RESUMO DE CONTROLE BIOLOGICO

E MICROBIOLOGICO
1. INTRODUÇÃO:

Controle de
qualidade

Objetivos

Eficácia Segurança

Garante que o teor Garante que é

declarado é o inócuo, sem
correto elementos tóxicos

A eficácia pode ser perdida ou alterada com a degradação química ou microbiológica,

resultnado em teor diferente. Os medicamentos na forma em que são vendidos não
apresentam contaminação microbiana, por resídios, pela manipulação do operador. Sem
efeitos tóxicos e sem comprometimento do paciente. Não é a toxicidade inerente ao princípio
ativo, devendo ser observada a preparação farmacêutica, quando a qual estiver fora das
especificações pode causar efeito tóxico.
Um controle total da qualidade envolve controle de desenvolvimento, produção e
distribuição, além do uso do fármaco. Sendo o controle da distribuição realizado pela ANVISA.
O controle de qualidade deve ser empregado na manufatura, minimizando as contaminações e
de acordo com as boas práticas de fabricação.
O controle de produtos biológicos é realizado através de ensaios biológicos, nos quais
a resposta biológica aferirá uma medida indireta do teor do fármaco. São empregados quando
não há ensaios diretos para quantificação do teor do fármaco, sendo aplicados a
imunobiológicos, fitoterápicos, biofármacos e a uma grande gama de antimicrobianos. São
ensaios indiretos pois não se mede diretamente o teor e sim a partir da intensidade da
resposta produzida com determinada dose em comparação com o padrão ( é a mesma
substância, em mesma dose e concentração). Se a resposta da amostra difere da do padrão é
sinal de que o teor encontrado experimentalmente diverge do declarado. Em geral, se trabalha
com curvas dose resposta.
As análises microbiológicas são muito importantes na segurança e na inocuidade,
apresentando presença aceitável máxima ou ausência de microorganismos.
 Pelo fato de
Animal
inteiro serem usados reativos
biológicos e por se tratar
de controle de qualidade,
não se trata apenas de
toxicologia.
Material Reativos Órgão São empregados
biológico biológicos isolado
os conceitos dos 3 Rs:
 Replacement:
substituição do reativo
biológico;
 Reduction:
Células
redução da quantidade
de reativos biológicos
empregados;
 Refinament: maior precisão de ensaios, métodos e equipamentos que reduzam ou
substituam o uso de reativos biológicos e, principalmente, que causem menos dor e
sofrimento.

2. PADRONIZAÇÃO BIOLÓGICA:
Os ensaios biológicos são realizados comparando amostras com padrão. Tais padrões
são padrões internacionais, produzidos em tempo e quantidade determinados. FDA e USP
produzem padrões internacionais, e no Brasil, o INCQS também os produz. Quando não se
possui autonomia para produção dos padrões internacionais, os mesmo são adquiridos em
centros de coleções oficiais. O uso de padrões é importante, pois em qualquer lugar, por
qualquer pesquisador os dados poderão ser comparados.
Os padrões internacionais são usados em CQ, bem como na validação de métodos e
qualificação de equipamentos.
Há as substâncias químicas de referância (SQR) que apesar de não serem obtidas de
meio biológico são importante na aplicação de ensaios biológicos, como no caso dos ensaios
com antimicrobianos.
O teor, nos ensaios biológicos, é obtido observando as respostas biológicas obtidas
com a amostra em comparação com as obtidas com os padrões internacionais. Como as
substâncias biológicas não apresentam alta pureza, em função de serem obtidas por diversos
meios de extração, é fundamental a comparação com os padrões internacionais. As
substâncias biológicas podem apresentar variação de eficácia em função de não apresentarem
sistema de unidade comum, já que as variabilidade tanto de origem biológica, quanto de meio
biológicos são grandes, surgindo a necessidade da utilização de padrões, uniformizando o
controle de qualidade.
Os padrões são as mesmas entidades químicas presentes nas amostras, porém
purificados. Os padrões também validam ensaios como, por exemplo, o uso da Indometacina
como padrão em ensaios de anti-inflamatórios, como a Morfina nos ensaios de analgésicos. Ou
seja, pode-se escolher os padrões quanto a: analogia estrutural, mecanismo de ação, além de
ser a mesma entidade química.
 As SQR são usadas na comparação em testes e ensaios oficiais, em programas de
segurança e qualidade. Pode-se economizar padrões internacionais, realizando ensaios físico –
químicos, biológicos e microbiológicos em comparação com tais padrões, construindo um
padrão de trabalho que pode ser utilizado em ensaios não oficiais. Em suma, as SQR podem ser
empregadas na pesquisa com a finalidade de identificação de moléculas , bem como na
validação de métodos e qualificação de equipamentos.
Quais são os critérios para que uma substância seja classificada como padrão
internacional:
 Pesquisada em ensaios colaborativo a fim de determinar as propriedades da
substância candidata a padrão.
 Esses ensaios são realizados em pelo menos 3 laboratórios de referência,
devendo chegar aos mesmos resultados.
 Matéria prima de elevada pureza.
 Os laboratórios envolvidos devem apresentar equipamentos e métodos de
mesmo nível tecnológico.
 Devem ser realizados diferentes métodos analíticos.
 Padrão deve estar disponível por um maior período de tempo, ser
homogêneo e estável.

