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Microbiologie des céréales et des

farines
Formation IFIM
11-12 avril 2018
A. Tantaoui Elaraki
Organisation de la formation
Document support pédagogique Power Point
Document support en Word
Projection Data show
Discussion de cas concrets
Evaluation de la formation par les participants
Durée: 2 jours
Programmation: 11 & 12 avril 2018
Présentation de l’animateur

 Nom: Abdelrhafour TANTAOUI ELARAKI


 Spécialité: Microbiologie, Hygiène et Biotechnologie
Alimentaires
 Fonctions:
- Professeur de l’Enseignement Supérieur (Institut
Agronomique et Vétérinaire Hassan II, Rabat; Sup’Agro,
Casablanca)
- Ex. Directeur de Sup’Agro, Casablanca
- Ex. Président de la MSM (Société Marocaine de
Mycotoxicologie)
Présentation des participants

Nom et prénom
Formation initiale: niveau et spécialité
Formation (initiale et continue) en microbiologie,
biochimie, biologie cellulaire
Fonctions dans l’entreprise (ou à l’IFIM)
Ancienneté: nombre d’années dans l’entreprise (ou à
l’IFIM) et dans le poste actuel
Objectifs

 Objectifs spécifiques:
 Objectif général:
- Connaître le monde microbien et les
Connaître les différentes catégories de
microorganismes de microorganismes des aliments
contamination des céréales - Connaître les différentes catégories
et dérivés et les analyses de microorganismes de
microbiologiques qui s’y contamination des céréales et dérivés
appliquent - Connaître les principes généraux des
méthodes d’analyse microbiologique
des céréales et dérivés
Contenu général

1- Le monde microbien

2- Les germes de contamination des céréales


et des farines

3- Moisissures toxinogènes et problématique


des mycotoxines

4- Principes des méthodes d’analyse


microbiologique des céréales et dérivés
Introduction générale
8

Dans les denrées alimentaires:

 Flore microbienne  Flore microbienne


Spécifique: de contamination:
- normale, - indésirable,
- « utile » - « nuisible »
- à favoriser (parfois - à combattre (à tuer ou
ensemencée) à inhiber)
9
La microbiologie alimentaire (sens large):
science consacrée à l’étude des microbes en
relation avec les aliments

Dans la pratique, on distingue:


- Microbiologie industrielle alimentaire: études
des espèces « utiles »

- Microbiologie alimentaire (sens strict): étude


des espèces indésirables (et de leurs
interactions avec les produits alimentaires)
10 Interactions microorganisme / aliment et
influence des paramètres de l’environnement

Paramètres
de l’environ-
nement

microorganisme aliment
1- Le monde microbien
12 1- Le monde microbien

1.1- Définitions

1.2- Différents types de microbes

1.3- Les microbes sont partout

1.4- Principales propriétés des microorganismes


13
1.1- Définitions

Les Microbes: êtres vivants microscopiques,


invisibles à l’œil nu:
- Virus: taille < 0,3 µm*
- Bactéries: 1 à 10 µm environ
- Levures: 10 à 25 µm environ
- Moisissures: mycélium à taille indéterminée
- Protozoaires: jusqu’à 300 µm
* 1μm = 10-3 mm
Taille comparée des bactéries et des virus

Bacille Coque

0 0,5 1µm

Virus Virus de la
Virus de la mosaïque du Petit virus
de la Bactériophage
Poliomyélite tabac sphérique
variole
Taille de certaines catégories de microbes
comparée à celles d’autres particules
Eventail des tailles des virus, des bactéries et des
protozoaires
17
Notion de vie

o Manifestations de la vie:
- Nutrition
- Respiration
- Reproduction

o Vie: Interactions entre être vivant et son milieu


18
blé blé

Souris en plastique Souris vivante


19
1.2- Différentes types de microbes

Algues
Virus Bactéries Levures Moisissures unicellulaires Protozoaires
Microorganismes
Fongiques
Microorganismes
d’intérêt alimentaire

Microbes d’intérêt alimentaire

Microorganismes

Microbes
20 Les Bactéries

- Morphologie
- Classification Gram + / Gram –
- Structure cellulaire
- Sporulation
- Mode de division
Morphologie
bactérienne

Différentes
formes
de cellules
bactériennes

21
22 Formes dominantes

allongée
(bâtonnet)
ronde
(coccus)
23
Structure cellulaire

- Cellules procaryotes (simples): paroi, membrane


cytoplasmique, cytoplasme, noyau avec un
chromosome unique circulaire et sans paroi
nucléaire

- Présence de flagelles ou de capsule chez


certaines espèces
24
25

Classification en Gram
positives et Gram
négatives (coloration
de Gram)

Schéma de la
coloration de Gram
26 Sporulation

- Formation de spores résistantes (espèces sporulées)

Spores
Sporulation et germination de la
spore bactérienne
27
Conditions favorables Conditions défavorables

Forme végétative
SPORULATION

MULTIPLICATION

Spore libre
28 Reproduction

Reproduction par division de la


cellule mère en 2 cellules filles
identiques
(scission binaire ou scissiparité)
29 Les Levures

 Morphologie
 Structure cellulaire
 Reproduction
30 Morphologie

- Etat unicellulaire dominant, formes variées, souvent


ovoïde ou globuleuse
31
Structure cellulaire

 Cellule eucaryote avec


paroi, membrane
cytoplasmique,
cytoplasme, noyau vrai
(membrane nucléaire
et plusieurs
chromosomes),
vacuole, réticulum
endoplasmique, etc.
Reproduction
32
- Reproduction surtout par
bourgeonnement
bourgeons

Cicatrices de
bourgeonnement
33

Levures mieux adaptées


que les bactéries aux
milieux acides
et/ou
riches en sucres
34
Moisissures

 Morphologie et structure
 Reproduction
35
Morphologie et structure

- Micro-organismes filamenteux
36

Structure filamenteuse
des moisissures

Filaments non cloisonnés filaments cloisonnés Moisissure sur l’épiderme


d’une plante
Structure détaillée d’un filament du mycélium
38
Reproduction
Reproduction par spores (pas spécialement résistantes)
39
Aspects des cultures
en milieu solide

Colonies de
Bactéries Levures

Thalles de
moisissures
40

Moisissures mieux adaptées


que les bactéries
aux milieux acides
et/ou
relativement secs
41 1.3- Les microbes sont partout

 Les microbes dans la nature

 Sources de contamination des produits

 L’Homme: source de contamination majeure


42 Les microbes dans la nature

 Le sol
 L’eau
 L’air
 Les plantes, les animaux domestiques
 Les insectes et autres nuisibles
 L’Homme
 L’environnement en général
43  Le sol: plusieurs milliards par gramme (sol cultivé)
 L’eau: océans, mers, lacs, cours d’eau, marécages,
eaux usées, etc.
 L’air: poussières et autres particules
 Les plantes, les animaux domestiques et les
produits qui en dérivent
 « Les nuisibles » (vermine): insectes, rongeurs,
oiseaux, etc. ;
 L’Homme
 L’environnement en général: parterre, murs,
plafonds, vêtements, ustensiles, matériel, etc.
44 Sources de contamination des produits
alimentaires

 Matières premières
 Milieu
 Main-d’œuvre
 Matériel
 Manipulations ou Modes opératoires
45 Matières premières

La contamination varie selon:

- la nature des intrants (matières premières, additifs,


emballages, etc.)

