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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA


RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE LARBI BEN M’HIDI OUM EL BOUAGHI
FACULTE DES SCIENCES EXACTES ET SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

Cours

La technologie des fermentations

Proposé par :
Dr. Lamia AOUAR

Destiné aux étudiants :

1ère année Master Microbiologie Appliquée

Année universitaire 2015/2016


Il n’existe aucun domaine de l’activité humaine, que ce soit
l’industrie ou l’agriculture, l’alimentation, les problèmes de
construction ou d’habillement, le maintien de la santé humaine ou
animale et le combat contre les maladies, où le microorganisme ne
joue un rôle important et souvent dominant.
SELMAN A. WAKSMAN, 1943
Préface

Les microorganismes sont capables de croître sur une large gamme de substrats et peuvent
produire de nombreux métabolites. La technologie de fermentation est un terme générique
appliqué au processus commerciaux qui repose sur la capacité des microorganismes à
produire des molécules utiles. La majorité des microorganismes utilisés commercialement
pour réaliser des fermentations, comme des actinomycètes sont aérobies, ne poussent pas dans
des conditions anaérobies et ne réalisent pas une fermentation.

La technologie de la fermentation est née avec les premières civilisations, qui ont
exploitées les capacités des microorganismes à produire des boissons alcoolisés, du pain et du
fromage. Durant la première moitié du vingtième siècle, les productions de vin et de bière, du
vinaigre et de levure de boulangerie, sont passées des méthodes artisanales anciennes aux
techniques scientifiques établies. Ainsi, les processus microbiens à grande échelle pour
l’industrie de production des acides citrique et lactique ont été développés. Aussi, l’acétone, le
butanol et l’éthanol étaient produits par fermentation.

La seconde moitié du vingtième siècle a connu des changements considérables dans


l’industrie de la fermentation. La plupart de ces changements ont pour origine la découverte
des antibiotiques comme arme efficace contre les maladies. D’autres produits générés par les
microorganismes, incluant des vitamines, des stérols, des acides organiques, des acides
aminés, des agents aromatiques, des enzymes et des boissons ou aliments fermentés ont pris
une grande importance commerciale. En plus le développement des manipulations génétiques
a permis d’étendre le spectre des métabolites produits par des microorganismes et de
développer de nouveaux procédés.

La fermentation industrielle a donné des produits qui ont influencé directement notre
vie de multiples façons. Ces produits ont profondément changé notre vie et espérance de vie.
Il y a les produis industriels et agricoles, les additifs alimentaires, les produits
pharmaceutiques pour la santé humaine ou animale et les biocombustibles.

Ce cours a été rédigé afin de présenter aux étudiants le domaine remarquable de la


technologie des fermentations. Les quatre chapitres traitent les différents aspects de la
fermentation industrielle à savoir : l’obtention et l’amélioration des microorganismes
industriels, la description des procédés et les principaux produits de fermentation
commercialisés; ainsi que leurs utilisations dans divers domaines.
Table des matières

Préface

Chapitre 1
1-Isoler les microorganismes industriels 1
1.1-Isolement et sélection des souches microbiennes productrices d’enzymes 1
1.2-Isolement des microorganismes producteurs d’antibiotiques 2
1.2.1-Isolement des souches d’actinomycètes 2
1.2.2-L’isolement des champignons 3
2-Criblage de souches pour la recherche de nouveau antibiotiques 3
2.1-Recherche de nouveaux antibiotiques 4
2.2-Tests sur animaux 5
3-L’amélioration des microorganismes industriels 5
3.1-Mutagénèse 7
3.1.1-Agents physiques 7
3.1.2-Agents chimiques 7
3.1.3-Combinaison de traitements 8
3.2-Manipulation du génie génétique 8
3.2.1-Les protoplastes 8
3.2.1.1-Les avantages des protoplastes 8
3.2.1.2-Obtention et régénération des protoplastes d’actinomycètes 9
3.2.1.3-Fusion des protoplastes d’actinomycètes 9
3.3-L’insertion de courtes séquences d’ADN 9
3.4-Modification de l’expression des gènes 10
4- Les critères de choix d’un microorganisme industriel 10

Chapitre 2
1-Le choix des matières premières 11
2-Les éléments du milieu 12
2.1-L’eau 12
2.2-Les sources de carbone et d’énergie 12
2.2.1-Les oses et leurs dérivés 12
2.2.2-Les acides gras et leurs dérivés 13
2.3-Les sources d’azotes 13
2.4-Les sels minéraux 13
2.5-Additifs 13
2.6-Les gaz dissous 14
3-L’élaboration du milieu 14
4-Stérilisation 14
5-Composition de quelques milieux de culture industriels 15
5.1-Milieux pour production d’enzymes d’origine microbienne 15
5.2-Milieux de production d’acides organiques 15
5.3-Milieux de production d’antibiotiques 15
5.4-Milieu de production de l’endotoxine de Bacillus thuringiensis 16
5.5-Milieu de production des acides aminés 16
Table des matières

5.6-Milieux de production des vitamines 16


5.7-Milieu de production de l’acide gibbérellique (A3) 17
5.8-Milieu de production de l’éthanol. 17

Chapitre 3
1-Les fermenteurs 18
1.1-Fermenteur à agitation mécanique 18
1.2-Les fermenteurs à agitation d’air 19
1.3-Les fermenteurs à boucles 19
2-Les critères de choix d’un procédé de fermentation 20
3-Systèmes de fermentation 20
3.1-Systèmes en phase liquide 20
3.1.1-Culture en discontinu 20
3.1.2-Culture discontinue alimentée 21
3.1.3-Culture continue 22
3.1.3.1-La technique du turbidostat 22
3.1.3.2-La technique du chémostat ou bactogène 22
3.2-Systèmes en phase solide 24
3.3-Systèmes immobilisés 26
4-Mesure et contrôle des paramètres de culture 26
4.1-Les paramètres physico-chimiques 28
4.2-Les paramètres microbiologiques 30
4.2.1-Population cellulaire 30
4.2.2-Les paramètres de cultures à contrôler 31
5-Paramètres utilisés lors de la production 32
5.1-Paramètres de croissance 32
5.2-Cinétique d’apparition des produits, quantification 33
5.3- Bilan l’apparition des produits de fermentation 34

