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Técnicas Separativas
Ano Letivo 2011 – 2012
Relatório 3
Electroforese
Grupo:
Nº Nome .
Nº Nome .
Nº Nome .
Turma: 17/04/2012
Resumo:
O objectivo do trabalho consiste no estudo por electroforese em papel da mobilidade de
três aminoácidos (ácido glutâmico, alanina e lisina) a um determinado valor de pH e da sua
eventual separação numa mistura ao mesmo valor de pH. Tendo em atenção os resultados
obtidos a vários valores de pH é possível fazer uma estimativa para os valores dos respectivos
pontos isoeléctricos.
Introdução:
Muitas moléculas biológicas apresentam carga eléctrica cujo valor e sinal depende das
suas características e também do pH e da composição do meio em que se encontram. Estas
moléculas carregadas electricamente (iões), quando colocadas num local onde é aplicado um
campo eléctrico, migram em solução para os eléctrodos de sinal contrário ao da sua carga
global. Na técnica que é designada por electroforese este fenómeno é utilizado para separar
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moléculas.
Para evitar fenómenos de convecção a electroforese pode ter lugar num meio de
suporte. Um dos meios de suporte que pode ser utilizado é o papel de filtro, o qual é
impregnado com uma solução tampão.
Na electroforese em papel a amostra é aplicada num ponto de uma tira de papel (origem)
a meia distância entre os compartimentos dos dois eléctrodos, cátodo e ânodo, de uma tina
para electroforese. Esses compartimentos contêm uma solução tampão de pH adequado.
Uma vez criado o campo eléctrico, as substâncias carregadas electricamente movimentam-se
no sentido do compartimento do eléctrodo de carga contrária (as com carga positiva para o
cátodo e as com carga negativa para o ânodo), com velocidades que dependem das suas
dimensões e da sua carga eléctrica. Para os aminoácidos a carga eléctrica será determinada
pelo valor do pH da solução tampão. A aplicação do campo eléctrico é feita por um período
de tempo inferior ao que seria necessário para que as substâncias atingissem os eléctrodos,
pelo que elas ficam separadas no papel em pontos intermédios entre os eléctrodos. As tiras
de papel são então submetidas a uma secagem rápida, para evitar a difusão das substâncias
separadas (outra das razões por que se usa um meio de suporte), e reveladas por um método
químico apropriado, que, no caso dos aminoácidos, será uma reacção com o reagente
químico ninidrina. Desta reacção, que se dá a quente em meio neutro ou ligeiramente
alcalino, resulta um composto corado de cor azulada.
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Numa solução tampão tem-se uma mistura de um ácido fraco com a sua base conjugada.
Exemplificando com o caso do ácido acético, o pH de uma solução contendo uma certa
quantidade da sua forma ácida (HAc) e da sua forma básica (Ac−), pode ser previsto com base
na eq. de Henderson – Hasselbalch:
[ HAc]
pH pKa log
[ Ac ]
quantidades de ácido ou de base. A adição de ácido (H+) conduz à formação de HAc não
pelo que, se as concentrações de HAc e Ac− forem elevadas, as adições de H+ ou OH− terão
OH− que é necessário adicionar a um litro de solução para que o seu pH varie de uma
unidade.
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Parte Experimental
a) Materiais
Para os ensaios em electroforese foi utilizada uma tina e uma fonte de alimentação para
electroforese, 4 tiras de papel Whatman 3 MM Chr (28 3 cm), medidor de pH e eléctrodos.
Foram ainda utilizados pulverizadores, secador e luvas.
b) Reagentes
Foram utilizados como aminoácidos (aa); o ácido glutâmico (Solução de ácido glutâmico a
0.5% p/v preparada com solução tampão), a alanina (Solução de alanina a 0.5% p/v
preparada com solução tampão) e a lisina (Solução de lisina a 0.5% p/v preparada com
solução tampão).
Foram utlizadas soluções tampão de pH=2 e pH=11, a solução contendo a mistura dos
três aa, cerveja e a solução de ninidrina com pH adequado.
c) Técnica
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RESULTADOS E CÁLCULOS
a) RESULTADOS EXPERIMENTAIS
Cerveja ---- 3 no no
no- não observável
Cerveja ---- 10 41 no
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b) CÁLCULOS
Fórmulas estruturais para as formas predominantes dos aminoácidos ao valor de pH a que foi
realizada a electroforese
Alanina – aminoácido apolar
CH3 CH3
HC – NH3 + HC – NH2
COOH COO-
NH3+ NH2
(CH2)4 (CH2)4
CHNH3+ CHNH2
COOH COO-
Em meio fortemente ácido Em meio fortemente básico
+
H3N – CH – COOH H2N – CH – COO-
CH2 CH2
CH2 CH2
COOH COO-
Tabela 3 - Carga eléctrica das espécies predominantes dos aminoácidos ao pH a que foi
realizada a electroforese
Carga
Aminoácidos
pH=2 pH=12
Ácido Glutâmico + -
Lisina + -
Alanina + -
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Tabela 4 – Pontos Isoeléctricos dos aminoácidos, PI
Aminoácidos pK
10,53 [pKa(NH3+)+pKa(NH3+)]/2
Lisina 2,18 8,95
(-amino) 9.74
[pKa(COO-)+ pKa(NH3+)]/2
Alanina 2,34 9,69
6.02
Ponto isoeléctrico - valor de pH para o qual a carga global do aminoácido é neutra e que,
consequentemente, não permite que o aminoácido se mova num campo eléctrico.