- les traitements appliqués (histoire de chaque


intrant depuis son origine)

- les conditions de stockage et de transport


46
Milieu

- Bâtiment
- Sol
- Air (poussières)
- Eau
- etc.
47
Matériel

La flore apportée par le matériel varie notamment avec:

- La nature des produits traités à l’aide de ce matériel

- L’usage du matériel en question

- Le nettoyage et la désinfection adoptés


48
Manipulations

- Tout traitement appliqué depuis l’obtention des


matières premières jusqu’à l’utilisation des produits
finis

- Chaque traitement peut avoir un effet sur la qualité


hygiénique d’un produit
49 Diagramme de cause à effet d’Ishikawa
Diagramme en arête
de poisson

Matériel Manipulations

Matières Main d’œuvre


premières Milieu
50 L’homme: source de contamination

 L’individu sain: flore commensale

 L’individu malade: flore pathogène et/ou


toxinogène

 Le porteur sain: flore pathogène (dont il ne souffre


pas)
51 L’individu sain

- Peau (surtout la main)

- Cheveux et cuir chevelu

- Sous les ongles

- Les cavités ouvertes: bouche, narines, oreilles, etc.

- L’intestin: plusieurs milliards de cellules microbiennes par


gramme.
52 Front:
Cuir chevelu:
104 à105 Bactéries/cm2
102 à 103 bactéries/cm2

Aisselles:
Sécrétions nasales:
106 à 107 bactéries/cm2
107 bactéries/g

Mains:
106 bactéries/cm2
Salive:
108 bactéries/g

Matières fécales:
109 bactéries/g
53

Nombre de particules de plus de 0,5 µm émises par minute


selon l’activité de l’individu
Nombre de
Gouttelettes
54 de Pflügge émises

Une toux faible: Un éternuement:


4 500 20 000 à 40 000
55 L’individu malade
Flore pathogène et/ou toxinogène:

- Sur la peau (plaies ouvertes, furoncles) et dans le


cuir chevelu
- Dans la gorge et les voies respiratoires:
tuberculose, grippe, angine, pharyngite,
bronchite, etc.
- Dans l’intestin: maladies parfois très graves
(choléra, typhoïde), gastro-entérites, etc.
- Dans les yeux: conjonctivites
56
Le porteur sain

- Individu hébergeant un microbe pathogène sans


montrer de signes de maladie

- Constitue une source de contamination pour son


entourage

- Contamine les produits alimentaires qu’il manipule


57
Conclusion

- Toute personne libère dans l’environnement des


microbes variés

- Toute personne peut contaminer les personnes de son


entourage avec des microbes dangereux

- Toute personne peut contaminer les produits manipulés


avec des microbes indésirables
1.4- Principales propriétés des microorganismes

 Croissance et métabolisme très rapides

 Activités enzymatiques intenses

 Grandes capacités d’adaptation


59
Croissance et métabolisme très rapides

VR bactéries > VR levures > VR moisissures


60
o Exemples:

• Escherichia coli (bactérie) se divise toutes les 20


min dans les conditions optimales (temps de
génération Tg); 3 divisions cellulaires/heure, soit
multiplication de l’effectif de population par 8
chaque heure

• Saccharomyces cerevisiae (levure) a besoin de


100 min pour se diviser; multiplication de
l’effectif de population par 1,6 en une heure
61

1 0h
Evolution de 8 1h
l’effectif 64 2h
d’Escherichia coli 512 3h
en fonction du 4 096 4h
temps dans des 32 768 5h
conditions 262 144 6h
optimales 2 097 152 7h
16 631 216 8h
133 049 728 9h
1 064 397 824 10 h
62

 Consommation très rapide des nutriments


 Libération très rapide de substances de
déchets pouvant être:
o responsables d’odeurs, de couleurs, de
goûts anormaux, etc. (propriétés
sensorielles ou organoleptiques)
o toxiques (troubles sanitaires chez le
consommateur)
63

L’Homme La sauterelle La bactérie


Consomme Consomme Consomme
l’équivalent de l’équivalent de
l’équivalent de
son poids en son poids en 10000 fois
24h son poids
10 jours
de sucre en
1 heure
64

Activités enzymatiques puissantes et diversifiées:


glucidases, protéases, lipases, etc.

Grandes capacités d’adaptation aux différents


milieux (composition, pH, etc.) et aux conditions
de l’environnement (température, oxygénation,
etc.)
2- Les germes de contamination
des
céréales et dérivés
66 2- Les germes de contamination des
céréales et dérivés

2.1- Nature de la microflore de


contamination

2.2- Conditions de contamination et de


développement

2.3- Conséquences
67 2.1- Nature de la microflore de contamination

- Les bactéries

- Les levures

- Les moisissures
68 Les bactéries

 Origine principale: sol

 Principaux ordres:
o Eubacteriales (ordre le plus représenté):
familles Enterobacteriaceae,
Lactobacillaceae, Bacillaceae,
Micrococcaceae, etc.
o Pseudomonadales: genres Pseudomonas,
Xanthomonas, Aeromonas, etc.
Fréquence d’apparition et importance relative (%) des principales
bactéries présentes sur blé et seigle (Kosmina, 1977)

Familles Genres et espèces % des % du


grains peuplement
contaminés bactérien
Achromobacteriaceae Flavobacterium sp. 90 15
Bacillaceae Bacillus cereus 18 1
B. pumilus 46 4
B. subtilis 36 3
Enterobacteriaceae Aerobacter sp. 54 15
Erwinia sp. 55 4
Escherichia coli 9 1
Paracolobacterium sp. 90 28
Lactobacillaceae Leuconostoc sp. 9 1
Lactobacillus sp. Présence
Streptococcus sp. Présence
Micrococcaceae Micrococcus candidus 48 3
M. caseolyticus 18 1
Pseudomonadaceae Pseudomonas sp. 73 6 69
70
 Autres groupes bactériens (moins fréquents):
o Actinomycètes: Streptomyces albus et S. griseus
o Bactéries pathogènes et/ou toxinogènes
(Staphylococcus, Salmonella, Clostridium, etc.):
• Contamination possible des farines par
l’intermédiaire des rongeurs ou des insectes
• Risques d’accidents sanitaires graves si
incorporation dans produits hydratés crus ou semi-
cuits (aliments pour enfants, pâtes réfrigérées, etc.)
71 Les levures

 Levures: champignons microscopiques le


plus souvent unicellulaires et non pigmentés
 Principaux genres:
o Saccharomyces
o Candida
o Hansenula
o Pichia
Hansenula

Saccharomyces

Principaux genres de
levures
des céréales Pichia
73

 Le nombre des levures dépasse rarement


quelques centaines par gramme de grain

 Nombres très élevés si:


o Humidité élevée des grains à la récolte
o Conditions climatiques humides à la récolte
o Pré-stockage humide avant séchage
74
Les moisissures

 Généralités
 Nature de la mycoflore de contamination
 Conditions de contamination et de
développement
 Conséquences
Généralités
75

o Champignons microscopiques (micromycètes)


filamenteux
o Toujours présents sur les grains de céréales, puis
dans farines, sons et autres produits
o Plus de 120 espèces recensées sur blés en
conservation
o Un même échantillon de blé ne porte que 5 à
6 espèces dominantes
76

o Reproduction par émission de spores très variées


o Deux grands types se spores de la reproduction
asexuée

Conidies ou conidiospores
Sporangiospores
Se forment à l’air libre sur
un conidiophore (parfois des Se forment dans un sac
têtes conidiennes (sprocyste) porté par un
caractéristiques) sporangiophore
Parfois micro & macroconidies
Sporangiospores

Sporocyste Sporocyste
entier ouvert
Sporocyste entier Sporocyste ouvert
avec spores à à maturité pour
l’intérieur libérer les spores

78
Aspergillus

Têtes conidiennes Aspergillus sp.


d’Aspergillus
a: monsériée
b: bisériée
79
Penicillium

Têtes conidiennes:
a & b: monoverticillé; c: polyverticillé
symétrique; d: polyverticillé asymétrique

