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Compte rendu du stage de Tp de

Microbiologie

Année 2002-2003

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Préparation des milieux et du matériel

L’étude des bactéries a connu son plein développement à partir du moment où furent mises au point des
méthodes permettant de les cultiver, les isoler, et de les identifier. Ces différentes opérations
nécessitent l’emploi de milieux de culture.

Principales caractéristiques d’un milieu de culture

Les microorganismes doivent trouver dans le milieu de culture et son atmosphère tous les éléments
chimiques les constituant, sous une forme appropriée.
Un bon milieu doit :
 Etre stérile
 Etre nutritif : doit contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigés pour la
croissance et l’entretien des microorganismes.
 Contenir une quantité d’eau suffisante pour permettre le métabolisme bactérien.
 Avoir un pH convenable.
Rq : Un milieu contenant uniquement ce qui est nécessaire aux microorganismes est dit milieu minimum.

Classification des milieux de culture

Les milieux de culture sont classés en fonction de leur composition ou de leur utilisation.
a) Classification selon la composition.
1. Milieux naturels ou empiriques
Milieux complexes de composition mal définie. Leur origine est soit animale (extraits de viande,
peptone), soit végétale (pomme de terre, levure).
2. Milieux synthétiques
Milieux composés de substances chimiques exactement définies
3. Milieux semi synthétiques
Milieux synthétiques additionnés d’un produit naturel
b) Classification selon l’utilisation
1. Milieu usuels = milieu de base
Milieu d’un emploi aussi général que possible. Il n’existe cependant pas de milieu de culture universel
2. Milieu d’isolement
Les milieux d’isolement peuvent être :
 Des milieux de base
 Des milieux enrichis de produits biologiques
 Des milieux électifs : Ce sont des milieux de culture permettant
un développement particulièrement abondant de certains germes.
 Des milieux sélectifs (ou d’enrichissement) : Ce sont des milieux
dans lesquels on incorpore un inhibiteur chimique. Celui-ci,
judicieusement choisi, entrave le développement de la plupart des
bactéries excepté celui de l’espèce recherchée. Ces milieux
permettent donc d’isoler une espèce bactérienne au milieu d’un
mélange de germes.
3. Milieu d’identification
Ces milieux permettent la mise en évidence des caractères biochimiques et donc de résoudre les
problèmes d’identification différentielle qui se posent entre des espèces ou des genres voisins.

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c) Classification selon leur présentation
1. Milieux liquides
Ce sont soit des bouillons nutritifs contenant des produits carnés ou protéiques, soit des solutions
riches en produits synthétiques. Dans les deux cas la gélose est totalement absente.
La croissance microbienne est réalisée dans des tubes, des ballons ou des erlenmeyers. Elle est suivie
par turbidimétrie : un milieu limpide au départ devient de plus en plus trouble lorsqu’un microorganisme
se développe.
2. Milieux solides
Les milieux nutritifs solides peuvent être identiques aux précédents mais ils contiennent de la gélose. Si
il y a plus de 1% d’agar on parle de milieu solide, si il y a moins de 1% d’agar on parle de milieu semi solide.
Ces milieux peuvent être répartis en boîtes de pétri, dans des tubes à gélose molle prise en culot, etc.
La croissance microbienne se déroule en surface ou en profondeur et est suivie par observation de
l’augmentation de la taille des colonies respectivement aérobies et anaérobies. Une cellule initiale se
multiplie et donne une descendance de plusieurs millions d’individus tous identiques, formant une colonie.

Préparation des milieux de culture

Sachant que de la préparation des milieux de culture dépend les résultats de l’analyse microbiologique,
un défaut de fabrication, une stérilisation mal conduite, risquent de perturber le travail. Il faudra donc
apporter un grand soin à leur fabrication.
Les milieux de culture existent aujourd’hui sous trois formes, soit, du plus coûteux au plus économique :
- Le prêt à l’emploi
- Le prêt à couler
- En poudre
Durant ce Tp nous avons essentiellement utiliser des milieux en poudre du fait de leur moindre coût, ce
sont soit un mélange des constituants de base, soit un des éléments de base, dont le fabricant indique la
dose à peser pour un volume final de milieu.
Les différentes étapes de la préparation de ces milieux consistaient en :
- La pesée
- La dissolution des ingrédients
- La mesure du pH
- La répartition
- La stérilisation des milieux (autoclave 121°C pendant 20 min)
Rq : L’agar étant un composé insoluble à froid, il sera incorporé après la dissolution des ingrédients et la
mesure du pH.

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Les milieux utilisés durant ce Tp, leur rôle et leur préparation

Durant ce Tp nous avons utilisé :


Un milieu empirique sous forme solide: Gélose nutritive (GN)
Un milieu empirique sous forme liquide : Bouillon nutritif (BN)
Deux milieux sélectifs : Milieu à l’éosine et bleu de méthylène (EMB), Milieu Malt agar (MA)
De l’eau physiologique

Gélose nutritive (GN):

Relativement simplifiée, sa formulation apporte les éléments nutritifs nécessaires à la croissance d’une
grande variété de germes non exigeants. Elle est utilisée pour la culture et la numération des
microorganismes ne présentant pas d’exigences particulières.
Elle est constituée :
- extrait de levure
- bouillon nutritif (nutrient broth)
- glucose
- agar
Nous avons pesé 20g de BN, 3g d’extrait de levures, 5g de glucose, que nous avons placés dans un erlen
de 2L et auxquels nous avons ajouté 1L d’eau déminéralisée et placé sous agitation avec un barreau
aimanté afin de dissoudre les différents constituants. Nous avons alors vérifié que le pH se situait bien
dans une gamme comprise entre 7 et 7.5. C’est donc après la dissolution des différents éléments du
milieu et ajustage du pH que nous avons incorporé les 15g d’agar. Nous avons alors bouché l’encolure de
l’erlen avec du coton cardé et placé une feuille d’aluminium autour avant de stériliser le milieu à
l’autoclave à 121°c pendant 20 min.

Bouillon nutritif (BN) :

Le bouillon nutritif contient exactement les mêmes constituants que la gélose nutritive, excepté le fait
qu’on n’ajoute pas d’agar puisque c’est un milieu liquide. Il est donc constitué de :
- extrait de levure
- bouillon nutritif (nutrient broth)
- glucose
Sa préparation est identique à celle de la gélose nutritive.

Gélose EMB (éosine methylen bleu) :

La gélose EMB est constituée d’éosine Y et de bleu de méthylène qui sont des agents faiblement
sélectifs. Ils n’inhibent que partiellement le développement des microorganismes gram positifs tels que
les Streptocoques fécaux. De plus ces colorants assurent la différenciation entre les germes lactose
positifs et les germes lactose négatifs, lorsque le milieu est lactosé.
Nous avons pesé 18.75g afin de préparer 500 mL de ce milieu, auxquels nous avons ajouté 500 mL d’eau
déminéralisée. On a alors ajusté le pH à 6.8-7 à l’aide de KOH concentré et stérilisé à 121°c pendant 20
min suivant le même protocole que précédemment.

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Gélose Malt agar :

Elle est constituée :


- extrait de malt
- extrait de levure
- glucose
- agar
Nous avions à notre disposition sous forme de poudre la base du milieu malt agar qui contenait tous les
constituants sauf l’extrait de levure et le glucose. Le fabricant indiquait qu’il fallait peser 45g pour
préparer un litre. Nous voulions préparer 500 mL, nous pesions par conséquent 22.5g sur une feuille
d’aluminium. Nous avons également pesé 1.25g d’extrait de levure et 5g de glucose. Après avoir pesé tous
les constituants nous les avons transférés dans un erlen d’un litre et ajouté 500 mL d’eau déminéralisée.
Nous avons ensuite rajouté 0.25g de Cloramphénicol avant de stériliser à 121°C pendant 20 min.
La sélection des levures se réalise par l’emploi du chloramphénicol

L’eau physiologique :

Elle est obtenue par dissolution de 9g de Chlorure de sodium (NaCl) par litre d’eau distillée. Elle
constitue un milieu isotonique qui permettra la dissolution des microorganismes tout en maintenant la
différence de pression osmotique de part et d’autre de la membrane plasmique évitant ainsi la lyse.

Après stérilisation nous avons procédé à l’étape de répartition des milieux. Nous avons coulé les géloses
de façon stérile à proximité de la flamme du bec Bunzen.

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Familiarisation avec le monde microbien

Les Techniques de préparations microscopiques

L’observation microscopique des microorganismes peut se faire sans coloration ou après coloration.
Dans le premier cas, on examine des individus vivants : on apprécie ainsi la mobilité, la taille, la forme des
germes ; dans un second cas, on précise la forme et on détaille les structures invisibles, par coloration,
après fixation et desséchage des préparations, opérations tuant les germes.