DISCUSSÃO DE RESULTADOS
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O uso da Ninidrina é essencial para evidenciar aminoácidos, pois ela reage com os grupos
amino livres das soluções.
O uso das duas soluções tampão foi essencial pois a migração ocorre de acordo com o
grau de ionização, tamanho e forma da molécula e das características da solução tampão
onde se realiza o processo.
As frações nas quais predominam as cargas negativas, o aminoácido dirige-se para o
ânodo (pólo positivo) e as positivas, migram para o cátodo (pólo negativo). Como a carga do
aminoácido depende da concentração do ião hidrogénio da solução, o pH deve ser
especificado e mantido constante durante o procedimento.
A carga líquida de um aminoácido depende do número de cadeias ionizáveis, o valor
do pK e o pH do meio. O pH onde a soma cargas negativas é igual a das cargas positivas é
denominado ponto isoelétrico (pI) do aminoácido. Quando submetido a um campo eléctrico
como na eletroforese, um aminoácido no seu pI não migra em qualquer direção. O pI varia
de um aminoácido para outro e depende dos valores individuais de pK de todos os grupos
ionizáveis presentes nas cadeias laterais dos aminoácidos e dos extremos das cadeias
polipeptídicas.
Em pH maior do que o pI o aminoácido tem carga negativa efetiva. Em pH menor do
que o pI a proteína tem carga positiva efetiva. A magnitude da carga elétrica efetiva de
umaminoácido é função da distância entre o pH e o pI.
CONCLUSÃO
A electroforese tem como objetivo separar os aminoácidos de acordo com a sua carga
elétrica. Neste ensaio realizou–se a separação de misturas de aminoácidos, isso é possível,
pois o grupo R dos aminoácidos relaciona-se de forma diferente com soluções a pH
diferentes. A alanina tem um grupo ácido e outro grupo básico, o ácido glutâmico tem dois
grupos ácidos e a lisina dois grupos básicos Dessa forma foram evidenciadas algumas
propriedades dos aminoácidos e assim pôde–se caracterizá–los de acordo com sua carga.
Conclui–se que os dados obtidos no ensaio foram os esperados uma vez que todos eles
migraram de acordo com a sua carga elécrica.
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A electroforese é um método em que a migração ocorre de acordo com o grau de
ionização, tamanho, forma da molécula, características da solução tampão onde se realiza o
processo, da força do campo eléctrico, da porosidade, viscosidade e da temperatura.
As frações nas quais predominam as cargas negativas, a proteína se dirige para o
ânodo (pólo positivo) e as positivas, migram para o cátodo (pólo negativo). Como a carga
depende da concentração do ião hidrogénio da solução, o pH deve ser especificado e
mantido constante durante o procedimento, o que será uma das causas de erro do método.
A electroforese não é adequada para a determinação de compostos voláteis, não
polares e de massa molecular baixa, sendo melhores determinados por cromatografia
gasosa.
BIBLIOGRAFIA
[2] – M. Melvin, Electrophoresis, ed. ACOL, John Wiley & Sons, Chichester, 1987.
[3] – J.R. Sargent, Methods in Zone Electrophoresis, BDH Chemicals Ltd, Poole, 1969.
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ANEXO I
A Parte experimental
Material
Tina para electroforese Fonte de alimentação para electroforese
2 tiras de papel Whatman 3 MM Chr (18 × 8 cm)
Medidor de pH e eléctrodos Secador
Pulverizadores Micropipetas
Luvas
Reagentes
Solução tampão de pH 2 e pH 11
Solução de ácido glutâmico a 0.5% (solução 1).
Solução de alanina a 0.5% (solução 2).
Solução de lisina a 0.5% (solução 3).
Solução contendo uma mistura dos três aminoácidos (solução 4).
Cerveja (solução 5).
Solução de ninidrina com pH adequado
Procedimento experimental
Obs. prévia: A pulverização com ninidrina deverá ser efectuada na “hotte”. Usar sempre
luvas para manusear as tiras de papel.
• Desenhar levemente a lápis uma linha transversal (origem) no centro das tiras de papel,
assinalar o centro das linhas com uma pequena cruz, identificar a lápis as tiras numa das
extremidades com o nome da amostra a colocar e marcar as extremidades catódica (com
C) e anódica (com A).
• Com uma micropipeta aplicar na origem de cada uma das duas tiras de papel uma
pequena gota(10L), respectivamente, de cada uma das soluções 1, 2, 3, 4 e 5 e secar
imediatamente a tira com um secador para evitar a difusão da gota.
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• Colocar as quatro tiras de papel na tina de electroforese depois de a ter enchido com a
solução tampão.
• Ligar os eléctrodos à fonte de alimentação e aplicar uma diferença de potencial de
200 V durante trinta minutos.
• Com um lápis, delimitar as manchas coradas que aparecerem nas tiras de papel e
medir as distâncias (em mm) da origem até ao centro de cada mancha.
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