis de transferencia Western confirmó que estos genes eran expresado en E.
coli (Fig. 4B).

Análisis de motivos de genes inactivadores de AHL.

Análisis de secuencia indicó que 10 genes aiiA clonados de especies de Bacillus fueron altamente
conservado, con identidades de aminoácidos que van desde 90.4 a 94.0% en comparación con
los aminoácidos de AHL lactonasa (Fig. 5). Según lo determinado por una búsqueda BLAST CD de
Conservado Bases de datos de dominio (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd
/wrpsb.cgi), se encontraron dos regiones conservadas alineando AHL lactonasas con metalo-
beta-lactamasa (pfam00753, Bases de datos de dominio conservadas) y glicoxalasa que contiene
zinc II (Y08357, GenBank) (Fig. 6A). Se sabe que varios residuos de histidina y glutamato en estas
dos regiones conservadas son esencial para la unión de zinc y la actividad enzimática de las
metalohidrolasas (7, 30). La mutagénesis dirigida al sitio ha demostrado previamente que los
residuos H106, D108, H109 y H169 de AiiA240B1 son necesario para la actividad de AHL
lactonasa (9). Basado en secuencia alineación, realizamos mutagénesis dirigida al sitio con varios
otros residuos de aminoácidos conservados, incluido D191, H235 y D236. Reemplazamos estos
residuos con residuos de serina. Los resultados mostraron que la mutación D191S resultó en una
pérdida completa de actividad enzimática, mientras que el H235S y las mutaciones D236S no
afectaron la actividad enzimática (Fig. 6B). Estos datos establecieron un motivo para AHL
lactonasa, 106HXDH-59 aminoácidos-H169-21 aminoácidos-D191, que es esencial para la
actividad enzimática.