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FICHES TECHNIQUES
de bactériologie
COULEUR
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101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP)
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101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP)
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4. COLORATION DE GRAM
1. Couvrir le frottis bactérien de 2. Rincer avec un mince filet 3. Mettre l’eau iodée (lugol) ;
cristal violet (colorant d’eau ; faire «tomber» l’eau attendre 1 minutes.
primaire); attendre 1 minute. un peu au-dessus du frottis et
non directement dessus.
4. Rincer avec un mince filet 5. Décolorer en couvrant 6. Rincer avec un mince filet
d’eau. d’alcool ; attendre 30 sec. d’eau.
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5. LE MICROSCOPE -- A) Figure
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PARTIES MÉCANIQUES :
2. Potence bras recourbé par lequel on saisit l’appareil pour le transporter ; supporte le tube optique et la
platine.
3. Platine plateau sur lequel on dépose la préparation à observer ; elle est percée en son centre pour laisser
passer la lumière.
5. Chariot pièce métallique située sur la platine ; sert à déplacer la préparation (contrôlé par les vis de
déplacement du chariot).
6. Vis de déplacement permettent de déplacer le chariot (et donc la lame) ; l’une permet les déplacements
du chariot avant-arrière (haut-bas pour l’image) et l’autre les déplacements LATÉRAUX (gauche-droite).
7. Tube optique porte à ses deux extrémités les deux composantes du système optique : l’oculaire et les
objectifs.
8. Revolver pièce circulaire rotative reliée au tube optique et qui porte les objectifs ; permet de placer dans
l’axe optique du microscope l’objectif approprié.
9. Vis macrométrique commande le déplacement en hauteur rapide et visible de la platine ; permet une première mise
au point de l’objet à observer ; ne doit être utilisée qu’avec l’objectif à faible grossissement.
10. Vis micrométrique commande un déplacement en hauteur de la platine de très faible amplitude (mouvement
produit peu visible) ; sert à faire la mise au point fine.
11. Vis du condensateur permet d’ajuster la hauteur du condensateur, pour obtenir l’éclairage optimal ; attention, il s’agit
d’une grosse vis, pas d’une petite (ne touchez pas aux petites vis : le condensateur pourrait
tomber)!
PARTIES OPTIQUES :
12. Source lumineuse fixée sur la base, sous le condensateur ; vous pouvez régler son intensité
(lampe) (attention de ne pas envoyer TROP de lumière : c’est plus fatiguant pour les yeux et on perd des
détails!).
13. Condensateur système de lentilles situé sous la platine ; concentre les rayons lumineux pour augmenter la
clarté de l’image. Sa hauteur est réglable par une vis.
14. Diaphragme intégré dans le condensateur ; dose la quantité de lumière qui traverse l’objet ; contrôlé par un
petit levier qui se déplace latéralement (pas une petite vis : un levier!).
15. Objectif fixés sur le revolver, ils sont au nombre de quatre ; chacun est un système de lentilles pointé
vers l’objet à observer ; produisent des images agrandies de l’objet (4X, 10X, 40X, 100X).
16. Oculaire système de lentilles pointé vers l’œil de l’observateur ; il agrandit une nouvelle fois (10X)
l’image déjà agrandie par l’objectif et la transmet à l’œil.
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5. LE MICROSCOPE – C) Utilisation
10 AVANT D'OBSERVER
1. Sélectionner l'objectif.
2. Abaisser lentement la platine (vis macrométrique) jusqu'à l'obtention d'une image dans l'oculaire.
3. Ajuster la mise au point (vis micrométrique).
4. Choisir un point de l'image à grossir et l'amener au centre du champ visuel (vis de la platine).
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Série 3
Flamber l’anse bactériologique.
Strie 3
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Description Milieu de base légèrement enrichi (avec du sang de mouton) pour cultiver et isoler un large éventail de
bactéries non exigeantes.
Utilisation Utilisé de routine en santé humaine et animale pour isoler des bactéries et les différencier selon le type
d’hémolyse (α, β ou γ)
Composition Formule par litre d’eau
Extrait de tissu cardiaque ...……………………10,0g
Extrait de bœuf ………………………….8,5g
NaCl ……………………………………5,0g
Agar …………………………………………15,0g
Sang de mouton défibrinisé …………………………..50ml
pH = 6,8 ± 0,2
Réf. http://www.quelab.com/htmleng/1601a.html
Interprétation Plusieurs bactéries sécrètent des hémolysines, des substances qui lysent les globules rouges.
Hémolyse β ou complète : les colonies sont entourées d’une zone claire et incolore; les globules
rouges sont lysés et l’hémoglobine dégradée en un composé incolore.
Hémolyse α ou partielle : l’hémoglobine est réduite en méthémoglobine et il y a alors une zone
verdâtre ou brunâtre autour des colonies.
Hémolyse γ : absence d’hémolyse.
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Description Milieu sélectif pour isoler les entérobactéries à gram - et milieu différentiel pour distinguer si elles
fermentent ou non le lactose.
Milieu sélectif : la présence de Crystal violet inhibe la croissance de la plupart des bactéries gram +, et
l’ajout de sels biliaires est toxique pour beaucoup de bactéries non adaptées au milieu intestinal.
