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Université MSBY - Jijel

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie


Département de Microbiologie Appliquée et Sciences Alimentaires
1e année Master Microbiologie Appliquée

Travaux pratiques
Fermentations Industrielles

TP No1 : Préparation des milieux de culture

Introduction :
Les microorganismes ont été divisés en deux grandes catégories sur la base de leurs exigences
nutritionnelles : les autotrophes et les hétérotrophes. Les premiers ont les besoins les plus simples. Ils
possèdent un équipement enzymatique extrêmement élaboré et puissant et peuvent synthétiser tous leurs
composants à partir de substances élémentaires. Les seconds, au contraire, exigent pour leur croissance les
substances qu’ils ne peuvent pas synthétiser.
Les milieux de culture devront donc fournir les éléments essentiels à la croissance et, souvent, les facteurs
de croissance indispensables. Ils seront le plus souvent isotoniques (NaCl à 0.9%) et leur pH se situera entre
7 et 7.6.
On distingue trois types de milieux.
 Milieux naturels ou empiriques de composition mal définie (bouillon nutritif)
 Milieux synthétiques qui sont chimiquement définis (milieu urée-indole, milieu minimum)
 Milieux semi-synthétiques, ils contiennent en plus certains composés favorisant la croissance comme
l’extrait de levure ou une peptone.
En microbiologie industrielle, les milieux de culture et de production proviennent souvent de matières
premières moins coûteuses, comme les sous-produits des industries agro-alimentaires et certains
hydrocarbures.

Objectif :
L’objectif du TP est d’apprendre à préparer et à stériliser des milieux de culture liquides et solides.

Matériel requis
 Extrait de viande de bœuf
 Peptone trypsique
 NaCl
 Agar-agar
 Poudre de lait écrémé
 Eau distillée
 NaOH, HCl
 Erlenmeyers (250ml), tubes en verre avec bouchons
 Eprouvette graduée (500 ml), pipettes graduées
 Boites de Pétri
 Balance
 pH-mètre
 Plaque chauffante magnétique
 Coton, gaze, aluminium
 Autoclave.

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Protocole expérimental

 Peser les constituants nécessaires à la préparation de 500 ml de chaque milieu comme indiqué dans le
tableau 1.
 Dans un erlenmeyer de 1L mettre 350 ml d’eau distillée, y ajouter les constituants préalablement pesés
et agiter après chaque addition.
 Ajuster le pH du milieu avec du NaOH ou du HCl
 Compléter le volume à 1000 ml avec de l’eau distillée, agiter.
 Répartir le bouillon nutritif dans les tubes en verre à titre de 10 ml par tube à l’aide d’une pipette
graduée, fermer les bouchons sans les serrerentièrement.
 Bien fermer les erlenmeyers qui contiennent les milieux solides avec du coton couvert de gaze, recouvrir
avec du papier aluminium.
 Autoclaver à 121°C pendant 15 minutes pour la GN et le BN et 10 minutes pour la GNL
 Laisser refroidir à une température avoisinant 48°C, faire couler dans les boites de Pétri.
 Laisser la gélose se solidifier puis inverser les boites et les incuber à 37°C.

Milieux de culture
Constituants
(g/L) Gélose Gélose au pH
Bouillon
nutritive lait
nutritif (BN)
(GN) (GNL)
Extrait de viande de bœuf 3 3 3 7.3± 0.2
Peptone trypsique 5 5 5 7.3± 0.2
Chlorure de sodium 5 5 5 7.3± 0.2
Agar-agar - 15 15 7.3± 0.2
Poudre de lait écrémé - - 10 7.3± 0.2

Compte rendu :
Le compte rendu devra comporter en plus de l’importance de chaque étape, des réponses aux questions
suivantes :
Pourquoi les milieux de culture doivent être stérilisés avant utilisation ?
Pourquoi doit-on inverser les boites de pétri après solidification de la gélose ?
Pourquoi doit-on laisser refroidir le milieu solide à 48°C avant de le couler dans les boites de pétri ?
Quelle est la source de carbone dans les milieux du tableau 1 ?
Indiquer si vos géloses apparaissent stériles après 24h d’incubation. Expliquer vos résultats.

