Practica n°6:

Purificación por HIC de proteínas: GFP

I.-Introducción:
La GFP (Green Fluorescent Protein, GFP, por sus siglas en inglés), es una proteína
expresada naturalmente en muchas medusas bioluminicentes, fue aislada de la
medusa Aequorea victoria, ha tenido un gran impacto dentro de la comunidad
científica. En octubre de 2008, los investigadores Osamu Shimomura, Martin Chalfie
y Roger Tsien fueron galardonados con el Premio Nobel de Química por sus
trabajos con la proteína verde fluorescente. El descubrimiento tuvo gran importancia
al observar que la GFP conservaba su propiedad fluorescente incluso dentro de
organismos distintos al de la medusa, lo que representaba una gran ventaja
respecto a otros tipos celulares (Chalfie et al., 1994). El gen que codifica esta
proteína, que ya ha sido clonado, se utiliza habitualmente en biología molecular
como marcador. (Perez & Becu, 2009). La GFP posee 239 aminoácidos y un peso
molecular de 26.9 KD, la estructura terciaria de la proteína tiene la forma de un barril
de 40 Å, formado por once hojas β antiparalelas, en el centro del cual se encuentra
una hélice alfa y el cromóforo fluorescente (Franco & Marinez, 2009).
El cromóforo está formado por tres aminoácidos adyacentes, Ser – Tyr – Gly
(posiciones 65, 66 y 67), los cuales bajo una serie de reacciones de ciclización
forman el cromóforo activo, el cual producirá absorbancia y fluorescencia. Cuando
la luz UV o luz azul impacta sobre el cromóforo, éste toma la energía de la luz y se
excita. En la fase siguiente, el cromóforo se libera de la energía emitiendo luz en
longitud de onda verde (BIO-RAD).
Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC): Técnica utilizada para separar
moléculas hidrofóbicas. Consiste en dejar fluir una solución de proteínas (Muestra)
y una elevada concentración de una sal cosmotrofa, a través de una fase
estacionaria de Sepharosa la cual tiene grupos hidrofóbicos unidos a su superficie
(fenil, metil, butil). Los aniones producto de la disolución de la sal interactúan con la
superficie de la proteína GFP y con las moléculas de agua en su superficie
inmediata. Incrementando la tensión superficial del agua y exponiendo la región
hidrofóbica de la proteína la cual mediante fuerzas de van der wall quedará anclada
a la superficie hidrofóbica de la resina. Soluciones menos concentradas de sal son
utilizadas para eluir a las proteínas.
II.-Objetivos:
 Determinar la presencia de la proteína verde fluorescente.
 Realizar la técnica de cromatografía de interacción hidrofóbica para la
separación de proteínas.
III.-Materiales y procedimientos:
 Materiales:
 Cepas de E. coli expresando GFP 
 Extracto lisado de bacteria con lisozima 
 Columna cromatografica (HIC)  Lámpara de luz UV 
 Buffer de Equilibrio (NH4)2SO4 2M 
 Buffer de Unión (NH4)2SO4 4M 
 Buffer de lavado (NH4)2SO4 1.3M  TE 
 Pipetas
 Tubos
 Gradillas

 Procedimiento:
 Preparar la columna, agregar 2 mL de buffer de equilibrio a la columna, dejar
gotear hasta que el buffer llegue a la marca de 1 mL.

 Preparar la muestra, (a) transferir 250 uL del extracto lisado a un e eppendorf

limpio, (b) luego agregar 250 uL de Buffer de unión y mezclar.
 Dejar gotear la columna en un tubo hasta que el buffer de equilibrio llegue al
ras de la resina, en ese momento agregar cuidadosamente 250 uL de la
mezcla extracto lisado + buffer de unión.
 Transferir la columna a un tubo 2, agregar 250 uL de buffer de lavado y dejar
que el buffer pase por la columna. Analizar la columna con la lámpara UV.

 Agregar 750 ul de TE y analizar la columna con la lámpara UV.

 Analizar los 3 tubos con la lámpara UV.

VI.-Conclusiones:
 Se logró determinar la presencia de la proteína verde
fluorescente(GFP) mediante la técnica de cromatografía de
interacción hidrofóbico que permite la separación de las
proteínas.

VII.-Referencias bibliográficas:

 Donal Voet, J. G. (2006). Bioquimica . España : Medica

panamericana.
 Donald Voet, J. G. (2007). Fundamentos de bioquimica . España:
Medica panamericana.
 Kischinevzky, C. A. (2005). Manual de practicas biologia
molecular de la celula L. Mexico: UNAM.
Práctica n°7: Determinación molecular de ovoalbúmina por SDS-PAGE
Introducción:
La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a cabo en
condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE). Las diferencias
entre uno y otro tipo radican en los componentes de los geles y del tampón de
electroforesis, así como el tratamiento de las muestras. Como su propio nombre
indica, en el segundo tipo, y no en el primero, se incluyen agentes desnaturalizantes:
reductores, detergentes y caótropos. En el primer caso, las proteínas mantienen su
estructura tridimensional y las diferentes cadenas polipeptídicas pueden
permanecer unidas, separándose no sólo en función de su carga eléctrica, sino
también según su tamaño y forma. Por el contrario, cuando las proteínas se
solubilizan en presencia del detergente aniónico SDS, éste se une a las proteínas,
rompiendo interacciones hidrofóbicas y desnaturalizándolas. Las proteínas
desnaturalizadas de la muestra adoptarán una estructura en forma de bastoncillo
con una serie de moléculas de SDS cargadas negativamente a lo largo de la cadena
polipeptídica. Como media, se une una molécula de SDS por cada dos residuos de
aminoácidos. La carga nativa original de la molécula está CH2 CH3 CH3 N CH2
CH3 CH3 N (NH4)2S2O8 TEMED N, N,N’,N’ Tetrametiletilenediamina PSA
Persulfato Amónico Inicia la reacción de Polimerización S2O8 2– + e– SO4 2– +
SO4 2–• TEMED Metilen-bis-acrilamida Neurotóxica Acrilamida Polimerización
(TEMED, PSA) Poliacrilamida (NO neurotóxica) Enlace bis-acrilamida 3
completamente enmascarada por la carga negativa del SDS. Debido a que la
cantidad de SDS que se une a las proteínas es prácticamente proporcional a su
tamaño, los complejos SDS-proteínas presentan un valor carga/masa constante y
por lo tanto se separan de acuerdo a su tamaño cuando migran desde el cátodo al
ánodo a una velocidad relacionada con su peso molecular. Además del SDS, se
emplean otros agentes desnaturalizantes como son un agente reductor,
generalmente el 2-mercaptoetanol que reduce los puentes disulfuro (Cys-S-S-Cys)
a grupos tioles (Cys-SH), y agentes caótropos, que como la urea, rompen puentes
de hidrógeno. Para asegurar la disociación de las proteínas en sus subunidades y
la pérdida de la estructura secundaria de las proteínas se suele calentar la muestra
antes de ser cargada en el gel. A diferencia de la electroforesis en condiciones
nativas, en la SDS-PAGE las proteínas se separan únicamente en función de su
tamaño. La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes fue originalmente descrita por Laemmli en 1970. Se presenta a
modo de esquema el efecto que tiene el tratamiento de las proteínas con los agentes
desnaturalizantes. La SDS-PAGE se usa frecuentemente, como es el caso de la
presente práctica, para determinar el peso molecular de proteínas desconocidas
mediante la comparación de su movilidad electroforética relativa (RF) con la de
proteínas estándar de peso molecular conocido, y para determinar el número de
subunidades de un complejo de proteínas. La SDS-PAGE es un método mucho más
resolutivo que la electroforesis en condiciones nativas; sin embargo, debido a que
las proteínas se desnaturalizan, es imposible detectar actividad enzimática.
II.-Objetivos:

 Determinación del peso molecular de las proteínas en estudio mediante la

técnica de electroforesis.

III.-Materiales y procedimientos:

 Materiales:

 Agua destilada.
 Rotulador indeleble.
 Vasos de precipitado y probetas (25, 50 y 100 ml).
 Micropipetas(2-50 µl, 50-200 µl y 200-1000 µl).
 Pipetas de cristal de 1, 2, 5 y 10 ml y pipetas Pasteur.
 Tubos eppendorf de 1,5 ml.
 Frasco lavador con agua destilada.
 Bandejas de plástico para el teñido de geles.

 Reactivos:

 Solución de acrilamida/bis-acrilamida 30% (preparado comercial).

 Tris-HCl 3 M
 Tris-HCl 1M
 SDS
 TEMED (preparado comercial).
 Persa
 Proteínas: alboalbúmina y seroalbúmina
 Procedimientos:

1.-Armar el slab conforme a las indicaciones del profesor. La cámara

electroforética y los vidrios deben estar completamente limpios:
 Se le agregó vaselina a los costados y se puso los slab en ambos
lados.
 Se agregó agua y se vio si en la base se mojaba.

2.-Se preparó los geles: Staking y de resolución o de corrida.

Gel Staking Gel de corrida

S.D.S=50 ul 50 ul 100 ul
Acril/Bis=0,75 0,75 ml(750 ul) 4,7 ml
ml(750 ul)
Tris HCl 1M=0,63 ml 0,63 ml Tris HCL 3ml=1,25
ml
Agua destilada=3,55 3,55 ml 4,43 ml
ml
Persa=50ul 50 ul 100 ul
TEMED: 5 ul 5 ul 10 l

3.-Preparación de la muestra:
Proteína: Seroalbúmina

Agua 20 ul 19 ul 17 ul
Buffer de 5 ul 5 ul 5 ul
muestra
Proteína 1 ul 2 ul 4 ul

Proteína: Ovoalbúmina

Agua 19 ul 17 ul
Buffer de muestra 5 ul 5 ul
Proteína 2 ul 4 ul

4.-Fuente de poder:
 Se realizó la corrida electroforética en donde se colocó un patrón
de 15 ul.
 En las otras se colocó la Seroalbúmina en tres casillas: 10 ul, 5 ul
y 5ul.
 En las siguientes casillas se colocó ovoalbúmina: 5 ul y 5 ul.
5.-Tinción y decoloración:
  Se colorea con Coomassie bue y la parte que no se quiere
coloreada se decolora con ácido acético
IV.-Resultados:

 Materiales :
 1.-Amar del slap

2.-Preparación de los geles

Gel Staking Gel de corrida

 3.-Preparación de la muestra

Proteínas: Ovoalbúmina y Seroalbúmina

4.-Fuente de poder

3 casillas: Seroalbúmina
2 casillas: Ovoalbúmina
 5.-Tincion y decoloración

Coloración: Cromassi

Coloración: ácido acético

V.-Discusión:

VI.-Conclusiones:

 se logró reconocer las técnicas de electroforesis en proteínas con la

técnica de la fabricación de los geles de poliacrilamida condiciones
nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE).
 Se determinó el peso molecular de las proteínas las cuales fueron: La
ovoalbúmina y seroalbumina.
VII.-Referencias Bibliográficas:

 Por Pilar Roca,J. O.(2004). Bioquímica : técnicas y métodos.

Madrid:Hélice.
 Varas, B. C. (2003). MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE
ELECTROFORESIS. Serie de Normas técnicas, 69.