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SOMMAIRE

INTRODUCTION
I- BOTANIQUE DU RIZ
1- Position systématique
2- Morphologie de la plante

3- Cycle de croissance

II- PRINCIPAUX TYPES DE MARQUEUR MOLECULAIRE INTERVENANT DANS


LA SELECTION VARIETALE DU RIZ

1- Définition de marqueurs moléculaires


a) Avantages
b) Inconvénient

2- Les principaux types de marqueurs moléculaires intervenant dans la sélection des


variétés du riz

III- QUELQUES APPLICATIONS DE MARQUEURS MOLECULAIRES DANS LA


SELECCTION VARIETALE DU RIZ

1- Application des microsatellites dans la sélection assistée par marqueurs (SAM)

2- Application de la RAPD, AFLP et de la RFLP dans la sélection des variétés du riz

IV- APPORT DES MARQUEURS MOLECULAIRES A LA SELECTION


VARIETABLE DU RIZ

1- Cartographie génétique

2- Clonage des gènes du riz

3- Cartographie comparée du génome du riz, blé, maïs

4- Intérêt des marqueurs moléculaires

CONCLUSION

I
INTRODUCTION
Le riz est une espèce majeure pour l’alimentation humaine puisqu’il est
consommé par la moitié de l’humanité. Le riz est la deuxième céréale après le
maïs en termes de surface cultivée (153 Mha en 2004) et de quantité produite
(608 Mt en 2004), avec un rendement moyen de 4,0 t/ha qui masque de très
importantes disparités (World Rice Statistics, 2005). La filière rizicole constitue
l’un secteur clé à la fois pour l’économie et la sécurité alimentaire du monde.
Vue son importance, des études scientifiques ont été réaliser dans le but
d’améliorer la productivité de cette culture. L’avènement de la génétique et le
développement des marqueurs moléculaires durant les dernières années ont
permis de réaliser des prouesses remarquables, à savoir établir de nouvelles
approches pour améliorer les stratégies de sélections.
Le présent document a pour objectif de mettre en évidence l’importance
des marqueurs moléculaires, leurs utilisations et applications dans l’étude des
sélections variétales du riz dans le but d’améliorer la productivité mais aussi la
résistance à plusieurs maladies et insectes.

I. Botanique de la plante

Le riz est une céréale de la famille des poacées (anciennement graminées),


cultivée dans les régions tropicales, subtropicales et tempérées chaudes pour son
fruit, ou caryopse, riche en amidon. Il désigne l'ensemble des plantes du genre
Oryza, parmi lesquelles deux espèces sont cultivées : Oryza sativa et Oryza
glaberrima, ou riz de Casamance.

1- Position systématique

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2- Morphologie de la plante

Le riz est une plante herbacée annuelle avec une tige ronde recouverte, des
feuilles sessiles plates en forme de lame et une panicule terminale. Sous des
conditions climatiques favorables et exceptionnelles, la plante peut pousser
pendant plus d'une année et est adapté à un habitat aquatique.

L'espèce cultivée traditionnellement en Afrique est Oriza glaberrima. A la


différence de Oriza sativa, cette espèce ne possède pas de branches secondaires
partant des branches primaires de la panicule. Il n'y a pas de ligule chez Oryza
glaberrima. Il y a aussi des différences mineures sur la pubescence du limbe. O
glaberrima est strictement annuelle.

Les racines sont constituées de racines secondaires et de leurs poils absorbants.


La racine primaire, qui croît à partir de la semence au moment de la
germination, ne vit qu'un court moment. Elle est rapidement remplacée par des
racines secondaires.

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La tige est constituée d'un certain nombre de nœuds et d'inter nœuds dans un
ordre successif. Les nœuds portent une feuille et un bourgeon qui pourra donner
naissance à un talle secondaire. Le talle primaire pousse à partir du nœud le plus
bas et donne naissance aux talles secondaires et ceux-ci donnent à leur tour
naissance à des talles tertiaires. La tige principale (talle primaire) développe le
nombre le plus important de feuilles. La première feuille rudimentaire à la base
du talle est le prophyllum.