Enseignante : Dr. H. Ouled Haddar

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Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Microbiologie Appliquée et Sciences Alimentaires
1e année Master Microbiologie Appliquée
Enseignante : Dr. H. Ouled Haddar
Travaux pratiques
Fermentations Industrielles
TP No2 : La courbe de croissance microbienne
Introduction :
La courbe de croissance d’une culture microbienne est souvent liée à l’étude de la cinétique de
croissance d’une bactérie donnée dans un système fermé.
De multiples techniques sont utilisées pour mesurer la croissance microbienne : en suivant les
changements du nombre total de cellules, du nombre de microorganismes viables ou de la masse cellulaire.
1- Mesure du nombre de cellules ;
 Les chambres de comptage : hemocytomètre…
 Le nombre de cellules viables : isolement par étalement (UFC), filtres…
2- Mesure de la masse cellulaire ;
 Poids sec des microorganismes
 Spectrophotométrie
 Mesure spectrophotométrique de la concentration de certaines substances cellulaires : ATP,
Protéines, Chlorophylle.

Objectif :
L’objectif du TP est de mesurer la croissance d’une culture bactérienne dans un milieu liquide afin de
représenter une courbe de croissance et de déterminer les paramètres cinétiques correspondants.

Matériel requis
 Culture bactérienne sur bouillon nutritif fraîchement préparée.
 Bouillon nutritif
 Gélose nutritive coulée dans des boites de Pétri.
 Erlenmeyer (250ml)
 Spectrophotomètre UV-visible
 Bain marie-agitateur ou incubateur-agitateur (37°C).

Protocole expérimental
 Ensemencer le bouillon nutritif par la culture bactérienne fraîche (10/100, v/v).
 Incuber à 37 oC avec agitation modérée.
 Dans des conditions aseptiques, prélever 3 ml du milieu de culture après chaque heure à partir du temps
d’inoculation (t 0), sur une durée de 12 heures.
 Pour le dénombrement des cellules viables, chaque échantillon (0.5 ml) doit être dilué dans de l’eau
physiologique et ensemencé sur au moins 2 boites de gélose nutritive,
 Mesurer la densité optique des échantillons restant (1 ml) à 600 nm, après avoir étalonné le
spectrophotomètre avec le même milieu stérile, tout en tenant compte de diluer ceux qui ont une DO
>1.0 avec le bouillon nutritif stérile.
 Représenter la courbe de la DO en fonction du temps et celle du nombre d’unités formant colonie en
fonction du temps sur une échelle logarithmique.

Compte rendu :
Rédiger un compte rendu tout en comparant les deux types de courbes réalisées en considérant de
calculer le taux de croissance et le temps de génération.
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Faculté SNV
Département MASA
1e année Master Microbiologie Appliquée
Fermentations Industrielles
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TP N 3 : Isolement et screening primaire des bactéries sporulées productrices de la protéase
Introduction
Le terme « protéase» désigne toute enzyme capable de catalyser la réaction d’hydrolyse de la liaison
peptidique par une réaction nommée protéolyse.
En général, les micro-organismes représentent la source la plus importante de protéases, comme ils peuvent
être cultivés à grande échelle dans un temps relativement court par les méthodes de fermentation, ils fournissent
également une variété abondante et régulière de produits désirés. Par ailleurs, les protéines microbiennes ont
une longue durée de vie et peuvent être stockées dans des conditions moins idéales pendant des semaines sans
perte significative de l’activité.Les microorganismes élaborent plusieurs types de protéases, qui sont soit
intracellulaires et / ou extracellulaires. Les protéases intracellulaires sont importantes pour divers processus
cellulaires et métaboliques, tels que la sporulation et la différenciation, le renouvellement des protéines, la
maturation des enzymes et des hormones. Certaines protéases extracellulaires sont importantes pour l’hydrolyse
des protéines dans l’environnement extracellulaire et permettent aux germes d’absorber et d’utiliser les produits
d’hydrolyse tandis que les autres sont des toxines ou des facteurs impliqués dans la virulence.
Les protéases de divers types ont trouvé des applications dans différentes industries, particulièrement, celle
de détergents, l’industrie alimentaire, pharmaceutique, médicale, l’industrie de cuir, et même dans les processus
de bioremédiation.
Objectif
L’objectif du TP est d’isoler et de sélectionner, par un screening qualitatif, un nombre de bactéries sporulées à
partir du sol et qui sont capables de produire une enzyme protéolytique.