O padrão e a amostra devem ser aplicados no sistema biológico, em mesma dose e

concentração, de acordo com o declarado, observando as respostas biológicas obtidas,
comparando-as, devendo considerar a análise estatística e os limites aceitáveis pela
farmacopeia. A análise estatística considera possíveis diferenças em função de contaminação,
alterações na produção, pelo sistema biológico empregado.

Novas substâncias a serem comercializadas requerem a produção de novos padrões,

principalmente quando a demanda aumentar, como no caso de patentes que caducam e que
abre a produção para diversas indústrias.

Nos padrões biológicos os ensaios colaborativos são mais complexos, mais caros e o
laudo será maior. São mais complexos em função da produção dos produtos biológicos
apresentar variações em termos de título, devendo ser realizados ensaios comparando
potência da amostra com a do padrão.

Os padrões de origem biológica não apresentam pureza máxima, mas com a utilização
de RMN e de espectrometria de massa é possível caracterizar a estrutura. Os padrões
biológicos não podem ser empregados como medicamenros, sendo apenas utilizados para CQ
e na determinação de atividade biológica.
Tipos de padrões
i. Padrão internacional:
São substâncias idênticas, estáveis e com potência em UI/mg. A produção é igual as
das SQRs, onde no estudo colaborativo se estuda a substância candidata a padrão, avalia a
potência, reprodutibilidade, estabilidade, variabilidade e define a quantidade UI. Não
necessariamente, são substâncias únicas, nem a mesma substância, mas pode ser um padrão
para uma classe ou determinado mecanismo de ação. A definição de UI está relacionada a
 potência, sendo uma quantidade pré – fixada de dada susbtância, que promove dada resposta
biológica em dado sistema biológico.
ii. Preparação internacional de referência:
São substâncias que não se conseguiu determinar UI, ou os estudos colaborativos
foram incompletos. Contudo, é de boa qualidade, podendo ser empregado no preparo de
padrões de trabalho.
iii. Reagente internacional de referância:
Segue o mesmo princípio das preparações internacionais de referência, porém com
mais incompatibilidades, podendo ser usado para fins qualitativos, em ensaios diagnósticos,
dentre outros, pois não apresenta a especificação da quantidade de UI.

3. BIOTERISMO:

O uso de animais, quando indispensável, é empregado em:

 Diagnóstico/prevenção;
 Detecção de riscos ambientais;
 Pesquisa científica;
 Teste de substâncias.

O bioterismo tem a função de produzir e controlar os animais usados em ensaios

biológicos visando o controle de qualidade.

Os animais são considerados reativos biológico pois apresentam absorção,

distribuição, biotransformação e eliminação de substâncias de modo semelhante ao homem,
permitindo extrapolação dos dados.

Como os reativos químicos, os reativos biológicos devem apresentar:

 Padronização;
 Reprodutibilidade;
 Sensibilidade de resposta.

A Lei Arouca de nº 11.794 de 08/10/2008, determina critérios para a organização,

criação e utilização de animais em pesquisa, estabelecendo o processo decisório e de
procedimentos
de

3Rs administração,
exigindo ética e
cientificidade.
Refinament: Reduce: Replace: Dessa lei surge
o CONCEA
•modificar protocolos, •é consenquência do •utilização de métodos
utilização de anestesia, refinament e do alternativos ao uso de (Conselho
procedimentos menos melhor delineamento animais, como cultura Nacional de
invasivos, melhoria das estatístico dos de células, ensaios in Experimentaçã
condições e menos protocolos, reduzindo silico.
sofrimento. o número de animais o Animal). O
empregados.
CONCEA cria normas para uso de animais, instalações e funcionamento de biotérios e
laboratórios de experimentação animal.

Os aspectos éticos são fundamentais na escolha e uso de animais em ensaios

biológicos e dependem de alguns fatores:

 Pessoal treinado;
 Busca por técnicas alternativas;
 Uso de espécies cuidadosamente selecionadas e adequadas ao experimento –
evita uso desnecessário e excessivo;
 Mínimo número de animais;
 Procedimentos que minimizem desconforto, estresse e dor;
 Condições micro e macro ambientais adequadas;
 Acompanhamento veterinário;
 Comissão de ética no uso de animais, atuando na revisão e aprovação dos
protocolos.

