CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO Y EFECTO DEL pH EN EL DESARROLLO DE

MICROORGANISMOS

Jonathan Ortiz a, Mauricio Rodriguez b

Grupo 6

a Departamento de Química,Universidad Nacional de Colombia, Bogotá

joaortizfo@unal.edu.co
b Departamento de Química,Universidad Nacional de Colombia, Bogotá

andmrodriguezcas@unal.edu.co
Microbiología

RESUMEN

Se desarrolló la curva de crecimiento de la bacteria E.coli mediante el método de conteo de

células viables a unas condiciones de pH 7 y temperatura entre 13 y 20 °C. Se encontró que la
fase exponencial dura aproximadamente 5 horas, una fase estacionaria muy prolongada y la
no posible identificación de la fase de muerte. Se asocia la larga duración de la fase
estacionaria al excelente funcionamiento de los mecanismos de la bacteria E. coli para poder
sobrevivir a la etapa de inanición. La curva presentada lleva consigo un alto error asociado
debido a la contaminación de los cultivos, errores experimentales y baja presencia de
unidades formadoras de colonia (UCF) en un rango estadísticamente significativo. En
paralelo se evaluó el efecto del pH sobre E. coli, E. faecalis y S. cerivisae en donde se
encontró que para las dos primeras bacterias el pH de 5 es el más óptimo para su crecimiento,
encontrándose diferencias con lo reportado por literatura asociado a errores experimentales en
la toma de la alícuota; mientras que para S. cerevisiae se obtienen bajos valores de
crecimiento debido a su baja velocidad de reproducción

Palabras clave. Bacterias, crecimiento, medios de cultivo, medios complejos, medios selectivos, Gram
positivas, Gram negativas, técnica aséptica, agentes antimicrobianos, técnicas de siembra.

1. MARCO TEÓRICO

La Técnica Aséptica la constituyen un conjunto de procedimientos y actividades que se realizan con el

fin de disminuir al mínimo las posibilidades de contaminación microbiana en distintos
procedimientos.[1] Específicamente en la siembra y crecimiento de microorganismos, dichas técnicas
junto con distintos métodos de siembra, permiten propagar a los microorganismos en cultivos mixtos,
así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio,
caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del
tipo de microorganismo y propósito específico del estudio. [2]

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de

cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un
medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina
cultivo puro o axénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo
mixto.[2]

Un medio de cultivo es el material alimenticio en que crecen los microorganismos y el crecimiento de

los mismos constituye el cultivo. [3] El medio de cultivo debe reunir una serie de condiciones:
temperatura adecuada, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto
de acidez o alcalinidad, Un medio de cultivo debe tener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismos contamiente. Según su estado físico, estos
cultivos pueden ser líquidos, semi líquidos o sólidos. [3]

Los medios de cultivo pueden clasificarse en definidos y complejos, en donde su diferencia primordial
es la certeza de la concentración de los nutrientes, lo cual pasa en los medios definidos. Los medios
complejos otorgan ventajas en la práctica y se usan frecuentemente. Este medio luego de su
preparación debe ser esterilizado con el fin de eliminar microorganismos no deseados.

Con respecto a las técnicas de siembra, existen de manera general tres tipos que pueden asegurar la
obtención de cultivos axénicos. El método de siembra por estría en placa es el más fácil y el más
usado. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación
se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri
también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el
asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación,
se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la
siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso
varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar
adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para
formar colonias visibles.[2]

Por otro lado en los métodos de vertido en placa y extensión en placa, las suspensiones de células
microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra
contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. [2] En el
método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa.
Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias
superficiales se extenderán y serán más grandes. En extensión en placa, las muestras diluidas se
siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndose con ayuda de un asa o
varilla Dally de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas
sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias.

Ahora bien, existen ciertas sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias,
pudiendo ejercer efectos ya sea bacteriostáticos: cuando impiden el crecimiento bacteriano o
bactericidas: cuando destruyen (matan) las bacterias.[4] En general, si no sólo nos referimos a las
bacterias, sino a cualquier tipo de microorganismos, hablamos respectivamente de agentes
microbiostáticos y microbicidas. Ahora bien, para una misma sustancia química, la línea de
demarcación entre un efecto microbiostático y otro microbicida depende muchas veces de la
concentración de dicha sustancia y del tiempo durante el que actúa. Para este caso se analiza el efecto
de tres tipos de bactericidas: antiséptico, desinfectante y antibiótico, los cuales a grandes rasgos se
diferencian en el grado de prejudicialidad que tienen sobre tejido humano y su selectividad a ciertos
tipos de microorganismos (en algunos casos pueden ser de amplio espectro).[5] Los antisépticos
inhiben el crecimiento bacteriano pero no son perjudiciales en la aplicación sobre tejido humano, los
desinfectante si lo afectan por lo que normalmente son de mayor cuidado y se usan para disminuir
carga microbiana de superficies inertes y/o ambientes, y los antibióticos se usan para prevenir
infección, o la propagación de la infección de una fuente microbiana y pueden afectar o no organismos
vivientes dependiendo de la dosis y aplicación dada.