Matériel requis
 Echantillons de sol
 Eau physiologique
 Gélose nutritive contenant 1 % de lait écrémé (pour détecter la protéase)
 Gélose de conservation
 Gélose nutritive
 Tubes stériles
 Cure-dents stériles
 Pipettes graduées stériles
 Pipettes automatiques, embouts stériles
 Etaloire
 Bain-marie 80°C.
 Etuve 37°C
Protocole expérimental
 Dans un tube en verre stérile, ajouter à 1 g de sol préalablement prélevé 10 ml d’eau physiologique
stérile, bien fermer le tube.
 Faire chauffer à 80°C pendant 10 minutes dans un bain-marie.
 Laisser refroidir et réaliser une série de dilution dans l’eau physiologique stérile (jusqu’à 10-6).
 A partir du dernier tube, ensemencer les boites de gélose au lait par étalement.
 Incuber à 37 oC pendant 24 heures ou plus.
 La présence d’une zone d’hydrolyse autour d’une colonie indique la production de la protéase.
 Repiquer et purifier davantage les souches productrices sur de la gélose nutritive et les conserver dans la
gélose de conservation à 4°C.

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Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Microbiologie Appliquée et Sciences Alimentaires
1e année Master Microbiologie Appliquée
Travaux pratiques
Fermentations Industrielles
TP No4 : Screening quantitatif des bactéries sporulées productrices de la protéase
Introduction :
Les protéases hydrolysent les protéines. Les molécules non hydrolysées sont précipitées par le TCA. Les acides
aminés et les peptides simples se trouvent dans la phase soluble (ne se précipitent pas). L'activité est mesurée
par le dosage colorimétrique des groupements de la tyrosine libre à l'aide du réactif de Folin-Ciocalteu.

Objectif :
L’objectif du TP est de sélectionner, à partir des bactéries préalablement isolées, celles qui sont douées d’une
activité protéolytiqueimportante par mesure colorimétrique de l’activité enzymatique.

Matériel requis :
 Les cultures bactériennes préalablement isolées, fraichement préparées sur BN
 Bouillon nutritif
 Erlenmeyers (250ml)
 Bain marie-agitateur ou incubateur-agitateur (37°C).

Courbe étalon
 Solution de tyrosine à 0.01%
 Solution de TCA (Tris-ChloroAcétate) à 4 %
 Réactif du Folin-Ciocalteu dilué à 50%
 Eau distillée
 Solution de Na2CO3 à 2 % dans le NaOH 0,1N
 Pipettes graduées de 1, 2 et 5 ml

Dosage de l’activité enzymatique


 Béchers
 Micropipettes automatiques
 Tampon phosphate/citrate 0,2M, pH 5
 Substrat: solution de caséine à 2,5 % dans le citrate de sodium 0,02M
 Solution de TCA à 4 %
 Solution de Na2CO3 à 2 % dans le NaOH 0,1N
 Réactif du Folin-Ciocalteu dilué à 50%
 Spectrophotomètre UV-visible
 Agitateur vortex
 Tubes à essai
 Centrifugeuse
 Bain marie
 Entonnoir
 Papierfiltre
 pHmètre

I. Fermentation de production
Ensemencer le bouillon nutritif (10%) par les souches bactériennes préalablement choisies pour le screening
secondaire, incuber à 37°C avec agitation modérée pendant 24h.
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II. Courbe d’étalonnage
La gamme étalon est établie à partir d'une solution mère de tyrosine diluée, les concentrations doivent être
exprimées en mg/ml.

Tubes 1 2 3 4 5 6
Solution mère 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
de Tyr (ml)
TCA (ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
Na2CO3 (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Agitation et incubation pendant 10min à T° ambiante
Folindilué a 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
50%

 Après agitation vigoureuse, laisser reposer 30min à température ambiante.


 L'absorbance lue à 750nm permet de tracer la courbe d'étalonnage.

III. Dosage de l’activité enzymatique des cultures bactériennes

Prélever 2 ml de chaque culture, centrifuger, le surnageant servira comme extrait enzymatique.