Milieu différentiel : la présence de lactose et d’un indicateur de pH permet de distinguer les
entérobactéries capables de fermenter le lactose (ex : E. coli) de celles qui ne le peuvent pas (ex :
salmonelles).
Utilisation Utilisé de routine en santé humaine et animale car plusieurs infections sont causées par les
entérobactéries (incluant les coliformes); de plus, ce milieu permet de confirmer la coloration de gram.
Très utilisé pour les analyses d’eau.
Composition Formule par litre d’eau
Peptone de gélatine ...……………………17,0g
Peptone de caséine ……………………………1,5g
Peptone de viande ………………………………1,5g
Sels biliaires …………………………………1,5g
Lactose …………………………………..10,0g
NaCl ………………………………………….5,0g
Rouge neutre ………………………………0,03g
Crystal violet ……………………………..0,001g
Agar ………………………………13,5g
pH = 7,1 ± 0,2
Réf. http://www.quelab.com/htmleng/1517a.html
Interprétation Deux résultats peuvent être interprétés :
Croissance + ou - :
o Confirmation du gram : la croissance de la plupart des gram + est inhibée par le Crystal violet; la
présence de colonies peut donc confirmer un gram – (mais attention, quelques gram + peuvent
aussi croître sur ce milieu).
o La croissance de bactéries résistantes aux sels biliaires est une indication de la présence
d’entérobactérie (encore là, il y a des exceptions).
Lactose + ou - :
o Lactose + : les bactéries capables de fermenter le lactose rendent le pH acide, et les colonies sont
alors teintées d’un rose foncé par le colorant Rouge neutre. Parfois, le pH acide fait aussi
précipiter les sels biliaires autour des colonies et le milieu devient opaque et rosé.
o Lactose - : Les bactéries qui ne fermentent pas le lactose ne sont pas colorées.
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Description Milieu sélectif pour isoler les staphylocoques et milieu différentiel pour distinguer s’ils fermentent ou
non le mannitol.
Milieu sélectif : la présence d’une forte concentration en sel inhibe la croissance de la plupart des
bactéries pour favoriser la croissance des bactéries dites «halophiles» (qui aiment le sel) tels les
staphylocoques (adaptés au milieu salé de la peau).
Milieu différentiel : la présence de mannitol et d’un indicateur de pH permet de distinguer les bactéries
capables de fermenter le mannitol : le milieu passe alors du rose au jaune.
Utilisation Utilisé en santé humaine et animale pour différencier les espèces de staphylocoques.
Composition Formule par litre d’eau
Peptone de caséine ……………………………5,0g
Peptone de viande ………………………………5,0g
Extrait de bœuf …………………………………1,0g
D-Mannitol …………………………………..10,0g
NaCl ………………………………………….75,0g
Rouge phénol ………………………………0,025g
Agar ………………………………15,0g
pH = 7,4 ± 0,2
Réf. http://www.quelab.com/htmleng/1858a.html
Interprétation Deux résultats peuvent être interprétés :
Croissance + ou - : Une croissance positive est une indication de la présence de staphylocoques.
D’autres espèces peuvent croître (ex : Enterococcus sp.) mais leurs colonies sont souvent très petites.
Mannitol + ou - : les bactéries capables de fermenter le mannitol rendent le pH acide et le Rouge
phénol fait passer le milieu du rose au jaune autour des colonies.
Staph. aureus
Serratia marcescens
Croissance +
Mannitol + Croissance -
Staph. epidermidis
Strep. agalactiae
Croissance +
Croissance -
Mannitol -
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Description Milieu sélectif et différentiel développé pour détecter spécifiquement la présence de Bacillus cereus
comme contaminant alimentaire.
Milieu sélectif : l’antibiotique polymyxine B est l’agent sélectif pour le genre Bacillus.
Milieu différentiel : la présence de mannitol et du colorant Bleu bromothymol permettent de détecter la
fermentation du mannitol et l’ajout de jaune d’œuf indique l’activité d’une lécithinase.
Utilisation Utilisé pour détecter la présence de Bacillus cereus dans l’industrie alimentaire.
Composition Formule par litre d’eau
Peptone de caséine ……………………………1,0g
Mannitol …………………………………10,0g
NaCl ………………………………………….2,0g
MgSO4 ………………………………………….0,1g
Phosphate de Na, dibasique ……………………………….2,5g
Phosphate de K, monobasique ………………………….0,25g
Pyruvate de Na ………………………………….10,0g
Bleu bromothymol ……………………………………..0,1g
Agar ………………..……………………………15,0g
Solution de jaune d’œuf ………………………………50ml
Antibiotique : Polymyxine B …………………100 000 unités
pH = 7,6 ± 0,2
Réf. http://www.oxoid.com/CA/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0617&c=CA&lang=EN&org=&sec
=
Interprétatio Trois résultats peuvent être interprétés :
n Croissance + ou - : Une croissance positive est une indication de la présence du genre Bacillus.
Mannitol + ou - : Le colorant Bleu bromothymol est jaune en milieu acide et bleu-vert en milieu
alcalin. Des colonies bleues-vertes indiqueront une absence de fermentation du mannitol, typique de
Bacillus cereus.