Chapitre 4
1- Antibiotiques 36
1.1-Exemples de quelques antibiotiques produits par voie microbienne 36
1.1.1-Pénicilline 36
1.1.2-Céphalosporines 36
1.1.3-Streptomycine 37
1.1.4-Érythormycine 37
1.1.5-Rifamycine
1.1.6-Rifampicine 37
1.1.7-Tétracyclines 37
1.1.8-Spiramycine 37
Table des matières

1.2- La production des antibiotiques par les actinomycètes 38


2-Les enzymes 39
2.1-Les amylases 40
2.2-Les glucoamylases 40
2.3-Les protéases 40
2.4-L'asparaginase 41
2.5-Les pénicillines acylases 41
2.6-La Taq polymérase 41
2.7-Autres enzymes 41
3-Les acides organiques 42
3.1-L’acide lactique 42
3.2-L’acide glutamique 42
3.3-L'acide citrique 42
3.4-L'acide itaconique 43
3.5-L’acide succinique 43
3.6-Autres acides organiques 43
4-Les acides aminés 44
5-Les vitamines 45
5.1-La vitamine B12 45
5.2-La riboflavine 45
5.3-La vitamine C 46
6-Biocides 46
7-Les protéines d’organismes unicellulaires (POU) 46
8-Biogaz 48
8.1-Production du biogaz 48
8.2-Les utilisations de biogaz 49
8.3-Biogaz et environnement 49
9-Biocarburants 50
9.1-Biodiesel 50
9.2-Bioéthanol 50
10-Les biosurfactants 51
11-Les biopolymères 51
12-Hormones 52
12.1-L’hormone de croissance humaine 52
12.2-L’insuline humaine 53
13-Vaccins 53
14-Autres produits de fermentation industrielle 54
15-Biotransformations 55

Bibliographie 56
Chapitre 1 Isolement, criblage et amélioration des microorganismes industriels

Les microorganismes qui produisent un composé dans leurs conditions naturelles, sont
susceptibles de le produire en quantité accrues dans des conditions de laboratoire. Aussi, une
croissance non optimale en laboratoire peut également conduire à l’expression de
l’information génétique spécifique, et à la production accrue de certains métabolites tels que
les antibiotiques.
La sélection et l’emploi des microorganismes en microbiologie industrielle et en
biotechnologie requièrent une bonne connaissance de la culture et de la manipulation des
microorganismes ainsi que leurs interactions avec les autres microorganismes. Avant tout
processus en microbiologie industrielle, il est nécessaire d’abord d’identifier ou de créer un
microorganisme qui effectue le processus désiré da la façon la plus efficace. Pour obtenir ces
microorganismes, plusieurs approches sont disponibles qui vont de l’isolement du
microorganisme à partir de l’environnement, jusqu’aux techniques moléculaires sophistiquées
pour modifier un microorganisme déjà existant.

1-Isoler les microorganismes industriels


Dans le but d’isoler des microorganismes possédant les caractéristiques voulues, des
échantillons naturels sont analysés. Ainsi, des cultures de matières naturelles (sol, eau, etc.)
provenant de toutes les parties du monde ont été analysées. Dans la plupart des milieux
seulement une partie des microorganismes ont été isolés et cultivés. Ainsi, l’effort se poursuit
à travers le monde pour trouver de nouveaux microorganismes même dans les milieux qui ont
été explorés depuis des décennies.

1.1-Isolement et sélection des souches microbiennes productrices d’enzymes

Les microorganismes qui sont capables de produire des enzymes de dégradation de certains
composés sont généralement localisés où ces substances sont abondantes. Par exemple, des
microorganismes secrétant des cellulases sont nombreux dans les sols des forêts. Les
méthodes d’isolement sont des méthodes classiques avec des milieux sélectifs. Dans le milieu
sélectif idéal, le substrat de l’enzyme est la seule source de l’un des éléments vitaux. Par
exemple, L’amidon comme seule source de carbone pour isoler les microorganismes
possédant une amylase. Les souches isolées pour être définitivement retenues doivent
présenter un certain nombre de caractéristiques :
- Se développer sur un milieu simple bon marché
- Produire le moins possible de métabolites secondaires, comme les antibiotiques

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Chapitre 1 Isolement, criblage et amélioration des microorganismes industriels

- Excréter l’enzyme de façon à ce que celle-ci soit facilement séparée et purifiée et ne


pas conduire à différents polluants
- Ne pas être pathogène ou produire des composés toxiques
- Si la préparation enzymatique va entrer en contact avec les aliments, la souche doit
avoir le caractère d’alimentarité, c’est-à-dire faire partie des souches G.R.A.S.
(Generaly Recognizer As Safe).
La capacité de production de la souche doit être préservée et tout risque de
contamination doit être éliminé. Pour cela, il faut éviter un trop grand nombre de cultures
successives. Il est préférable d’ensemencer un flacon de milieu gélosé directement à partir de
la souche lyophilisée puis, à partir de cette culture, d’ensemencer un seul fermenteur qui
servira lui-même d’inoculum pour le fermenteur industriel. Le volume de l’inoculum
représente généralement de 3 à 10 % du volume du milieu de production.

1.2-Isolement des microorganismes producteurs d’antibiotiques


Le sol est devenu le principal réservoir de microorganismes producteurs d’antibiotiques. La
grande majorité de souches productrices d’antibiotiques a été isolée du sol. Cependant,
d’autres niches écologiques contiennent des microorganismes potentiellement producteurs de
métabolites secondaires : matériaux en décomposition, des sédiments, des excréments, des
eaux marines ou douce, des lichens, des mousses et plantes.
L’un des objectifs d’isolement est la recherche de nouvelles souches avec l’espoir
qu’elles produisent de nouveaux métabolites secondaires. Les actinomycètes et surtout les
Streptomyces sont de meilleurs producteurs d’antibiotiques. Cependant, les Streptomyces ont
été très exploités. Il faut continuer à isoler des espèces de ce genre mais en essayant de
trouver des espèces rares.

