Recipientes y medios de cultivo para las

células

Ricardo Felm er D .
Bioquím ico, Ph.D .
 Recipientes de cultivo
•La mayoría de las células animales cultivadas in vitro crecen en
monocapa sobre un sustrato artificial. Por lo tanto el sustrato debe
estar cargado apropiadamente para permitir la adhesión.

•La elección del envase va depender

de las características de crecimiento
de las células y el número de células
requeridas.
 Recipientes de cultivo

Vidrio:

• Es el sustrato más comúnmente utilizado.

• Fácil de lavar y esterilizar, por lo que se

pueden re-utilizar.
• Bajo costo
• Ópticamente transparente para permitir la
observación microscópica de los cultivos.
 Recipientes de cultivo

Plástico desechable:
• Muy utilizado en la actualidad (Poliestireno).

• Muy buena calidad óptica para la evaluación de los

cultivos.

• Debido a que es hidrofóbico (repele el agua),

requiere un tratamiento para producir una superficie No tratadas (para
células en suspensión).
cargada hidrofílicamente que facilita la adhesión y
posterior crecimiento de las células.
Tratadas (para células
adherentes.
 Recipientes de cultivo

Plástico desechable:

Tratamiento al Plástico.
• Modificación permanente que se realiza a la
superficie de Poliestireno.
• Genera una carga neta en la superficie del plástico.
• Algunos tratamientos incluyen:
•Irradiación gamma
•Químico (ionizante)
•Cubierta proteica (Proteínas, Plasma o
Aminoácidos).

Algunas células requieren un sustrato de
adhesión específico:
•Algunos ejemplos son matrices extracelulares de proteínas como:

Colageno

Fibronectina

Laminina
 Recipientes de cultivo

Plástico desechable:

Algunas células requieren un sistema de adhesión específico:
Por ej: Para el cultivo de algunas células epiteliales, se utiliza
sistemas con membranas plásticas porosas.
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.
La elección del recipiente de cultivo depende de diferentes factores
incluidos:

La cantidad de células que se quiera obtener.

Si la célula crece en suspensión o en monocapa.
Si el cultivo debe ser ventilado a la atmósfera o no.
La frecuencia de muestreo.
El tipo de análisis requerido.
Costo.
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.

Cantidad de células (Rendimiento celular).

Para cultivos en monocapa el

rendimiento dependerá de la
superficie de crecimiento.

Rendimiento aumenta a medida

que aumenta la superficie.
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.

Cantidad de células (Rendimiento celular).

Placas multipocillos (Multi-well plates).
•6, 12, 24, 96, 384 pocillos

Permite la realización de múltiples
réplicas de un experimento.

Placas se usan para experimentos específicos.

•Recuperar células para Geles de Proteína
(Western B.).
•Fijar y teñir células para localización
proteica.
•Clonación.

Disponibles en 3 tamaños:
•35, 60 y 100 mm de diámetro.
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.

Cantidad de células (Rendimiento celular).

Frascos se utilizan generalmente para el
transporte de células entre países.

Para el mantenimiento de las líneas y para

expandir las células.

Facilitan la recuperación de células en

monocapa luego de la tripsinización y
facilitan el lavado celular.

Tamaño de superficie 25, 75 y 160 cm2

 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.

Cantidad de células (Rendimiento celular).
• Frasco de varias capas “multilayered flasks”

Para un mayor rendimiento celular.

Evita la utilización de varios frascos.

Incrementan el área de superficie por volumen.

10 Niveles
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.

Cantidad de células (Rendimiento celular).
Para un rendimiento incluso mayor, se requiere de un propagador
multisuperficie o botella tipo Roller.
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.

Cantidad de células (Rendimiento celular).
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.

Cultivos en suspensión.

Células que crecen en suspensión pueden crecer
en cualquier tipo de recipiente y no requieren
tratamiento para adhesión celular.

Usualmente se crecen en frascos con agitación o

en matraces Erlenmeyer. Esto mantiene las células
activamente en suspensión.

Las ventajas de este sistema son una mayor

facilidad de manipulación y subcultivo (replaqueo)
pues no requieren separación del sustrato mediante
tripsinización.
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.