2. RESULTADOS Y ANÁLISIS

Inicialmente se realizó una prueba del manejo de la técnica aséptica, en donde mediante la
transferencia de volúmenes reducidos de TSA entre 2 tubos, se validó la correcta aplicación del método
(uso de asa, esterilización y manejo de zona aséptica) con la posterior visualización de posible
crecimiento en cada tubo. Teniendo en cuenta lo anterior en la imagen 1 se puede visualizar que la
técnica fue manejada de manera correcta ya que se logró esterilizar el asa para posterior contacto con
el medio, lo cual evitó contaminación y posterior crecimiento de microorganismos. La ausencia de
turbidez indica que no hubo crecimiento microbiano en el medio usado en el tiempo de incubación
aplicado, sin embargo también podría darse el escenario de que al aumentar el tiempo de cultivo o de
contacto del medio en condiciones óptimas de crecimiento, podría desarrollarse algún tipo de población
microbiana.

Imagen 1. Comparación de los medios de cultivos usados por cada experimentador para evaluar la
técnica aséptica. a) corresponde al experimentador 1 y b) al experimentador 2.

Posteriormente se buscó aislar un “cultivo puro” de un microorganismo de interés, lo que significó

extender físicamente una población de microorganismos en una placa de agar de tal manera que un
solo microorganismo pudiese crecer en una colonia individual. En este caso se partió de un cultivo
hecho con E. Coli en TSA el cual se realizó por siembra en estría. Dicho cultivo muestra un crecimiento
elevado para ambas repeticiones realizadas. Es posible observar que el cultivo a partir de un inóculo
en medio líquido y realizado por una estría continua como lo muestra la imagen 2.a se lleva a cabo el
crecimiento del organismo pero no se pueden encontrar colonias definidas debido a una alta población
de UFC, por otro lado, usando un inóculo sólido obtenido previamente y haciendo uso de un patrón de
siembra distinto (teniendo en cuenta que son diversas las formas de sembrar), se puede observar que
de igual modo se presenta una alta actividad microbiana con la diferencia de que en este caso se
puede visualizar como mínimo la formación de una colonia, tal y como se observa en la imagen 2.b.
Lo anterior indica que el aseguramiento de colonias individuales dependerá del manejo correcto que
se le de al asa, al medio de cultivo y al método de siembra aplicado. De igual modo, es importante
aclarar que de un medio sólido es más viable tomar una colonia puta, mientras que en un medio líquido
no se puede garantizar en muchos casos que el cultivo sea puro, sin embargo, si se desea asegurar
formación de colonias, cualquier punto de partida puede ser útil.
 Imagen 2. Siembra por estría de E.coli. a) Siembra de E.coli con muestra tomada de medio líquido.
b) Cultivo con muestra tomada de medio sólido. Se visualiza formación de colonia.

Ahora bien, para evaluar la técnica de siembra por extensión, se hizo uso de una varilla Dally la cual
está diseñada específicamente para esparcir el líquido o muestra que cae sobre la placa, de modo que
la placa esté completamente cubierta y todo lo que esté o repose sobre el líquido pueda crecer de
manera adecuada. Para este experimento se usó de nuevo el medio de cultivo TSA para así evaluar
la actividad microbiana en una alícuota de 100 μL de agua la cual en principio es apta para el desarrollo
de bacterias gram positivas y negativas.

Una vez se realizó la extensión teniendo en cuenta condiciones estériles de siembra, se pudo observar
que hay formación de colonias en cada uno de los ejercicios realizados. Se puede observar que aunque
el número de colonias es reducido, presentan un tamaño importante. Lo anterior permite afirmar que
la velocidad de crecimiento de los organismos desarrollados no es tan alta, como sí ocurrió en el
ejercicio anterior con E. coli. De igual modo, el crecimiento se puede deber a contaminación en el
momento de la aplicación de la técnica. Es de tener en cuenta que para este caso no se conocerá la
naturaleza de las colonias formadas (tipos de microorganismos, bacterias u hongos) ya que por un
lado este tipo de cultivo no es selectivo y por el otro, se tendría que realizar microscopía para realizar
una identificación del tipo de microorganismo.