Les feuilles prennent naissance à un nœud de la tige et sont constituées de deux


parties : la gaine foliaire et le limbe foliaire. Chaque nœud donne naissance à
une feuille. La gaine foliaire enveloppe la totalité de l'inter noeud et même dans
certain cas le nœud suivant. Le limbe foliaire ou la partie terminale de la feuille
est attachée au nœud par la gaine foliaire.

La fleur a 6 étamines et 1 pistil. Les étamines sont constituées de deux anthères


soudées au bout d'un filament fin. Le pistil est constitué de l'ovaire, du style et
du stigmate de structure plumeuse.

Le grain de riz est constitué de l'ovaire fécondé, des glumes et glumelles, du


rachis, des glumes stériles et éventuellement de la barbe. L'embryon est fusionné
avec l'endosperme.

3- Cycle de croissance

Le cycle du riz peut être divisé en trois phases :

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 la phase végétative qui comprend la germination, la levée et le tallage et
dure du semis jusqu’à la phase de différenciation paniculaire.

 La phase reproductive va de l'initiation paniculaire à la fécondation. Elle


dure de 19 à 25 jours. Elle comprend l'initiation panîculaîre, la-montaison,
Fépiaison et la fécondation. A partir de l'initiation paniculaire, le tallage
s'arrête. Durant la phase reproductive, le plant de riz est particulièrement
sensible à des conditions défavorables (sécheresse, basses températures
...).

 La phase de remplissage du grain et de maturation va de la fécondation


des grains jusqu'à la maturité. Durant cette phase, on observe un
remplissage des grains par un mouvement des éléments nutritifs de la
plante vers les grains. Les grains passent par une phase de grain laiteux,
puis grain pâteux et enfin de grain mature. Cette phase dure de 30 à 42
jours, selon les conditions de température et d'humidité du milieu.

II. PRINCIPAUX TYPES DE MARQUEUR MOLECULAIRE


INTERVENANT DANS LA SELECTION VARIETALE DU RIZ

1. Définition de marqueurs moléculaires


Les marqueurs moléculaires sont un type de marqueur génétique composé de
fragment d’ADN qui servent de repères pour suivre la transmission d’un
segment de chromosome d’une génération à une autre.

a) Avantages
Les avantages des marqueurs moléculaires sont nombreux :
 Non soumis à l’influence de l’environnement
 Potentiellement en nombre illimité (couvre le génome entier)
 Mesure objective de la variation

b) Inconvénient
Le majeur inconvénient est le fait qu’ils nécessitent un équipement technique
plus complexe.

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2. Les principaux types de marqueurs moléculaires intervenant dans la
sélection des variétés du riz

Le choix du système de marquage dépend de l’objectif fixé, des compétences


disponibles au laboratoire. Nous décrivons les principaux systèmes de
marquage moléculaire appliqué au riz.
 Les marqueurs RFLP (Restriction fragment
length polymorphism ; polymorphisme de
longueur des fragments de restriction)

La technique RFLP développée par Botstein et al (1980) repose sur la mise


en évidence de la variabilité de la séquence nucléotidique de l’ADN génomique
après la digestion par des enzymes de restriction.
 Principe
 L’ADN génomique est extrait en grande quantité, purifié et soumis
à digestion par une enzyme de restriction.
 Les fragments générés sont séparés selon leur taille par
électrophorèse en gel. L’ADN est ensuite transféré du gel sur la
membrane de nylon en prenant soin de conserver la position
relative des fragments d’ADN.
 Enfin on réalise l’hybridation moléculaire avec une sonde d’ADN,
qui va s’hybrider avec le ou les fragments de l’ADN avec lesquels
elle présente des homologies et l’ADN cible est visualisé par
autoradiographie.
Bien que cette technique soit Co-dominante et permette une analyse
génétique complète, elle est lente et laborieuse. Les étapes de transfert et
d’hybridation empêchent une automatisation du travail.