Ventilados.

Las placas de cultivo incluidas las multiplacas, tienen una tapa
suelta para un acceso fácil al cultivo, porque requieren de una
atmósfera húmeda con una concentración controlada de CO2.

Para prevenir la formación de condensación en la tapa, se

usan “tapas ventiladas” con unos apoyos de plástico al interior.

Los frascos pueden ser ventilados, soltando la tapa 1 vuelta

después de cerrada. Pero son más recomendables las tapas con
filtro permeable ya que previenen la contaminación.
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.

Muestreo.

Las Multiplacas son ideales para hacer replicas de un cultivo
si todas las muestras se procesarán simultáneamente y en la
misma forma.

Se aconseja usar recipientes distintos si las muestras se

procesarán en tiempos distintos.

Placas de microtitulación.

Permiten tener distintas muestras o tratamientos y procesarlos
en forma individual, removiendo el pocillo de interés.

Ojo, se pueden presentar algunos problemas si se requiere un

procedimiento de extracción con solventes (acetona, tolueno
etc), que podría solubilizar el poliestireno de las placas.
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.

Análisis.

Multiplacas, frascos y botellas son buenos en general
para su análisis mediante un microscopio invertido,
aunque las placas de 24 o más pocillos pueden presentar
algunos problemas debido al menisco de los pocillos, que
permite ver adecuadamente sólo en el centro.

Frascos grandes (Roller flasks) pueden dar problemas

en algunos microscopios, por lo que es necesario remover
el condensador .
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.

Análisis.

Chamber slides (Cámaras en portaobjeto).

Se utilizan para preparar células para estudios

microscópicos (Inmunofluorescencia,
inmunohistoquímica etc).
 Recipientes de cultivo

Elección del recipiente.
 Costo.
Siempre se debe balancear el costo con el
beneficio o conveniencia.

Placas petri son más baratas que los frascos de

cultivo.
•Pero requieren de humedad y
condiciones controladas de CO2.

•Son más proclives a contaminación.

 Recipientes de cultivo

Sistemas especializados.
 Soportes permeables.

Pocillos con filtros (Filter wells).
•La permeabilidad de las superficies donde la célula se ancla
puede inducir polaridad por estimulación de la membrana basal.
•Esta polaridad es esencial para la expresión funcional de células
epiteliales secretorias.

También disponibles otros soportes precubiertos:

•Colágeno
•Laminina
•otro material como matriz (Matrigel)

Usados en estudios de:

•Interacción célula-célula.
•Interacción célula-matriz
•Diferenciación y polaridad
 Recipientes de cultivo

Superficies tratadas.
 Matriz de recubrimiento.

CÉLULAS FBHE CRECIDAS DURANTE 5 CÉLULAS FBHE CRECIDAS DURANTE 5

DÍAS SOBRE SOPORTE PLÁSTICO DÍAS SOBRE SOPORTE PLÁSTICO CON
DESNUDO COBERTURA DE COLÁGENO
 Recipientes de cultivo

Superficies tratadas.
 Matriz de recubrimiento.

La observación empírica que las placas de vidrio usadas soportaban el desarrollo
celular mejor que las placas nuevas, llevó a la conclusión que residuos celulares en
las primeras (colágeno, fibronectina etc) permitirían un mejor crecimiento de las
células.

El pre-tratamiento del sustrato mejora la habilidad de la célula para adherirse y

crecer.

Matriz de recubrimiento.

Se puede realizar con el medio de cultivo utilizado en otro cultivo.

Suero.

Fibronectina y colágeno purificado.
 Recipientes de cultivo

Superficies tratadas.

Matriz de recubrimiento (Colágeno, gelatina, matrigel).
Colágeno. Fuentes de colágeno
• Mejora la adhesión de muchos tipos celulares.
•Ej: Células epiteliales •A partir de cola de rata
•Puede ser necesario para la expresión de •Comercial (Vitrogen)
funciones diferenciadas.