Stipe = conidiophore

80
 Nature de la mycoflore de contamination

o Mycoflore du champ

o Mycoflore de stockage

o Mycoflore d’altération avancée


82

Mycoflore du champ

- Espèces qui contaminent les grains avant récolte


- Certaines sont incapables de se développer plus
tard (conservation)
- Comprend des espèces indifférentes (Alternaria,
Cladosporium, etc.) et d’autres parasites (Fusarium,
Septoria)
83 Principales moisissures du champ

Claviceps purpurea
Sclerotinia sclerotiorum
Fusarium graminearum**
Aspergillus flavus*
Rhizoctonia leguminicola
Helianthosporium biseptatum
Alternaria
Cladosporium
Verticillium
Septoria
* également au stockage
** également stockage et
altération ,avancée
L’ergot du seigle
Claviceps purpurea
Attaques fongiques
au champ du maïs

Penicillium

Aspergillus
flavus
Aspergillus flavus sur maïs

86
Fusarioses des céréales
F. graminearum
Fusarioses des céréales sur blé

Fusarium
sur maïs
Grains fusariés
90

Mycoflore de stockage
- Flore peu abondante à la récolte, devient
dominante au stockage
- Très abondante dans les recoins des entrepôts
et silos
- Flore très sporulante (contaminations
secondaires lors de manutention et
transformation des grains)
91

o Espèces capables de pousser avec des taux


d’humidité de 15 à 16%
o Comprend des espèces toxinogènes
o Principaux genres:

Penicillium
Aspergillus
Fusarium
92

• Genre Aspergillus
Aspergillus flavus*
A. parasiticus
A. ochraceus
A. clavatus
A. fumigatus
A. rubrum
A. chevalieri
A. niger
A. glaucus
* Également au champ
93
• Genre Penicillium

Penicillium islandicum Penicillium urticae

P. citrinum P. verruculosum

P. rubrum P. puberulum

P. citreoviride P. expansum

P. cyclopium P. rugulosum

P. viridicatum P. palitans
P. roquefortii
94
• Genre Fusarium et autres

Fusarium graminearum *
F. tricinctum
F. nivale
F. moniliforme

Chaetomium globosum

* Également au champ et
d’altération avancée
Aspergillus glaucus
Aspergillus

Aspergillus
Aspergillus niger niger
Aspergillus et
Penicillium
98

Mycoflore d’altération avancée

- Se développe en cas de conservation dans des


conditions extrêmement médiocres
- Peut contenir des espèces sans signification
particulière quand on les trouve en petit
nombre
99
o Principaux genres et espèces

Pithomyces chartarum Dendrochium toxicum


Stachybotrys atra Myrothecium verrucaria
Periconia minutissima Trichothecium roseum
Fusarium sporotrichioides Trichoderma viride
Cladosporium sp. Absidia
Alternaria longipes Mucor
Fusarium graminearum* Rhizopus
Chaetomium globosum
* Également au champ
et au stockage
moisissure en silo
de stockage

Altération avancée des


Céréales par moisissure
Différentes
Flore du flores
champ fongiques des
101
céréales
Aspergillus flavus

F. graminearum

Flore de
stockage

Pithomyces chartarum Dendrochium toxicum


Stachybotrys atra Myrothecium verrucaria
Periconia minutissima Trichothecium roseum
F. sporotrichioides Trichoderma viride
Cladosporium sp. Absidia Flore
Alternaria longipes
A.: Aspergillus
Ch. globosum
Mucor d’altération
Ch.: Chaetomium Rhizopus
F.: Fusarium avancée 05/04/2018

P.: Penicillium
102
2.2- Conditions de contamination et de
développement

- Humidité

- Température

- Composition de l’atmosphère

- Composition et structure du produit


103 Humidité

 Exigences des micro-organismes

 Teneur en eau et activité de l’eau du grain

 Conséquences pour les micro-organismes des


céréales et dérivés
Exigences des micro-organismes
104

o Chaque espèce exige une activité de l’eau (aw)


minimale pour sa croissance
o Chaque espèce a aussi une aw optimale de croissance
o Les exigences de certains métabolismes (ex.
toxinogenèse) diffèrent de celles de la croissance.

Pression de vapeur du milieu


aw =
Pression de vapeur de l’eau
105

o De façon générale (sauf exceptions):


• bactéries plus hygrophiles que levures
• levures plus hygrophiles que moisissures
o Espèces osmophiles ou osmotolérantes: adaptées aux
faibles aw dues aux fortes concentrations en sucres
(surtout levures)
o Espèces xérophiles ou xérotolérantes: adaptées aux
milieux relativement secs (surtout moisissures)
o Espèces halophiles ou halotolérantes: adaptées aux
faibles aw dues aux fortes concentrations en sel (surtout
bactéries)
106

aw min. (en moyenne) aw min. (cert. espèces)

Bactéries : 0,90-0,91 Candida utilis : 0,94


Levures : 0,88 Mucor spinosus :0,93
Moisissures : 0,80 Candida zeylanoides: 0,90
Aspergillus glaucus : 0,70
Bac. halophiles : 0,75 A. echinulatus : 0,64
Mois. xérophiles : 0,65 Saccharomyces rouxii : 0,62
Lev. osmophiles : 0,60

Minimum absolu: 0,6


107 Teneur en eau et activité de l’eau des grains

Notions d’isothermes de sorption

Isotherme d’adsorption: Isotherme de désorption:


courbe des teneurs en courbe des teneurs en
eau en fonction de eau en fonction de
l’activité de l’eau à une l’activité de l’eau à une
température donnée, température donnée,
quand le produit est en quand le produit est en
phase de phase de séchage (HR de
réhumidification (HR de l’air <100aw)
l’air >100 aw)

HR: Humidité Relative


108
Isothermes
de sorption
du blé vers
Teneur en 20°C et
eau (%) zones d’activité
des différentes
20
catégories de
micro-
18
Bactéries organismes
16
Levures
14
Levures osmophiles
12
Moisssures
10 hygrophiles
Sorption Moisissures xérotolérantes

Désorption Activité de l’eau


0,7 0,8 0,9 1
109

 Les moisissures de stockage peuvent se contenter d’aw


relativement faibles

 Les levures viennent ensuite

 Les bactéries sont les plus exigeantes en eau libre


110

 Conséquences:

o Cas des moisissures xérophiles ou xérotolérantes

o Cas des levures

o Cas des bactéries


Cas des moisissures xérophiles ou xérotolérantes
111

aw
112
Effet de l’activité de
l’eau des grains sur la
croissance d’Aspergillus
candidus*
Croissance
pondérale (% du * Moisissure xérotolérante très
maximum) commune sur céréales

100

50

aw 0,70

0 1 2 3 4 Temps (mois)
113
 Conséquences: plus l’aw des grains est faible:

o Plus la vitesse de développement est faible (pente


de la phase exponentielle)

o Plus le niveau maximum atteint en phase


stationnaire est réduit

o Plus la phase de latence est longue: pas


d’altération microbienne apparente
Effets de l’aw des grains sur les paramètres de croissance
114 des micro-organismes (exemple d’Aspergillus candidus)

Croissance Limite de la phase


pondérale (% du
maximum)
de latence

Vitesse de croissance
100
Niveau maximum
(phase stationnaire)

50

aw 0,70

0 1 2 3 4 Temps (mois)
115 Une humidité de 16%
(aw de 0,78 à 20-25°C)
ne permet pas de
stopper le développement
Teneur en
des moisissures
eau (%)
xérotolérantes
(Aspergillus glaucus).
20
Une aw de 0,70 ralentit
nettement la croissance,
18 d’où une conservation
16 de plusieurs mois
14
Levures osmophiles
12