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 Marqueurs de type PCR (polymerase chain
reaction)
Le développement de la technique PCR offre l’avantage d’analyser les
marqueurs moléculaires en un temps en un court tout en utilisation des
concentrations faibles d’ADN. Les marqueurs basés sur la technique PCR
tendent à remplacer les systèmes classiques et deviennent très nombreux. Les
plus largement utilisés chez le riz sont : les microsatellites ou SSR (Single
Séquence Repeat) ; l’AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) et la
RAPD (Randamly Amplified Polymorphic DNA)

 Les microsatellites ou SSR (Morgante, Olivieri, 1993). Ils sont


constitués de séquence de di-, tri-, tétra- nucléotides répétés en tandem.

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Ces éléments sont uniformément répartis en plusieurs exemplaires sur
l’ensemble du génome d’une espèce et présentent un taux de
polymorphisme élevé en reposant sur la variation du nombre d’unité de
répétition constituant le microsatellite.
La technique de PCR est utilisée pour relever le polymorphisme des
microsatellites. Si la SSR est un bon marqueur moléculaire (reproductibles, Co-
dominant et aisé d’utilisation). Leur caractérisation initiale est toutefois assez
lourde. En effet, leur production doit passer d’abord par le clonage et le
séquençage de des éléments répétés.
 La technique RAPD (Williams et al. ,1990). Elle consiste en
l’amplification par PCR de fragments de l’ADN génomique en utilisant
des amorces arbitraires de taille courte (10 Pb). Une amorce RAPD
permet généralement l’amplification d’une dizaine de fragments
correspondant à des locus dominants. Les produits d’amplification sont
généralement visualisés par électrophorèse sur gel d’agarose. Le
polymorphisme décelé est dû à des mutations soit dans les régions
amplifiées soit au niveau des sites de fixation des amorces. Le
polymorphisme révélé est un polymorphisme de sites d’hybridation
d’amorce. Les amorces constituent donc les marqueurs.
Cette technique est simple, rapide et ne nécessite ni un marquage radioactif
ni une connaissance préalable de la séquence nucléotidique. Néanmoins, la
RAPD manque de reproductibilité puisqu’elle est très sensible à la concentration
de l’ADN et aux conditions d’amplification.
 La technique AFLP (Vos e t al . ,1995). Elle est fondée sur la mise en
évidence conjointe de polymorphisme de sites de restriction et
d’hybridation d’amorces arbitraires. Cette technique utilise à la fois les
enzymes de restriction et l’amplification PCR. L’ADN génomique est
clivé par deux enzymes de restriction. Des adaptateurs de séquences
connues et spécifiques des enzymes de restriction utilisées sont ajoutés
aux extrémités des fragments de restriction générant ainsi une matrice
pour l’amplification. Une première amplification, dite pré-amplification,
est réalisée à l’aide d’amorces de séquences complémentaires à la
séquence des adaptateurs et des sites de restriction. La deuxième
amplification, dite sélective, utilise des amorces identiques aux premières
mais prolongées à l’extrémité 3’ de quelques nucléotides arbitraires (de 1
à 3 nucléotides). Ainsi, seuls sont amplifiés les fragments possédant les
bases complémentaires de ces bases arbitraires. Ces amorces sélectives
permettent de réduire le nombre de fragments amplifiés à une centaine.