Gelatina. Matrigel.
•Beneficiosa para el cultivo de: •Disponible comercialmente de:
•Células musculares. •Laminina
•Células endoteliales. •Fibronectina
•Proteoglicanos
Protocolo:

Recubrir la superficie de la placa con por ej. colágeno.

Drenar el exceso.

Dejar secar el residuo.
 Recipientes de cultivo

Superficies tratadas.

Capa de células alimentadoras (Feeder layers).

Para algunas células más complicadas, la superficie del sustrato es tratada con una
capa de células especiales (células alimentadoras).

Se llaman así porque efectivamente alimentan las células en crecimiento (a través
de los factores de crecimiento y metabolitos liberados).

Mejoran la adhesión de muchos tipos celulares.

•Ej. Células epiteliales.
•Puede ser necesario para la expresión de funciones diferenciadas.

Ejemplos de “Feeder cells”:

•Células gliales.
•Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF).
•Células intestinales fetales humanas (FHI).
 Recipientes de cultivo

Superficies tratadas.

Capas de células alimentadoras (Feeder layers).
 Aislamiento de células madre embrionarias sobre feeder cells (MEF).

 Desarrollo de embriones bovinos sobre

feeder cells (Células epiteliales de
oviducto).
 Recipientes de cultivo

Superficies tratadas.

Capas de células alimentadoras (Feeder layers).

Morphology on Feeder Layers. A: Fibroblasts from human breast carcinoma growing on plastic. B:
growing on a confluent feeder layer of fetal human intestinal cells (FHI). C: Epithelial cells from human
breast carcinoma growing on plastic. D: on same confluent feeder layer as in B.
 Medios de cultivo
El medio de cultivo es un ambiente artificial, con un adecuado componente en energía
y otros nutrientes requeridos para la proliferación celular.

Primeros intentos de cultivo celular se basaron en:

Extractos de tejido Pej. Extracto de embriones de pollo.

Fluidos corporales Pej. Suero, linfa.

Pero la demanda por mayor cantidad de medio y consistencia en

la calidad dio lugar al desarrollo de medios “químicamente
definidos”.
-Se logró desarrollar gracias al estudio bioquímico de la
composición de los fluidos corporales.
Medios definidos -Aumentó consistencia.
-Permitió esterilización (disminuyó la contaminación).
 Medios de cultivo

MEM: Eagle´s Minimal Essential Medium (Eagle, 1959).

Uno de los primeros medios de cultivo químicamente definidos desarrollados, ampliamente
adaptado con diferentes suplementos:
•Suero humano, de ternero o de caballo, hidrolizados de proteínas.

DMEM: Dulbecco´s modification of Eagle´s medium. (Dulbecco

& Freeman, 1959).

Incluye mayor concentración de aminoácidos (2x) y vitaminas (4x).

Adecuado para la mayoría de los cultivos primarios y líneas celulares.

El mejoramiento de este medio se basó en:

El reemplazo del suero (medios libre de suero).
Su optimización para diferentes tipos celulares (Pej. medio RPMI1640 para células
linfoblastoides).
o para condiciones especiales (Pej. medio Leibovitz L15 para eliminar la necesidad de
agregar CO2 y NaHCO3).
 Medios de cultivo

RPMI1640: Roswell Park Memorial Institute.
AMINO ACIDS VITAMINS
• Glycine • Biotin
• Choline chloride
• L-Arginine
• D-Calcium pantothenate
• L-Asparagine • Folic Acid
• L-Aspartic acid • Niacinamide
• L-Cystine 2HCl • Para-Aminobenzoic Acid
• L-Glutamic Acid • Pyridoxine hydrochloride
• L-Glutamine • Riboflavin 376
• Thiamine hydrochloride 337
• L-Histidine
• Vitamin B12 1355
• L-Hydroxyproline • i-Inositol
• L-Isoleucine INORGANIC SALTS
• L-Leucine • Calcium nitrate (Ca(NO3)2 4H2O)
• L-Lysine hydrochloride • Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.)
• L-Methionine • Potassium Chloride (KCl)
• Sodium Bicarbonate (NaHCO3)
• L-Phenylalanine
• Sodium Chloride (NaCl)
• L-Proline • Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4)
• L-Serine anhydrous
• L-Threonine OTHER COMPONENTS
• L-Tryptophan • D-Glucose (Dextrose) 180
• Glutathione (reduced) 307
• L-Tyrosine disodium salt dihydrate
• HEPES 238
• L-Valine • Phenol Red
 Medios de cultivo

Propiedades físico-químicas del medio.

pH
 La mayoría de las células crece bien a pH 7.4

Líneas de fibroblastos normales pH 7.4-7.7

Células transformadas pH 7.0-7.4

Células epidermales pH 5.5

Rojo de fenol
 Usado comúnmente como indicador.