1.2.1-Isolement des souches d’actinomycètes


Certaines souches détectées par observation directes ne se développent pas en condition de
laboratoire. Le choix du milieu est un point critique, trop de substrats favorisent les
champignons et les bactéries à croissance rapide. Pour se débarrasser de ces germes
envahisseurs et sélectionner d’autres espèces, un traitement des échantillons et le
développement de milieux appropriés sont indispensables. Il n’existe pas une méthode
universelle pour l’isolement de tous les types d’actinomycètes.

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Chapitre 1 Isolement, criblage et amélioration des microorganismes industriels

-Pour certain groupes d’actinomycètes l’isolement est parfois aisé : les actinomycètes
acidophiles sont les seuls capables de se développent à pH 4,5. Il existe également des germes
basophiles ou halophiles qui seront isolés sur des milieux appropriés par exemple à 4,5%
NaCl. Les actinomycètes carboxytrophes, capables d’utiliser le monoxyde de carbone comme
seule source de carbone et d’énergie, peuvent être isolés en utilisant un milieu minimal en
présence de monoxyde de carbone, qui agit comme agent sélectif idéal pour sa haute toxicité
pour les autres microorganismes.
-Les contaminations par les champignons sont supprimées par l’addition d’antifongiques tels
que l’actidione et la nystatine (50 µ/ml). Cependant les bactéries sont éliminées par les
antibactériens tels que le chloramphénicol, la kanamycine et la tétracycline.
-Dans certains cas l’objectif est de trouver des microorganismes producteurs d’une famille
particulière d’antibiotiques, le procédé est basé sur le fait qu’un microorganisme producteur
d’un antibiotique est plus résistant que les autres à cet antibiotique. Cette stratégie a été
utilisée avec succès dans le cas des glycopeptides et des aminosides.

1.2.2-L’isolement des champignons


L’isolement des champignons est devenu plus facile après la découverte d’agents
antifongiques spécifiques, ainsi des milieux spécifiques pour Phytophotora et Fusarium ont
été créés. Pour l’isolement des champignons producteurs d’antibiotiques, l’addition d’agents
surfactants ou de cyclosporine limite la taille des espèces à croissance rapide. Ainsi, la
formation de colonies à dimension réduite permet d’obtenir une population plus variés et
facilite la mise en culture pure.

2-Criblage de souches pour la recherche de nouveau antibiotiques


- Parmi les microorganismes du sol, la production de métabolites antimicrobiens est une
propriété banale. Mais la question qui se pose aujourd’hui n’ai plus savoir si l’on peut isoler
des souches possédant une activité antimicrobienne mais comment faire pour découvrir de
nouvelles molécules thérapeutiques humaines.
- Si les nouveaux antibiotiques naturels ne sont pas directement utilisables en clinique, ils
peuvent être utilisés comme structure de base dans la synthèse chimique. Par exemple en
1984, 60 molécules semi synthétiques à utilisation clinique en médecine humaine contre 11
molécules naturelles seulement.
-Selon les méthodes de criblage et les objectifs, la découverte d’un antibiotique nécessite
l’examen de quelques centaines à plusieurs milliers de souches :

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Chapitre 1 Isolement, criblage et amélioration des microorganismes industriels

*pour la recherche de nouveau glycopeptides une souche positive a été détectée parmi 320
microorganismes testés.
*les invermectines ont été trouvés après l’examen in vitro de 2000 cultures
*par contre, le criblage de plus de 20000 cultures était nécessaire pour la découverte de
nouveaux aminosides.
*plus d’un million de bactéries ont été analysées pour la découverte de nouveaux types de
bêta-lactame.
Stratégie de criblage : elle met en œuvre 3 étapes :
Criblage primaire : consiste à tester les souches cultivées sur milieux solides en utilisant la
technique des cylindres d’agar ;
Criblage secondaire : a pour but la production en milieu liquide ;
Criblage tertiaire : constitue une étape de caractérisation précoce des métabolites
potentiellement originaux.

2.1-Recherche de nouveaux antibiotiques : le critère indispensable pour la recherche de


toute molécule nouvelle est le développement d’un système appelé tri, criblage ou screening.
Que le criblage soit réalisé pour des inhibiteurs, de nouvelles enzymes ou des acides
organiques ou aminés, un dosage efficace est indispensable. Une des procédures possibles
pour la recherche d’antibiotiques est la suivante :
 Identification d’une source de producteurs potentiels. dans la recherche d’antibiotiques,
toutes les expériences passées indiquent que les actinomycètes constituent les
microorganismes les plus intéressants à trier. Les meilleures sources pour en récolter sont les
sols, composts ou boues à pH neutre ou légèrement alcalin.
 Isolement des organismes : l’isolement est généralement réalisé en étalant des dilutions
convenables de sol sur la surface de boîtes de Pétri contenant de la caséine hydrolysée
(origine animale), du soja (origine végétale) et des extraits de levures (origine microbienne).
Le contenu en sucre doit être maintenu bas pour limiter la croissance rapide des Pseudomonas
et des Bacillus par rapport à la croissance lente des actinomycètes. Les colonies compactes
d’actinomycètes sont apparentes et facilement identifiables pour un technicien expérimenté.
 Le test préliminaire sur boîte : la capacité des microorganismes isolés à produire une
substance antibiotique est recherchée en utilisant un test sur boîte d’agar. Streptomyces et
d’autres actinomycètes forment des colonies compactes lorsqu’elles sont « striées » sur une
boîte. Après plusieurs jours, les organismes tests sont étalés à la perpendiculaire de
l’actinomycète. Des bactéries Gram-positives et Gram-négatives sont généralement utilisées