10
Sorption
Moisissures xérotolérantes

Désorption Activité de l’eau


0,7 0,8 0,9 1
116 Teneur critique: « alarm water content »
à 20°C, HR de l’air: 70% (en %)

 Farines de blé 13-15  Viande dégraissée séchée 15


 Riz 13-15  Légumes déshydratés 14-20
 Amidon 18  Fruits déshydratés 18-25
 Lait en poudre entier 8
 Œuf entier déshydraté 10-11
117

Remarque: le développement, même lent, des moisissures,


s’accompagne de production d’eau métabolique; l’aw
tendra donc à s’élever (la température aussi)

Risque de développement
d’espèces plus exigeantes en eau

Altérations visibles et
Irréversibles des grains
118 Cas des levures

 Il existe des levures capables de se développer aux


faibles aw (levures osmophiles ou osmotolérantes)

 Ces levures préfèrent les milieux très riches en sucres

 Posent surtout problèmes en pâtisserie (très rarement sur


grains ou farines)
119 Cas des bactéries

 Généralement incapables de se développer aux aw


habituelles des grains et farines

 Exigent généralement des aw > 0,90 (produits fortement


réhumidifiés)
120 Température

Vitesse de
croissance
 Pour la croissance de
chaque espèce:
• Température minimale
• Température optimale
• Température
maximale

T min T opt T max température


121

 La température optimale de la plupart des moisissures


de stockage des céréales avoisine les 30°C

 Un échauffement peut survenir suite à un


développement fongique (hot spot)

 Les fluctuations de température accélèrent


l’altération fongique des grains (ex.: fluctuations de 25
à 40°C par rapport à 30°C constante)
122 Composition de l’atmosphère

 Moisissures en général aérobies


 Certaines (microaérophiles) sont peu
exigeantes: se contentent de 5% d’Oxygène
 En dessous de
0,5%, croissance Moisissures microaérophiles:
très difficile Penicillium roqueforti
Fusarium spp
Quelques Mucorales
123

 Conservation de grains semi-humides (20%


environ) possible sous atmosphère neutre
(anaérobiose)

 Inconvénient: perte du pouvoir germinatif

 Réservée aux céréales destinées à des usages


particuliers: alimentation animale, amidonnerie,
etc.
124 Composition et structure du produit

 La zone du germe est la plus favorable aux


micro-organismes (richesse biochimique);
généralement point de départ du
développement fongique

 Même pour des aw faibles (0,75-0,85), les


moisissures xérotolérantes peuvent utiliser les
lipides du germe comme sources de Carbone
grâce à leurs lipases
125

 Les enveloppes externes du caryopse du blé :


substrat moins favorable au développement
des moisissures que les couches profondes

Pour une humidité de 17,5-18%:

- Grain entier (enveloppes intactes): visiblement moisi


après 15 à 20 jours

- Grain « pelé » (enveloppes altérées mécaniquement):


visiblement moisi en 5 à 6 jours
126

 Grains endommagés à la récolte plus


susceptibles à l’attaque microbienne que grains
intègres

 Brisures souvent beaucoup plus contaminées


que grains entiers

 Farines plus faciles à attaquer que les grains


correspondants (mêmes raisons)
2.3- Conséquences
127

- Conséquences organoleptiques: odeurs de


moisi; acidité

- Conséquences technologiques: pouvoir


germinatif des grains; valeur boulangère de
la farine

- Conséquences hygiéniques: mycotoxines


128 Conséquences organoleptiques

o Odeurs de moisi ou de renfermé


• Dues à des substances volatiles
• Persistent dans les produits finis, même après
cuisson
• L’analyse du pain (Chromatographie en Phase
Gazeuse) permet de déterminer la proportion
de farine altérée utilisée dans sa fabrication
129

o Acidité
• Les moisissures des céréales produisent des
lipases et des lipoxygénases
• Les lipases libèrent des acides gras par hydrolyse
des lipides (lipolyse)
• Acides gras libres responsables de goûts
indésirables
130

• On observe souvent une lente acidification des


grains et des farines au stockage sans
développement de moisissures

• Cette acidification est due aux lipases formées


par les moisissures du champ ou du pré-
stockage
131

• Les lipoxygénases oxydent les acides gras en


peroxydes, qui réagissent avec:

 Les groupements Thiol (R-S-H) des acides, ce qui


altère la qualité du gluten

 Les carotènes, ce qui provoque le


blanchissement de la farine
132

Normes pour
l’acidité grasse
des farines

ISO 7305: 1998 AOAC 939.05

70 mg pour 100 g de 50 mg d’Hydroxyde de


Farine (matière sèche) Potassium pour la
neutralisation des acides
exprimée en
gras libres dans 100 g de
acide sulfurique farine (en matière sèche)
133 Conséquences Technologiques

Perte du pouvoir germinatif des grains

Valeur boulangère très peu touchée en


général (pas de déformation significative de
l’alvéogramme Chopin)

 Dans les cas extrêmes, les peroxydes


peuvent altérer la qualité du gluten
134 Conséquences hygiéniques

Certaines moisissures (toxinogènes) produisent


dans les grains ou la farine des substances très
dangereuses pour la santé du consommateur:
les mycotoxines

Voir Troisième Chapitre


3- Moisissures toxinogènes et
problématique des mycotoxines
136
3- Moisissures toxinogènes et
problématique des mycotoxines

3.1- Historique, définitions


3.2- Principales mycotoxines et mycotoxicoses
3.3- Conditions de toxinogenèse
3.4- Devenir des mycotoxines au cours des
traitements technologiques
3.5- Présence de mycotoxines dans les
produits céréaliers marocains
3.6- Prévention, protection du consommateur
Ergotisme:
137 3.1- Historique, feu de la
définitions Saint Antoine
ou Mal des
Ardents
Historique
o Antiquité:
ergotisme
(feu de Saint
Antoine);
gangrène
des
extrémités
139 Agent causal

- Fin XVIIIème siècle: association avec l’ergot


du seigle

- XVIIème siècle: responsabilité reconnue du


pain fait avec de la farine de seigle.

- Ce seigle était atteint par l'ergot du seigle


dû à un champignon:
Claviceps purpurea
05/04/2018
Claviceps purpurea sur
seigle
140

Claviceps
purpurea sur blé
05/04/2018
141
o ATA (Aleucie Toxique Alimentaire)
- Attaque de la moelle osseuse
- Nombreux décès en Europe de l’Est (ex- URSS, années 1930
et 1940), Europe centrale, Etats-Unis, Finlande et Chine.
- Mycotoxines responsables: trichothécènes, produits par
des Fusarium

o 1930-40: Stachybotryotoxicose chez le cheval (ex.


