TIN TEMA 3

TEMA 3 – ANÁLISIS DE RNA: EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓ N,

RT-PCR. HIBRIDACIÓN IN SITU

TIPOS DE RNA

- Ribosómico (rRNA): polimerasa I.

- Mensajero (mRNA): polimerasa II
- Micro RNA (miRNA): polimerasa II
- No codificante largo (lnc RNA): polimerasa II
- Transferente (rRNA): polimerasa III
- Nuclear pequeño (pnRNA): polimerasa III

El RNA en el núcleo se sintetiza a partir de las polimerasas. Los factores de transcripción

(proteínas) cuya misión es reconocer una serie de secuencias específicas para cada uno de
ellos y los promotores de los genes que están en el núcleo y se unen al ADN en virtud de ese
reconocimiento de esas secuencias.

Una vez la RNA polimerasa II se activa y está en su sitio, lee la secuencia de ADN y hace de una
de las hebras (la codificante) hace una copia de ARN. Este ARN madura y se convierte en los
diferentes tipos que existen.

DNA  transcripción  RNA  procesamiento  mRNA

Transcripción y maduración del mRNA:

Los genes tienen porciones:

- Exones: porciones con información codificadora de las proteínas, se mantienen en el

ARN.
- Intrones: región del ADN que forma parte de la transcripción primaria pero son
eliminados del transcrito maduro, previamente a su traducción.

Estos exones están precedidos por una porción que no codifica nada (5’-UTR) y seguidas por
otra zona sin capacidad de traducción (3’-UTR) y ahí está el promotor donde se unirían los
factores de transcripción y el inicio de la transcripción generado por la polimerasa. La
polimerasa hace una copia entera de RNA que incluye las partes codificantes (exones) y partes
entre éstas que no codifican para nada (intrones).

Hay un codón al inicio (AUG) que indica el inicio de la traducción (codifica metionina, en casi
todas las proteínas el primer aminoácido es metionina). Hay otro codón que marca dónde
debe dentenerse la polimerasa (UGA).

RNA heteronuclear. No sirve para sintetizar proteínas. Para dar estabilidad y aportar una serie
de señales importantes para su regulación necesita adquirir una cabruza de metil guanosina
(m7Gp) fundamental para la función del RNA (se degrada sin él). También es necesario que
mediante una polimerasa, se le añada una cola de poli a’s (puede variar mucho en longitud).
Luego se quitan las secciones que no codifican nada (ayuste o ensamblaje; splicing), a través de
unas proteínas que los detectan y los suprimen. La parte que codifica proteínas será sólo
aquella que queda entre el codón de inicio y de fin.

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Extracción de ARN: consideraciones generales :

1. ARN total versus ARNm: la proporción de ARNm es muy pequeña respecto al total de
ARN en la célula.
2. RNasas (enzimas que degradan el RNA):
a. Son ubicuas: están en todas partes. Se degrada enseguida el ARN.
b. Son muy estables: son difíciles de quitar.
c. Son de acción rápida.
d. Son difíciles de inactivar.
3. Precauciones:
a. Uso de guantes
b. Tratamiento de vidrio a 300ºC/4h
c. Dietilpirocarbamato (DEPC) 0.2%: las soluciones que utilizamos deben llevar
agua con DEPC
d. RNasin: para preparaciones de poco volumen, inhiben RNasas

Extracción en Fenol Cloroformo:

- Método basado en Chomczynski y Sacchi:

o Alternativa más fácil y rápida
o Ideal para muestras de pequeño tamaño
o Lisis: isotiocianato de guanidinio (sal con un gran poder de desnaturalización;
enseguida que contacta con la solución desnaturaliza las proteínas, RNasas,
que es lo que queremos), fenol/cloroformo
o Centrifugación (microcentrífuga) 3 fases:
 Fenol: contienen las proteínas
 Interfase: contiene el ADN genómico
 Fase acuosa: contiene el ARN. A partir de ahí se precipita el ARN.
o Transferir ARN y precipitar
- Kit de extracción de ARN total con columnas (membranas de sílice): el ARN se queda
atrapado en el sílice, tras diluirlo con agua.

Comprobación de la integridad de ARN total:

Correr la preparación en un gel de agarosa, si lo vemos en un iluminador transvioleta, se ven

las bandas de ARN

Estabilización de RNA en muestras de tejidos:

- RNA LATER (sulfato amónico): se coge el trozo de tejido, lo disecas y lo metes en el

RNA LATER. Éste confiere mucha estabilidad cuando preparas el tejido. Una vez
tenemos la preparación medimos la cantidad de RNA que tenemos mediante un
espectrofotómetro.

Integridad del RNA en las muestras (Nanodrop):

Te da dos picos del ribosómico que cuantifica cuánto ARN tienes y te da una idea del grado de
pureza de la preparación.