Dr Lamia AOUAR 4
Chapitre 1 Isolement, criblage et amélioration des microorganismes industriels

pour réaliser ce test. Une mycobactérie peut être utilisée pour sélectionner des antibiotiques
antituberculeux et une levure pour les antifongiques.
Si la zone d’inhibition est significative pour au moins un des quatre organismes testés,
l’actinomycète est retenu pour l’étape suivante.
 Essai pour une nouvelle activité : compte tenu du vaste nombre d’antibiotiques connus, la
très grande majorité des activités découvertes sont dues à un antibiotique déjà décrit. Il est
ainsi primordial que les producteurs d’antibiotiques déjà décrits soient éliminés rapidement du
tri.
 Criblage avancé de cultures : à cette étape, si l’activité apparaît nouvelle, le
microorganisme isolé est soumis à une série de procédures pour augmenter la production.
L’expérience nous indique que les microorganismes nouvellement isolés produisent
seulement quelques microgrammes d’antibiotique par millilitre, et synthétisent généralement
une série d’antimicrobiens apparentée de sorte qu’aucun d’entre eux n’est produit en quantité
significative. Des paramètres variés sont testés pour leurs effets positifs sur la production
d’antibiotique : pH, aération, substrat de croissance, durée de fermentation, et d’autres
conditions. Ces efforts pour augmenter la quantité d’antibiotique produit sont suivis par des
techniques de dosage pour s’assurer que l’activité antimicrobienne détectée est identique à
celle de l’isolat original. Des résultats favorables vont conduire à la production dans des
fermenteurs à l’échelle du laboratoire. Des chimistes sont alors mis à contribution pour
identifier la substance antimicrobienne. Si le composé apparaît toujours nouveau, des tests sur
animaux sont réalisés.

2.2-Tests sur animaux : des tests sur des souris sont réalisés pour déterminer si le composé
est toxique ou s’il est détruit par les enzymes de mammifères. De tels tests déterminent si
l’antimicrobien est effectif in vivo. Si tout se déroule bien, l’antibiotique est testé sur des
animaux supérieurs puis sur des humains avant, en de rares cas, de se retrouver en pharmacie.
Les antibiotiques peuvent être classés en fonction de leur spectre antimicrobien, leur
mécanisme d’action, la souche productrice, la voie de biosynthèse ou la structure chimique.

3-L’amélioration des microorganismes industriels


Quand une souche est isolée pour la première fois d’un environnement ou sélectionnée à
partir d’un stock d’une collection de culture, ce producteur potentiel de produits d’intérêt
industriel n’est pas très différent des espèces proches. Cependant, l’amélioration rigoureuse

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Chapitre 1 Isolement, criblage et amélioration des microorganismes industriels

des souches à partir de la culture originale est nécessaire avant une exploitation commerciale
rentable du produit synthétisé.
Les microorganismes industriels utilisés pour la synthèse des produits commerciaux
sont des spécialistes hautement sélectionnés qui ne survivraient pas probablement pas dans
des conditions autres que les conditions de laboratoires. Choisis pour leur stabilité génétique
au cours des processus de fermentation et leur efficacité de production, ils présentent une
croissance rapide et produisent des molécules d’intérêt dans une période de temps
relativement courte. De telles souches ne doivent généralement pas être nuisibles à l’homme
ni à l’environnement.
Deux procédures standards sont utilisées pour améliorer les microorganismes
susceptibles de générer des métabolites utiles : la mutation et la sélection. Cette technique a
augmenté considérablement la production, le cas de la pénicilline est le plus connu. Suite à
l’amélioration la production est passée de quelques milligrammes à 40 g/l. La production de
la lancomycine produite par Streptoverticillium kitasatoensis a été améliorée par la mutation –
sélection (Tableau 1).
Tableau 1 : amélioration de la souche Streptoverticillium kitasatoensis productrice de la
lancomycine.

Nombre de cycle de mutation-sélection Production de lancomycine mg/l


Souche originale 70
10 1200
20 2800
30 5600
40 9200
50 11000

L’objectif principal de la mutation-sélection est l’augmentation de la production mais


aussi d’autres types de mutants peuvent être recherchés : la synthèse d’un seul métabolite
secondaire, la production de nouvelles molécules, la capacité de produire des métabolites sur
des milieux bon marché.
Le taux de mutation naturelle est de l’ordre de 10-5 à 10-10 ce taux peut être augmenté
-2
jusqu’à 10 à 10-3 par l’utilisation d’agents mutagènes. L’homogénéité et la pureté de la
souche sont d’abord contrôlées avant de passer à la mutation. Les procédés utilisés pour

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Chapitre 1 Isolement, criblage et amélioration des microorganismes industriels

l’amélioration de la souche sont : les agents physiques, les agents chimiques, la combinaison
de traitement et les méthodes de manipulation génétique.

3.1-Mutagénèse
3.1.1-Agents physiques
La lumière ultra violette (254 nm) et les radiations ionisantes ont été couramment utilisées.
Les UV induisent des substitutions et surtout des erreurs lors de la réparation de l’ADN
(fonction SOS). Les UV sont facile à utilisés est sont peu dangereux. Le traitement s’effectue
par la mise en suspension des cellules dans un tampon TES à pH7 dans une boite de Pétri en
verre. La suspension est maintenu homogène par agitation. La lampe bactéricide est fixée à
une distance de 20 à 30 cm.
Les radiations ionisantes, rayons X ou gamma provoquent des dommages et des
modifications très importantes du matériel génétique, sont à déconseillées dans un programme
d’amélioration de souches.

3.1.2-Agents chimiques
a/ Les agents alkylants
Parmi les substances chimiques, les agants alkylants sont les plus utilisés entre autres :
-L’éthyl-méthansulfonate (EMS) : dans le cas de traitement (EMS), les cellules en phase de
croissance sont incubées dans un tampon potassium additionné de 0,5 à 3 % EMS et ceci
durant 15 à 20 minutes.
-N-méthyl-N’-nitro-N nitrosoguanidine (NTG) : le NTG induit plusieurs changements de
bases de l’ADN au niveau de la fourche de duplication.
Il existe d’autres agents alkylants, entre autres le méthyl-méthansulfonate (MMS) et le
diépoxybutane (DCP).

b/ Les agents non alkylants


-l’hydroxylamine
-4 nitroquinoline-oxyde (NQQ) ou l’acide nitreux.

c/ Les bases analogues


-5-bromouracile (analogue de la thymine)
-2 aminopurine (analogue de l’adénine)

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Chapitre 1 Isolement, criblage et amélioration des microorganismes industriels

d/ Agents intercalants
-acridine orange
-bromure d’éthidium
Les agents intercalants comme l’acridine orange ou le bromure d’éthidium, ainsi que
les analogues de bases nucléiques telles que le 2-aminopurine et la 5-bromouracile ne sont pas
efficaces dans l’induction de mutations stables chez les actinomycètes et les champignons.
NB : tous ces agents mutagènes sont cancérigènes et doivent être manipulés avec une grande
prudence.