Rojo a 7.4

Naranjo a 7.0

Amarillo a 6.5
 Medios de cultivo

Propiedades físico-químicas del medio.

CO2 y Bicarbonato

El CO2 en la fase gaseosa se disuelve en el medio,- jugando un complejo
papel ya que influye en el CO2 , el pH y el ion (HCO 3 ).

H2O + CO2 ↔ H2CO3 ↔ H+ + HCO3-

HCO3- tiene baja constante de disociación, por lo que tiende a reasociarse,

bajando el pH.

La adición de NaHCO3 en el medio tiende a desplazar la ecuación hacia la

izquierda, equilibrando el pH deseado (7,4) estableciendo la concentración
correcta de CO2.
 Medios de cultivo

Propiedades físico-químicas del medio.

Oxígeno. Es el otro componente principal de la fase gaseosa.
El O2 es requerido para la respiración celular in vivo.
• Células en cultivo dependen de la glicólisis.

O2 es tóxico cuando está disuelto en el medio.

• Por incremento en el nivel de radicales libres.
• Se requieren neutralizadores (scavengers) de radicales libres
en el medio (Cisteína, βME, DTT, glutation).

Requerimiento de O2:
• Cultivo de órganos requiere alta tensión de O2 (95%).
• Células dispersas requieren baja tensión de O2 .
• En general la tensión atmosférico de O2 anda bien.
 Medios de cultivo

Propiedades físico-químicas del medio.

Temperatura.

Tº por encima de la temperatura óptima de crecimiento destruyen a las células
(39,5°C por unas pocas horas). Tº por debajo son mejor toleradas (35°C).

La temperatura óptima para el crecimiento celular depende del tejido u órgano

animal de origen. Tº en tejidos humanos y de animales: 36-38ºC .

Tº en tejidos de anfibios, peces, insectos y reptiles: 20-36ºC.

Humedad.
 Humedad debe mantenerse a niveles de saturación ya que la evaporación puede
conducir a cambios en:

La osmolaridad.

Volumen del medio y los aditivos.
 Medios de cultivo

Propiedades físico-químicas del medio.

Osmolaridad.

Es la concentración molar dada por el número de partículas (moléculas o
iones) presentes en una disolución por unidad de volumen.

Se mide por el descenso en el punto de congelación de la muestra.

Plasma humano 290mOsm/kg.

Aceptable 260-320 mOsm para la mayoría de las células.

Revienta

Se encoje
Osmómetro
 Medios de cultivo

Soluciones salinas balanceadas (BSS).

Composición:
 Sales inorgánicas
 Bicarbonato de sodio
 Glucosa

Usos:
 Diluyente para concentrados de aminoácidos y vitaminas.
 Forman la base de muchos medios completos.
 Para lavado de células (tripsinización).
 Medio de disección.
 Incubaciones cortas (<4 horas) en presencia de > glucosa.
 Medios de cultivo

Soluciones salinas balanceadas (BSS).
 Medios de cultivo

Medio Completo
Medio que contiene todos sus constituyentes y suplementos para el
uso deseado.

Hecho de un medio químicamente definido como por ejemplo:

•Eagle´s MEM.
Medio simple con aa esenciales, vitaminas y sales.

•TCM-199, RPMI 1640, CMRL1066 y F12.

 Medios complejos, tienen aa esenciales y no esenciales, > número de
vitaminas y metabolitos extras (nucleósidos, lípidos etc) .
 Medios de cultivo

Medio Completo

Aminoácidos:
Aminoácidos esenciales:
•No son sintetizados en el cuerpo.
•Son requeridos por las células en cultivo.