Observation sans coloration : Etat frais

L’observation de l’état frais se réalise à l’objectif x40, le conden seur descendu, et le diaphragme
légèrement fermé. On observe ainsi sur un fond grisâtre des bactéries brillantes. On met à profit la
propriété de réfringence des microorganismes pour les observer vivants.

1) Technique opératoire

La technique opératoire consiste à préparer une lame propre dégraissée et sèche.


Homogénéiser la suspension à observer : prélever aseptiquement à la Pipette Pasteur une goutte de
culture : déposer cette goutte au centre de la lame.
Rq : Si on part d’un produit solide comme une colonie sur une boite de pétri par exemple, on déposera
d’abord une goutte d’eau au centre de la lame et on y suspendra une faible quantité de la colonie à l’aide
de l’ose.
On recouvrira ensuite la goutte d’une lamelle tout en évitant les bulles d’air et les débordements de
liquide au-delà de la zone délimitée par la lamelle.
On observera sur fond clair avec l’objectif 40.

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2) Interprétation

Cette préparation permet d’apprécier :

 Le nombre de bactéries contenues dans le prélèvement ; notion semi quantitative permettant de


dire s’il y a beaucoup ou peu de germes (renseignement utile ultérieurement pour choisir la
quantité d’inoculum convenable pour l’observation d’un bon isolement et d’une bonne culture).

 La forme des bactéries

 Coques ou cocci : éléments arrondis, sphériques.

 Bacilles : bâtonnets : éléments allongés de taille variable.

Bacilles de taille moyenne

Bacilles grêles

Gros bacilles trapus

Bacilles courts et arrondis : coccobacilles

 Le mode d’assemblage de bactéries

Isolés
Groupés par deux : diplocoques
Coques En grappe ( Staphylocoques)
En chaînettes ( Streptocoques)
En longue chaînes
Isolés
En courtes chaînettes
Bacilles
En chaînes
En palissades

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 La mobilité

Les cellules peuvent être mobiles : la présence de cils ( non visibles à l’état frais) favorise le
déplacement qui ne doit pas être confondu avec le mouvement général du liquide ou avec le mouvement
brownien si la température du liquide est trop élevée (du fait de l’éclairage continu).
Un corps microbien est mobile lorsqu’un individu observé traverse le champ du microscope ou lorsque
deux individus se croisent.

Il ne faut pas oublier que dans un échantillon, il y a le plus souvent plusieurs types de bactéries, l’état
frais permet de savoir combien de types différents sont présents. Dans d’autres cas, cette observation
permet de vérifier la pureté d’une culture. Il ne faut jamais oublier que les bactéries sont vivantes.
L’observation de l’état frais est une étape indispensable et très importante, qui apporte de nombreux
renseignements et oriente déjà le diagnostic et permet de passer à l’étape suivante : l’observation de
préparations colorées.

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Observation après coloration

Les observations après coloration se font à l’objectif 100 à l’immersion, le condenseur relevé à fond, et
le diaphragme ouvert entièrement.

Avant tout examen d’un frottis coloré, il faut dans un premier temps réaliser le frottis.

1) Préparation d’un frottis

On dépose une goutte de culture microbienne ou on suspend une colonie dans une goutte d’eau au centre
d’une lame.
On étale la préparation avec l’oese de façon à obtenir une couche mince
On sèche la lame.
On fixe la préparation en écrasant la flamme du bec 2 à 3 fois avec la lame.

2) Colorations

Les colorants simples que l’on emploie sont des colorants acides qui colorent uniformément les cellules,
et des colorants basiques à affinité pour le cytoplasme (fushine, violet de gentiane)

Durant ce Tp nous avons réalisé :

Un examen après coloration différentielle d’un frottis, c’est la coloration de Gram.

2.1) Coloration de Gram

C’est la coloration la plus utilisée en microbiologie car elle permet de distinguer deux grands groupes de
microbes : les Gram + et les Gram -. La distinction est basée sur la différence de structure des parois
mise en évidence par la double coloration.
La lecture se fait avec l’objectif à immersion. La coloration de Gram permet de classer les bactéries en
deux grandes catégories :
- Les bactéries à Gram positif qui gardent la coloration violette après action de l’alcool
- Les bactéries à Gram négatif qui sont décolorées par l’alcool et teintées en rose plus ou moins vif
par la fushine.

Cette distinction, base de toute la taxonomie bactérienne repose sur une variation dans la structure de
la paroi des bactéries. En effet, la richesse en lipides de la paroi des bactéries à Gram négatif permet à
l’alcool de traverser cette paroi et de dissoudre le composé coloré, fixé dans le cytoplasme, résultat de
l’action co njointe du violet de gentiane et du lugol.
Par contre, la paroi des Gram positifs, riche en peptidoglycane et pauvre en lipides est imperméable à
l’alcool et par conséquent garde le complexe coloré violet.

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2.2) La coloration des spores

La coloration de spore permet de mettre en évidence les spores ou endospores, qui constituent les
formes de résistances de deux classes de bactérie :
- Les Bacillus (aérobie)
- Les Clostridie (anaérobie)
La spore est résistante à la chaleur, à la dessiccation, et aux radiations. Afin de la mettre en évidence il
faut réaliser une coloration à chaud faisant intervenir du vert de Malachite, rincer à l’alcool, et faire une
contre coloration à la safranine.

Endospore

Les spores seront colorées en vert et le cytoplasme des bactéries en rose.

2.3) Coloration à la nigrosine :

La nigrosine est un colorant qui peut permettre la mise en évidence des cicatrices des bourgeonnements
des levures. Sinon on l’utilise lors d’état frais pour augmenter le contraste de la préparation.

2.4) Coloration à l’encre de chine :

L’encre de chine est obtenue à partir d’une suspension de particules de charbon. Du fait de la taille
élevée des particules, celles -ci ne pénètrent pas dans la cellule. On observe donc des cellules non
colorées sur un fond noir. Cette technique est une coloration négative, puisqu’on ne colore pas les
cellules, ainsi on peut mettre en évidence la présence de capsules qui apparaissent blanchâtre autour de
la cellule qui elle est réfringente.
La technique consiste à placer sur une lamelle une goutte de la préparation et une goutte de colorant
côte à côte.

Et de déposer dessus une lamelle. Les deux gouttes se mélangeront, et on observera au grossissement
x40.

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Observation d’un mou de raisins

Le mou de raisin est un mélange en solution aqueuse de raisins écrasés. Afin d’observer les différentes
catégories de germes présents, nous avons réaliser des techniques microscopiques d’observation.

Coloration de Coloration à
Technique s
Etat Frais (G x40) Nigrosine (G x 40) spore l’encre de chine
d’observation
(G x100) (G x 40)
On observe des
bactéries et des
On observe des
levures. Les
On observe des bactéries en forme de bactéries roses en
bactéries ne
bâtonnet qui ne possèdent pas de forme de bâtonnet
Observations possèdent pas
mobilité. ne présentant pas
d’halo blanc
On observe également des levures de spores, et des
caractérisant la
levures roses.
présence de
capsule.

On peut donc constater que le raisin possède plusieurs flores microbiennes : une d’origine bactérienne et
l’autre de type levure. Ces deux flores sont nécessaires à la fabrication du vin.

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Observation d’un jus de radis

Coloration de Coloration à
Technique s
Etat Frais (G x40) Nigrosine (G x 40) spore l’encre de chine
d’observation
(G x100) (G x 40)
On observe des protozoaires.
On observe des arthrospores. On observe
Observations
On observe également du quelques capsules.
pseudomycélium.

Sélection des bactéries formants des endospores dans la suspension de radis

Les spores sont des formes de résistances, afin de les mettre en évidence nous allons mettre dans des
conditions de stress un aliquote de notre solution de jus de radis à 90°C pendant 20 min.
Cette étape à pour but de tuer toutes les formes végétatives, et de sélectionner uniquement les formes
sporulantes.
Par étalement sur un milieu GN de notre aliquote chauffé et après incubation, on a obtenu des colonies
correspondantes aux bactéries sporulées.
Nous avons ainsi confirmé la présence de spores et isolé les bactéries sporulantes.