3.1.3-Combinaison de traitements
Il est possible de traiter les cellules avec un agent mutagène chimique puis avec la lumière
UV. En plus, l’addition de certaines substances augmente le taux de mutation. La caféine par
exemple inhibe les mécanismes de réparation de l’ADN et l’acide nalidixique augmente le
taux de réparations erronées.

3.2-Manipulation du génie génétique


3.2.1- Les protoplastes
Le terme protoplaste désigne une structure cellulaire exempte des composants de la paroi.
L’obtention des protoplastes viables a révolutionné les techniques génétiques permettant les
fusions intraspécifiques avec des taux élevés, certaines fusions interspécifiques et des
transformations.
Actuellement, la fusion des protoplastes est largement utilisée. Pour la préparation des
protoplastes on cultive les cellules dans une solution isotonique tout en les traitant par des
enzymes tels que la B-galacturonidase. Les protoplastes sont ensuite régénérés en utilisant des
stabilisateurs osmotiques comme le saccharose. Lorsqu’il y a formation d’hybrides les
recombinants désirés sont identifiés par les techniques sélectives d’étalement sur boites.
Après régénération de la paroi, le produit de la fusion des protoplastes peut servir à des études
antérieures.

3.2.1.1-Les avantages des protoplastes


-fusions interspécifiques : un grand avantage de la technique de fusion des protoplastes est de
pouvoir fusionner des protoplastes de différentes espèces microbiennes même si elles ne sont
pas très proches. Par exemple on a fusionné des protoplastes de Penicillium roqueforti et de
Penicillium chrysogenum. Même des protoplastes de levures et des érythrocytes peuvent être
fusionnés.

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Chapitre 1 Isolement, criblage et amélioration des microorganismes industriels

-taux élevé de recombinant : il est généralement élevé pour toutes les régions du chromosome
et plus important que celui obtenu avec la conjugaison (10-3 à 10-7) ;
-taux élevé de Crossing-over multiple : ils peuvent atteindre une fréquence de 25% contre 1 à
2% pour la conjugaison ;
-utilisation possible de plus de deux parents.

3.2.1.2-Obtention et régénération des protoplastes d’actinomycètes


- La croissance des cellules dans un milieu contenant de la glycine (empêche la
formation du peptidoglycane). La fin de la croissance logarithmique (dans beaucoup
de cas : 48 à 72 heures) constitue la phase idéale pour l’obtention des protoplastes.
- La lyse totale du mycélium par incubation dans une solution osmotiquement stable
(lysozyme à 2 mg/ml, saccharose, sulfate de magnésium)
- Régénération des protoplastes : par passage de la solution sur laine de verre suivi
d’une centrifugation ou bien on utilise un gradient de saccharose. La solution des
protoplastes est diluée dans un milieu osmotiquement stable contenant le Ca+2 et Mg+2.

3.2.1.2-Fusion des protoplastes d’actinomycètes: pour être optimale la fusion nécessite


l’intervention d’agents chimiques dits fusogènes, le plus efficace est le polyéthylène glycol
(PEG) (Pm 1000 avec 50% P/V). La fusion est stimulé par les ions Ca+2 et parfois le diméthyl
sulfoxyde qui augmente la fréquence des fusions. Une à quelques minutes suffit à la fusion
dans un milieu tamponné en présence du PEG. Les protoplastes fusionnés sont étalés sur des
milieux nutritifs gélosés de régénération. Le taux de recombinants peut être augmenté jusqu’à
30% grâce au rayons UV ou bien grâce au chauffage de la solution des protoplastes de l’une
des souches parentales.

3.3-L’insertion de courtes séquences d’ADN


Courtes séquences d’ADN synthétisées chimiquement peuvent être insérées dans des
microorganismes hôtes. Donc on peut créer de petites modification génétiques qui induisent
le changement d’un ou de plusieurs acides aminés dans la protéine cible. On a constaté que
dans beaucoup de cas des changements mineurs entrainent des modifications inattendues dans
les caractéristiques des protéines et donnent de nouveaux produits : enzymes plus résistantes
aux conditions environnementales.
Cette technique ou approche fait partie du domaine de l’ingénierie des protéines.
Grace à cette approche on peut construire des enzymes et des peptides biologiquement actifs
avec des caractéristiques nettement différentes (stabilité, cinétique, activités, etc.). Un des

Dr Lamia AOUAR 9
Chapitre 1 Isolement, criblage et amélioration des microorganismes industriels

domaines les plus intéressants est la conception de sites actifs d’enzymes qui pourrait
modifier les substrats non naturels (la biodégradation du plastique).

3.4-Modification de l’expression des gènes


En plus d’insérer des gènes nouveaux dans certains microorganismes, il est aussi possible de
modifier la régulation génétique en touchant à la transcription, en fusionnant des protéines et
en supprimant des contrôles de rétrorégulation. Ces approches permettent de surproduire une
large variété de produits. Cette approche peut aussi consister en un changement intentionnel
de voies métaboliques par inactivation ou dérégulation de gènes spécifiques. C’est le domaine
de l’architecture des voies métaboliques. La production de la pénicilline a ainsi été améliorée
par ingénierie des voies métaboliques. Cette technique a permis aussi de produire des
variantes de l’érythromycine par blocage des étapes biochimiques spécifiques dans les voies
de biosynthèse d’un précurseur de l’antibiotique, conduit à des produits finals modifiés.

4- Les critères de choix d’un microorganisme industriel

1-Les caractéristiques nutritionnelles du microorganisme: il est souvent nécessaire qu'un


processus de fermentation soit effectué à l'aide d'un milieu le moins coûteux.
2-La température optimale de croissance: l'utilisation d'un microorganisme ayant une
température optimale supérieure à 40 ° C permet de réduire considérablement les coûts de
refroidissement d'une fermentation à grande échelle.
3-L'aptitude du microorganisme à s’adapter au type de procédé mis en œuvre.
4-La stabilité du microorganisme et sa susceptibilité aux manipulations génétiques
5-La productivité du microorganisme, mesurée par sa capacité à convertir le substrat en un
produit et à obtenir un rendement élevé de produit par unité de temps.
6-La facilité de récupération du produit à partir de la culture.
Les microorganismes subissent des traitements de manipulations génétiques dans le but :
- d’augmenter leur productivité spécifique
- de diversifier leur capacité à utiliser efficacement certaines matières premières pour faire
face à des difficultés d’approvisionnement
- d’améliorer les caractéristiques rhéologiques des cultures car l’emploi des souches rendant
le milieu de culture trop visqueux est à éviter
- de modifier le spectre de métabolites produits.