URSS)
o 1945: intoxication de porcs (Maroc)

05/04/2018
142 Découverte des aflatoxines

- UK (1960): 100000 dindes et canards tués


(période de Noël);
- Turkey-X disease (maladie X du dindon);
- Farine d’arachide (Brésil):
. spores d’ Aspergillus flavus
. substance toxique associée

Aflatoxine
05/04/2018
143 Nouvelle orientation

Aspergillus flavus, considérée comme une


moisissure banale, s’est révélée
extrêmement dangereuse
Depuis, on a découvert des centaines
d’autres mycotoxines
Toutes les moisissures doivent être
suspectées

05/04/2018
144 Définitions

 Mycotoxine: métabolite fongique non


antigénique (faible poids moléculaire)
capable de provoquer des syndromes
spécifiques chez l’Homme et/ou les animaux

 Mycotoxicose: syndrome spécifique


provoqué par une mycotoxine; non
infectieuse et non contagieuse
(contrairement à mycose)
145

 Une espèce toxinogène peut produire une ou


plusieurs mycotoxines

 Une même mycotoxine peut être produite par


une ou plusieurs espèces de moisissures
146 3.2- Principales mycotoxines et
mycotoxicoses

Mycotoxines « classiques »
Mycotoxines « émergentes »
Mycotoxicoses
o Intoxication chronique et intoxication aiguë
o Diversité des syndromes
Principales mycotoxines « classiques »

Mycotoxines Moisissures productrices


Aflatoxines B1 & B2 Aspergillus flavus
Aflatoxines B1, B2, G1 & G2 A. parasiticus
Toxine T-2 Fusarium sporotrichioides
Déoxynivalénol (ou nivalénol) F. graminearum
Zéaralénone F. graminearum
Fumonisine B1 F. moniliforme (F. verticillioides)
Ochratoxine A A. ochraceus, Penicillium verrucosum, etc.
Patuline Plusieurs espèces
Ergotamine Claviceps purpurea

147
148 Nature chimique des mycotoxines

Très variable

Parfois plusieurs variantes chimiques formant


un groupe de mycotoxines. Exemples:
- les aflatoxines;
- les fumonisines;
- les trichothécènes, etc.)

05/04/2018

148
Principales Aflatoxines
149

Structure des Aflatoxines B1, B2, G1 et G2 05/04/2018


150
Ochratoxines

05/04/2018

150
Citrinine
151

05/04/2018
152
Patuline

05/04/2018
Zéaralénone
153

05/04/2018
154

T2-Toxine
155 Trichothécènes

05/04/2018
156 Fumonisines

05/04/2018
Mycotoxines émergentes
Mycotoxines Moisissures Effets biologiques
Enniatines Espèces de Fusarium Phytotoxicité

Beauvéricine Espèces de Fusarium, Beauveria Fragmentation de l’ADN


bassiana Activité antibactérienne

Fusaroproliférine Espèces de Fusarium Toxique pour Artemia


salina; cytotoxicité sur
lymphocytes B
Tératogène

157
Enniatines
Enniatine A
- Produites par plusieurs espèces de

Fusarium (F. tricinctum, F. avenaceum)

- 35 molécules d’ENs ont été isolées dont :

A, A1, B, B1

- Activité biologique: phytotoxique.


Beauvéricine
Beauvericine
- Produite par certaines espèces de
Fusarium (F. proliferatum, F. poae,
etc.) et Beauveria bassiana.

- Induit une fragmentation de l’ADN.

- A une activité antibactérienne


Fusaproliférine
Fusaroproliférine
- Produite par des espèce de Fusarium
(F. subglutinans)
- Activité biologique contre Artemia
salina
- Cytotoxique aux lignes cellulaires
des Lymphocytes B
- Tératogène

160
Mycotoxicoses

o Chroniques ou aiguës

Intoxication Chronique Aiguë

Dose Faible Forte

Durée Longue Courte


(effet cumulatif)
Signes cliniques Manque d’appétit Mort
(ex: Ralentissement de croissance brutale
aflatoxicose) Perte de poids
Fatigue générale
Cancer
161
Activité trémorgène Encéphalomalacie
Penitrème Fumonisine
Penicillium crustosum Fusarium moniliforme
162

Nécrose hépatique Cancer

Stérigmatocystine Aflatoxines

Aspergillus versicolor Aspergillus flavus

Syndrome de la bave Hémorragie poumon et

Slaframine
Mycotoxines cerveau
Patuline
Rhizoctonia leguminicola
Plusieurs espèces

Néphrotoxicité Hémorragie du foie

Ochratoxine Rubratoxine

P. verrucosum; A. ochraceus Penicillium rubrum

Œstrogène Troubles intestinaux


Zéaralénone Austidiol
F. graminearum Aspergillus ustus

Aperçu sur la diversité des syndromes mycotoxiques


3.3- Conditions de toxinogenèse
163

Conditions liées à la moisissure

Conditions liées au substrat

Conditions liées à l’environnement

Autres paramètres pour les céréales


164 Conditions liées à la moisissure

 Au niveau des genres

Les plus Assez À ne pas


importants importants oublier

Aspergillus Stachybotrys Claviceps


Penicillium Alternaria
Fusarium Trichothecium
165

 Au niveau des espèces:


o Certaines espèces sont réputées toxinogènes,
d’autres non
o Pour céréales et légumineuses, surtout les
espèces de stockage
o Parfois espèces de la flore du champ (ex.:
Aspergillus flavus, Fusarium graminearum)
166

 Au niveau des souches:


o Toutes les souches d’une espèce peuvent
être toxinogènes (A. parasiticus; aflatoxines)
o Dans une espèce, souches toxinogènes et
d’autres non (limites des techniques
d’analyse) (A. flavus; aflatoxines)
o Pouvoir toxinogène variable parmi les
souches d’une même espèce
Variabilité du pouvoir toxinogène entre les souches d’une
même espèce fongique: cas d’Aspergillus parasiticus
(aflatoxines totales en μg/g)

Substrat Souche NRRL Souche NRRL Souche NRRL


3000 2999 3145
Arachide 107 104 8,5
Soja 19 2,8 0,06
Maïs 53 47 5,5
Blé 79 19 7,1
Riz 107 185 10,6
Sorgho 72 88 5,7

167
168 Conditions liées au substrat

 Influence de l’espèce de céréale

 Influence de l’activité de l’eau


 Influence de l’espèce de céréale

Effet de l’espèce de céréale sur la production de mycotoxines


dans les grains, en comparaison avec 2 légumineuses:
cas de 3 souches d’Aspergillus parasiticus (aflatoxines totales en μg/g)

Souche Souche Souche


NRRL 3000 NRRL 2999 NRRL 3145
Arachide 107 104 8,5
Soja 19 2,8 0,06
Riz 107 185 10,6
Sorgho 72 88 5,7
Maïs 53 47 5,5
Blé 79 19 7,1

169
 Influence de l’activité de l’eau
Toxinogenèse généralement plus exigeante que
croissance

Valeurs optimales de l’activité de l’eau (aw) pour la croissance de


certaines moisissures et la production de leurs mycotoxines

Moisissure Mycotoxine Aw min de Aw min de


croissance toxinogenèse
A. flavus Aflatoxines 0,70-0,75 0,83-0,87
A. parasiticus Aflatoxines 0,70 0,80
A. ochraceus Ochratoxines 0,85-0,88 0,88
A. ochraceus Ac.pénicillique 0,85-0,88 0,97-0,99
P. expansum Patuline 0,91 0,99
170
171 Conditions liées à l’environnement

 Température

 Oxygénation

 Humidité Relative de l’air


172  Température

Températures optimales et minimales de


toxinogenèse de certaines moisissures

Moisissure Toxines Optimum Minmum


A. flavus Aflatoxines 25-28 8-10
A.parasiticus Aflatoxines 25-30 10-13
A. ochraceus Ochratoxine 25 12
P. expansum Patuline 20-22 0-4
A. clavatus Patuline 20-25 12
F. roseum Zéaralénone 10 <10
Fusarium sp. T2-Toxine 0-5 <0
173

 Oxygénation

o Les moisissures ont besoin d’oxygène


o L’aération des locaux de stockage:
 Prévient l’accumulation d’humidité, mais ….
 Favorise la dispersion des spores
 Humidité relative de l’air
174
Elle permet réabsorption d’eau dans le produit si
elle est élevée

HRE > HR air HRE < HR air


H2O H2O

L’aw du produit diminue L’aw du produit augmente


Autres paramètres pour les céréales

FACTEURS PHYSIQUES Au A la Au
champ récolte stockage
Humidité + + +
rapidité de séchage - + +
réhumidification - + +
humidité relative + + +
Température + + +
Endommagement mécanique + + +
Broyage des grains - + +
« Hot spots » - - +
Temps + + +