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Ces fragments sont séparés par électrophorèse sur gel d’acrylamide
dénaturant puis visualisés par coloration au nitrate d’argent ou révélés
grâce à un marquage radioactif ou fluorescent réalisé lors de
l’amplification sélective. C’est la combinaison enzyme de
restriction/amorce qui permet de révéler le polymorphisme entre les
individus et constitue donc le marqueur AFLP.
Cette technique est puissante, stable et rapide. En outre, l’AFLP ne nécessite
aucune connaissance préalable de séquences du génome de la plante étudiée ni
la construction des banques génomiques ou cDNA, à l’encontre des SSR ou des
RFLP. Elle connaît une large application dans le fingerprinting, l’identification
des cultivars et la détermination de leur relation phylogénétique, la cartographie
des génomes et le clonage. Toutefois, la dominance, le coût élevé (elle est
couverte par un brevet de la société néerlandaise Keygene qui a mis au point
cette technique) et les difficultés techniques liées au marquage par AFLP
limitent son utilisation à grande échelle pour des applications comme la
sélection assistée par marqueurs
En résumé, les marqueurs RFLP et microsatellites sont spécifiques de
locus, Co-dominants et sont utilisés généralement pour la cartographie et la
détection de QTL (Quantitative Trait Loci) tandis que les marqueurs RAPD et
AFLP sont dominants, non spécifiques de locus et servent essentiellement à la
saturation d’une région du génome au voisinage d’un gène d’intérêt en vue de
son clonage.

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III. QUELQUES APPLICATIONS DE MARQUEURS
MOLECULAIRES DANS LA SELECTION VARIETALE DU
RIZ

1. Application des microsatellites dans la sélection assistée par


marqueurs (SAM)
Les microsatellites ou la SSR sont les marqueurs moléculaires les plus
utilisés dans la sélection variétale du riz. Ce sont de courtes séquences d’ADN
qui se répètent sans cesse. Chez le riz ils sont abondants de sorte que les
généticiens peuvent les utilises comme repère pour localiser avec précision les
séquences d’ADN qui affectent le caractère désires. Les marqueurs SSR peuvent
être localises dans ou à proximité d’un gène.
C’est ainsi que lors du SAM (Sélection assistée par marqueur) les
généticiens croisent une variété du riz avec une autre doté de caractères
recherché. Ensuite, ils test le caractère recherché, lorsqu’ils commencent à
procéder au rétrocroisement de la descendance avec la variété favorite. L’astuce
consiste à garder la plus grande quantité possible du matériel génétique issu de
variété favorite et uniquement les gènes d’intérêt de l’autre variété.
Trouver des marqueurs qui sont génétiquement lies à un caractère peut
aider à identifier rapidement les plantes supérieures. L’ADN pouvant être extrait
des plantes de riz très jeunes et le diagnostic de marqueurs peut être fait
longtemps avant que la plante n’exprime les caractères réels. Le SAM permet de
développer des variétés prometteuses en quelques générations, évitant des
années de sélection des plantes.
A travers ce programme la généticienne d’AfricaRice, Dr Marie-Noëlle
Ndjiondjop à développer une variété de riz plus rigoureuse. En effet, elle a
introduit un gène de résistance au virus de la panachure jaune du riz (RYMV)
dans quatre variétés populaire au MALI, au BURKINA-FASO, en GAMBIE et
en GUINNEE.