Requisitos dos reativos animais:

Para o estudo de patologias os

modelos animais podem ser
geneticamente modificados,
Reativos •Adultos
como os animais knowkout, ou
animais •Saudáveis
com maior suscetibilidade a um
perfil de resposta, como os
•CDG camundongos AJ que
Tipos mais •Ratos
comuns apresentam maior
•Coelho
suscetibilidade para o perfil TH1
•Cão de resposta imune.
Outros •Gato
usados •Porco As regras de boas
•Macaco práticas de bioterismo devem
ser seguidas para garantir a
qualidade dos animais, pois em situações e condições adversas levam a resultados negativos.
As boas condições devem ter manutenção a fim de garantir a reprodutibilidade dos resultados.

Os animais convencionais são: Mus

musculus (cdg), Rattus novergicus (rato) e Sem doença
Saudáveis genética ou
Oryctalogus cimiculios (coelho). São os mais neoplásica
utilizados, pois apresentam baixo custo, fácil
reprodução, vida curta e grande base de dados.
Boa aparência
Devem apresentar algumas Ativo com pelo liso e
brilhante
características:

Os modelos animais podem apresentar as

seguintes classificações quanto a microbiota: Sem estresse
 Convencionais - SPF - patógeno free - Germ free - axênico,
haloxênicos heteroxênicos monoxênico

Microbiota sem
Microbiota indefinida Microbiota associada definida
patógenos

Ambientes sem barreiras Apenas microorganismos Criados com barreiras sanitárias

sanitárias não patogênicos absolutas

Criados normalmente nos Criados em condições Mantidos em isolamento e

biotérios sanitárias rigorosas nascidos de cesariana asséptica

Axênico - sem microbiota

Monoxênico - contaminado
com apenas 1 microorganismos
para compor a microbiota

Linhagens -Acasalamento
Monogâmico Poligâmico
Co - sanguíneo = INBREAD Ao acaso = OUTBREAD

Maior qualidade e Maior quantidade e

uniformidade genética variabilidade genética

Fácil controle da linhagem Difícil controle da linhagem

Mantém as matrizes das

linhagens
Criação
Idade
controle rígido do padrão
genético e de saúde
Aspecto
Coito Criação em grandes
Critérios de seleção Doenças/anomalias
quantidades
Tipos de biotério Produção

Mortalidade Recebe as matrizes

Peso
Recebe os animais da
produção
Experimentação

Utiliza em experimentos
 Biotério
Instalações: Condições
•Criação sanitárias:
•Experimentação •Controle dos fatores de
•Almoxarifado risco químicos, físicos e
ambientais
Nutrição
•Depósito de água e
comida •Controle de ventilação,
•Limpeza e esterilização umidade luz e barulho
•RH

O biotério deve apresentar áreas limpas e áreas sujas. As áreas limpas são as áreas de
criação, devendo apresentar barreiras químicas (hipoclorito, coloreto de benzalcônio e álcool
70%), físicas (autoclaves, filtros de ar e de líquidos) e outras como higiene pessoal, EPI, além de
monitoramento da saúde dos manipuladores. Periodicamente uma amostra de cada colônia
ou linhagem deve ser submetida a exames parasitológicos, bacteriológicos e virológicos, a fim
de determinar o status sanitário.

A manipulação de animais apresenta riscos para quem maneja, mesmo que o animal
não esteja infectado, para isso que a biossegurança atua garantindo:

 Prevenção de escape de OGMs e/ou patogênicos;

 Prevenção e promoção da saúde do trabalhador.

Os riscos envolem:

 Manipulação e administração de drogas e/ou agentes infecciosos;

 Avaliação de compostos tóxicos;
 Contato com tecido, sangue e soro;
 Manipulação de maravalha com fezes e urina.

4. RESPOSTAS BIOLÓGICAS:
Os produtos biológicos são derivados de organismos vivos e apresentam moléculas
complexas, requerendo procedimentos especiais para controle de qualidade em função de sua
origem. Como exemplos de produtos biológicos temos: insulina, heparina, imunobiológicos,
hemoderivados (fatores de coagulação, plasma, soros). São ensaios mens precisos e mais
complexos que os ensaios físico químicos. Para controlar a variabilidade são utilizados padrões
internacionais e delineamento estatístico.
 quantitativa