+: a un effet -: n’a pas d’effet


175
FACTEURS CHIMIQUES Au A la Au
champ récolte stockage
CO2 - - +
O2 - - +
Nature du substrat + - +
Nutrition minérale + - +
Traitements chimiques - - +

+: a un effet -: n’a pas d’effet

176
FACTEURS BIOLOGIQUES Au A la Au
champ récolte stockage
Variété de plante + - +
Stress (plante) + - +
Vecteurs invertébrés + - +
Infection fongique + - +
Souche fongique + - +
Charge de spores + + +
Écosystème microbien + - +

+: a un effet -: n’a pas d’effet

177
178 3.4- Devenir des moisissures et des mycotoxines
au cours des traitements technologiques

Mouture

Traitements thermiques

Fermentation

Panification
179 Mouture

o Contamination fongique des farines


• Les spores de la mycoflore du champ: surtout
dans le son (faible sporulation)
• Celles de la mycoflore de stockage: grande
dispersion dans la farine (forte sporulation;
spores à surface sèche)
• Dans les machines du moulin, résidus de farine
sur lesquels se développent des espèces
fongiques
• Développement de moisissures dans les silos
de stockage
o Distribution des mycotoxines; mouture sèche
Céréale Mycotoxine Distribution (%)

Enveloppes 5-31; Farine de son 7-12;


Maïs Aflatoxine B1 Germe 30-49; « Grits* » 3-6;
Farine à faible taux de lipides 2-3;
Farine à taux de lipides élevé 14-15
Riz Aflatoxine B1 Son 95; riz poli 95

Blé dur Aflatoxine B1 Concentration augmente avec taux


d’extraction (maximum dans le son)

Orge, blé Ochratoxine A Concentration similaire dans farine


et son

* préparation à base de maïs moulu

180
o Distribution des mycotoxines; mouture humide du
maïs (distribution des toxines en %)

Mycotoxine Parties Fibres Gluten Amidon Germe


Solubles
Aflatoxine B1 39-42 20-38 13-17 1 6-10

Zéaralénone 17-26 15-19 49-56 0 9-11

T2-Toxine 64-70 9-11 6-13 3-6 8-12

181
182 Traitements thermiques

o Grande thermostabilité en général


• Aflatoxines
A l’état sec, stables jusqu’au point de fusion
Résistent à 150°C plusieurs heures
Moins résistantes en présence d’humidité

• Ochratoxine A
Relativement stable à la chaleur
Après autoclavage de céréales
pendant 3h, reste 12,5 à 17%
Effet de l’humidité sur le devenir des mycotoxines

Produit Mycotoxine Traitement Humidité Destruction

Riz Aflatoxine B1 Cuisson 4 X Riz 48-49%


8 X Riz 75-82%

Orge Patuline Stockage aw 0,70 ½ Vie 13j


aw 0,90 ½ Vie 7j

Orge Citrinine Stockage aw 0,70 ½ Vie 8j


aw 0,90 ½ Vie 2j

Farine Ochratoxine A Autoclavage Pas d’eau 87,5%


d’avoine 50% eau 74%

183
184 Fermentation

 Fermentation alcoolique (bière):


disparition de l’ochrtatoxine A de l’orge

 Fermentation alcoolique (pain):


- Farine contaminée par Aflatoxine B1 : 225 µg/kg
- Taux résiduel dans le pain après cuisson: 44 µg/kg
185 Effet de la panification

Niveaux de contamination 40 à 225 µg/kg


initiale de la farine
Taux résiduels (TR) après 13 – 100%
pétrissage
TR 1ère fermentation 11,5 - 65%
(2h de pointage)
TR 2ème fermentation 9,5 – 65%
(1h d’apprêt)
TR après cuisson 7,8 - 40%
3.5- Présence de mycotoxines dans des
Céréales
produits céréaliers marocains

Aflatoxine B1 Ochratoxine A & Zéaralénone


Produits analysés Contaminés Taux Contaminés
Produits analysés
Blé 107 0 -
OTA ZEA
Orge 75 0 -
Maïs 50 1 18*
Blé 87 0 0
Son de blé
Orge 75 3* 0
54 0 -
Maïs 43 0 0
Son de blé 14 0 0

Total 286 2 2 Total 219 3 0


* μg/kg * 1,13 – 2,83 μg/kg

Tantaoui Elaraki et al., Actes Inst. Agron. Vét., 1994, 14, 11-6

186
Fumonisine B1, Ochratoxine A & Zéaralénone

187
Ochratoxine A dans le pain

- % de contamination:
48% (0.14 - 150 ng/g)
- 26 % échantillons >LMR
(Europe) (3ng/g)
- La présence d’OTA
dans le pain est due à la
contamination de la
matière première (farine)

188
Déoxynivalénol dans le blé dur

Ennouari et al., Food Control 32 (2012) 115-118

189
Enniatines dans le blé, le maïs et l’orge

(mg/Kg)

Zinedine et al., Food Control 22 (2011) 1-5

190
Beauvéricine et Fusaroproliférine dans le blé, le
maïs et l’orge

Zinedine et al., Food Control 22 (2011) 1-5

191
Enniatines dans des « breakfast » et aliments
pour enfants à base de céréales

Mahnine et al., Food Chemistry 124 (2011) 481-485

192
Beauvéricine et Fusaroproliférine dans des « breakfast »
et aliments pour enfants à base de céréales

Mahnine et al., Food Chemistry 124 (2011) 481-485


Enniatines dans le riz

Sifou et al., Food Control 22 (2011) 1826-1830


Mycotoxines dans la semoule de couscous
Nombre d’échantillons 98

Nombre de toxines recherchées 22

Nombre d’échnatillons contaminés 96


(au moins une toxine)
Plus haute incidence ENB, ENB1, ENA1, ZEA

Co-présence Fréquente

Zinedine et al. Food Chemistry 214 (2017): 440-446


Mycotoxines dans les pâtes alimentaires

Nombre 40 106
d’échantillons
Nombre de 7 13
toxines
recherchées
Principaux 50% positifs DON 80% positifs aux
resultats (conc. > limit Enniatines &
max. europ.) ZEA
Bouafifsa et al., Inter Conf Mycotoxins & Cancer (2016)
197 3.6- Prévention, protection du consommateur

 Aspects réglementaires
 Aspects techniques
 Contrôles
o Analyses mycologiques des céréales
o Recherche et dosage des mycotoxines
o Application de la démarche HACCP
198 Aspects réglementaires
o Dans plusieurs pays ou communautés de pays (UE),
des teneurs maximales sont fixées pour les
principales mycotoxines, pour l’alimentation
humaine et pour différents types d’animaux
(volailles, veaux, vaches laitières, etc.)

o Réglementation marocaine pour les mycotoxines:


arrêté conjoint du ministre de l’agriculture et de la
pêche maritime et du ministre de la santé n° 1643-
16 du 23 chaâbane 1437 (30 mai 2016) publié au
Bulletin Officiel n° 6514 du 03/11/2016
Réglementation marocaine pour les Aflatoxines (extrait du
décret conjoint MAPM et MS n° 1643-16
Limites maximales (µg/kg)