Dr Lamia AOUAR 10
Chapitre 2 Milieux de cultures dans les procédés industriels

Le milieu de culture industriel approprié doit :


- favoriser la croissance de la souche à toutes les étapes de la production;
- assure une production maximale : c-à-d la quantité de produit formé pendant la phase de
production est plus ou moins proportionnelle à la biomasse formée pendant la phase de
croissance (trophophase).

1-Le choix des matières premières


Le milieu de culture d’un microorganisme est critique parcequ’il peut influencer la
compétititivité économique d’un procédé particulier. Fréquement, des matières brutes peu
coûteuses servent de sources de carbones, d’azote, de phosphore et de facteurs de croissance.
C’est le cas des hydrolysats végétaux bruts. Les sous produits de barsseries sont aussi souvent
employés car il ne coûtent pas cher et sont diponibles en quantité. Il ya d’autres sources de
carbone, comme les melasses et le petit-lait obtenu lors de la fabrication du fromage.
-Les mélasses de betteraves et de canne à sucre : riches en saccharose, permettent
d’obtenir des biomasses protéiques ou des levures pour la panification.
-Le lactosérum : est un exelenet milieu de culture permettent le developemet des levures
utilisant le lactose
-Les liqueurs sulfiriques : résidus de la fabrication de la pate à papier, riche en pentose anisi
que les hydrolysats cellulosiques provenant de dechets forstiers.
-L’amidon : est utilisé comme matière première pour la production industrille des protéines.
Les cultures en fermenteurs utilisent des matières premières ne garantissent pas toujours une
production maximale, leurs critères de choix sont :
- Le prix d’acquisition et de stockage : certains prix sont instables et dépendent des
marchés internationaux, surtout les protéines (farine de soja…) qui peuvent varier au
double. De 15 à 25% sont représentés par le milieu de culture.
- Leur disponibilité et la constance de leur qualité : dans le cas de qualité inconstante de
matières premières, la même souche cultivée de la même manière peut donner des
variations de production de plus de 20%.
- Leur stabilité au stockage.
- Le cout de stérilisation qui peut varier en fonction de la viscosité du milieu (présence
d’amidon)
- Leurs caractéristiques rhéologiques et tensio-actives : une viscosité élevée est
défavorable à l’aération et l’homogénéisation du milieu, et demande une plus forte

Dr Lamia AOUAR 11
Chapitre 2 Milieux de cultures dans les procédés industriels

énergie d’agitation. La présence de mousses entraine des débordements de la cuve et


la consommation excessive de produits anti-mousses.
- Ces matières doivent être exemptes de substances toxiques
- Utilisation des procédés d’extractions aussi simples que possible.

2-Les éléments du milieu


2.1-L’eau
Les fermentations industrielles utilisent en général des eaux provenant des nappes
phréatiques, ces eaux ne sont jamais pures et leur qualité est adaptée à chaque type de
fermentation. L’eau adoucie, déminéralisée, déionisée sont obtenues par des techniques de
filtrations sur membranes et la résine échangeuse d’ions. La qualité d’eau est déterminée par
les traces de matières qu’elle contient. La qualité d’eau est un élément important pour obtenir
des cultures optimales et reproductibles.

2.2-Les sources de carbone et d’énergie


On trouve dans cette catégorie, les oses, les polyholosides, les acides gras, les triglycérides.
2.2.1-Les oses et leurs dérivés
Le glucose est une excellente source de carbone très répondue pour stimuler la croissance
microbienne. Mais le glucose peut avoir des effets indésirables sur la production de
métabolites secondaires. Cet effet peut être réduit par :
- L’addition du glucose pendant la phase de croissance (technique d’alimentation en
continue ou Fed batch), pour favoriser au maximum la croissance au début de la
fermentation et ne fournir pendant la phase de production que des quantités minimales
non inhibitrices.
- L’emploi de source lentement métabolisées, comme par exemple le lactose, pour la
production de la pénicilline. Le lactose est d’abord hydrolysé en glucose et galactose,
le glucose est hydrolysé en premier puis le galactose sera converti pour suivre la
même voie que le glucose. Donc la concentration en glucose reste faible et n’inhibe
pas la synthèse.
- D’autres sucres à consommation lente sont le saccharose et les polymères de glucose
hydrolysables par la cellule tels que dextrines, amidon, etc. Les mélasses de sucres
sont souvent préférées au saccharose à cause de leur prix moins élevé. Elles sont
riches en saccharose mais elles contiennent aussi d’autres métabolites.

Dr Lamia AOUAR 12
Chapitre 2 Milieux de cultures dans les procédés industriels

2.2.2-Les acides gras et leurs dérivés


Ils se trouvent dans les huiles sous forme de triglycérides. Les huiles les plus utilisées sont les
huiles de soja, d’arachide, de mais et de colza. Les acides gras peuvent remplir des fonctions
multiples :
- Ils peuvent être utilisés comme source de carbone et d’énergie.
- Ils exercent des actions physico-chimiques liées à leur propriété tensio-actives :
formation d’émulsion, encapsulage de matériaux hydrophobes, réduction des mousses,
etc.

2.3-Les sources d’azotes


Le microorganisme est normalement capable de synthétiser toutes ces molécules azotées à
partir de l’ion (NH4+), cette synthèse demande de l’énergie et du temps. Il est possible que la
souche ayant subi plusieurs traitements ait perdu quelques capacités prototrophiques.
Dans les milieux synthétiques l’ion ammonium est apporté sous forme de chlorure
d’ammonium, dans les cultures industrielles par contre on utilise des sources d’azotes
naturelles comme les farines de soja ou d’arachide. Ces farines de soja sont riches en
protéines et apportent en même temps des acides nucléiques, des vitamines, des oligo-
éléments, des lipides, des sucres, du soufre et du phosphate.
NB : en plus de son rôle de fournisseur d’azote, l’ion ammonium a la capacité de réguler
certaines étapes qui participent à la production d’antibiotiques. Il est important de maitriser la
concentration de l’ion ammonium dans le milieu de culture.