Gradual
intensidade de efeito
aumenta com
aumento da dose
Respostas biológicas

qualitativa

Quantal
quantificação da
respostas tudo ou
ferequência do
nada
efeito

a. GRADUAL:
Avalia potência e eficácia, onde a potência encontrada in vitro deve ser extrapolada
para a in vivo. Observa os efeitos biológicos nos reagentes biológicos como animais inteiros,
órgãos isolados, células, fluidos e microorganismos.
As bases da resposta gradual estão na farmacodinâmica, estudando o efeito que os
fármacos exercem no organismo ou no reagente biológico. Em geral, nos ensaios
farmacopeicos não se utiliza o animal todo.
A ligação de um ligante ao alvo produz a resposta biológica, sendo tal ligante
endógeno ou exógeno (fármaco). Os fármacos modulam/mimetizam/impedem a ação dos
ligantes endógenos.
Há uma série de proteínas que são alvos para fármacos, como: enzimas, receptores
nucleares, receptores acoplados a tirosina cinase, GPCRs e canais iônicos.
Na resposta gradual se avalia a curva dose resposta, ou concentração efeito.

Considerando a contração do
músculo reto abdominal e a inibição da
contração no ventrículo como respostas à
ação da acetilcolina em diferentes doses. É
observado o aumento da resposta conforme
se aumenta a dose (no caso, o Log da dose a
fim de obter linearidade na curva).
 Com a linearidade promovida pelo Log é
possível identificar a CE50, a qual é a concentração
efetiva em que há 50% do efeito máximo, sendo
empregada para determinar a potência – CE50 em
menor dose = maior potência. Mesmo com potências
diferentes, diferentes fármacos poem apresentae a
mesma eficácia, desde que ambos cheguem ao efeito
máximo.
A potência é a mesma, independente do
sistema biológico empregado, por isso que se testa a
potência in vitro com tecidos não humanos, com a
possibilidade de extrapolação dos dados para
humanos. Isso é a base da resposta gradual. A intensidade do efeito é proporcional ao número
de receptores ocupados.

CE CI
Concentração efetiva Concentração inibitória

Promove inibição /redução

Produz resposta
de determinada resposta

CE50 - 50% do efeito CI50 - 50% da inibição

máximo máxima

CE ou CI são termos utilizados para ensaios in vitro, enquanto que DE ou DI são para
ensaios in vivo

b. QUANTAL:
Avalia o produto quanto a inocuidade e toxicidade em função da presença do
contaminante. É um tipo de resposta qualitativa, pois observa a presença ou a ausência de
efeito, avaliando a frequência de efeito.
Na resposta quantal quanto maior a dose administrada maior o número de indivíduos
que apresentarão resposta. A morte é a principal resposta quantal, assim como a convulsão,
enquanto que hipertrofia, frequência cardíaca dentre outras são respostas graduais.
São respostas de tudo ou nada e o principal parâmetro é a DL 50/CL50, a qual é um
parâmetro de toxicidade e segurança. A DL50/CL50 não é 50% de resposta e sim 50% dos
indivíduos que apresentam determinada resposta. Também pode ser útil para potência.
 A sigmóide corresponde a
relação frequência acumulada x log da
dose. Somando-se as frequências há a
frequência cumulativa a qual segue
uma distribuição normal, com valores
em torno da dose efetiva média.
É possível converter uma
resposta gradual em quantal, quando
se estabelece um valor de aumento
limite, e quando há aumento acima de
tal limite se avalia a frequência de
aumento ou redução.
Na curva sigmóide no gráfico de frequência acumulada há uma relação de linearidade,
que permite o cálculo da DL50 ou na DE50/CE50.
Cada porcentagem da frequência acumulada equivale a uma determinada quantidade
de probitos, e tais valores de probitos são plotados no gráfico probito x log da dose,
permitindo, de fato, o cálculo da DL50, isso porque a conversão para probitos promove a
conversão da curva sigmóide em uma reta.
Há duas curvas para os fármacos: curva de efeito terapêutico, na qual se avalia eficácia
e potência através da DE/CE máx e da DE50 /CE50, e a curva do efeito tóxico em que se avalia
a DL (dose letal). Com estas duas curvas é possível determinar as margens de segurança e,
portanto, o índice terapêutico (IT). O índice terapêutico é obtido pela seguinte equação: 𝐼𝑇 =
𝐷𝐸50
, quanto maior esta relação, mais seguro será o fármaco.
𝐷𝐿50
Muitas vezes a DL50 não é suficiente para dar informação de segurança, pois apesar de
2 fármacos diferentes apresentarem mesma DL50, podem apresentar margem de segurança
diferente, dependendo da inclinação da reta, por isso que é importante converter a
porcentagem de frequência em probitos.

Apresentam a mesma DL50,

mas a inclinação da reta é
diferente, pois quando se
avalia 10% de morte, o
composto A já apresenta
número maior de morte que
o composto B e, em menor
dose.