Produits
B1 B1+B2+G1+G2 M1

2.1.11- Toutes céréales et tous produits dérivés, y compris 2,0 4,0 -


produits de céréales transformés, à l’exception des
produits 2.1.12, 2.1.15 & 2.1.17
2.1.12- Maïs et riz destinés à être soumis à un traitement 5,0 10,0 -
de triage ou à d’autres méthodes physiques avant
consommation humaine ou utilisation comme ingrédients
de produits alimentaires
2.1.15- Préparations à base de céréales et aliments pour 0,10 - -
bébés destinés aux nourrissons et enfants en bas âge
2.1.17- Aliments diététiques destinés à des fins 0,10 - 0,025
médicinales spéciales, spécifiquement pour les
nourrissons
Réglementation marocaine pour l’Ochratoxine A (extrait du
décret conjoint MAPM et MS n° 1643-16
Limites maximales
(µg/kg)
Produits
2.2.1- Céréales brutes 5,0
2.2.2- Tous produits dérivés de céréales brutes, y compris produits 3,0
de céréales transformés et céréales destinées à la
consommation humaine directe, à l’exception des produits 2.2.9,
2.2.10 & 2.2.14
2.2.9- Préparations à base de céréales et aliments pour bébés 0,5
destinés aux nourrissons et enfants en bas âge
2.2.10- Aliments diététiques destinés à des fins médicinales 0,5
spéciales, spécifiquement pour les nourrissons
2.2.14- Gluten de blé non vendu directement au consommateur 8,0
Réglementation marocaine pour le Déoxynivalénol (extrait du
décret conjoint MAPM et MS n° 1643-16
Limites Seuil d’alerte Date limite
maximales (µg/kg) d’application
Produits (µg/kg) seuil d’alerte

2.4.1- Céréales brutes autres que blé dur, avoine, riz et maïs - 1250 4 ans
2.4.2- Blé dur et avoine bruts - 1750 4 ans
2.4.3- Maïs brut à l’exception du maïs brut destiné à être transformé 1750 - -
par mouture humide
2.4.4- Céréales destinées à la consommation humaine directe, farine - 750 4 ans
de céréales, son et germe en tant que produit fini commercialisé
pour consommation humaine directe, à l’exception des produits
2.4.7, 2.4.8, 2.4.9 et des produits à base de riz
2.4.5- Pâtes sèches - 750 4 ans
2.4.6- Pain (y compris petits produits de boulangerie), pâtisseries, - 500 4 ans
biscuits, collations aux céréales et céréales pour petit-déjeuner
2.4.7- Préparations à base de céréales et aliments pour bébés 200 - -
destinés aux nourrissons et enfants en bas âge
2.4.8- Fractions de mouture de maïs dont la taille est > 500 microns 750 - -

2.4.9- Fractions de mouture de maïs dont la taille est ≤ 500 microns 1250 - -
Réglementation marocaine pour la Zéaralénone (extrait du
décret conjoint MAPM et MS n° 1643-16
Limites Seuil d’alerte Date limite
maximales (µg/kg) d’application
Produits (µg/kg) seuil d’alerte

2.5.1- Céréales brutes autres que maïs et riz - 100 4 ans


2.5.2- Maïs brut à l’exception du maïs brut destiné à être transformé 350 - -
par mouture humide
2.5.3- Céréales destinées à la consommation humaine directe, farine - 75 4 ans
de céréales, son et germe en tant que produit fini commercialisé
pour consommation humaine directe, à l’exception des produits
2.5.6, 2.5.7, 2.5.8 et 2.5.9 et des produits à base de riz
2.5.4- Huile de maïs raffinée - 400 4 ans
2.5.5- Pain (y compris petits produits de boulangerie), pâtisseries, - 50 4 ans
biscuits, collations aux céréales et céréales pour petit-déjeuner, à
l’exception des collations au maïs et des céréales pour petit-
déjeuner à base de maïs
2.5.6- Maïs destiné à la consommation humaine directe, collation à 100 - -
base de maïs et céréales pour petit-déjeuner à base de maïs
2.5.7- Préparations à base de céréales et aliments pour bébés 20 - -
destinés aux nourrissons et enfants à bas âge
2.5.8- Fractions de mouture de maïs dont la taille est > 500 microns 200 - -
2.5.9- Fractions de mouture de maïs dont la taille est ≤ 500 microns 200 - -
Limites marocaines pour les aflatoxins dans différents produits
alimentaires (comparées aux limites européennes)
Mycotoxines Produits alimentaires Limites Limites
marocaines 1 européennes 2
(µg/Kg) (µg/Kg)
Aflatoxine B1 Céréales et produits dérivés 2 2
Aliments pour bébés incluant produits à base de céréales 0.1 0.1
Epices 5 5
Pistaches, amandes 8 -
Figues sèches 6 -
Fruits secs destinés à la consommation humaine directe - 2
Aflatoxines Céréales et produits dérivés 4 4
totales
Epices 10 10
B1+B2+G1+G2
Pistaches, amandes 10 -
Figues sèches 10 -
Aflatoxine M1 Lait liquide 0.05 0.05
Lait pour bébés - 0.025
1 Bulletin Officiel du Royaume du Maroc (2016)
2 European Commission (2006)
205 Aspects techniques

 Plusieurs paramètres influent sur le


développement des moisissures toxinogènes
et l’apparition des mycotoxines. Deux
aspects très importants:
o L’humidité des grains et des farines
o L’intégrité des grains
206

o L’humidité des grains et des farines


 À la récolte: éviter de récolter par temps
humide
 Au pré-stockage: déshydratation des grains
(cas du maïs)
 Au stockage (grains et farines): entrepôts
divers, commerces, ménages, etc.
 Au transport: surtout maritime
207

o Intégrité des grains


Eviter tout endommagement des grains:
• Mécanique: récolte, battage, etc.
• Biologique:
 Insectes: au champ et au stockage
 Champignons (espèces parasites ou
saprophytes non toxinofgènes): au champ et au
stockage
Moisissure
Espèce non Espèce
Souche
208 toxinogène toxinogène
toxinogène

Souche non
toxinogène
Substrat Substrat
défavorable favorable

Environt
défavorable Environt
favorable

Traitements
Aliment moisi sans Aliment moisi avec
technologiques mycotoxines
mycotoxines

Aliment non moisi avec


Aliment sain mycotoxines

Consommation humaine ou animale 05/04/2018


209 Contrôles

 Analyses mycologiques

 Recherche et dosage des mycotoxines

 Application de la démarche HACCP


210
 Recherche et dosage des mycotoxines
 Extraction: solvants appropriés
 Purification de l’extrait (éliminer lipides,
pigments, etc.)
 Séparation chromatographique
 Révélation (souvent par UV)
 Confirmation (souvent par dérivation
chimique)
 Quantification (HPLC par exemple)
211

 Application de la démarche HACCP

o HACCP: démarche consistant à prévoir les


dangers que pourraient encourir le
consommateur et prendre les mesures
nécessaires pour le protéger

o Les mycotoxines sont incluses dans les


dangers biologiques
212

BPF:
BONNES
PRATIQUES
DE
FABRICATION
QUALITE
BPH:
BONNES
PRATIQUES
D’HYGIENE
4- Principes des méthodes
d’analyse microbiologique des
céréales et dérivés
4- Principes des méthodes d’analyse
microbiologique des céréales et dérivés

4.1- Numération des propagules de moisissures


dans une farine
4.2- Recherche, dans les grains de céréales, de
moisissures susceptibles de représenter un
danger
4.3- Identification des 3 genres importants :
Aspergillus, Penicillium et Fusarium.
4.1- Numération des propagules de moisissures
dans les farines

Principe

Les moisissures se trouvent sous différentes formes susceptibles


de donner naissance à un nouveau mycélium :
- spores de toutes sortes,
- fragments de filament,
- touffes de filaments, etc.