Lécithinase + ou - : L’apparition d’une opacité du milieu autour des colonies est due à la précipitation
du jaune d’œuf, indiquant l’activité d’une lécithinase, typique de B. cereus.
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Description Milieu différentiel utilisé surtout pour distinguer les divers types de bactéries pathogènes entériques,
bacilles gram -. Il permet de détecter :
La fermentation d’un des 3 sucres présents et ce, en surface et en profondeur dans le tube
La production de gaz (au cours de la fermentation)
La production de H2S
Composition Formule par litre d’eau
Peptone de gélatineine ……………………………5,0g
Peptone de caséine ………………………………5,0g
Extrait de levure …………………………………3,0g
Extrait de bœuf ………………………………………3,0g
Peptone de viande …………………………………..10,0g
NaCl ………………………………………….5,0g
Lactose ……………………………………10,0g
Saccharose ………………………………10,0g
Glucose …………………………………………1,0g
Citrate d’amonium ferrique ……………………..0,2g
Thiosulfate de Na ………………………..0,2g
Rouge phénol ……………………………………..0,025g
Agar ………………..……………………………12,0g
pH = 7,3 ± 0,2
Réf. http://www.quelab.com/htmleng/2354a.html
Interprétation Quatre résultats doivent être observés :
Fermentation des sucres : la fermentation d’un des 3 sucres produit des composés acides qui font virer
le milieu du rouge au jaune grâce au colorant Rouge phénol. Cette fermentation peut avoir lieu en
surface (sur la pente de la gélose) et/ou en profondeur (dans le culot). Par convention, on notera un
milieu jaune «acide» (ou A) et un milieu rouge «alcalin» (ou K, de l’anglais, alkaline); souvent, le
résultat est noté sous forme de rapport :
Ex : pente/culot = alcalin/acide ou K/A
Note : si un dépôt noir (voir production de H2S) empêche de voir la couleur jaune ou rouge, on assume
que le milieu est jaune (acide, A)
Production de gaz : la fermentation peut être accompagnée de production de gaz qui se manifeste par
des craques dans la gélose ou par le soulèvement de celle-ci. On note le résultat «avec» ou «sans», ou
encore simplement par + ou -.
Production de H2S : La production de H2S se manifeste par l’apparition d’un dépôt noir dans la gélose.
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# Tube 1 (témoin) 2 3 4 5
Pente/culot K/K A/A A/A K/A K/A
Gaz - - + - -
H2S - - - + +
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8. TESTS ENZYMATIQUES
CATALASE
OXYDASE
1. Placer un papier absorbant sur une lame et l’imbiber avec le réactif d’oxydase.
2. Avec une anse de Koch, y déposer un prélèvement bactérien pris sur une gélose.
3. Observer l’apparition d’une coloration rosée à pourpre pour une réaction positive.
COAGULASE
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9. CULTURE ANAÉROBIE
BESOINS EN OXYGÈNE
Types de Métabolisme Rendement
Milieu Équation générale
bactéries énergétique énergétique
Aérobies Aérobie Respiration 38
C6H12O6 + O2 CO2 + H2O
+O2 cellulaire ATP/glucose
Facultatives
Anaérobie C6H12O6 (CO2) + Composé organique 2
Fermentation
-O2 (éthanol, ac. lactique, méthane, etc.) ATP/glucose
Anaérobies
Gélose droite.
On peut ensemencer des bactéries dans des tubes de gélose nutritive («géloses droites»). L’oxygène
diffuse très peu à travers la gélose de telle sorte qu’il y a un gradient de concentration décroissant qui
s’établit à partir de la surface vers le fond du tube; le fond constitue un milieu quasi anaérobie. Après
incubation, on pourra observer la croissance à divers endroits dans la gélose selon les besoins en O 2 des
bactéries :
Chambre anaérobie.
On peut incuber des géloses en boîtes de Pétri à
l’intérieur de contenants hermétiques dans lesquels
on enlève l’O2 à l’aide de systèmes réactionnels tels
que celui qui est illustré ici.
Bouillon thioglycollate.
Enfin, on peut cultiver des bactéries anaérobies dans un bouillon nutritif contenant du thioglycollate; ce
composé fixe l’O2 et rend le milieu anaérobie.
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10. ANTIBIOGRAMME
1. INTRODUCTION
2. MANIPULATIONS
1) À l’aide d’un écouvillon, prélever un échantillon de la bactérie inconnue et ensemencer une gélose de
façon à former un tapis bactérien.
2) À l’aide de pinces stérilisées (flambées à l’alcool) et/ou d’un distributeur automatique, disposer les
papiers buvards sur la gélose : ils doivent être placés en périphérie (1,0 cm du bord) et à au moins 2,0
cm les uns des autres.
3) À l’aide de pinces stérilisées, appuyer légèrement sur les disques de papier pour qu’ils adhèrent bien
à la surface de la gélose (sans pour autant qu’ils s’y enfoncent).
4) Incuber selon les conditions appropriées pendant 24 heures.
3. RÉSULTATS
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