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CINETIQUE A DEUX SUBSTRATS

Introduction
Jusqu’ici, nous nous sommes intéressés qu’à des réactions faisant intervenir un seul substrat. En
réalite, de telles réactions sont rares et restent limitées à quelques réactions d'isomérisation, comme
la conversion du glucose 1-phosphate en glucose 6-phosphate catalysée par la
phosphoglucomutase. Toutefois, les réactions enzymatiques qui impliquent deux substrats et qui
conduisent à la formation de deux produits représentent environ 60% des réactions enzymatiques
connues.

Presque toutes ces réactions, appelées réactions à deux substrats, sont soit des réactions catalysées
par des transférases, dans lesquelles l’enzyme catalyse le transfert d’un groupement fonctionnel
spécifique, X, de l’un des substrats à l’autre :

Soit des réactions d’oxydoréduction, dans lesquelles des équivalents réducteurs sont transférés
d’un substrat à l’autre. Par exemple, lors de l’hydrolyse d’une liaison peptidique par la trypsine, le
groupement carbonyle du peptide est transféré de l’atome d’azote peptidique à l’eau.

De même, au cours de la réaction de l’alcool déshydrogénase, un ion hydrure est transféré de


l’éthanol au NAD+.

Bien qu’en principe, de telles réactions à deux substrats puissent faire intervenir de très nombreux
mécanismes, on en connait qu’un petit nombre.
I- Terminologie
Nous suivrons la nomenclature introduite par W.W. Cleland pour représenter les réactions
enzymatiques.
- Les substrats sont désignés par les lettres A, B, C et D dans l’ordre de leur liaison à
l’enzyme ;
- Les produits sont désignés par P, Q, R et S dans l’ordre de leur séparation de l’enzyme ;
- Les formes stables des enzymes sont désignées par E, F et G, l’enzyme libre étant
représentée par E ;

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- Le nombre de substrats et de produits dans une réaction donnée est spécifique, dans l’ordre,
par les termes Uni (un), Bi (deux), Ter (trois) et Quad (quatre). Une réaction qui utilise
un substrat et conduit à la formation de trois produits est une réaction Uni Ter.
Dans ce cours, nous nous intéresserons aux réactions qui utilisent deux substrats et qui forment
deux produits, c’est-à-dire des réactions Bi Bi.
II- Modèles des réactions Bi Bi
On peut ranger les réactions enzymatiques de transfert de groupe en deux grandes catégories
selon leur mécanisme en réactions séquentielles et en réactions Ping-pong.
II-1- Réactions séquentielles
Les réactions dans lesquelles tous les substrats doivent se combiner à l’enzyme avant
qu’une réaction puisse avoir lieu et que les produits puissent être libérés sont des réactions
séquentielles. Dans de telles réactions, le groupe transféré, X, passe directement de A (=P-X) à B,
pour donner P et Q(=B-X). Ces réactions sont donc appelées des réactions de simple
déplacement.
On distingue, parmi les réactions séquentielles, celles pour lesquelles l’ordre de liaison à
l’enzyme est imposé, qui font donc intervenir un mécanisme ordonné, et celles où l’ordre de
liaison des substrats est indifférent, qui font intervenir un mécanisme aléatoire.
II-1-1- Réactions séquentielles ordonnées
Dans le mécanisme ordonné, la liaison du premier substrat semble necessaire pour que
l’enzyme établisse le site de liaison du deuxième substrat.
Selon Cleland, une réaction Bi Bi ordonnée est représentée par :

Où A et B sont respectivement le premier et le deuxième substrat. De nombreuses


déshydrogénases à NAD+ et NADP+ suivent un mécanisme Bi Bi ordonné dans lequel le
coenzyme se fixe en premier.
II-1-1- Réactions séquentielles aléatoires
Ici, les deux sites de liaison sont présents sur l’enzyme libre. Un mécansme Bi Bi aléatoire
est représenté par :