Etape 1: Préparation du mélange réactionnel

Réactif Essai (ml)


Extraitenzymatique 1
Tampon phosphate 1,5
Substrat (caséine) 2,5
Agiter et placer au bain-marie à 37ºC pendant 30min
TCA 2,5
Laisser reposer 10min à température ambiante
Filtrer

Remarque: La réaction est arrêtée par l'addition du TCA.

Etape 2: Dosage de l'activité enzymatique

Réactif Tube 1 Blanc (ml) Tube 2 essai (ml)


Filtrat - 0,5
TCA 0,5 -
Solution de Na2CO3 2,5 2,5
Réactif de Folin 0,5 0,5
Agiter et laisser reposer 30min, lire l'absorbance à 750nm
 Tracer la courbe d'étalonnage DO= f([Tyr]).
 Etablir un rapport numérique entre la densité optique et la concentration de la tyrosine
 Déduire la concentration correspondante par référence à la courbe étalon de la tyrosine.
 Calculer l'activité de la protéase, sachant que l'activité protéolytique est exprimée en UI et que 1UI= µg
de tyrosine libérée par 1ml de l'extrait enzymatique par heure.
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Travaux pratiques
Fermentations Industrielles

TP No5 : Production de la protéase par cellules immobilisées


I. Préparation des cellules immobilisées

Introduction :
Dès les années 1960 l’idée de fixer les « catalyseurs biologiques » c’està-dire les enzymes d’abord, puis les
micro-organismes a assez rapidementdébouché sur des applications industrielles comme les électrodesà
enzymes fixées (biocapteurs), les bactéries adsorbées en vinaigrerie, ou encore leslits bactériens en dépollution.
Au plan de la théorie, on attend de l’immobilisation des cellules microbiennesles avantages suivants :
• accroître la vitesse de réaction en augmentant le nombre de cellulesprésentes dans le réacteur.
• éviter la perte du micro-organisme en fin de réaction et donc avoir lapossibilité de le réutiliser.
• faciliter la séparation cellules/liquide, ce qui permet soit de mettre finà la réaction au temps voulu soit de
faciliter les opérations de clarificationen fin de réaction.

Objectif :
L’objectif du TP est d’apprendre à immobiliser des cellules bactériennes par extrusion dans un gel d’alginate de
sodium

Matériel requis :
 Culture bactérienne fraichement préparée sur bouillon nutritif
 Solution d’alginate de sodium (1g dans 45 ml d’eau distillée) autoclavée
 Eau physiologique stérile
 Eau distillée
 Solution de chlorure de calcium (CaCl2) 0.05M autoclavée et refroidie au réfrigérateur
 Bain marie-agitateur
 Tubes (centrifugation) stériles
 Becher stérile
 Seringues (2.5 ml)
 Embouts stériles
 Micropipette automatique
 Centrifugeuse
 Vortex
 Agitateur magnétique
 Filtres (Whatman) stériles
 Entonnoir stérile

Protocole expérimental
I. Préparation des cellules bactériennes pour l’immobilisation
 Les cellules bactériennes cultivées dans le bouillon nutritif (50ml) 37°C pendant 24h sont recueillies par
centrifugation (4000 g pendant 3 minutes).
 Le culot contenant les cellules bactériennes est lavé une fois avec de l'eau physiologique et suspendu
dans 5 ml d'eau physiologique stérile.

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II. Immobilisation des cellules bactériennes dans un gel d'alginate de sodium à 2%
 Toutes les opérations doivent être accomplies aseptiquement.
 5 ml de la suspension bactérienne sont mélangés avec 45 ml d'une solution d'alginate de sodium à 2%
préalablement autoclavée, et homogénéisée aseptiquement avec un barreau magnétique.
 Le mélange ainsi obtenu est introduit dans une seringue stérile. La gélification est faite comme suit : la
suspension est coulée en goutte à goutte dans la solution de coagulation CaCl2 (0.05 M) préalablement
autoclavée et refroidie, les billes formées sont ensuite laissées une heure sous une agitation douce afin
de compléter l'échange ionique Na++-Ca++.
 Les billes sont lavées deux fois avec l'eau distillée stérile afin d'éliminer l'excès de calcium.
 Les billes d'alginate de sodium sont maintenues dans du sérum physiologique au réfrigérateur à 4°C
jusqu'à usage ultérieur.

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TP No5 : Production de la protéase par cellules immobilisées


II. Production

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