Protocolo Extracción ácidos grasos para análisis CSSI.

I. Preparación del material

Todo el equipamiento y el material de vidrio debe ser cuidadosamente limpiado antes de
empezar con los procedimientos de laboratorio. El uso de guantes, bata de laboratorio y
gafas de seguridad es obligatorio.
Los solventes usados en la extracción deben ser de alta pureza, grado HPLC o doblemente
destilado. Los reactivos utilizados deben ser preparados previamente. Por ejemplo, BF 3 al
5% en MetOH (en metanol) a partir de BF3 al 25%.
Preparación del material antes de la extracción:

• Etiquetar el material que contendrá las muestras con lápiz grafito.

• Enjuagar con pequeñas porciones de DCM (diclorometano) todo el material
que se utilizará en el proceso de extracción.

II. Secado de muestras

1. Colocar las muestras de suelo/sedimento en una bandeja de aluminio y disgregar
para para prevenir la formación de bloques de muestras.
2. Colocar en una estufa a 60°C y dejar secar durante 24 h o hasta sequedad completa
cuidando de disgregar la muestra en la medida de lo posible.
3. Una vez seca la muestra disgregar los cúmulos de suelo con un martillo de goma o
rollo.
4. Tamizar la muestra de suelo usando un tamiz de malla de 2 mm para colectar la
fracción de suelo <2 mm.

III. Medición del % de Carbono Orgánico del Suelo (% COS).

Los crisoles empleados en la calcinados de las muestras de suelo deben ser previamente
secados en estufa a 110°C y almacenados en desecador.
1. Registrar la masa de los crisoles y tarar la balanza.
2. Agregue una porción de aproximadamente 5 g de muestra en el crisol y registre la
masa de la muestra.
3. Calcine la muestra a 550°C durante 3 horas en una mufla.
4. Deje enfriar por unos minutos y coloque los crisoles en desecador hasta que
alcancen temperatura ambiente.
5. Vuelva a masar la muestra y registre el peso de las cenizas junto con el crisol.
IV. Extracción de ácidos grasos
1. Tome una porción de muestra seca y utilice un peso aproximado de acuerdo con
los siguientes valores:
- 10 a 20 g de muestra para un suelo orgánico medio (5 – 10% COS).
- 30 a 60 g para suelo arenoso con baja materia orgánica (<1 % COS).
- 2 g para materia vegetal (47% CO).
2. Si se utiliza un sistema de extracción con solvente asistida por microondas (MAE),
pese la muestra en los tubos de extracción y agregue 15 ml de mezcla de solventes
(DCM:MetOH 4:1). Tape los tubos y cargue el programa adecuado en el software del
MAE.
3. Si utiliza agitación orbital (Shaker), pese en un frasco Schott la cantidad de muestra
necesaria y agregue 50 ml de mezcla de solventes y deje en agitación durante 24 h.
4. Si utiliza sonicador, pese en un frasco Schott la cantidad de muestra necesaria y
agregue 50 ml de mezcla de solvente y someta a sonicación por 30 min.
5. Filtre el extracto usando papel filtro whatman 40 o equivalente.
6. Añada nuevamente la mezcla de solvente al contenedor con la muestra y repita el
proceso de extracción.
7. Filtre nuevamente y colecte las fracciones filtradas en un balón de fondo plano y
concentre en rotavapor cuidando de no llegar hasta sequedad.
8. Transfiera cuantitativamente el extracto concentrado a un tubo de ensayos con tapa
y lleve a sequedad con N2 ultrapuro. También puede utilizar una placa calefactora a
40°C.
9. Añada 1 ml de BF3 en metanol al tubo de ensayos con tapa y colóquelo en gradilla
para tubos de ensayos en una estufa a 70°C durante 20 minutos.
10. Retire la gradilla con tubos de ensayo y deje enfriar.
11. A cada tubo de ensayos agregue 1 ml de agua destilada y 1 ml de una mezcla de
HEX(hexano):DCM 4:1. Mezcle mediante un vórtex por 1 minuto.
12. Permita que las fases se separen y transfiera la fase orgánica (HEX:DCM) a un vial
usando una pipeta pasteur.
13. Repita los pasos 11 y 12 añadiendo 1 ml de agua destilada y 1 ml de mezcla de
HEX:DCM 4:1.
14. Al transferir las dos porciones tendrá un volumen aproximado de 2 ml del extracto.
15. Los viales deben ser rotulados adecuadamente para la identificación de las
muestras.
16. Para enviar las muestras a análisis están deben ser llevadas a sequedad en el vial
con N2 ultrapuro.