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Etude de 6 souches de collection

Coloratio
Nom de la Aspect Coloration
Coloration à la nigrosine Etat frais Gram n à l’encre oxydase catalase Mobilité
souche macroscopique de spores
de chine
Bâtonnet à bouts carrés Bâtonnet à bouts carrés Exospores
Colonie blanche
1.5µ*4µ 1.5µ*4µ verte
Bacillu s à bord crénelé Bacille violet
Mobilité + ou – Mobilité + ou – et spores - - + +/-
megaterium de 0.5 cm de gram +
par ciliature péritriche par ciliature péritriche déformantes
diamètre
isolé isolé subterminales
Colonie Coque gram
blanche-jaune, + violet,
Micrococcus
ronde, lisse, Petit coque, immobile Petit coque, immobile isolé, par 2, - - + -
flavus
brillante, en amas, ou
diamètre 1mm en tétrade
Bacille Bacille
1µ*5µ 1µ*5µ Bacille a
Waksmania sp - - - -
Isolé Isolé gram variable
Courte chaînette Courte chaînette
Petite colonie
Bâtonnet ovoïde, groupé par 2 ou Bacille rose
Serratia ronde, bombée Bâtonnet ovoïde, groupé par 2 ou isolé
isolé Gram – - - +++
marcescens pigmentée en Taille : 1-3µ
Taille : 1-3µ Isolé ou par 2
rose
Colonie lisse,
1.5 mm de
diamètre, Petit bâtonnet ovoïde de forme Petit bâtonnet ovoïde de forme
Coccobacille
Escherichia rondes, coccobacille coccobacille
rose gram- - - -
coli bombées, bord Isolé, par 2 Isolé, par 2
Isolé, par 2
réguliers, Taille : 1µ Taille : 1µ
luisantes,
jaunâtres
Grande colonie
plates de 2 à 3
mm de
Petit bâtonnet Petit bâtonnet Bacille rose
Pseudomonas diamètre,
Isolé, par 2 Isolé, par 2 Gram – - + ++ +
aeruginosa transparente,
Taille : 5µ Taille : 5µ Isolé, par 2
bords frangés,
aspect irisé,
nacré

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Réalisation d’une courbe de croissance

La croissance est définie comme l’accroissement ordonné de tous les composants d’un organisme.
Chez les micro-organismes unicellulaires comme les bactéries ou les levures, elle aboutit à une
augmentation du nombre d’individus résultant d’une division cellulaire. Cet accroissement est donc
synonyme de multiplication, puisque au bout d’un temps correspondant au temps de génération, une
bactérie peut donner naissance à deux nouvelles bactéries. Parallèlement, cette croissance se
traduit par un appauvrissement en divers métabolites, et par l’accumulation de déchets entraînant
la mort des cellules.
Afin d’étudier la croissance, nous avons évalué le nombre de cellules en mesurant le trouble.
C’est le procédé le plus simple et le plus rapide. C’est une méthode optique générale, appelée
turbidimétrie, fondée sur la propriété que présente toutes les solutions d’absorber une partie de
l’intensité d’un faisceau de lumière qui la traverse. Cette propriété est basée sur la loi de Beer
Lambert ou log (I0/I) =  .l.c. Il en découle que l’absorbance est proportionnelle à la concentration.
Cependant cette loi n’est plus valable aux fortes concentrations, c’est pour cela que nous avons
dilué nos échantillons lorsque la DO dépassait les 0.8. L’inconvénient de cette technique c’est
qu’elle est incapable de différencier les cellules mortes des cellules vivantes et de mesurer des
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concentrations microbiennes inférieurs à 10 bactéries/mL.
C’est pour cela que nous avons réalisé une préculture en milieu BN 24h auparavant. Celle-ci avait
pour but d’obtenir une culture jeune avec un fort inoculum, et aussi d’habituer la souche au milieu
de culture, permettant ainsi de diminuer la phase de latence qui correspond au temps d’adaptation
de la bactérie.

Nous avons réalisé des courbes de croissance sur deux souches différentes :
Un coque gram + : Micrococcus flavus
Un bacille gram - : Escherichia coli

Les courbes ont été obtenues en traçant l’évolution de la densité optique en fonction du temps,
toutes les 30 minutes environ. La croissance est constituée de différentes phases, dont la phase
exponentielle de croissance. Durant cette phase l’absorbance, donc le nombre de cellules,
augmente de façon exponentielle et ln (nb cellules) est proportionnel au temps.
Cette phase permet de déterminer deux paramètres :
- Le temps de génération
- Le taux de croissance népérien

C’est ces paramètres que nous allons calculer ; ce sont des caractères propres à chaque espèce.
Nous allons utiliser du papier semi-log ce qui permettra de reporter directement les valeurs de
DO, tout en linéarisant la phase exponentielle de croissance.

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Explication des différentes phases de la croissance

On a remarqué que si on représente la fonction ln N = f (t), on obtient une zone linéaire pendant la
phase où N augmente (phase exponentielle de croissance).

Valeur de µ x
(vitesse spécifique
Phase Description
de croissance) en
h-1
Elle est facultative. Quand elle existe, elle correspond à une phase d'adaptation
des bactéries au milieu. Les bactéries ne se divisent pas (ou trop peu pour
µx = 0
Phase de mesurer la variation). Elle est absente quand l'inoculum est jeune et que le
latence milieu est le même que le précédent. Cette phase correspond au temps
(ln N = ln N o)
nécessaire aux bactéries pour synthétiser les enzymes nécessaires pour
dégrader le milieu et pour ajuster certains paramètres comme le pH.
Phase
Les bactéries se multiplient de plus en plus activement µx ↑ (G↓)
d'accélération

Les bactéries se multiplient à leur rythme le plus élevé. Le ln de N est


Phase directement proportionnel eu temps. C'est la phase physiologique (production
exponentielle d'antibiotiques et de toxines. La représentation est une droite d'équation : µx = µmax
de croissance

Phase de Lorsque les nutriments se raréfient, la croissance ralentit, le phénomène


µx ↓et tend vers 0
ralentissement s'accentue plus les nutrime nts se raréfient.
La biomasse est stable. Deux explications sont envisageables :
- Les bactéries ne se divisent plus ;
Phase
- Il y a autant de bactéries qui se divisent que de bactéries qui meurent. µx = 0
stationnaire
Elle peut être due à la disparition d'un ou plusieurs nutriments, à l'acidification
du milieu et, ou surtout à l'accumulation de déchets toxiques.
Phase de Les bactéries ne se divisent plus, certaines meurent et sont lysées. Leur nombre
µx < 0
déclin N diminue.

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Temps de génération :
Le temps de génération (en min) est le temps de doublement de la population bactérienne, c'est
l'intervalle de temps compris entre 2 divisions bactériennes en phase exponentielle..

Taux de croissance :

1) Escherichia coli :

1.1) Préculture :

Un jour avant de réaliser notre courbe de croissance, nous avons ensemencé 2 mL de bouillon BN
à l’aide d’un clone de la bactérie. Nous avons mis le tube à incuber sous agitation au bain marie
pendant la nuit à 30°C.

1.2) Expérience :

Dans un premier temps nous avons étalonné le spectrophotomètre.


Nous avons donc transféré dans une cuve 1mL du milieu BN restant contenu dans notre flacon, et
nous avons étalonné le spectrophotomètre.

Ensemencement

Préalablement nous avons mesurer la Do à 600 nm afin d’avoir une estimation de la concentration
de l’inoculum. On veut obtenir une absorbance inférieure à 0.1 dans notre Bouillon nutritif de 100
mL au temps t=0 initial.
Préalablement j’ai dilué la culture au 1/20ème (50 L dans un volume final de 1000µL), ce qui a donné
une DO de 0.395 pour 1mL soit une DO de 7.9 pour l’échantillon non dilué.
1 ml de la culture dans les 100 mL de bouillon nutritif donnerait donc une Do de 0.08.
On a donc inoculé les 100 ml de milieu BN à l’aide de 1mL de la préculture. On a laissé la pipette
cotonnée qui nous a servi à l’inoculation dans l’erlen en la callant avec le coton cardé. On agite la
solution pour l’homogénéiser et on prélève 1 mL pour réaliser la mesure de l’absorbance au temps
t=0. On replace alors l’erlen sous agitation au bain marie à 30°C, c’est le temps zéro de
l’expérience.

Mesure de la croissance :

Toutes les 30 minutes, on prélève 1 mL de la culture en cours afin de suivre l’évolution de


l’absorbance et tracer la courbe de croissance.

Rq : On a toujours utilisé la même cuve pour faire les mesures qu’on a rincé entre temps à l’eau.

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Résultats :

DO avec
Temps Dilution DO
Dilution
0 Aucune 0,122 0,122
30 Aucune 0,125 0,125
60 Aucune 0,163 0,163
90 Aucune 0,213 0,213
120 Aucune 0,28 0,28
150 Aucune 0,364 0,364
180 Aucune 0,516 0,516
210 Aucune 0,798 0,798
240 ½ 0.5 1
270 ½ 0.595 1,19
300 ½ 0.715 1,43

On a dilué à partir du temps t=240 min, car le spectrophotomètre ne donne plus de réponse
linéaire au-delà d’une absorbance de 0.8, ainsi que la loi de Beer Lambert qui n’est plus valable.