Por isso que é interessante avaliar a DL1 e a DE99, que correspondem,

respectivamente, à dose letal em 1% da população e à dose eficaz em 99% da população. Com
𝐷𝐿1
esses valores se estabele o FCS (fatore de certeza de segurança) 𝐹𝐶𝑆 = 𝐷𝐸99
. Portanto, se há 2
fármacos com o mesmo IT, deve-se avaliar a DL1 e a DE 99 a fim de determinar o FCS e se tais
valores se sobrepoem no gráfico é sinal de que o fármaco não é seguro.
 Os valores de DE99 e
DL1 para o fármaco B se
sobrepõem, indicando que B
não é um fármaco seguro,
apesar de apresentar a mesma
DL50 que A, mas A não
apresenta sobreposição dos
valores de DE99 e DL1.

5. ENSAIOS TOXICOLÓGICOS:
São ensaios que visam garantir a segurança. Toxicidade é a capacidade ou habilidade
da substância ou produto causar dano aos seres vivos. Para avaliação da toxicidade se avalia o
potencial de dano, através de avaliação indireta in vivo ou in vitro. No CQ os ensaios in vivo
vem sendo menos utilizados.Quando se pensa nos ensaios toxicológicos no desenvolvimento
do medicamento, ai sim que os ensaios são in vivo.
Os testes de toxicidade são realizados na matéria prima, nas formulações em
desenvolvimento, no produto acabado, seja ele medicamento, cosmético ou correlatos. Os
animais mais empregados são: Mus musculos, Rattus novergicus e Oryctalogus cimiculios.
É importante a aplicação dos 3Rs, reduzindo o número de animais utilizados,
reduzindo o sofrimento e aumentando o bem estar, além de aprimorar o método a fim de
susbtituir o modelo animal ou reduzir sua utilização ao máximo. Órgãos isolados, culturas de
células, modelos físicos e matemáticos e simulaçãoes podem substituir o modelo animal em
ensaios toxicológicos, desde que estejam validados. Nem todo método alternativo é in vitro,
podendo ser in vivo com um número menor ou com menos sofrimento.
Tipos de ensaios:
Diferem na
duração e grau de
avaliação dos efeitos
Ensaios tóxicos.
Os ensaios
agudos estimam o
potencial de dano ao
Agudo Subcrônico Crônico usuário (DL50 e
CL50), estabelecendo
o mecanismo de
Curto prazo Médio prazo Longa duração toxicidade. Ensaios
lote-a -lote
1-14 dias 21-90 dias até 1 ano
Subcrônicos
e crônicos não são
utilizados no CQ, apenas no desenvolvimento. Apresentam ensaios que aprimoram o
mecanismo de toxicidade a nível celular, investigando doses nas quais alteram a fisiologia,
além de predizer efeitos adversos com o uso intermitente com exposição repetida e crônica.
 Nos ensaios subcrônicos há a administração de doses repetidas e se avalia a alteração
histológica de diversos órgãos, além de avaliação bioquímica. A partir dos ensaios subcrônicos
é possível planejar os crônicos. Testam a toxicidade por diferentes vias de administração,
podendo avaliar diferentes idades, vias e doses.
Nos ensaios crônicos se avalia a teratogenicidade e os efeitos no feto, além da
carcinogenicidade. São planejados para durar a maior parte da vida do animal.
A complexidade dos ensaios crônicos impede a susbtituição por sistemas de testes não
animais, mas é possível a redução do número de animais (reduce) e do tempo de
experimento(refinament).
Voltando aos ensaios agudos, há basicamente 2 tipos de ensaios:
A. Ensaios locais:
A amostra é aplicada no tecido alvo. São empregados para formulações tópicas,
cosméticos, aplicação ocular,subcutânea, intranasal, intra vaginal e de uso bucal.

a. IRRITABILIDADE CUTÂNEA:
O método convencional utiliza coelhos, nos quais se aplica o produto ( em patches)
para que entre em contato com a pele do animal por até 3 dias, com inspeções a fim de avaliar
o surgimento de irritações. Não apresenta capacidade de avaliação de sensibilização, ou seja,
não avalia alergia. Em até 3 dias aparecem lesões que recebem algumas pontuações, as quais
permitem boa extrapolação para humanos em irritantes fortes, mas os irritantes fracos não
apresentam boa
extrapolação.
Somando
essas pontuações
dos parâmetros
de formação de
eritema e escara
e da formação de
edema há o
índice de
irritação.