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2. Application de la RAPD, AFLP et de la RFLP dans la sélection des
variétés du riz
Lors des travaux réalisés au centre d’ORSTOM de Montpellier ainsi que
sur des descendances étudiées à l’Institut international de recherche sur le riz
aux Philippines (IRRI) et l’Université Cornell (États-Unis).trois marqueurs
moléculaires ont été à la base des résultats obtenus.
D’abord, on a eu l’utilisation de la technique AFLP : Le suivi des
introgressions a été réalisé en utilisant les marqueurs développés par le
programme de carte génétique des riz (Tanksley et al, 1992). Le choix des
sondes a été réalisé en fonction de leur distribution le long des chromosomes et
également de leur origine; ainsi l’étude des introgressions avec Oryza
brachyantha a exigé l’utilisation des sondes développées à partir d’une banque
de cDNA d’avoine car la librairie génomique réalisée à partir de la variété
d’Oryza. sativa IR 36 ne s’hybridait pas ou très peu avec l’ADN d’O.
brachyantha (Panaud, 1992). La distance génétique importante entre les parents
permet d’identifier des marqueurs spécifiques avec seulement quelques couples
enzymes/sondes. Ainsi, la comparaison du polymorphisme des parents
impliqués dans les hybridations avec Oryza longistaminata (lignée d’ O sativa,
hybride F1, parent O longistaminata, souches d’O. longistaminata utilisées
dans les recroisements) permet pour la majorité des sondes testées avec les 2
enzymes de restriction EcoRV et HindIII d’identifier une bande diagnostic
«sativa» et d’en suivre l’hérédité sans ambiguïté dans la génération BC1F2
(Leblanc et al, 1992). L’ADN de cette descendance et des parents a été alors
digéré, transféré sur membrane et hybridé avec les sondes retenues suivant les
protocoles standards (Mc Couch et al, 1988).
Ensuite la technique de RFLP fut utilisée lors Recombinaison entre le riz
cultivé (O sativa) et l’espèce de riz sauvage (O brachyantha). En effet, Les
plantes BC1 sont très homogènes et leur méiose révèle 12 univalents
correspondant au génome F par suite de la non réduction chromatique des
gamètes femelles FI. En revanche, les plantes BC2 sont beaucoup plus
hétérogènes phénotypiquement et montrent un nombre de chromosomes variant
de 26 à 32 chromosomes ; les plantes présentent 12 bivalents et donc un nombre
d’univalents du génome F allant de 2 à 8. Cette génération BC2 est donc
particulièrement propice mettre en évidence et comprendre les recombinaisons
inter génomiques, car celles-ci sont progressivement éliminées dans les
générations avancées par le processus de recroisement et d’autofécondation
nécessaire pour créer des lignées recombinantes. L’observation des patrons
d’hybridation montre que toutes les plantes ont au moins un locus RFLP

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révélant un marqueur spécifique d’O brachyantha. L’absence de marqueurs d’O
brachyantha (- - -) pour un chromosome donné s’accorde avec l’élimination du
chromosome venant d’O brachyantha au cours de la méiose BC1, alors que les
patrons où tous les marqueurs d’O brachyantha sont observés (+ + +)
correspondent vraisemblablement à une situation aneuploïde à 2n + 1
chromosomes. À côté de ces cas de figure classique, d’autres situations sont
observées (+ - +), (- + -), (- + +), (+ + -) et suggèrent des possibilités de
recombinaisons entre les chromosomes des génomes A et F (fig 3).

La recherche de marqueurs a été complétée en testant 466 amorces de 10


bases en utilisant la technique RAPD et a permis de retenir 4 amorces pour
lesquelles les produits d’amplification de l’ADN de 2 des lignées isogéniques
manifestent une bande du parent sauvage 0 australiensis. Ces 4 marqueurs ont
été clonés pour être hybridés sur des membranes avec l’ADN des 2 parents et les
5 lignées isogéniques. Deux de ces marqueurs correspondent à des séquences
répétées et ne sont donc pas utilisables, un autre ne donne aucun signal et le
dernier ne donne plus de signal positif. Une autre série d’amorces de 10 bases
sera testée pour identifier un marqueur qui puisse correspondre à une séquence
unique ou en petit nombre de copies afin d’être cartographié. Deux des lignées
isogéniques ont été croisées avec le parent récurrent pour mettre en évidence les
Co ségrégations entre la résistance et les marqueurs RFLP et RAPD
préalablement identifiés. De la même manière que les 2 marqueurs RFLP
RG901 et RG190, de nombreux marqueurs RAPD révèlent chez les lignées
isogéniques un polymorphisme différent de celui des 2 parents 0 australiensis et
0 sativa; ils peuvent peut-être témoigner d’événements de recombinaison non
homologue ou mutationnel consécutifs à la confrontation de génomes différents
chez l’hybride Fl.