2) Calcul des différents paramètres de la croissance

Nom de la souche Temps de génération (min) Taux de croissance (min-1)


Escherichia coli 75 0.009min-1 0.54 h-1

On a pu constater sur le graphique une augmentation de l’absorbance au temps t= 3h et ensuite


une diminution au temps t= 3h30. Ce changement correspond à une élévation de température et un
retour à la température initiale, on est passé de 28°C à 30°C puis on est retourné à 28°C. De ce
fait on a pu voir que le temps de génération n’est une constante pour un germe donné que dans des
conditions données.
Le temps de génération est différent pour chaque microorganisme. On peut s’en servir pour
obtenir un nombre de cellules à un temps donné.

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Etude microbiologique de produits

L’étude microbiologique d’un produit à pour but de mettre en évidence et de dénombrer les
microorganismes présents, comme les bactéries, les levures, ou les moisissures par l’utilisation de
milieux sélectifs adéquats. Par la suite, l’étude des caractères biochimiques permettra
éventuellement de caractériser ces microorganismes.
Les microorganismes contenus à l’intérieur du produit à analyser doivent être extraits puis
ensemencés en milieu solide ou liquide. Le choix des milieux et des conditions de culture
(température) est important et l’utilisation de plusieurs milieux sélectifs permettra d’isoler
l’ensemble de la flore microbienne.
On utilisera donc pour la recherche des bactéries, le milieu GN.
La recherche des entérobactéries se fera sur milieu sélectif au pH neutre : EMB
La recherche des levures et moisissures se fera sur milieu complexe sélectif au pH acide :
Ma+chloramphénicol.
L’extraction des microorganismes du produit à analyser devra être adaptée au type de produit à
analyser. Pour un produit solide comme la terre, un broyat en présence d’un solvant facilitant la
dispersion des cellules (eau physiologique) a été réalisé. Pour le lait, milieu liquide, aucun
traitement particulier n’a été nécessaire.

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1 Analyse microbiologique et dénombrement d’un échantillon de sol

Extraction et analyse microbiologique d’un échantillon de sol

1) Prélèvement
Afin de déterminer la flore présente dans le sol, nous allons prélever de façon le plus stérilement
possible, un échantillon de terre afin de limiter l’apport d’autres contaminants. On veillera à
prélever une masse supérieure à 10g. Puisque par la suite nous aurons besoin de deux fois 5g de
terre, une pour déterminer le poids sec, l’autre pour déterminer la flore présente.

2) Extraction
A partir de cet échantillon, nous allons peser deux fois 5g de terre. Le contenu de la première
pesée sera placé dans un bêcher et placé au four pasteur pendant 6h à 180°C afin de déterminer le
poids sec. Le contenu de la deuxième pesée est placé dans un mortier en présence de 30 mL de
solution d’extraction (eau physiologique). L’eau physiologique constitue un milieu isotonique qui
empêche la lyse des cellules, en maintenant une pression constante de part et d’autre de la cellule.
On broie alors à l’aide d’un pilon le produit, puis on transvase dans un tube gradué de 50mL.
L’ensemble de l’étape d’extraction se réalise dans des conditions stériles autour du bec bunsen
avec du matériel stérile. Le pilon et le mortier sont rincés avec la solution d’extraction afin de
récupérer toute la terre présente. Puis le tube est complété à 50 mL avec la solution d’extraction.
Nous étant trompé notre volume final était de 53 mL .L’échantillon est homogénéisé au vortex puis
on laisse reposer pendant 15 min.

3) Calcul du poids sec


Après avoir mis dans un bêcher un poids connu et précis de terre. On place celui ci au four pasteur
pendant un temps minimum de 6h. Ainsi on s’affranchira du taux d’hydratation de la terre qui
varie en fonction des conditions atmosphériques et du lieu de prélèvement. Ceci est nécessaire
pour comparer des échantillons prélevés à des lieux différents, puisqu’on ne prend plus en compte
que la masse de la terre sèche.
Masse du bêcher 46.73g
Masse terre humide = 4.97g
Masse du bêcher + terre humide 51.70g
Masse bêcher + terre sèche 47.99
Masse terre sèche = 51.7-47.99=3.71g
On dispose donc de 3.71g de terre sèche.
Il y avait donc ((4.97-3.71)/4.97)x100=25% d’humidité dans la terre.
Pour la suite des calculs on considèrera que la masse de terre humide était de 5g.

4) Dilutions
-1 -9
Les microorganismes en suspension sont dilués en cascade de 10 à 10 . Le transfert de 1mL de la
er
suspension préparée précédemment dans le 1 tube contenant 9 mL de solution de dilution
-1
constitue la dilution 10 . On homogénéisera à l’aide d’un vortex et on procédera de la même
-1
manière, en prélevant 1 mL dans le tube 10 pour le transférer dans le tube 2, on homogénéise, et
ainsi de suite.

19
5) Ensemencement
A partir des dilutions, les microorganismes dilués sont étalés sur boîtes de milieu nutritifs et
inoculés en milieu nutritif liquide.

6) Dénombrement
Afin de déterminer le nombre de microorganismes contenus dans notre échantillon de terre, nous
allons utiliser deux techniques de dénombrement :
Une technique de comptage sur boite
Une technique statistique : le test de Mac Grady faisant intervenir un paramètre : le MPN (most
popular number) ou NPP (nombre le plus probable)
6.1) Comptage sur boite
Afin de dénombrer des microorganismes sur milieu solide, il faut considérer que chaque colonie
ou clone visible correspond à un microorganisme déposé sur la boîte lors de l’étalement. Vue que
certains microorganismes peuvent être pluricellulaire, on ne peut considérer que chaque clone
provient d’une seule cellule originelle. On utilise donc le terme d’UFC (unité formant colonie) pour
rapporter le résultat obtenu
On réalisera donc des étalements en surface de 0.1mL des différentes dilutions précédemment
préparées, en inoculant 3 boîtes par dilution.
Un nombre trop faible ou trop important de colonies sur une boîte n’étant pas statistiquement
fiable, seules les boîtes contenant entre 30 et 300 colonies seront prises en comptes.
Le milieu MA va servir à la multiplication des champignons
Le milieu GN va servir à une multiplication non sélective des bactéries
Le milieu EMB va servir à la présélection de notre souche isolée d’entérobactérie

Milieu MA

Dilution 10-3 10-4 10-5


Boîte 1 0 0 0
Boîte 2 1 0 0
Boîte 3 3 0 0
Moyenne 1.33

Afin d’avoir un nombre statistiquement correct, on considère un nombre comptable entre 30 et


300 colonies. On prendra donc pour le calcul la dilution 10 -3 qui donne un nombre de 1.33 colonies.
Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent :
N = 1.33 x 10 3 x 10 = 1.33 x 104 UFC/mL dans le sol. Ces germes correspondraient aux levures.

Milieu GN

Dilution 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9


Boîte 1 1 0 0 0 0
Boîte 2 1 0 0 0 0
Boîte 3 0 0 0 0 0
Moyenne 0.75

-5
La dilution 10 donne un nombre de 0.75 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque
dilution sur le milieu, il a donc par conséquent :
N = 0.75 x 10 5 x 10 = 7.5 x 105 bactéries/mL dans le sol.
Il y aurait donc 7.5 x 105 bactéries, toutes flores confondues, dans un mL de suspension de terre.

20
Milieu EMB

Dilution 10-2 10-3 10-4


Boîte 1 84 6 0
Boîte 2 111 13 0
Boîte 3 105 10 1
Moyenne 100 10

Afin d’avoir un nombre statistiquement correct, on considère un nombre comptable entre 30 et


-2
300 colonies. La dilution 10 donne un nombre de 100 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de
chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent :
2 5
N = 100 x 10 x 10 = 1 x 10 bactéries/mL dans le sol. Ces germes correspondraient aux
Entérobactéries.

6.2) Test de Mac Grady (NPP: technique du nombre le plus probable)

Une utilisation de l’analyse statistique peut être faite pour obtenir des résultats plus précis en
milieu liquide. Cette technique utilise trois essais par dilution. C’est la méthode du nombre le plus
probable (NPP), dérivée des études de Mac Grady, qui consiste à interpréter les résultats en
comparant les trois essais et leurs résultats. Il s’agit d’une interprétation probabiliste.
Après incubation des tubes, on notera pour chaque essai si le résultat est positif ou négatif.
Et, à chaque dilution, on affectera un chiffre égal au nombre de tubes positifs.
On groupe ensuite en nombre de 3 chiffres la suite de chiffres obtenue, en commençant par le
chiffre obtenu pour la plus faible dilution.

Dilution 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9


Tube 1 + + + - - -
Tube 2 + + - - - -
Tube 3 + - - - - -
Nb de tube + 3 2 1 0 0 0

Ici nous obtenons les nombres : 321 210 100


On choisi le nombre le plus grand possible et si possible inférieur à 330 (car cela correspond à une
meilleure répartition dans les dilutions).