No
método
alternativo se utiliza cultura
de queratinócitos humanos,
os quais entram em contato
com o produto, sem possível
avaliar algumas alterações. A
análise histológica in vitro é muito semelhante in vivo, no entanto não é possível avaliar edema
e eritema, já que há ausência de resposta inflamatória, mas a análise histológica permite boa
comparação. É um método que funciona bem para cosméticos.
 b. SENSIBILIDADE CUTÂNEA:
Irritabilidade é diferente de sensibilidade, onde a primeira já acontece no primeiro
contato, enquanto que a segunda só irá se manifestar no segundo contato, já que depende do
desenvolvimento de resposta imume.
O método tradicional se utiliza cobaias, as quais são expostas a produto a cada 2 dias
por 18 dias, esperando-se um período de tempo para a produção de anticorpos, após o qual,
no 35º dia há uma reexposição a fim de avaliar o aparecimento da reação alérgica.
Se não houve reação alérgica positiva, se utiliza outra metodologia com o ACF,
o qual é adjuvante, a fim de mimetizar a população mais susceptível a alergia,
avaliando se ainda assim o produto não apresenta capacidade sensibilizante.
A metodologia alternativa também utiliza animais, porém em menor
quantidade. É o ensaio do linfonodo local. O produto é aplicado na orelha do animal e
se espera um período de tempo, após o qual há coleta dos linfonodos e análise por
citometria de fluxo, a qual irá permitir a avaliação da proliferação dos linfócitos,
através de marcação com timidina tritiada. Esse método é um método de redução, se
houvesse redução do tempo de protocolo (o tradicional leva 20 dias) seria
refinamento.

c. IRRITABILIDADE OCULAR:
É uma variação do ensaio de irritabilidade cutânea, com aplicação no globo ocular a
fim de avaliar a irritação na conjuntiva, íris e córnea.
O produto é aplicado na quantidade de 0,1 mL ou 100 mg, no saco conjuntival, fecha-
se a pálpebra e depois a mesma é liberada a fim de observar as alterações. Se avalia após 1h,
24 h até 3 dias. Para cada lesão há escore que varia de 0-4 conforme a gravidade da lesão. O
teste será dado como positivo quando mais de 4 animais apresentarem a irritação ocular e
negativo quando apenas 1 apresentar. Se 2 ou 3 animais apresentarem irritação, o teste deve
ser repetido com mais 6 animais.
O método alternativo é um conjunto de refinamento e redução. Se utiliza 1 animal,
caso o resultado seja positivo o mesmo é confirmado com o ensaio em mais 1 animal. Se o
resultado for negativo, repete-se o ensaio com mais 2 animais. Em todo o procedimento há
utilização de analgésicos opióides e anestésicos locais (refinamento).
Outro método alternativo é in vitro com a utilização da córnea de boi, obtida de
bovinos abatidos para alimentação. Os compostos são aplicados na córnea, a qual está fixada
com um aparato. O objetivo do ensaio é avalair a opacidade da córnea e a permeação do
composto, a qual é avaliada com o uso de fluoroceína a fim de observar se a mesma permeia
as camadas da córnea.
Mais um método alternativo é o uso da membrana córion – alantóide de ovos de
galinha. Tal membrana apresenta estrutura similar a da conjuntiva, sendo utilizada para a
avaliação da irritabilidade, observando hiperemia, hemorragia, ruptura de vasos e coagulação.
É realizada em ovos embrionados no 10º dia. Também apresenta escore, e dependendo do
mesmo há avaliação da severidade da irritação.
 d. FOTOTOXICIDADE:
Se assemelha ao ensaio de irritabilidade cutânea. O produto é aplicado na pele e,
quando se expõe à luz acontece a reação. Há também a fotoalergia, que só acontece se há
contato prévio com o produto e a luz, não sendo avaliado in vitro.
O método convencional utiliza o dorso do animal dividido em 4 quadrantes, em 2
quadrantes se aplica o fármaco e 1 deles será exposto à luz, e nos outros 2 quadrantes se
utiliza o controle positivo (8-metoxipsoraleno) e 1 deles será exposto à luz. Se utiliza luz Uva
por 116 minutos. Após esse período de exposição há a avaliação de edema e eritema.
Se o produto causar irritação, irá apresentar esta resposta em ambos os quadrantes,
exposto ou não à luz, mas se o produto é fototóxico a irritação aparecerá apena no quadrante
exposto à luz.
O método alternativo utiliza cultura de fibroblastos de cdg que são expostos à luz UV, a
fim de avaliar a citotoxicidade. Se na presença de luz há morte, confirma-se a
fotocitotoxicidade com a utilização do corante vermelho neutro, o qual cora apenas células
vivas.