2.4-Les sels minéraux : les rôles joués par les sels minéraux sont très divers :
-éléments constitutifs des antibiotiques (P, S, Cl…)
-éléments constitutifs de la biomasse (Mg, P, Cl, Ca, Fe,..)
- responsable de la pression osmotique (NaCl, KCl,….)
-modificateur de pH (NaH2PO4, CaCO3,….)
-intermédiaire d’oxydo-réduction (Cu++, Fe (CN)6 -3)
-agent de complexation et de précipitation (SO4-2, HPO4-2, CO3-2,…)
-catalyseurs de réaction (Mg+2, Mn+2, CO+2, Fe+2/+3, Zn+2, Mo++).

2.5-Additifs
Le terme additif désigne les produits qui stimulent la synthèse par exp : les antibiotiques.

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Chapitre 2 Milieux de cultures dans les procédés industriels

 Les précurseurs : c’est des molécules intermédiaires qui servent de substrats de


départ aux réactions suivantes, au cours de la biosynthèse des antibiotiques par
exemple.
- Dans une production de pénicilline, l’acide phénylacétique est le précurseur.
- La cystéine est un précurseur dans la synthèse de céphalosporines.
 Les régulateurs de biosynthèse : la biosynthèse des molécules peuvent être régulées
par des activateurs, des inducteurs ou répresseurs. Par exemple le glutamate stimule la
production de pénicillines.
 Autres additifs : il existe d’autres additifs qui agissent par exemple sur la
perméabilité de la paroi ou qui complexe les molécules inhibitrices.

2.6-Les gaz dissous


Parmi les gaz dissous qui intervient dans le métabolisme des microorganismes producteurs de
molécules, le seul important est l’oxygène. Dans les cultures du laboratoire l’oxygène est
disponible à partir de l’air ambiant mais dans le fermenteur à partir de l’air comprimé et
stériliser par filtration. La difficulté consiste à le dissoudre rapidement pour couvrir les
besoins du microorganisme qui sont souvent élevés, surtout en période de croissance
logarithmique. Le manque d’oxygène provoque non seulement la chute de croissance mais
provoque aussi des modifications du métabolisme, qui peuvent être néfastes à la production.
La capacité d’oxygénation d’un fermenteur est une caractéristique essentielle

3-L’élaboration du milieu
La formulation d’un milieu optimal est une tâche complexe parce que les facteurs influents
sont nombreux. L’optimisation se fait d’abord au laboratoire ensuite à des échelles plus
grandes, où elle peut s’effectuer avec des méthodes de planification expérimentale permettent
d’analyser simultanément plusieurs facteurs et de déterminer la composition optimale.

4-Stérilisation
Un milieu doit être débarrassé de la présence de tout microorganisme avant d’être ensemencé
par la souche productrice. Le traitement thermique est le moyen le plus utilisé pour stériliser
le milieu, il présente l’inconvénient d’altérer et de modifier les qualités du milieu à cause de :
-dégradation de polymères tels que : protéines, acide nucléiques
-dégradation des vitamines et d’acide aminés comme le tryptophane et l’asparagine
-formation de produits de dégradation toxiques ou inhibiteurs de croissance comme la
dégradation des sucres et de la vitamine C en furfural et hydroxyfurfural.
Dr Lamia AOUAR 14
Chapitre 2 Milieux de cultures dans les procédés industriels

-réaction de Maillard entre sucre et protéine.


-complexation d’ions métalliques telle que la précipitation de phosphore, de magnésium et de
calcium.

5-Composition de quelques milieux de culture industriels


5.1-Milieux pour production d’enzymes d’origine microbienne
Les matières premières comptent pour 60 à 80 % du prix de revient dans une production
d’enzyme par fermentation. La composition du milieu doit être définie avec soin et beaucoup
de travaux de recherche ont pour objet le remplacement de composés chers par d’autres,
disponibles en plus grandes quantités, de moindre prix. Ces composés doivent être utilisés le
plus complètement possible pour réduire les rejets. La composition du milieu de culture doit
tenir compte des étapes de production et d’extraction. Pour la production de pectinase,
cellulase, catalase, invertase, B-galactosidase, les milieux employés sont composés de :
Source de C : Farine de céréales : soja, amidon, pomme de terre, riz, son, mélasses.
Source de N : farine de poisson, gélatine, farine de soja, de son et de peptone.
Facteurs de croissance : extrait de levure.

5.2-Milieux de production d’acides organiques


L’acide citrique : microorganisme producteur est Aspergillus niger, la synthèse de l’acide
citrique se fait quand le milieu est déséquilibré. L’aconitase nécessite du fer comme cofacteur.
On trouve cette enzyme dans les cellules en voies de croissance, mais non pas en cours de la
production de l’acide citrique. Il est possible de bloquer l’aconitase par l’utilisation du cuivre
comme antagoniste du fer. La teneur en saccharose est de l’ordre de 14%, peu d’azote pour
éviter la formation de l’acide oxalique (0,25 % NO3NH4), la teneur en phosphate est inférieur
à 0,25 %, sinon il y a formation de l’acide oxalique et l’acide gluconique.
L’acide acétique : le microorganisme producteur Acetobacter aceti. Les milieux sont de type
suivant : sucre de maïs, 4,5 kg; NH4 HPO4, 2 kg; Mg SO4, 0,5 kg; citrate de potassium, 0,5
kg; pantothénate de Ca, 5 g; pour 450 litres.