Pour l’échantillon de sol le nombre significatif est 321 pour la dilution 10 -4.
On lit la valeur correspondante n dans la table, on obtient un NPP de 15
La concentration de bactérie dans notre échantillon de sol est:

-4 5 4
Nb bactérie = (n/10 )= 1.5 x 10 bactéries/mL de la dilution 10-
On départ on avait 53 mL dans lesquels on à prélevé 0.5 mL, ce qui correspond à :
5 7
(1.5 x 10 x 53)/0.5 = 1.59 10 bactéries/ml
Dans nos 53ml de départ, il y avait 5g de terre humide soit 3.71g de terre sèche. Le nombre de
bactérie par gramme de terre sèche est :
7 6
1.59 10 / 3.71 = 4.28 10 bactéries / gramme de terre sèche.
6
Notre échantillon de sol à une concentration en bactérie de 4.28 10 bactéries/ gramme de terre
sèche.

21
2 Analyse microbiologique et dénombrement d’un échantillon de lait cru

1) Dilutions

Nous avons préparé une gamme de dilution en NaCl 0.9% de 10 -1 à 10-4. Pour cela nous avons placé
au préalable 4.5 mL de NaCl dans chaque tube. Nous avons homogénéiser l’échantillon de lait cru,
prélever 0.5 mL et dilué dans le tube 1 (10 -1). Nous avons bien homogénéisé entre chaque
prélèvement, et transvaser 0.5 mL du tube 1 vers le tube 2. Nous avons répété cette opération
jusqu’au tube 4 (10-4) en réalisant une dilution en cascade de 10 en 10.

2) Enrichissement/sélection

-2 -4
A partir des dilutions 10 à 10 , nous allons procéder à l’étape d’enrichissement sélection grâce
à l’utilisation de milieux sélectifs. Pour cela nous allons inoculer 0.1 mL sur les milieux GN MA
EMB, en utilisant trois boîtes par dilution.

3) Comptage sur boite

Afin de dénombrer des microorganismes sur milieu solide, il faut considérer que chaque colonie
ou clone visible correspond à un microorganisme déposé sur la boîte lors de l’étalement. Vue que
certains microorganismes peuvent être pluricellulaire, on ne peut considérer que chaque clone
provient d’une seule cellule originelle. On utilise donc le terme d’UFC (unité formant colonie) pour
rapporter le résultat obtenu
Un nombre trop faible ou trop important de colonies sur une boîte n’étant pas statistiquement
fiable, seules les boîtes contenant entre 30 et 300 colonies seront prises en comptes

4) Résultats

Milieu MA (Sélection des champignons)

Dilution 10-2 10-3 10-4


Boîte 1 164 20 0
Boîte 2 180 8 0
Boîte 3 198 11 12
Moyenne 181 13 4

Afin d’avoir un nombre statistiquement correct, on considère un nombre comptable entre 30 et


300 colonies. On prendra donc pour le calcul la dilution 10 -2 qui donne un nombre de 181 colonies.
Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent :
2 4
N = 181 x 10 x 10 = 1.81 x 10 UFC/mL dans le lait cru. Ces germes correspondraient aux levures.

22
Milieu GN (développement non sélectif de la totalité de la flore)

Dilution 10-2 10-3 10-4


Boîte 1 inc inc 276
Boîte 2 inc inc 262
Boîte 3 inc inc 300
Moyenne inc inc 280

-4
La dilution 10 donne un nombre de 280 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque
dilution sur le milieu, il a donc par conséquent :
4 7
N = 280 x 10 x 10 = 2.8 x 10 bactéries/mL dans le lait cru.
7
Il y aurait donc 2.8 x 10 bactéries, toutes flores confondues, dans un mL de ce lait cru.

Milieu EMB (développement sélectif du genre Entérobactérie)

Dilution 10-2 10-3 10-4


Boîte 1 inc 444 Pb
Boîte 2 inc Pb Pb
Boîte 3 inc Pb Pb
Moyenne inc 444 Pb

-3
La dilution 10 donne un nombre de 444 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque
dilution sur le milieu, il a donc par conséquent :
3 6
N = 444 x 10 x 10 = 4.44 x 10 bactéries/mL dans le lait cru. Ces germes correspondraient aux
Entérobactéries.

23
Identification d’un bacille gram – oxydase – Réf : lait 2

Origine : lait
Isolement à partir de EMB

Vérification du genre Enterobacteriacea


a) Négrosine
La coloration à la nigrosine a pu mettre en évidence la forme bacillaire de la bactérie.
b) Coloration de Gram
On a observé des bacilles roses gram -.
c) Encre de Chine
La coloration à l’encre de chine n’a pas révélé la présence de capsule.
d) Oxydase
La bactérie ne possède pas l’oxydase.

Tous ces tests confirment bien la présence d’une Entérobactérie

Vérification du type fermentaire : Hugh et Leifson

Les entérobactéries dégradent les oses, en particulier le glucose, par voie fermentaire en
produisant des acides organiques. Pour mettre en évidence la fermentation d’un sucre, il suffit
donc de rechercher la variation de pH du milieu grâce à un indicateur coloré.
Grâce au milieu Hugh Leifson, nous allons étudier la voie d’attaque du glucose.
Ce milieu, faiblement peptoné, contient du glucose à la concentration de 1% et du bleu de
bromothymol comme indicateur de pH. Il est présenté en culot, du fait de sa consistance molle.
Après régénération (élimination de l’O2 dissous par passage au bain marie) et refroidissement, on
a ensemencé par piqûre centrale 2 tubes en parallèle :
- un tube est recouvert d’huile minérale, il est dit fermé :F
- l’autre est laissé au contact de l’air : il est dit ouvert :O
Les résultats obtenus permettent de distinguer plusieurs catégories de bactéries.
Bactéries acidifiant le milieu :
- acidification dans les deux tubes : bactéries fermentatives.
- acidification en surface dans le tube ouvert : bactéries oxydatives.
Bactéries ne modifiant pas le pH du milieu : bactéries inactives.

«F» «O»
«F» «O » «F» «O»

Culture et virage au Culture et virage au jaune en Peu ou pas de culture en


jaune en « O » et « F » surface dans « O » seul « F », culture en « O » mais
pas de virage

24
Détermination de la sensibilité de la bactérie aux antibiotiques

1) Définition
Antibiotique :
C’est une substance chimique produite par un microorganisme qui est capable d’inhiber la
croissance (bactériostase) ou de tuer (bactéricide) certaines bactéries. De nombreux
antibiotiques sont susceptibles d’être obtenus par synthèse, de ce fait, la discrimination entre
antiseptique et antibiotique repose essentiellement sur leur mode d’action :
Un antibiotique est électif, dirigé uniquement contre les bactéries, agit rapidement et à faible
dose. Alors qu’un antiseptique est global, détruisant à la fois les germes et les cellules
vivantes.

2) Antibiotiques utilisés et leurs cibles

Les agents antimicrobiens peuvent être classés en familles d’après leur origine, leur spectre
d’action, leur mode d’action.

25
Durant ce Tp nous avons testé trois antibiotiques :
- Tétracycline
- Ampicilline
- Pénicilline
Ces trois antibiotiques ont des cibles différentes :

 Antibiotiques inhibiteurs de la synthèse protéique :


Différentes classes d'antibiotiques agissent en interférant avec la synthèse protéique
bactérienne, et ce, au niveau de l'une des trois étapes principales de la traduction :

- l'initiation
- l'élongation
- la terminaison

Les ribosomes procaryotes présentent un coefficient de sédimentation de 70S (50S pour


la sous-unité lourde et 30S pour la sous-unité légère). La sous-unité 50S comporte les ARN
ribosomaux (ARNr) 5S et 23S alors que la sous-unité 30S intègre l'ARNr 16S (impliqué
dans la reconnaissance de la séquence de Shine-Delgarno de l'ARN messager, aboutissant à
l'initiation de la traduction).
Les tétracyclines sont des antibiotiques isolés de souches de Streptomyces , et aujourd'hui
obtenus par hémisynthèse. Les tétracyclines inhibent la synthèse protéique en empêchant
la liaison de l'aminoacyl-ARNt à la sous unité 30 S du ribosome bactérien. Ce sont des
composés bactériostatiques à très large spectre. Néanmoins, leur usage est aujourd'hui
limité par l'émergence de résistances. Les tétracyclines doivent leur nom à leur structure
tétracyclique commune (noyau naphtacène-carboxamide), sur laquelle viennent se greffer
des substituants au niveau des positions indiquées par un astérisque dans la figure ci-
dessous.