Imagen 3. Siembra por extensión de muestra de agua. Para los dos casos: a y b se visualiza
formación de colonias.

Posteriormente y con el objetivo de demostrar que los microorganismos se encuentran en todas partes
se procedió a realizar muestreo de una suela de zapato para posterior siembra sobre 3 medios de
cultivo distintos. Para el caso de la siembra en TSA, se puede visualizar en la imagen 4b como aún
siendo esparcida de manera uniforme dicha muestra, hay formación de una alta población de
microorganismos. Al ser este medio de cultivo no selectivo, existirán condiciones para el crecimiento
de distintos tipos de microorganismos. En este medio se puede visualizar colonias bacterianas rugosas,
no se visualizan colonias aisladas que pueden dar idea de algún tipo de microorganismo. Además,
teniendo en cuenta que el tiempo de cultivo fue de aproximadamente 24 horas, permite inferir que al
paso del tiempo posiblemente se podría presentar un mayor crecimiento.

Una vez evaluado el medio no selectivo, se procedió a realizar siembra sobre medio tipo sal de manitol,
la cual corresponde a un medio de cultivo selectivo y diferencial. Este medio permite el crecimiento de
bacterias Gram positivas mientras que inhibe el crecimiento de Gram negativas. Como se puede
observar en la imagen 4c, hay formación de colonias que permiten establecer comparación con el
crecimiento mostrado en el cultivo no selectivo. La disminución de las colonias formadas se puede
asociar a la acción de la alta concentración de sal suministrada por el medio. Es de tener en cuenta
que la sal de manitol fue diseñada para el aislamiento de cocos Gram positivos en su mayoría
patógenos, tales como el Staphylococcus aureus y en general Staphylococcus spp. Además contiene
manitol, otro inhibidor de bacterias Gram negativas y un indicador de pH de fermentación. [7] Lo anterior
permite intuir entonces que el crecimiento puede estar asociado a familia de Staphylococcus spp o
incluso Micrococcaceae, la cual es común en el aire y en la piel; lo anterior podría corroborarse con
análisis enfocados a la estructura como lo podría ser aplicación de tinción de gram y visualización por
microscopía.

Ahora bien, se evaluó el crecimiento de la misma muestra en agar MacConkey, el cual corresponde de
nuevo a un medio selectivo diferencial pero en este caso para bacilos Gram negativos y entéricos; de
igual modo permite la identificación de coliformes. [8] Según el ejercicio realizado, se puede visualizar
en la imagen 4d que no hay crecimiento de colonias asociadas a microorganismos Gram negativos
que se alimenten de lactosa presente en el medio. En este caso se puede afirmar incluso que en la
muestra o frotis de la suela no hay siquiera presencia de E.coli.

Imagen 4. Cultivo de frotis de suela de zapato. a) Frotis con hisopo de suela de zapato. b) Cultivo en
TSA. c) Cultivo en sal de manitol. d) Cultivo en agar MacConkey.
En la prueba de inhibición por acción de agentes antimicrobianos, se realizó una comparación de halos
de inhibición de tres activos distintos. Se realizaron medios con TSA buscando generar un césped de
bacterias haciendo uso de la varilla Dally. Como la idea es validar la efectividad de los antimicrobianos
para distintos tipos de microorganismos, se partió de la siembra de E.coli como ejemplo de
microorganismo Gram negativo y E. faecalis como ejemplo de Gram positivo. Cada placa o cultivo se
dividió en 4 en donde 3 de esos cuadrantes corresponden a un activo antimicrobiano y el restante a un
blanco o control negativo. Los antimicrobianos a evaluar fueron: Iodopovidona como antiséptico,
Amonios cuaternarios de quinta generación como desinfectante y Amoxicilina como antibiótico.