Chacun de ces éléments est une unité de propagation ou


propagule.
La technique de numération consiste à:
- suspendre une quantité donnée de farine dans
un milieu liquide dispersant;
- ensemencer des dilutions successives de cette
suspension mère dans un milieu nutritif gélosé
favorable
- incuber (température, durée)
- compter le nombre de « thalles » qui
proviennent, en principe, chacun d’un
propagule.
217
Mode opératoire

 Bien homogénéiser l’échantillon de


farine avant de commencer l’analyse
 Dans un récipient stérile, peser
aseptiquement 1g de cette farine
 Ajouter 9 ml d’eau physiologique stérile
(8,5 g de NaCl/l) avec 0,1% de tween 80
(favorise la dispersion des spores) : 1ml de
cette suspension mère représente 0,1g de
farine
 Agiter fortement
Procéder à une série de dilutions décimales de la suspension
218
mère dans des tubes à essais contenant 9 ml d’eau
physiologique stérile au tween 80 (le nombre de dilutions
dépendra de la charge présumée de la farine en moisissures)

1ml 1ml 1ml 1ml

Solution
de
dilution:
tubes
Solution mère: 1g de 9ml
+ 9ml eau distillée
stérile au tween

Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-n


 Dans une série de boîtes de Petri, répartir 1ml de
chacune des dilutions préparées précédemment

 Couler aseptiquement dans chaque boîte 15 à 20


ml de milieu gélosé stérile ramené à 45-48°C, puis
bien homogénéiser : les milieux utilisés sont le milieu
de Sabouraud Agar, le milieu MEA (Malt Extract
Agar) ou le Czapeck-Dox Agar

 Après solidification, incuber les boîtes 6j à 25°C ou 4j


à 30°C
220  Technique d’ensemencement

Dilutions 100 10-1 10-2 10-n

Ensemencement
(en double) sur
milieu gélosé

incubation
.... …. . .. .. Lecture et
.... ... . … .. . ..
...

. interprétation
..

.. ... ..
n0 n1 n2 nn
221
Lecture et interprétation
- Sélectionner les boîtes avec un nombre de
colonies n tel que m<n<M
- Le minimum m et le maximum M varient selon
la taille moyenne des colonies concernées,
généralement:
.pour les bactéries, entre 30 et 300
.pour levures et moisissures, entre 10 et 100
223
∑ C: somme des colonies
comptées dans toutes les boîtes
retenues (avec nombre de
colonies entre 10 et 100)
∑C
N= n1: nombre de boîtes retenues à
(n1 + 0,1n2)d
la 1ère dilution
2 dilutions successives
retenues n2: nombre de boîtes retenues à
la 2ème dilution
∑C n3: nombre de boîtes retenues à
N=
(n1 + 0,1n2 + 0,01n3 )d la 3ème dilution
3 dilutions successives d: facteur de dilution
retenues
correspondant à la 1ère dilution
224

Expression des résultats

- Le chiffre trouvé est arrondi à 2 chiffres


significatifs (ex.: 28350 à 28000; 11500 à 12000)
- le nombre d’UFC/g ou/ml trouvé est converti
en un nombre compris entre 1,0 et 9,9
multiplié par 10x,(ex. 28000 converti en 2,8.104
4.2- Recherche, dans les grains de céréales, de
moisissures susceptibles de représenter un danger

Principe

 Laver soigneusement les grains de leurs poussières de


surface pour enlever les moisissures sans intérêt;
 disposer les grains à la surface d’un milieu nutritif gélosé
approprié dans des boîtes de Petri;
 après incubation, observer le développement éventuel
de moisissures;
 Isoler ces moisissures pour étude et identification
éventuelle.
Mode opératoire

Prélever aseptiquement quelques grains de la céréale à


étudier ;
Les placer dans un flacon contenant de l’alcool à 76° ou
de l’eau physiologique stérile et agiter légèrement pour
débarrasser les grains de leurs moisissures de surface sans
intérêt (en cas d’utilisation d’alcool, repasser les grains
rapidement dans de l’eau distillée ou de l’eau
physiologique stériles sans agitation pour supprimer les
restes d’alcool) ;
Disposer quelques grains à l’aide de pinces stériles
à la surface d’un milieu gélosé dans une boîte de
Petri, de préférence le sillon vers le bas ;
Incuber comme précédemment ;
Observer le développement éventuel de
moisissures partant des grains : on peut regarder
les boîtes toutes les 24 heures à partir du 2ème
jour ;
Repiquer et purifier les souches en boîte de Petri
par les techniques microbiologiques classiques en
vue de l’identification et/ou la conservation.
4.3- Identification des 3 genres importants:
Aspergillus, Penicillium et Fusarium

Principe
Observation microscopique de cultures ou de
prélèvements de cultures. Noter notamment :
 la nature cloisonnée ou non des filaments végétatifs ;
 la forme et le cloisonnement éventuel du conidiophore ;
 la forme spécifique de la tête conidienne ;
 la forme, la taille et le caractère unicellulaire ou
pluricellulaire des conidies ;
 d’autres aspects spécifiques à chaque genre.
Modes opératoires

- Observations des cultures in situ dans une boîte


de Petri
- Observations de cultures sur lames
- Technique du scotch
- Observation entre lame et lamelle
Observations des cultures in situ dans une boîte de Petri

- Observer directement les « thalles » de moisissures en


plaçant la boîte de Petri sous l’objectif du microscope
- Observer de préférence les parties périphériques des
« thalles » (peu denses)
- Avantages de cette technique: simplicité, possibilité
de regarder les structures intactes de la moisissure
- Inconvénient: on ne peut généralement pas passer à
des forts grossissements.
Observations de cultures sur lames

- Etaler soigneusement en couche mince un petit volume d’un


milieu gélosé approprié sur une lame porte-objets stérile
- Ensemencer par touche centrale avec la souche à identifier
- Placer la lame à l’intérieur d’une boîte de Petri vide stérile,
avec un peu d’eau stérile pour éviter la déshydratation du
milieu, puis incuber à 25-30°C.
- Quand le développement de la moisissure est jugé suffisant,
placer la lame sous l’objectif du microscope et observer.
- Cette technique permet de plus forts grossissements que la
précédente, mais elle nécessite la culture préalable sur lame.
Technique du scotch (ou du drapeau)

- Appliquer une bande de scotch sur la partie à


prélever d’un « thalle », puis coller la bande sur
une lame porte-objets et observer.
- Avantages: technique simple et pratique,
Inconvénient: risque de briser les structures de la
moisissure au cours du prélèvement.
Observation entre lame et lamelle.

- Déposer une goutte d’eau sur une lame porte-objets


- Prélever, à l’aide d’un stylet (ou d’une lame de rasoir),
une fraction suffisante (mais la plus fine possible) d’une
culture sur milieu gélosé de la souche à étudier et la
déposer dans la goutte d’eau
- Avant d’observer, recouvrir délicatement le prélèvement
d’une lamelle, sans trop écraser le mycélium et sans laisser
de bulles d’air entre la lame et la lamelle.
- Inconvénient: les spores ont tendance à se disperser dans
l’eau, ce qui défait les têtes conidiennes
- Remarque : pour améliorer la qualité de l’observation, on
peut ajouter dans l’eau du « bleu coton ».
Observation entre lame et lamelle

Technique du drapeau
Aspergillus

- Cellule podale: foot cell


- Conidiophore non cloisonné
- Vésicule (forme variée)
- Métules et phialides (bisérié) ou
phialides seules (unisérié)
- Conidies en ligne à partir des
phialides
Penicillium

- Conidiophore cloisonné
- Conidiophore simple (a et b)
ou ramifié (c et d)
- Tête conidienne décisive pour
identification des espèces
Fusarium

- Microconidies (uni- ou
bicellulaires)
- Macroconidies (multicellulaires)
en fuseau
- Chlamydospores: formes de
résistanc
Conclusion générale
245
Entre aliment et
microorganismes:
un combat à mort
‫رحم هللا عبدا عمل عمال ف أتقنه‬
‫حديث شريف‬

‫من غشنا ف ليس منا‬


‫حديث شريف‬
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