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Purificación del ARNm

Métodos para purificar el mensajero del resto de ARN:

Los mensajeros se pegan a las Oligo-dT celulosa que tienen colas poli T, complementarias a la
cola poli A de los ARNm. Metiendo en la solución esta solución de Oligo-dT, separamos las
bolas de Oligo-dT y nos quedamos el ARNm.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR. Polymerase Chain Reaction)

Polimerasa: enzima que es capaz de, mediante alguna señal, unirse a una hebra de ADN, la lee
y genera una copia de esa misma.

En la PCR: hay una bacteria (enzima) Termophilus Aquaticus (vive en una temperatura óptima
de 72ºC). A partir de una muestra de ADN de doble cadena, si calentamos esa muestra a 90º,
se separan las cadenas, si incubamos la preparación con la polimerasa Taq (Termophilus
Aquaticus) y lo bajamos a 72 grados, esta polimerasa va a hacer una copia de cada una de las
hebras (y así sucesivamente), volvemos a subir a 90º, se generan las 4 hebras, y así
sucesivamente.

Poder de amplificación: 30 ciclos = 10^9. 1 molécula – 1000 millones de cadenas.

Para el ARNm:

- Incubamos el ARN con Oligo-dT

- Añadimos nucleótidos y transcriptasa inversa: actúa como una polimerasa pero lee en
sentido inverso, y convierte el ARN en ADNcomplementario (añade otra hebra).
- Amplificar mediante PCR con polimerasa Taq: a partir de esa hebra podemos realizar
PCR. Diseñamos un par de oligodendronucleótidos que enmarquen en sentido inverso
una región de interés que queramos amplificar. Esos oligodendronucleótidos
reconocen esa secuencia, van a anellarse al ADN en el segmento que hemos diseñado
nosotros y mediante PCR podemos amplificar esa región, que es lo que vamos a
cuantificar.
- Resolver en gel y visualizar.

Termociclador y ciclos de PCR:

La muestra inicial, partiendo de un DNA de doble hebra o de una de las hebras que hemos
sintetizado a partir de nuestra muestra de RNA, calentamos a 94º para separar las hebras. Se
baja la temperatura a 55 para que los primers puedan reconocer las secuencias diana y puedan
unirse a ella. Después subimos la temperatura a la óptima para la Taq y al activarse hace una
copia de cada una de las hebras y empiezan otra vez los ciclos (suelen durar unos 30
segundos).

PCR cuantitativa (o en tiempo real): SYBR Green:

Mediante una señal de fluorescencia te da información en tiempo real de la cantidad de

material que se está sintetizando a consecuencia de la actividad de la sintetasa.

SYBR Green: emite fluorescencia cuando se une a las dobles hebras. La cantidad de
fluorescencia emitida es directamente proporcional al material sintetizado.

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PCR cuantitativa: Sonda TaqMan:

Las sondas son secuencias de ADN que corresponden a la diana que queremos identificaer.
Tienen en un extremo una sustancia que emite fluorescencia y en el otro extremo un
Quencher (sustancia que entra mediante un fenómeno que es el FRED); la energía que tiene
este emisor de fluorescencia es recogida por este Quencher o inhibidor, de manera que en
esta situación no vemos ninguna fluorescencia. Lo metemos en nuestra PCR; cuando la
polimerasa (tienen asociada una actividad nucleasa) empieza a sintetizar, a hacer una copia, se
encuentra con la sonda Quencher, estas polimerasas rompe o degrada aquello que le
“estorba”, de modo que el emisor fluorescente deja de estar influido por el Quencher y emite
fluorescencia.

PCR cuantitativa: cómo se cuantifica.

Se cuantifica el CT (ciclo umbral): el ciclo a partir del cual la fluorescencia emitida por la
reacción pasa un cierto nivel que es detectable. Se le aplica una fórmula y te dice cuánto RNA
hay, lo haces en referencia a un gen que sabes que no varía tanto.

GeNorm: software que mide la cantidad de variabilidad que cada gen tiene en una muestra.

MICRO ARN

ARN muy pequeños (20-22 nucleótidos) que tienen la capacidad de reconocer secuencias de
los ARNm, en su parte reguladora (3’) o cualquier otro sitio, se unen formando parte de un
complejo proteico que recluta proteínas que o bien inhiben su traducción o bien degradan el
ARNm entero. Son reguladores muy potentes de la expresión génica ya que impiden la síntesis
de proteínas a partir del ARNm.

Los microARN están “escondidos” en el genoma, bien en intrones o bien en exones. Se pueden
sintetizar de 2 maneras:

- Porque pueden estar bajo control de su propio promotor.

- Como consecuencia del procesamiento de los splashing (ayuste).