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Certaines déshydrogénases et kinases suivent ce mécanisme.
II-2- Réactions Ping-Pong
Des mécanismes où un produit ou plusieurs sont libérés avant que tous les substrats aient
été ajoutés sont appelés des réactions Ping-Pong.
On schématise une réaction Ping-Pong comme suit :

Dans ce cas, un groupement fonctionnel X du premier substrat A ( = P-X) est enlevé du


substrat par l’enzyme E pour donner le premier produit P et une forme stable de l’enzyme F (=E-
X) dans laquelle X est fortement lié (souvent par covalence) à l’enzyme (Ping). Dans la deuxième
partie de la réaction, X esr déplacé de l’enzyme par le deuxième substrat B pour donner le
deuxième produit Q (= B-X), régénérant ainsi l’enzyme sous sa forme initiale, E (Pong). De telles
réactions sont appelées des réactions de double déplacement.
Dans ce type de réactions, les substrats A et B ne se rencontrent pas à la surface de
l’enzyme. Beaucoup d’enzymes, dont la chymotrypsine, les transaminases et quelques enzymes
flaviniques réagissent selon des mécanismes Ping-Pong.

III-Equations de vitesse
Des mesures de cinétique à l’état stationnaire permettent de déterminer le type de réactions
à deux substrats parmi celles que nous venons de voir. Pour ce faire, on doit d’abord dériver leurs
équations de vitesse. La méthode est la même que celle utilisée pour les enzymes à un substrat,
c’est-à-dire l’établissement d’une série d’équations linéaires simultanées, une pour chaque
complexe enzymatique différent dans les conditions de l’état stationnaire, et une équation qui
exprime la conservation de l’enzyme. Naturellement, le problème est plus complexe que pour les
réactions à un substrat.
Les équations de vitesse pour les mécanismes de réaction à deux substrats décrits ci-dessus,
en l’absence de produits, sont données sous la forme double inverse.
III-1- Mécanisme Bi Bi séquentiel

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III-1-1 Mécanisme Bi Bi séquentiel ordonné

III-1-2 Mécanisme Bi Bi séquentiel aléatoire en équilibre rapide


L’équation de vitesse pour une réaction Bi Bi aléatoire est très compliquée. Cependant, dans le
cas particulier où les deux substrats sont en équilibre rapide et indépendant avec l’enzyme, où
l’interconversion EAB-EPQ est la réaction limitante, l’équation de vitesse initiale se réduit à la
forme relativement simple suivante :

On parle alors de mécanisme Bi Bi aléatoire en équilibre rapide.


III-2 Mécanisme Bi Bi Ping-Pong

IV-Distinction entre les mécanismes des réactions à deux substrats


On peut faire la distinction entre les mécanismes Ping-Pong et séquentiels d’après l’allure
différente de leurs représentations linéaires ou de la représentation en double inverse.
IV-1- Représentations graphiques des réactions Bi Bi Ping-Pong
Soit l’équation des doubles inverses suivantes :

En portant 1/v0 en fonction de 1/[A] et en maintenant [B] constante, d’après l’équation de doubles
inverses, on obtient une droite de pente égale à qui coupe l’axe 1/v0 en des points égaux.
Puisque la pente est indépendante de [B], de tels tracés pour différentes valeurs de [B] donnent
une famille de droites parallèles.
Des tracés de 1/v0 en fonction de 1/[B] pour différentes valeurs de [A] donneront, de la même
manière, une famille de droites parallèles. Ces droites parallèles caractérisent un mécanisme
Ping-Pong.