B. Ensaios sistêmicos:
Há a distribuição do produto pelo sistema circulatório a fim de avaliar a toxicidade do
produto em diferentes órgãos.
Para os ensaios sistêmicos podem ser utilizados ratos ou cdg, os quais recebem 1
tratamento por via sistêmica (oral, percutânea, inalação e injeção sistêmica). Os objetivos
desse ensaio é a determinação da dose letal mínima, da dose máxima sem efeito tóxico, da
DL50 e da observação dos efeitos tóxicos.
Como parâmetros que são avaliados após a injeção do produto por via oral temos:
morte (principal parâmetro), peso, consumo de água e comida e alterações comportamentais.
Como método alternativo (refinamento), o teste é iniciado com 3 animais, aos quais é
administrada dose de 300 mg/Kg do produto. Se nenhum dos animais morrerem, o composto
tem perfil seguro. Então se repete o ensaio com mais 3 animais e se continuar com este perfil a
dose é aumentada para 2000 mg/Kg. Com a dose aumentada se nenhum ou apenas 1 animal
morrer, o ensaio é encerrado e a DL50 é determinada como maior que 2000 mg/Kg. Se há 2 ou
3 mortes a dose é reduzida. Neste caso há redução do número de animais (reduce) além de
ter a alteração do protocolo (refinament).

6. ENSAIOS DE POTÊNCIA RELATIVA:

Os ensaios de potência relativa medem a intensidade de resposta e a reposta biológica
comparando amostra e padrão. É denominado potência relativa, pois avalia a resposta obtida
de modo relativo, indireto. Não, necessariamente vai refletir a resposta ou atividade
terapêutica principal.
A variabilidade deve ser contornada para garantir a validade dos resultados, através de
métodos estatísticos e padrões internacionais.
Deve-se definir o delineamento e planejamento do experimento, o que ajuda a
detectar e corrigir as fontes de variabilidade. Na farmacopeia já estão sugeridos os principais
métodos experimentais.
O desenho experimental apresenta a definição de como o tratamento é designado e
quais são as unidades experimentais, apresenta algumas etapas:
  Seleção do conjunto da amostra e padrão.
 Especificação da medida experimental.
 Definição das regras para a distribuição da dose - aleatorização dos grupos.
Pode utilizar um mesmo indivíduo mais de uma vez, mas sem atribuir duas
vezes amostra ou padrão - evita variabilidade.
 Especificação da medida de registro – considerando as formas de medida mais
ou menos precisas. Avalia até que dose há efeito, geralmente não usa curva
dose resposta.
Com o desenho experimental definido, os ensaios são mais precisos e com resultados
mais válidos.
Quando a molécula do fármaco é nova e pouco conhecida, não se utiliza o modelo
animal, pois não se conhece ainda a toxicidade.
Na monografia da substância na farmacopeia sempre se encontram os limites de
variação do teor, seja para medicamentos, quanto para matérias primas. Há também a
potência declarada e, quando a substância for testada o valor pode ser próximo da potência
declarada, devendo avaliar o desvio padrão e os limites fiduciais, a fim de avaliar se a potência
relativa está dentro dos limites farmacopeicos. Para matéria prima, esses limites são mais
estreitos,
O delineamento experimental apresenta alguns tipos que podem ser empregados nos
ensaios de potência relativa:
A. Experimentos totalmente ao acaso:
Este experimento só pode ser conduzido se as unidades (animais) são similares.
Similaridade não siginifica igualdade, mas as unidades devem responder ao mesmo tratamento
de formas similares. Com os modelos animais se emprega como similaridade para formação
dos grupos mesma idade, mesmo sexo, a fim de ter no início do experimento as mesmas
características. Os grupos devem apresentar o mesmo número de repetições, sendo
recomendável que o grupo controle apresente maior número de repetições. Exige
homogenidade das condições experimentais. Podem ser empregados qualquer número de
tratamento e repetições, desde que isso aconteça de modo homogêneo.

B. Experimentos em blocos ao acaso:

Empregado quando as unidades experimentais apresentam heterogeneidade. Forma
grupos que podem ser diferentes entre si, mas no interior de cada grupo deve ocorrer a
homogeneidade, cada grupo corresponde a um bloco. Os blocos podem ser: período de
tempo, estação, ninhada, faixa de idade, etc. É muito importante que cada bloco tenha
unidades similares, mas entre os blocos haja variabilidade. E ao cada bloco apresentar
unidades similares há redução da interferência da heterogeneidade das condições na resposta
biológica.

C. Experimentos em blocos ao acaso com repetição:

O mesmo tratamento é repetido dentro de um mesmo bloco, sendo importante para o
conhecimento da variância interna de cada bloco. Cada animal será seu próprio controle a fim
de observar as variações em cada unidade similar dentro de cada bloco. O número de
unidades similares deve ser múltiplo do número de tratamentos.
 D. Ensaios cruzados:
Os animais recebem 2 tratamentos, podendo responder a amostra e padrão. É ideal
para a redução do número de animais utilizados. Elimina a variabilidade de cada animal e
aumenta a precisão. Cada grupo deve apresentar um mesmo número de repetições. Deve-se
ter cuidado na hora de escolha da resposta biológica a ser avaliada, pois os ensaios cruzados
não permitem a utilização de respostas irreversíveis como morte e convulsão. Deve existir um
espaço de tempo entre os tratamentos em cada animal, a fim de que não haja interferência.

