UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO

CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL

QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL EXPERIMENTAL
PROFESSORA DRA. LORENA C. MARTINIANO DE AZEVEDO
ANA BEATRIZ DA SILVA DOS SANTOS – 2017058298

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

SÃO LUÍS
2019
ANA BEATRIZ DA SILVA DOS SANTOS – 2017058298

QUARTA AULA PRÁTICA:

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Relatório apresentado à Professora Dra. Lorena

C. Martiniano De Azevedo na disciplina de
Química Analítica Instrumental Experimental do
Curso de Química Industrial da Universidade
Federal do Maranhão, para obtenção de nota
parcial.

SÃO LUÍS
2019
 RESUMO
1. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
A cromatografia líquida é uma técnica usada para separar uma amostra em partes
individuais. Essa separação ocorre baseada em interações químicas ou físicas da amostra nas
fases móveis e fixas. Como há muitas combinações de fase móvel/fixa que podem ser
empregadas ao separar uma mistura, há vários tipos diferentes de cromatografia classificados
com base nos estados físicos dessas fases. A cromatografia de coluna líquida-sólida, a técnica
de cromatografia mais popular, possui uma fase móvel líquida que filtra lentamente por meio
da fase fixa sólida, trazendo os componentes separados com ela.

Se baseia nas bombas para passar um solvente líquido pressurizado que contém a
mistura de amostra por meio de uma coluna preenchida com um material absorvente sólido.
Cada componente da amostra interage, de forma um pouco diferente, com o material
absorvente, causando taxas de transporte diferentes para os diferentes componentes e levando
à separação de componentes enquanto saem da coluna.

A cromatografia pode ser classificada como planar e colunar, existindo dessa forma vários tipos
de cromatografia por exemplo, cromatografia gasosa, líquida, de camada delgada, etc.

A cromatografia líquida de alta eficiência – CLEA ou também conhecida com a sigla

HPLC (High Performance Liquid Cromatography) faz parte do grupo de classificação da
cromatografia colunar. Essa técnica cromatográfica normalmente é empregada em amostras de
alimentos, água, solo, sangue, urina, etc.

Esse tipo de cromatografia obteve um avanço significativo a partir dos anos 70, e
desde então vem apresentando novas sofisticações tecnológicas, dentre elas a utilização de
colunas preenchidas por partículas de pequenos tamanhos, desenvolvimento e aperfeiçoamento
de vários detectores por exemplo fluorescência, espectrofotômetros de massa acoplados ao
HPLC, e dentre outros avanços que ocorreram desde a descoberta do equipamento.

Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade
de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos,
com alta resolução, eficiência e sensibilidade.

2. EQUIPAMENTO DE HPLC

O equipamento para a realização desse tipo de cromatografia é denominado de cromatógrafo

líquido que é constituído por vários sistemas, sendo os principais componentes estes:
 Reservatório de fase móvel: Garrafas com solventes utilizados para "transportar" a amostra
 Injetor: Dispositivo que permite a introdução da amostra no sistema
 Bomba: Responsável por movimentar a fase móvel e a amostra por todo o sistema
 Coluna cromatográfica: É um dispositivo preenchido com fase estacionária
 Detector: Responsável por identificar os tempos de retenção das substâncias analisadas

3. FASES DA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Na cromatografia líquida existe um sistema composto por duas fases, uma fase móvel
e outra fase denominada de estacionária.

Na fase estacionária podem ser utilizados compostos sólidos ou líquidos. Os sólidos

normalmente são substâncias absorventes, tais como, sílica, carvão ativo, etc., que se encontram
“empacotadas” em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. Nesse caso a base para a
separação de misturas é chamada de absorção. Já o composto líquido da fase estacionárias é
denominado de película delgada, sendo que nesse caso a base de separação de misturas é
denominado de partição.

Na fase móvel emprega-se uma mistura de alguns solventes, por exemplo, metanol, acetonitrila
e água, sendo que essa mistura é denominada de Eluente. Normalmente para a fase móvel
existem alguns critérios quanto aos solventes, tais como:
 O grau de pureza dos solventes,
 Baixa viscosidade;
 Dissolução da amostra sem perca dos compostos;
 Polaridade adequada para a realização da separação dos componentes da amostra.