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IV-2- Représentations graphiques des réactions Bi Bi séquentielles
Soit l’équation

(1)
Représentant un mécanisme séquentiel ordonné
et l’équation

(2)
Représentant un mécanisme aléatoire à équilibre rapide
Ces deux équations sont l’une et l’autre dépendante de [A] et de [B].
L’équation (1) peut être réarrangée pour donner :

(1’)
Puis, en portant 1/v0 en fonction de 1/[A] pour [B] constante, on obtient une droite dont la pente
est égale au coefficient de 1/[A] et qui coupe l’axe 1/v0 à une valeur égale au deuxième terme de
l’équation (1’).
On peut également réarranger l’équation (1) de la sorte

(2’)
Qui donne une droite si l’on porte 1/v0 en fonction de 1/[B] tout en maintenant [A] constante,
droite dont la pente est égale au coefficient directeur de 1/[B] et qui coupe l’axe 1/v0 à une valeur
au deuxième terme de l’équation (2’).
La caractéristique de ces tracés, qui indique un mécanisme séquentiel, c’est que les droites
se coupent derrière l’axe 1/v0

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IV-2- 1-Distinction entre mécanismes séquentiels aléatoire et ordonné
Pour savoir si un mécanisme est Bi Bi ordonné ou Bi Bi aléatoire, on peut faire des études
d’inhibition par le produit.
Si l’on n’ajoute qu’un produit, P ou Q, au mélange réactionnel, la réaction en sens inverse ne peut
pas être assurée. Néanmoins, en se liant à l’enzyme, ce produit inhibera la réaction dans le sens de
la formation des produits.
Pour une réaction Bi Bi ordonnée, Q ( = B-X, le deuxième produit qui sera libéré) est en
compétition directe avec A ( =P-X, le premier substrat à se lier) pour se lier à l’enzyme et se
comporte donc comme un inhibiteur compétitif de [A] quand [B] est constante. Toutefois, comme
B se combine avec EA, et non E, Q est un inhibiteur mixte de B quand [A] est constante. De même,
P, qui ne se combine qu’avec EQ, est un inhibiteur mixte de A quand [A] est maintenu constante.
Par contre, pour une réaction Bi Bi en équilibre rapide, puisque les deux produits et les deux
substrats peuvent se combiner directement avec E, alors P et Q sont tous les deux des inhibiteurs
compétitifs de A quand [B] est constante, et de B quand [A] est constante.
Le tableau ci-dessous rassemble les différents types d’inhibition possibles par le(s) produit(s) selon
le mécanisme de la réaction.

V- Echanges isotopiques

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Les déterminations de mécanismes de réactions enzymatiques basées uniquement sur des
données cinétiques sont grevées d’incertitudes, notamment en raison de données expérimentales
peu précises. Il est donc indispensable de recourir à d’autres approches expérimentales si l’on veut
une confirmation.
On peut faire la distinction entre les mécanismes à deux substrats séquentiels (simple
déplacement) et Ping-Pong (double déplacement).
Dans le cas de réactions à double déplacement, l’échange en retour d’un isotope du premier
produit P au premier substrat A en l’absence du deuxième substrat est possible. Considérons une
réaction Ping-Pong dans son ensemble, catalysée par une enzyme E à deux substrats.

Dans laquelle A = P-X, Q = B-X et X est le groupement transféré d’un substrat à l’autre au cours
de la réaction. En l’absence de B, seule la première étape de la réaction peut se dérouler. Si une
faible quantité de P marqué par un isotope, symbolisé par P*, est ajoutée au mélange réactionnel,
P* - X se formera au cours de la réaction inverse :

autrement dit, il y a échange isotopique.


Par contre, dans le cas de la première étape d’une réaction séquentielle, il se forme un complexe
enzyme-substrat non covalent :

L’addition de P* ne peut donner lieu à un échange isotopique car il n’y a pas de rupture de
liaisons covalentes lors de la formation de E.P-X, c’est-à-dire qu’il n’y a pas de P libéré de
l’enzyme qui puisse s’échanger avec P*.
La démonstration qu’il y a échange isotopique dans une réaction enzymatique à deux
substrats est donc un argument convaincant en faveur d’un mécanisme Ping-Pong.