E. Quadrado latino:
São utilizados em experimentos que precisam controlar duas fontes de variação ou
dois tipos de blocos. Os blocos podem ser organizados em linhas ou colunas, mas cada uma
delas correspondendo a um bloco completo. É importante para a pesquisa de duas ou mais
fontes de variação e o número de tratamentos deve ser igual ao número de repetições.

Os ensaios de potência relativa comparam os valores da resposta biológica entre

amostra e padrão. A estatística aliada ao desenho experimental estimam a potência,
garantindo a validade e a precisão do ensaio.
A potência relativa é uma medida de potência, porém não é potência farmacológica. É
potência relativa, justamente, pois é obtida em função da comparação com o padrão. Pode ser
realizada de duas maneiras:

i. ENSAIOS DIRETOS:
A medida é realizada
diretamente no sistema biológico,
com correlação entre dose e efeito,
em caso de respostas graduais; ou
com ensaios contendo limite da
ocorrência ou não do efeito, em
caso de respostas quantais.
As soluções de amostra e
padrão devem estar nas mesmas
doses/concentrações. As repostas
biológicas obtidas devem ter seus
valores convertidos em Log e
devem ser calculados os valores
médios dos Log das doses eficazes
de padrão (ẌP) e de amostra (ẌA). A
estimativa da potência (M’) será a diferença dos valores médios de padrão e de amostra: 𝑀′ =
ẌP − ẌA

Para ajustar a potência (M) soma-se a estimativa da potência (M’) com o log da potência
declarada (Pa): 𝑀 = 𝑀′ + 𝐿𝑜𝑔𝑃𝑎. Para achar o valor, na ordem de grandeza correta, da
potência ajustada ou da estimativa da potência, utiliza-se o antilog, obtendo, respectivamente
R e R’ , os quais devem ser somados aos valores de desvio padrão, a fim de avaliar se estão
dentro dos limites da farmacopéia.
 A variância dentro do mesmo grupo não depende da dose ou da resposta produzida.
Dentro de um mesmo grupo não se espera variabilidade, pois os animais são similares e estão
respondendo a uma mesma coisa. A variabilidade estará relacionada com interferências
externas, como problemas de seleção.

ii. ENSAIOS INDIRETOS:

A potência é determinada indiretamente, comparando as respostas produzidas em
escala quantitativa por dose de padrão com aquelas produzidas por uma ou mais doses de
amostra.
Avalia a diferença entre amostra e padrão em um mesmo nível de dose ou em outros
níveis de dose. Utiliza curva dose resposta de amostra e padrão (2 curvas), usando 2 níveis de
dose na parte linear da curva, uma vez que neste ponto há uma relação linear entre as
respostas de amostra e padrão e o Log da dose.
As retas de amostra e padrão devem ser paralelas, o que garante a semelhança entre
suas respostas, de preferência que sejam também sobrepostas, garantindo que não há
diferença entre amostra e padrão. Essa linearidade e paralelismo devem ser validados,
conforme os seguintes critérios:
 Seleção ao acaso das unidades experimentais de cada tratamento;
 As repostas (no eixo Y) devem apresentar distribuição normal;
 O desvio padrão deve ser independente do nível de resposta, devendo ser
igual para todos os tratamentos;
 As respostas (no eixo Y) devem apresentar correlação linear com o Log da dose
(no eixo X) nos intervalos determinados;
 A linha reta correspondente a uma amostra ou mais deve ser paralela a do
padrão.

O cálculo de F nos fornece a

diferença entre amostra e padrão. O
cálculo de E nos fornece o valor da
diferença entre as doses maiores (YA2
e YP2) e as menores (YA1 e YP1).

O cálculo de I fornece a
diferença entre o Log das doses. A
razão entre E e I fornece o coeficiente
angular da reta, o qual, através de sua
variância, mostra o quanto que as
retas são paralelas.

Utilizando os valores de
coeficiente angular (b) e da diferença
entre amostra e padrão (F), temos a
razão F/b que fornece o dado da estimativa da potência (M). Utilizando o antilog de M, temos
a potência na ordem de grandeza adequada (R) , a qual deve ser somado os valores de desvio
padrão, a fim de verificar se há enquadramento nos limites da farmacopeia. A potência relativa
será dada pelo produto de R com a potencia declarada.