Tétracycline hydrochlorure (masse moléculaire : 480,9)

26
Les -Lactamines :

Les -lactamines sont des inhibiteurs de la synthèse de la paroi bactérienne. Ces composés
n'agissent donc que sur des bactéries se multipliant activement. Durant ce Tp, nous avons utilisé
deux lactamines :
- La pénicilline
- L’ampicilline

 La pénicilline appartient à la famille des lactamines. Lorsque les bactéries gram+ ou gram-
sont en croissance et traitées par des pénicillines, la synthèse de leur paroi est stoppée.
On peut observer que les cellules s’accroissent mais que la paroi diminue progressivement.
La pression osmotique augmente à l’intérieur de la cellule, qui finit par éclater. Au niveau
du peptidoglycane les pénicillines empêchent l’incorporation des peptides dans les chaînes
polysaccharidiques de la paroi. Il se forme alors un complexe non fonctionnel [peptidase-
pénicilline]. La pénicilline empêche la construction de la paroi en bloquant deux enzymes :
Transpeptidases qui a pour rôle de faire rentrer les tétrapeptides Carboxypeptidase, qui
décroche la 2ème D-Ala.

 L’ampicilline est aussi appelée aminopénicilline. Elle appartient également à la famille des 
lactamines comme la pénicilline, et possède le même mode d’action. Elle arrête le processus
de transpeptidation qui lie les peptidoglycannes de la paroi bactérienne. Les bêta
lactamines se lient et inactivent des cibles enzymatiques situées sur la paroi interne de la
membrane bactérienne: les protéines de liaison des pénicillines : transpeptidases,
carboxypeptidases, endopeptidases. Les bêta lactamines inactivent également des
inhibiteurs endogènes des autolysines bactériennes.

27
3) Antibiogramme par la méthode des disques

L’antibiogramme est l’examen de pratique courante qui permet d’étudier commodément sur une
souche bactérienne l’activité bactériostatique d’antibiotique choisi en fonction de leur spectre
d’activité et d’apprécier les résistances acquises.

Principe :

La culture bactérienne est réalisée à la surface d’une gélose GN. Des disques préimprégnés d’une
dose connue d’antibiotique sont déposés à la surface de la gélose. L’antibiotique diffuse
horizontalement et verticalement à partir du disque en créant un gradient de concentration
minima inhibitrice. Les caractères de sensibilité ou de résistance de la souche bactérienne en
seront déduits.
La mesure du diamètre de la zone d’inhibition de la bactérie peut être reliée à la concentration de
l’antibiotique à ce niveau : cette concentration est la concentration minima inhibitrice ou CMI de la
souche pour cet antibiotique.

Technique de l’antibiogramme :

Les différentes étapes de la réalisation de l’antibiogramme sont standardisées ;


Il y a l’ensemencement : on verse 0.2 mL à la surface du milieu qu’on réparti a l’aide d’un râteau ou
de billes de verre. On laisse sécher les boîtes
Ensuite nous appliquons les disques : Les disques ne doivent pas être trop près les uns des autres,
et ils ne doivent pas être déplacés une fois posés. On veillera à ne pas les chauffer avec la pince
flambée.
Il faut en dernier lieu qu’il y ait prédiffusion avant d’incuber la boîte : on laisse les boîtes à
température ambiante, puis on les incubent 18h à l’étuve à 37°C.

Lectures et interprétation :

Aux diamètres mesurés autour du disque, permettant l’estimation de la CMI, on peut associer les
diamètres critiques eux-mêmes correspondant à deux concentrations critiques, concentration
critique supérieure et concentration critique inférieure. La comparaison de la CMI aux deux
concentrations critiques permet de déterminer le caractère sensible (S), intermédiaire (I) ou
résistant R de la souche. La comparaison des diamètres permettra la même opération :
- diamètre d’inhibition (correspondant à la CMI) > diamètre de la concentration critique
inférieure  souche sensible S
- diamètre d’inhibition < diamètre de la concentration critique supérieure : souche résistante
- diamètre d’inhibition compris entre les deux diamètres des concentrations critiques :
souche intermédiaire.

mm


CMI mg/L

S I R
Concentration Concentration
critique inférieure critique supérieure

28
Résultats :

Diamètre Interprétation
Nom de Interprétation
Sigle de l’ATB d’inhibition Par rapport au Résultat
l’antibiotique CMI
(mm) diamètre
TE Tétracycline 20 > 19 CMI < 4mg/L S
AM Ampicilline Pas de halo R
P Pénicilline Pas de halo R

Schéma explicatif pour la tétracycline :


19 17
mm

S I R

CMI mg/L

4 8

29
4) Détermination de la CMI, méthode en tubes

4.1) Définition de la CMI

La CMI est la concentration minimale inhibitrice. C’est, pour un temps donné d’application de
l’antibiotique, la concentration la plus faible en antibiotique pour laquelle on n’observe aucune
croissance (µ x= 0).

4.2) Principe de la détermination de la CMI

Il consiste à placer dans un même inoculum de la souche à étudier (présentée en tubes), des
concentrations croissantes d’antibiotiques selon une progression d’ordre 2 et en présence d’un
témoin sans antibiotique. Les tubes sont incubés à 37 °C pendant 24 H la concentration du premier
tube ne présentant pas de culture correspond à la CMI.

4.3) Schéma montrant la préparation de la galerie de dilution et l’ensemencement de dilution et


l’ensemencement de la gamme

Afin de déterminer la CMI (concentration minima inhibitrice), nous allons réaliser une gamme de
dilution de l’antibiotique.

On va donc préparer 10 tubes

- tube 2 à 9 contenant 5 mL de milieu BN


- Tube 1 contenant 10 mL de milieu BN
- Rien dans le tube 10

Dans le tube 1, nous allons rajouter de la tétracycline afin d’avoir une concentration finale de 150
µg/mL. Pour cela, on dispose d’une solution initiale à 10 mg/ml.

CiVi = CfVf  Vi = (CfVf)/Vi

Ci : concentration initiale en ATB : 10 mg/mL

Cf : concentration finale en ATB 150 µg/mL

Vf : volume du tube : 10 mL

Vi : volume de solution mère à prélever

-6 -3
Vi = (150.10 x 10) / (10.10 )= 0.15 mL soit 150 µL

Il faudra donc introduire 150 µL de la solution mère d’antibiotique dans le tube 1 afin d’obtenir une
concentration de150 µg/mL.

Ensuite, il sera réalisé une dilution géométrique de raison 2 de l’antibiotique. Nous prélèverons
après homogénéisation 5 mL du tube 1 que nous transvaserons dans le tube 2. Cette étape sera
répétée jusqu’au tube 10.

30
Ce n’est qu’après dilution de l’antibiotique que nous allons incorporer la bactérie.

Tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
[ATB]
150 75 37.5 18.75 9.375 4.6875 2.34375 1.171875 0.5859375 0.5859375
µg/mL
Résultat - - - - + + + + + +

Absence de culture : -

Présence d’une culture : +

La présence ou l’absence de culture se traduit par la présence ou non d’un trouble due à un
développement bactérien.

-1
4.4) Lecture de la galerie (représentation, détermination de la CMI en µg.mL )

Témoin - - - - + + + + + +

Le tube contenant 18.75 µg/mL est le premier ne présentant pas de culture, pour notre souche la
concentration minimale inhibitrice est de 18.75 µg/mL.

31
5) DETERMINATION DE LA CMB

5.1) Définition de la CMB

La CMB est la concentration minimale bactéricide. C’est pour un temps donné la plus faible
concentration pour laquelle le nombre de bactéries survivante est inférieur à 1/10 000 (ou 0,01%).

5.2) Schéma de la technique de détermination de la CMB

Afin de déterminer la CMB : concentration minima bactéricide, nous allons étaler une goutte de
nos tubes 1 à 6 qui ont servi à réaliser le test de la CMI. Afin de vérifier que lorsque il n’y a plus
de trouble, cela signifie qu’il n’y a plus de culture et donc qu’on à atteint la CMB.

Incubation : 37 °C, 24 h.

5.3) Lecture : schéma de l’observation de la gélose

On observe une décroissance du nombre de bactérie d’un demi de 6 à 1, correspondant aux


dilutions de l’antibiotique, mais en aucun cas il y a inhibition de la croissance traduisant un effet
bactéricide de la part de l’antibiotique.

32
5.4) Résultat de la CMB

La concentration minimale CMB est supérieure à 150 UI.mL -1.

6) Conclusion des deux résultats CMI et CMB trouvés

La CMI est très inférieure à la CMB (CMI << CMB), on peut en conclure que l’antibiotique, vis à vis
de cette souche est bactériostatique (c’est à dire qu’il inhibe la souche mais ne la tue pas).

Les concentrations dites bactériostatiques permettent à la population bactérienne de se


développer mais en ralentissant la croissance ; alors que les concentrations dites bactéricides
permettent de réduire le nombre initial de bactéries.