ARNmi canónico:

DNA da lugar a un ARN relativamente grande (pre microARN), que tiene una parte donde está
el microARN. El micro ARN siempre se va a sintetizar a partir de una horquilla que forma la
propia hebra de ARN y es autocomplementaria. Esta primera horquilla es reconocida por un
complejo de dos proteínas importantes: Drosha y DGCR8 (proteínas) reconocen que hay un
ARN y cortan lo que sobra. Da lugar a un pre microARN; esto ocurre en el núcleo. Este ARN es
reconocido por exportinas (proteínas) que exportan el microARN al citoplasma, donde será
procesado algo más. En el citoplasma este ARN se encuentra con dos proteínas más: Dicer
(enzima) que va a quitar la parte de la horquilla que une las dos hebras (proceso = dicing). Una
vez hecho presenta el ARN a otra proteína (argonauta) AGO1-4 (molde donde está el ARN
dentro), las dos hebras se separan y se constituye el ARN.

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ARNmi intrónico

Mientras ocurre el splicing, en esa horquilla se une Drosha y DGCR8 y ocurre lo mismo.

Silenciamiento génico con ARN de interferencia: los metes en un virus y mediante el mismo
mecanismo silencian el gen que quieres silenciar.

Detección de ARNmi:

1. PCR cuantitativa: se añade una cola de poli A’s. Se introduce un Oligo-dT con cola de
poli T’s que se liga (hibrida). Podemos hacer una reacción de transcriptasa inversa que
puede secuenciar al revés. Tenemos un primer complementario que podemos utilizar
o incluso un oligómero universal para amplificar.
2. Array: compramos un soporte donde están todos los microARN y vamos a hacer una
preparación de ARN del tejido que queremos medir y marcamos ese ARN con un
marcador fluorescente y hacemos una hibridación, hibridarán los microARN. [Perfil de
expresión con arrays de cADNs: marcar nuestro RNA preparado y hacemos una
irrigación en los micro RNA que hemos comprado preparados.]

LncRNAs: RNA no codificadores largos:

RNA muy largos que no codifican proteínas.

Pueden estar presentes en la hebra no codificante de genes conocidos o escondidos en

intrones.

Funciones:

- Forman parte de andamiajes sobre los que interaccionan una serie de proteínas
aparentemente sin relación.

HIBRIDACIÓN IN SITU

Es una combinación de las técnicas clásicas de anatomía o histología con las de biología
molecular. Queremos detectar la expresión de un gen mediante la detección de ARN que nos
interesa en un tejido determinado.

Técnicamente, consiste en la utilización de una sonda de un ácido nucleico marcado para

detectar u localizar ARNm específicos en una sección histológica

Sirve para:

- Localización

Diagrama general de la hibridación in situ:

1. Sonda marcada: complementaria al mensajero.

2. Rodaja de tejido en el que se encuentra el mensajero a analizar
3. Señal de hibridación

Es posible localizar un ácido nucleico preservando la estructura tisular y celular que lo

contiene.

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Esquema del procedimiento general. Se realiza en cámaras húmedas para que no sequen el
tejido y la sonda.

a. Síntesis de la sonda
b. Preparación del tejido
c. Prehibridación.
d. Hibridación. A una temperatura dada, normalmente alrededor de los 55ºC
e. Post-hibridación para quitar el exceso de ribosonda y la que se ha unido a sitios que no
debería

Marcajes más usados:

- Radiactivos: son nucleótidos a los que se ha unido un isótopo radiactivo, como el P32,
33 (al día siguiente ya se tienen los resultados), S35 (en una semana se tiene el
resultado) y H3 (ya no se usa porque es muy lento). Características:
o Más sensibles (5-10 veces) que los no radiactivos
o A mayor actividad del isótopo, mayor sensibilidad, menor resolución y menor
tiempo de exposición
o Es imprescindible para experimentos cuantitativos
o Aconsejable para tránscritos poco abundantes
o Coste alto
o Detección
o Mediante exposición a películas
o Mediante recubrimiento con emulsiones fotográficas
- No radiactivos: nucleótidos a los que se ha añadido una molécula antigénica, como la
digoxigenina, fluoresceína o biotina.
o Mayor resolución, resolución celular
o Mayor rapidez en la obtención de los resultados
o El marcaje no decae, y se pueden utilizar sondas marcadas hasta 6 y 8 meses
con la misma resolución
o Fácil manejo y menor coste
o No comporta ningún riesgo para la salud
o Baja sensibilidad
o Detección con técnicas inmunohistoquímicas
- La elección viene determinada por
o Sensibilidad requerida
o Resolución requerida: la mejor es la del tritio o la digoxigenina
o Tipo de información a extraer: si no importa la resolución porque se quiere ver
una zona pero no la célula

Protocolo:

- Síntesis de la ribosonda y marcaje.

- Tratamiento con DNasa.
- Purificación: precipitación con EtOH; resuspensión + RNasin.
- Hibridación: 50-60ºC.
- Post-hibridación: lavado y tratamiento con RNasa.
- Exposición en film o/y emulsión fotográfica: 24h o días.

Objetivos de la hibridación in situ:

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- Localización anatómica: patrón de expresión del gen en estudio.

- Identificación molecular del fenotipo celular.
- Localización de las células que sintetizan una determinada proteína.
- Determinación de la co-expresión de dos ARNm.
- Detección de cambios en la expresión génica.