Quanto a eluição de compostos é importante ressaltar que existem dois tipos de eluições:
 Isocrática: a composição da fase móvel (%B) se apresenta constante durante todo o processo
de análise. Normalmente se utiliza um tipo de solvente.
 Gradiente: a composição da fase móvel (%B) pode ser alternada durante a realização da
análise.
Nota: Em relação a porcentagem das eluições, essa denominação é definida de acordo com o
tipo de bomba do cromatógrafo líquido, podendo ser uma bomba binária, quaternária, etc.

No caso da bomba binária, existem dois pistões e canais (estes denominados de canal A e canal
B), os quais são responsáveis por todas as funções essenciais que fazem parte do sistema de
fluxo dos solventes. Portanto, quando se diz %B, estará indicando a porcentagem de solvente
que irá passar pelo canal B.

4. COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
A coluna é um componente chave para o funcionamento de um Cromatógrafo Líquido de Alta
Eficiência. A Eficácia de uma análise cromatográfica depende, fundamentalmente, da coluna
selecionada conforme a natureza das substâncias a serem determinadas.
Tipos de Colunas
Em um HPLC podem ser utilizados três tipos de coluna: coluna de saturação, ou pré-coluna,
coluna guarda e a coluna de separação.
a) A coluna de saturação ou pré-coluna é colocada entre a bomba e o injetor e é empregada
para condicionar a fase móvel (FM). A utilização de uma coluna de saturação visa a proteção
da fase estacionária (FE) da coluna de separação. A FM, estando saturada ao entrar na coluna
de separação, não ataca a FE aumentando seu tempo de uso.

b) A coluna de guarda é colocada entre o injetor e a coluna de separação e tem a finalidade

de proteger a coluna de separação, aumentando o seu tempo de uso. Deve ser recheada com a
mesma FE ou uma similar à coluna de separação.

c) A coluna de separação é parte fundamental da CLAE sendo responsável pela separação

dos componentes presentes na amostra analisada. A coluna de separação é importante a ponto
de o sucesso da análise depender da escolha adequada da coluna de separação.

As colunas utilizadas na CLAE geralmente possuem diâmetro variando de 02 a 21 mm. As

colunas de 2 mm são mais comumente empregadas em CLAE de pressão ultraelevada (também
chamados de UHPLC), as colunas de 4-6 mm são empregadas na grande maioria das aplicações
de CLAE e as colunas com diâmetro em torno de 21 mm são utilizadas na CLAE semi-
preparativa.

Os tubos utilizados costumeiramente são de aço inox, sendo mais resistentes às altas pressões
presentes na CLAE e mais inertes às possíveis oxidações químicas resultantes do meio. Os
tubos de cobre são evitados pela possibilidade de absorver ou reagir com alguns compostos ou
fases móveis, especialmente as ácidas. Os comprimentos das colunas podem variar de 10-13
cm ou de 25-30 cm (CIENFUEGOS, 2000).

A escolha da coluna é feita em função da sua capacidade, que pode ser determinada por suas
dimensões, comprimento e diâmetro interno e pelo material de recheio.

5. AQUISIÇÃO DE DADOS E RESULTADOS

Para a cromatografia normalmente se utiliza sistemas de computação ou automação.
Esses sistemas têm o intuito de aumentar a capacidade de utilização dos aparelhos, por meio de
injeção de amostra, inserção de dados das amostras e métodos, aquisição e tratamento de dados.

A aquisição e tratamento de dados irá definir a precisão de um pico gerado no cromatograma,

além de permitir a determinação de tempos e intensidades (áreas e alturas dos picos), lembrando
que normalmente os gráficos gerados apresentam uma relação de tempo e sinal do detector para
os analitos como pode ser verificado abaixo:
REFERÊNCIAS
CIENFUEGOS, F.; VAITSMAN, D. Analise Instrumental. Rio de Janeiro: Interciência, 2000.
606p.

GRUBERT, Laila. O que é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência? Blog Freitag, julho
de 2018.

MENDONÇA, Adrianne. Cromatografia Líquida. Disponível em:

https://pt.slideshare.net/adriannemendonca/cromatografia-liquida. Publicado em junho de
2013. Acesso em: novembro de 2019.

SIQUEIRA, Gilson. Princípios de cromatografia a líquido (HPLC). Disponível em:

https://www.linkedin.com/pulse/princ%C3%ADpios-de-cromatografia-l%C3%ADquido-
hplc-gilson-siqueira. Publicado em 2018. Acesso em: novembro de 2019.