33
Réalisation de la galerie API20E :

La galerie API est un ensemble miniaturisé d’une vingtaine de tests biochimiques. Ces systèmes
sont variés et chacun cible l’identification d’un groupe particulier de bactéries. Nous allons utiliser
dans ce Tp une galerie API20E qui cible l’identification du groupe des Entérobactéries.

Préparation de l’inoculum :

On a prélevé à l’aide de l’oese quelques colonies fraîchement isolées sur le milieu GN ensemencé la
veille avec la souche à identifier. On introduit ces bactéries dans un tube contenant 5 mL d’eau
physiologique et on homogénéise bien à l’aide d’un vortex.

Inoculation de la galerie :

Cupule

Tube

Il faut remplir tubes et cupules des tests CIT VP GEL, et remplir uniquement les tubes des
autres tests. Il faudra créer une anaérobiose dans les tests ADH LDC ODC H2S URE en rajoutant
de l’huile de paraffine dans leur cupule. Afin d’éviter la déshydratation de la galerie celle-ci sera
placée dans une boîte d’incubation contenant des alvéoles qu’on remplira d’eau afin de créer une
atmosphère humide. Puis incubée 24h minimum à 37°C.

Lecture :

La lecture de certains tests ne se fait pas directement :


Dans la cupule TDA, il faudra rajouter une goutte du réactif TDA ; une couleur marron indique une
réaction positive
Une goutte du réactif IND sera ajoutée dans la cupule IND. Un anneau rouge traduira une
réaction positive.
Une goutte de réactif VP1 et VP2 sera ajouté à la cupule VP. Une couleur rose apparaissant au bout
de 10 min indique une réponse positive.

Rq : si la cupule GLU est positive, on pourra réaliser le test de la nitrate réductase en rajoutant
Nit1 et Nit2, puis du zinc si la réaction est négative afin de mettre en évidence la présence
éventuelle d’une nitrate réductase ainsi que son stade d’oxydation (NO 2 ou N2).

34
Résultats :

En comptabilisant les résultats positifs et négatifs on obtient un profil numérique : 12055735 qui
correspond à Rahnella aquatilis

Quelques informations sur la bactérie trouvée

Rahnella aquatilis était précédemment connu comme Enterobacter cloacae-like class H2. C’est dans
les années 80 qu’elle est venue rejoindre la famille des Enterobacteriaceae . C’est une bactérie qui
se rencontre qu’exceptionnellement dans les fèces et qui peut se multiplier dans des eaux de
boisson de qualité relativement bonne.

35
Correspondance DO600 et nombre de cellules/ml

Afin de déterminer la correspondance entre la DO et le nombre de cellules par mL


Nous allons suspendre un peu de notre bactérie dans un tube contenant de l’eau physiologique.
Après avoir dilué l’échantillon au 1/20ème ; on mesure la DO. On obtient : 0.08 d’unité d’absorbance.
Ce qui correspondrait à une DO de 1.6 si l’échantillon n’était pas dilué.
En se basant sur le fait que :
8
1 Do  10 cellules/mL au maximum
On peut estimer le nombre de cellules :
8
1.6 DO   1.6 x 10 cellules/mL

Sur un milieu, on considère un nombre comptable entre 30 et 300 UFC.


Je choisi donc de calculer la dilution adéq uate afin d’obtenir 160 colonies.
8 6
La dilution de référence correspondante est : 1.6 x 10 / 160 = 10

Fautes de boîtes de milieu de culture nous n’avons pu encadrer cette dilution, nous avons réaliser
les dilutions 10 -6 et 10 -7 en ensemencent en surface 2 boîtes par dilution avec 0.1 mL de la dilution.

Nous avons obtenu les résultats suivants :

10-6 10-7
Boîte 1 Inc 1600
Boîte 2 Inc 1600
Moyenne Inc 1600

Ce qui correspond à un nombre de :


1600 x 10 7 x 1/0.1 = 1.6 x 1011 cellules/mL

Une Do de 1.6 correspond à 1.6 x 10 11 Cellules/mL


11
Donc 1 x 10 cellules/mL correspondent à une DO de 1

11
Pour Rahnella aquatilis une DO de 1 correspond à une population de 1 x 10 cellules/mL

36
Actinomycètes
LES MICRO-ORGANISMES DU SOL: SOURCE PRINCIPALE DES ANTIBIOTIQUES

Les producteurs d'antibiotiques les plus féconds sont les Actinomycètales, un ordre de bactéries
filamenteuses qui sont présentes dans le sol. Elles produisent plus de la moitié des
antibiotiques.Les actinomycètes sont des bactéries filamenteuses, ramifiées, communément
rencontrées dans la nature (sol, eau). Les Actinomycètes sont des Bactéries dont la croissance
donne lieu à des colonies constituées d’hyphes, c’est -à-dire de filaments qui irradient, par
croissance centrifuge, tout autour du germe qui leur a donné naissance. Cela explique leur
dénomination : le mot « Actinomycètes » provient de deux substantifs grecs et signifie
« Champignons à rayons » ou « Champignons rayonnants ». Les formes les plus évoluées des
Actinomycètes rivalis ent en complexité morphologique avec les moisissures (Champignons
imparfaits) mais en diffèrent radicalement puisque, comme toutes les autres Bactéries, ce sont
des Procaryotes (cellules sans enveloppes autour du matériel génétique). Un corollaire de leur
structure cytologique est le diamètre de leurs hyphes qui est de l’ordre de 0,5 mm, soit
approximativement un dixième de celui de la plupart des hyphes fongiques.

Les Actinomycètes sont les plus prolifiques de tous les micro -organismes en tant que producteurs
d’antibiotiques. Parmi les espèces appartenant aux différents genres d’Actinomycètes, les
Streptomyces sont les plus importants producteurs d’antibiotiques et autres métabolites
secondaires. On peut estimer que 75% des antibiotiques isolés des Actinomycètes sont produits
par des Streptomycètes
- Les aminoglycosides (streptomycine, néomycine, kanamycine, gentamicine).
- Les macrolides (érythromycine) ;
- Les ansamycines (rifamycine) ;
- Les bêta-lactames (thiénamycine) ;
- Les peptides (viomycine, thiostrepton, actinomycine, pristinamycine) ;
- Les anthracyclines (adriamycine) ;
- Les tétracyclines (chlortétracycline, oxytétracycline) ;
- Les nucléosides (puromycine) ;
- Les polyènes (nystatine, candicidine, amphotéricine B) ;
- Les polyéthers (monensine).

Afin de mettre en évidence la présence de la sécrétion d’un antibiotique, nous allons dans un
premier temps vérifier une des caractéristiques de l’espèce : la présence d’une structure
filamenteuse caractéristique. Pour cela nous disposons sur une gélose GN, de 8 souches qui ont été
isolées à partir de nos différents échantillons de sol.

37
Après observation microscopique, on constate que les souches 1 et 5 ne sont pas filamenteuses.
En parallèle nous avons observé au gram une colonie sur milieu au char bon. C’est un milieu sélectif
des actinomycètes. Les actinomycètes ont un aspect macroscopique caractéristique :

Ceci nous a permis d’observer leur structure filamenteuse en spirale et ainsi caractériser
l’appartenance ou non des souches 1 à 8 à l’espèce.

Afin de voir la présence d’antibiotiques produit par les actinomycètes, on coule une surcouche BN +
agar 0.5% + microorganisme testeur (9mL de BN + agar et 1 mL de culture)
Nous avons réalisé cela sur 5 souches différentes :
Escherichia coli
Bacillus megaterium
Serratia Marcescens
Micrococcus flavus
Pseudomonas aeruginosa

1 2 3 4 5 6 7 8
Escherichia coli 20 mm

Bacillus megaterium 16 mm

Serratia
Marcescens

Micrococcus flavus 23 mm 8 mm

Pseudomonas
aeruginosa

On peut constater que la souche 7 sécrète un ou plusieurs antibiotiques auxquels Escherichia coli
et Micrococcus flavus sont sensibles.

On peut constater que la souche 4 sécrète également un ou plusieurs antibiotiques auxquels


Bacillus megaterium et Micrococcus flavus sont sensibles.

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Les Champignons microscopiques
Les champignons microscopiques (mycètes) se divisent en deux groupes :
- Les champignons unicellulaires ou « levures »
- Les champignons filamenteux ou « moisissures »

Levures

1) Les levures

On appelle levures les champignons microscopiques de type unicellulaire ou présentant dans leur
cycle biologique une phase cellulaire prépondérante.
Il en existe deux classes :
- ascomycètes : Les spores sont contenues dans un sac (ascospore)
- basidiomycètes : Les spores se retrouvent dans des structures externes (basides).
Possédant un polymorphisme fréquent au niveau de la taille ou de l’organisation : formes
mycéliennes ou pseudo mycéliennes ; et pouvant parfois être polynucléé chez les levures faisant
des mycéliums . C’est donc sur ces critères morphologiques et physiologiques que nous allons nous
baser pour identifier les levures. La forme, la taille, le mode de reproduction (sexué ou asexué),
sont donc une partie des caractères d’identification des levures.