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IV. APPORT DES MARQUEURS MOLECULAIRES A LA
SELECTION VARIETABLE DU RIZ

1. Cartographie génétique
La cartographie génétique est la construction d’une carte soit localisée
autour d’un gène soit à la base large portant sur le génome entier plus
généralement, c’est la détermination de la position d’un locus (gène au marqueur
génétique) sur un chromosome en fonction du taux de recombinaison génétique.
Son unité de distance est le centimorgan(CM).
Plusieurs cartes génétiques du riz ont été développées. La première fut
établie par Mc Couch et al (1988) à partir d’une population F2indica X japonica,
d’autre ont suivi. La découverte du positionnement du centromère (Singh et al,
1996) a permis de fixer et d’homogénéiser les cartes génétiques du riz.
Les deux cartes génétiques marquantes du riz sont celles de Causses et al
(1994) établie à partir d’un croisement interspécifique O. Sativa X O.
Longistaminata et celle de Rice genome project à partir du croisement Japonica
X Indica ; Nipponbare X Kasalath (Harushima et al, 1998). La carte référence de
la population indica X japonica IR64 X A jucena développé par le Cirad et
l’IRRI (Guiderdoni et al, 1992 ; Huang et al, 1994) a eu un franc succès.
Ces cartes génétiques ont permis de cartographier de nombreux gènes
majeurs résistants à des maladies ou des insectes. Permettant de déterminer le
contrôle génétique de caractère quantitatif complexe de grand intérêt pour les
sélectionneurs : résistance partielle à la pyriculariose, croissance racinaire,
composante du rendement notamment. Le premier article sur la détection du
QTLs (Quantitative Trait Loci) de résistance à la pyriculariose chez le riz a été
publié par Wang et al (1994). Depuis plusieurs autres QTLs ont été découvert
pour de nombreux caractères (Xu, 2002, dans une revue).

2. Clonage des gènes du riz


Le clonage est une technique de la biologie moléculaire qui consiste à
isoler un fragment d’ADN et à le multiplier à l’identique, de façon partielle ou
entière. Chez le riz l’existence de cartes génétique saturé puis le développement
de banque B A C ont rendu possible le clonage positionnel des gènes majeurs
intéressantes comme Xa21, qui détermine la résistance au flétrissement
bactérien (Song et Al, 1995), Sdl, le gène de semi nanisme (Sasaki et al 2002),
ou récemment le gène codant pour le composé majeur de l’arôme du riz
(Bradbury et Al, 2005).
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Quant aux premiers QTLs du riz, ils ont été clonés par Yano et al, 2000
en partant d’un jeu de ligné de substitution. Ces QTLs contrôlaient la durée de
cycle, un caractère facile à phénotype. La gamme de QTLs clonés c’est
rapidement élargi a des caractères plus complexe, comme le nombre de grain par
panicule (A. shikari et al. ,2005).

3. Cartographie comparée du génome du riz, blé, maïs

4. Intérêt des marqueurs moléculaire


Outre leurs intérêts fondamentaux les marqueurs moléculaires suscitent
un grand intérêt dans le domaine de la sélection. Le développement considérable
des marqueurs moléculaires au cours des dernières décennies a permis une
meilleure compréhension du génome du riz et la cartographie de plusieurs
dizaines de locus liés aux résistances, aux maladies et aux insectes.

CONCLUSION
Dans un monde en perpétuel évolution avec une croissance
démographique de plus en plus importante, les questions alimentaires se posent
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notamment celles sur le riz. Toutefois grâce aux efforts de recherches sur le riz
notamment dans le domaine de la sélection assistée par marqueur (SAM)
plusieurs cartes génétiques ont été élaborées et plusieurs caractères ont été
étiquetés en utilisant les différentes techniques de marquage moléculaire.
Aujourd’hui, avec le marquage moléculaire, de nouvelles perspectives
s’ouvrent pour le sélectionneur. La mise en évidence de marqueurs moléculaires
liés à des gènes de résistance aux maladies et insectes dans les lignées du riz en
cours de sélection, ou servant de parents potentiels dans les croisements, permet
d’intervenir précocement au niveau d’un schéma de sélection. Cette sélection
permettra des constructions de génotypes qui sont difficilement réalisables par la
sélection phénotypique.

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