Al observar la imagen 5 se puede visualizar que para el cultivo de E.coli (bacteria gram negativa) hubo
inhibición del crecimiento en el cuadrante donde se añadió el disco con antibiótico y amonios
cuaternarios en mayor proporción. Aunque el yodo presentó inhibición, no fue tan significativa como
en el caso de los dos activos antes mencionados. Para el caso del cultivo de E. faecalis (bacteria gram
positiva), se puede visualizar que los halos más grandes están asociados a los cuadrantes en donde
fueron sembrados los discos impregnados con yodo y antibiótico, visualizandose un menor grado de
acción por parte de los amonios cuaternarios. Para ambos casos, el antibiótico tiene un efecto en las
proteínas relacionadas con la síntesis de la pared de peptidoglicano, explicando así su alta efectividad.
Para el caso de los amonios cuaternarios de quinta generación se puede afirmar que dicho activo actúa
inhibiendo las funciones de la pared celular y de la membrana citoplasmática o por interacción física
con la membrana celular. Aunque en principio debe ser efectivo para bacterias gram positivas, gram
negativas, virucida y fungicida, se debe asegurar una concentración mínima entre 0,01 y 0,02 %(MIC)
[9]; con lo anterior se desea indicar, que el método aplicado puede o no asegurar la concentración
necesaria para asegurar una inhibición del crecimiento de dichos microorganismos de manera más
efectiva. Para el caso del yodo actúa sobre las proteínas estructurales y enzimáticas de las células
microbianas, destruyéndose por oxidación. Es activa frente a bacterias (Gram+ y Gram-) [10]l Las
concentraciones de los activos son un factor importante en el momento de visualizar resultados, por lo
cual si se encuentra una concentración reducida del mismo en el medio, no se verá la inhibición
esperada incluso si el activo reporta actividad inhibitoria para distintos tipos de microorganismos como
lo es en este caso.

Imagen 5. Agentes antimicrobianos aplicados a cultivos de a) E.coli y) E. faecalis.

3. CONCLUSIONES

Existen medios de cultivo denominados universales, los cuales favorecen el crecimiento de cualquier
tipo de microorganismo, pero no le otorgan al cultivo selectividad alguna y puede ser desfavorable.
Debido a que la estructura de la bacteria puede ser alterada por los componentes presentes en el
medio se pueden generar medios selectivos a los distintos tipos de bacterias.
En el experimento para el cual se compararon los distintos medios de cultivo relacionándolos con el
crecimientos microbiano se puede concluir que en la muestra tomada de la suela del zapato, existe
una alta presencia de microorganismos, los cuales en su mayoría son Gram positivos posiblemente
pertenecientes al grupo Staphylococcus spp, además se evidencia la ausencia de bacterias Gram
negativas. Dependiendo el tipo de población bacteriana que queramos obtener (Gram + o -) se
requerirán distintos tipos de nutrientes.Con el fin de corroborar las hipótesis anteriores, se hace
necesario el análisis por microscopia, donde podamos observar su morfología, tamaño y demás.

De acuerdo a los resultados obtenidos en la práctica de comparar los distintos tipos de agentes
antimicrobianos (Iodopovidona, Amonios cuaternarios y Amoxicilina), se puede concluir que el
mecanismo de acción de estos agentes afecta drásticamente la estructura y el metabolismo celular de
los microorganismos lo cual ocasiona muerte celular, hecho que es acorde con los resultados
obtenidos.

La efectividad del antibiótico se puede asociar en un primer momento a la potencia del activo y su
efecto en la síntesis de membrana en la pared celular que es mucho más efectivo en la inhibición que
los mecanismo del desinfectante y el antiséptico. En el yodo se encontró efectividad para afectar tanto
bacterias gram negativas como gram positivas por su capacidad de oxidar e inactivar componentes
celulares. Por otro lado los amonios cuaternarios de quinta generación mostraron mayor actividad
sobre bacterias gram negativas fijándose a la superficie de los microorganismos, ejerciendo su
actividad biocida, inhibiendo las funciones de la pared celular y de la membrana citoplasmática o por
interacción física con la membrana celular.

5. REFERENCIAS

[1] Tisné L., Técnica aséptica y sus componentes, Hospital Santiago de oriente - Santiago de Chile,
2004.
[2] Tovar F., 2012. Tecnicas y metodos de aislamiento y selección de microorganismos. -
Conalepfelixtovar. Recuperado de:conalepfelixtovar.wordpress.com
[3] Serrano C, Gutiérrez R, Manual de microbiología - Facultad de ciencias biológicas, Universidad
Católica de Chile. 2014.
[4] Agentes químicos (Desinfectantes, antisépticos y antibióticos) - Universidad de Granada. 206.
Disponible en: www.ugr.es/
[5] McDonnell G, Denver A (2001)- Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance -
Clinical Microbiology Reviews.
[6]Parija S H. Textbook of microbiology and inmunology. El sevier. 2009 Página 39
[7] Bachoon, Dave S., and Wendy A. Dustman. Microbiology Laboratory Manual. Ed. Michael Stranz. Mason,
OH: Cengage Learning, 2008. Exercise 8, "Selective and Differential Media for Isolation" Print.
[8]Kumara B. B Varma A Microbial biomass process technologies and management. Springer . 2017. Página
53
[9] Eufar - Eucida advance - Mecanismo de acción de cloruro de amonio cuaternario de quinta generación -
2018
[10] Madigan, Martinko Parker. Brock –Biología de los Microorganismos. Addison-Wesley. 2004/2009.