2) Le dénombrement direct

La méthode directe s’effectue à l’aide d’une cellule de comptage, on dénombre tous les germes
aérobies ou anaérobies, vivants ou morts.
Les germes sont dénombrés à l’aide d’une lame spéciale appelée « cellule de comptage ».
Elle comporte un quadrillage calibré ou réseau.
Sur la lame, on compte les cellules dans plusieurs champs microscopiques.
Le résultat du dénombrement s’exprime en nombre de cellules par mL.

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2.1) La cellule de Thoma

Le quadrillage de la cellule de Thoma est constituée d’un grand carré de 1mm de côté (rstu) divisé
en 400 petits carrés de 0.05 mm de côté. Certains petits carrés sont regroupés par 16 en carrés
moyens de 0.2 mm de côté, séparés les uns des autres par une rangée de petits carrés striés
(rstu).

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Lorsque la lamelle plane est déposée sur la plate-forme centrale, la profondeur de la chambre est
de 0.1 mm.

La chambre correspondant au grand carré a un volume de :

3
V = 1 * 1 * 0.10 = 0.1 mm

Le parallélépipède correspondant au carré moyen a un volume de :

V = 0.20 * 0.20 * 0.10 = 0.004 mm3

Ici, nous appliquons la technique de comptage directe aux levures.

3) Comptage des levures à la cellule de Thoma

Résultats :

En comptant dans un carré moyens nous trouvons :

14 33 34 33
20 20 9 27
20 17 17 20
19 19 16 15

Observation de levures
en cellule de Thoma

3 -6
Ce qui fait un total de 323 levures dans un volume de 0.004 mm soit dans 4.10 mL

Le nombre de levures par mL est donné par la formule :

N= 323/4.10 -6

Il y a donc 8.1 x 107 levures/mL

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4) Observation de levures de collection

Formation de
Nom Taille (µm) Forme Mode de division
Pseudomycélium
Saccharomyces
10 Sphérique Bourgeonnement Pseudomycélium
cerevisiae
Kluyveromyces
5 Ovoïde Bourgeonnement Tubes germinatif s
lactis
Sphérique
Pichia scolyti 5 Bourgeonnement
(unicellulaire)
Klockera
5 Apiculée Bourgeonnement
apiculata
Saccharomyces
7 Ovoïde Bourgeonnement
oviformis
Debaromyces sp 5 Sphérique Bourgeonnement Pseudomycélium
Mycélium
9 Sphérique
Trichosporon sp Tubes germinatifs
6 cylindrique
Arthrospores

Schizosaccharomyces octosporus

C’est une levure qui se divise par fission. Il contient des asques avec 8 spores

Sporobolomyces salmonicolor

C’est une levure ovoïde, qui se divise par bourgeonnement. La spore se situe au bout d’un pédicelle,
et est remplie de liquide. Lorsque la pression est trop forte, la spore est éjectée. C’est ce qui se
traduisait par les petites gouttelettes sous le couvercle de la boîte.

Schéma :

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5) Observation de nos levures

A partir de nos isolements réalisé sur milieux Malt agar +Cloramphénicol, nous avons pu isoler 3
levures différentes provenant du lait.

Souche Taille (µm) Forme Mode de division


1 3 Ovoïde Bourgeonnement polaire
Bourgeonnement polaire
2 3 Ovoïde
Mycélium
3 3 Ovoïde Bourgeonnement polaire

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Moisissures

1) Généralités

On désigne sous le nom vaguement scientifique de moisissures toute une série de champignons
appartenant en réalité à des groupes taxonomiques très divers. Tout aussi prolifiques que les
bactéries, les moisissures sont capables de se dévelop per et de s'adapter à des conditions les plus
extrêmes. Il en existe plusieurs dizaines de milliers d'espèces. Ces champignons microscopiques
sont pluricellulaires, composés de filaments ou hyphes constituant un ensemble appelé mycélium.
Ce mycélium peut porter des structures de reproduction avec des spores souvent nombreuses,
dont la dimension peut varier de 1 à plusieurs dizaines de microns, suivant les espèces et le type.

Il existe deux modes de reproduction: sexué et asexué(s). Dans le cas de la reproduction asexuée,
le champignon émet une multitude de spores minuscules. L'identification se fait, entre autres, en
fonction des caractéristiques du "porteur de spores " ou conidiophore (asexué).

En l'absence de conidiophore, on parle de mycélium stérile, car l'identification n'est pas


réalisable.

Les moisissures sont connues pour les substances anti-bactériennes qu’elles sécrètent : les
antibiotiques ; elles synthétisent également des toxines, ou mycotoxines, et des substances
volatiles pouvant être hautement nuisibles pour la santé.

L'identification des espèces repose sur des critères morpho-ontogéniques qui accordent une
grande importance à l'aspect macroscopique du champignon (aspect, couleur et odeur des
colonies), à la morphologie des spores et à l'ontogénie de ces spores, c'est-à-dire la conidiogenèse
(aspect, couleur et structure des conidiophores).

2) La méthode d’observation

Le plus souvent, l'observation microscopique des moisissures ne requiert aucune coloration.


Cependant, en mettant un colorant, on peut mettre en relief certaines structures. Les deux
colorants les plus utilisés sont le "bleu coton" et le "lactofuschine".

2.1) Le colorant utilisé

Bleu coton lactique

C’est une solution à 0,1% de bleu coton dans de l’acide lactique pur ou dilué de moitié. Il colore le
contenu cellulaire et certaines ornementations sporiques et permet la mise en évidence de la
"cyanophilie" (coloration bleue des spores ou des hyphes par le colorant).

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2.2) La préparation

La méthode consiste à découper au ¾ du champign on, à l’aide d’un scalpel un petit morceau
rectangulaire.

De le déposer sur une lame sur la tranche et d’enlever au maximum la gélose en surplus.Après il
suffit de mettre dessus une petite goutte de colorant, et de déposer une lamelle. A l’aide d’une
allumette on tapotera dessus afin d’écraser la préparation. On pourra s’aider de la veilleuse du bec
bunsen pour réchauffer la gélose, en faisant attention à ne pas trop chauffer.
La préparation s’observe comme un état frais, au grossissement x40.

3) Observation de nos souches


3.1) Souche n°1

Colonie : thalle bleu vert, d’aspect poudreux, colonie rase, marge blanche. Revers orangé.

Hyphes : cloison nombreuses  septomycètes

Conidies : Elles sont de forme sphérique, de 2µ de large, ne possèdent pas de cloisons, à paroi
lisse et vert clair.

3.2) Souche 2

Colonie : aérienne, avec des spores noires, poilue, grise, filamenteuse, possédant un revers
jaunâtre peu coloré, très envahissante

Hyphes : Ils sont assez gros, de taille homogène 10-20 µm, peu cloisonnés  siphomycètes

Conidies : Elles sont de forme ovale 4µx7-10µ, ne possèdent pas de cloison, de couleur jaune-gris.
L’ornementation est fine et légèrement rugueuse

L’arrangement peu être différent :

Columelle
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4) Observation de souches de collection

Geotrichum (Septomycètes)

Colonie : thalle blanc à croissance rapide, blanc lisse, souvent d'aspect membraneux ou velouté, à
odeur douçâtre. Revers clair.

Hyphes : septés rampants, à embranchements dichotomiques de 8-10 µm d'épaisseur.

Conidies : rectangulaires de taille 5-10×3-6 µm à 20×10 µm, formées par désarticulation des
hyphes fertiles, les chaînes sont le plus souvent aériennes, érigées.

Mycélium

Arthrospore ou
arthroconidie

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Aspergillus

Colonie : marron -noire avec marge blanche, rase, plissée dessous, revers jaune.

Hyphes : Deux types 1-5 µm et 10-15µm d'épaisseur.

Conidies : Têtes conidiennes bisériées (quelquefois unisériées) radiées, de couleur vert jaune à
vert-olive, rondes de taille 3-4 µm, lisse, en chaînette, et ne possédant pas de connectif visible,
unicellulaire.

Conidiophore : Conidiophores pouvant atteindre 1mm, à parois rugueuses renflée en vésicules


sphériques à légèrement allongées, de 25-45 µm de diamètre.

Spores : exogènes

Phialides : verdâtres, de 6-10×4-6 µm, groupées sur les trois quarts supérieurs de la surface de
la vésicule.

Phialide

Conidie

Métule

Spore ou
conidie

Conidiophore

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