Aminoácidos no esenciales.
•Se agregan para compensar la incapacidad de
alguna célula en particular de hacerlos.

Glutamina se agrega a la mayoría de los cultivos.

•Se puede utilizar como fuente de energía (en el ciclo de
los ácidos tricarboxílicos) para la síntesis de proteínas.
 Medios de cultivo

Medio Completo

Vitaminas: Son precursores de muchos co-factores.
Eagle´s MEM:
•Lleva sólo vitaminas solubles en agua (Acido folico, colina, inositol etc).
•Otras vitaminas las suplementa el suero.

Medios complejos:
•Llevan otro tipo de vitaminas (solubles en grasa) Pej. Vit A, D, E, K,
Biotina etc.

Sales:
•Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO42-, PO4-, and HCO3- (Regulan la osmolaridad
del medio).
•Calcio:
•Requerido por algunas moléculas de adhesión (Caderinas).
•Concentración puede influir en que una célula prolifere o se diferencie.
•Bajos niveles disminuyen la agregación y adhesión celular .
 Medios de cultivo

Medio Completo

Glucosa:

Incluido en la mayoría de los medios como fuente de energía.

Otros suplementos orgánicos:

Proteínas, péptidos, nucleosidos, intermediarios del ciclo del ácido cítrico,
piruvato y lípidos.

Antibióticos y antimicóticos (Penicilina, Streptomicina,

gentamicina, anfotericina).

Reducen el riesgo de contaminación bacteriana o fúngica.

Desventaja:

Favorece el desarrollo de resistencia.
•Enmascara la presencia de bajos niveles de contaminación.
•Fomenta malas condiciones de asepsia
 Medios de cultivo

Medio Completo

Suero posee:

Factores de crecimiento (IGF-I, Insulin, FGF,
EGF, IL-1, IL-6).
•Promueven la proliferación celular.

Factores de adhesión

Actividad anti-tripsina

Minerales

Lípidos

Hormonas

Más utilizados

Fetal bovine serum (FBS) y calf serum (CS).

Suero humano, no muy utilizado, riesgo de
presencia de virus (HIV y hepatitis B).

Suero de caballo (HS).
 Medios de cultivo

Medio Completo

Suero.
 Medios de cultivo

Medio Completo

Suero.
 Medios de cultivo

Medio libres de suero.

 Son medios diseñados para crecer un tipo celular específico.

 Permite estandarizar las condiciones de cultivo en un set de

condiciones definidas libre de variables que pueden confundir el
resultado.
 Medios de cultivo

Medio libres de suero.
 Desventajas del Suero.
• Variabilidad fisiológica:
 Se desconoce efecto en las células de algunos de sus
constituyentes (amino ácidos, nucleosidos, azucares,
péptidos, factores de crecimiento, hormonas,
minerales).
 Medios de cultivo

Medio libres de suero.
 Desventajas del suero.
• Consistencia y vida útil:
 Suero varía de lote a lote.

No dura indefinidamente.

Si se reemplaza, puede que no sea idéntico al primer

lote.
 Medios de cultivo

Medio libres de suero.
 Desventajas del Suero.
• Control de calidad:
 El cambio de un lote (reemplazo) requiere de
muchas pruebas.

Curva de crecimiento, eficiencia de plaqueo etc.

 Medios de cultivo

Medio libres de suero.
 Desventajas del Suero.
• Contaminación:
 Presencia de virus o micoplasma.

Requiere el registro del país de origen y del lote.

• Costo $
 Medios de cultivo

Medio libres de suero.
 Ventajas de los medios libres de suero
• Una vez validado se convierte en un medio selectivo para una
determinada línea celular.

• Mayor definición.

• Mayor consistencia.

• Mayor facilidad en la purificación y procesamiento posterior de

productos celulares.
 Medios de cultivo

¿Cómo seleccionar el medio de cultivo correcto?
• Revisar la literatura.

• >75% de los medios que se venden son el MEM,

DMEM y RPMI 1640.

• Si no hay información disponible, se debe hacer un

experimento de curva de crecimiento.