5.3-Milieux de production d’antibiotiques


L’érythromycine : c’est un antibiotique non polyène c-à-dire absence de double liaison
conjuguée. Le microorganisme producteur est Streptomyces erythreus, la composition du
milieu de culture en g/l est la suivante : l’amidon, 25; glucose, 25; farine de soja, 47; corn
steep liquor, 10; extrait de levure, 5; NaCl, 5; CaCO3, 2; CaCl2, traces ; le pH 7,2. L’aération

Dr Lamia AOUAR 15
Chapitre 2 Milieux de cultures dans les procédés industriels

doit être intense. Le propionate et le propanol sont des précurseurs de la synthèse


d’érythromycine.
La streptomycine : le milieu de production pour Streptomyces griseus est : farine de soja, 4
% ; glucose, 2,5 %; NaCl, 0,25; pH 7,3-7,5. Forte aération et agitation, température de 25-30°
C.
Pénicilline : glucose ou mélasses, 10 %; corn steep liquor, 4-5 %; acide phényle acétique,
0,5-0,8 %; huile végétale 0,5 %; pH 6,5-7,5.
La bacitracine : le microorganisme producteur est le Bacillus licheniformis. Les milieux de
cultures employés sont les suivants (Tableau 2) :

Tableau 2 : les milieux employés pour la production industrielle de la bacitracine


Milieu de culture Méthode Temps Bacitracine Unités/ml
Tryptone, infusion de viande Surface 3-5 j 10-26
Farine de soja, amidon, lactate de calcium Surface 7 jours 88
Farine de soja, lactate CaCo3, amidon submergée 26 h 80-90
Farine de coton et de soja, CaCo3, dextrine submergée 24 h 125
Farine de soja, amidon, CaCo3 submergée 24 h 325

5.4- Milieu de production l’endotoxine de Bacillus thuringiensis


Mélasses, 0,4 %; farine de soja, 2-6 %; K2HPO4, 0,5 %; KH2PO4, 0,5; MgSO4 7H2O, 0,005
%; MnSO4 4H2O, 0,003 %; FeSO4, 0,0001 %; CaCl2, 0,005 %; Na(NH4)2 PO4 4 H2O, 0,15
%; Lysine; mélasses de canne blackstrap, 20 %; farine de soja, 1,8 %; agent anti-mousse.

5.5-Milieu de production des acides aminés


Tryptophane : la souche productrice est un mutant de Corynebacterium glutamicum. Le
milieu contient : 10 % en équivalent glucose de mélasses de canne; 0,05 % KH2PO; 0,025
MgSO4 7 H2O; 2 % (NH4)2 SO4; 1 % corn steep liquor; 2 % CaCO3.

5.6-Milieux de production des vitamines


La vitamine B 12 : la production commerciale utilise seulement le Propionibacterium ou le
Pseudomonas ; les milieux employés ainsi que les microorganismes utilisés sont portés dans
le Tableau 3.

Dr Lamia AOUAR 16
Chapitre 2 Milieux de cultures dans les procédés industriels

Tableau 3 : milieux de production de la vitamine B 12.


Souche Milieu Durée de Rendement
fermentation mg/l
Propionibacterium Corn steep, glucose, cobalt, 80 h 23
shermanii ammoniaque
Streptomyces olivaceus Farine de soja, glucose, 144 h 5,7
cobalt, sels minéraux
Bacillus megaterium Mélasses, (NH4)2 HPO4 18 h 0,45
Pseudomonas denitrificans Saccharose, bétaines, acide 48 h 15
glutamique, acide oxalique,
cobalt, 5,6 diméthyl
benzimidazole

La vitamine B2 (riboflavine) : la souche utilisée est Ashbya gossypii pour cette vitamine les
hydrolysats peptidiques de tissus animaux sont très stimulateurs, le milieu employé est le
suivant : glucose, collagène, huile de soja et glycine.
B-carotène (précurseur de la vitamine A) : les microorganismes producteurs sont Blakeslea
trispora et Mycobacterium smegmatis, le milieu est composé de mélasses, huile de soja, B-
ionone, thiamine, hexadecane.

5.7-Milieu de production de l’acide gibbérellique (A3)


La souche productrice est Fusarium moniliform la forme imparfaite de Giberella fujikuroi,
cette phytohormone est utilisée en malterie car elle augmente la teneur en amylase tout en
réduisant le développement des radicules de l’orge germé. Le rendement est de 1 g/l. Il faut
peu d’azote dans le milieu (NH4+), du saccharose, Mg+2, K+, PO4-2, SO4-2, supplément en
farines végétales. Le glycérol augmente la quantité produite. La température est de 31-32° C
pour la croissance, 29° C pour la production, l’aération est forte.

5.8-Milieu de production de l’éthanol.


Des souches de Saccharomyces cerevisiae sont sélectionnées pour être cultivées à 39° C. La
croissance est inhibée mais la synthèse d’alcool est stimulée. Le milieu de culture : glucose,
100g ; NH4 Cl, 8 g; extrait de levure, 8 g; Na2 HPO4, 3,9 g; KH2PO ; 0,5 g; MgSO4, 0,5 g ;
CaCl2, 0,28 g; acide citrique, 4,3 g; Na citrate, 1,25 g.

Dr Lamia AOUAR 17
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

Le terme fermentation se réfère à la production à grande échelle de molécules biologiques dans


des fermenteurs. Les fermentations se différencient en fermentation continue et discontinu. Dans
la fermentation discontinue, les microorganismes sont cultivés dans une cuve (ou fermenteur)
souvent de grand volume, pour récolter ou extraire les produits formés après une période de
temps déterminé. Ces fermenteurs appartiennent au groupe des bioréacteurs : enceinte
permettent la culture de tous type de cellules (animales, végétales, microorganismes), avec des
paramètres physico-chimiques de cultures contrôlés et pilotés (pH, température, agitation,
substrats, produits, etc.).

1-Les fermenteurs
Enceintes hermétiquement close, les fermenteurs doivent permettent une stérilisation facile et le
maintien de l’asepsie pendant toute la durée de la culture. Ils doivent résister aux vibrations (lors
de l’agitation), aux surpressions et à la corrosion. En généra,l le volume total ne représente que
4/5 du volume total de la cuve. Pour les petits volumes inférieurs à 10 litres la cuve est en général
fabriquée en verre. Pour les volumes supérieurs, ce sont des enceintes en métal inoxydable avec
des hublots permettent un contrôle visuel de la culture. Selon le mode d’agitation Il existe deux
types de fermenteurs.

1.1-Fermenteur à agitation mécanique : c’est le modèle le plus employé, parce que c’est le plus
simple. Le fermenteur à agitation mécanique existe en volumes allant d’un litre à 500.000 litres,
sa conception tient compte de toutes les tâches qui doivent être réalisée.
-Le conteneur : il doit pouvoir contenir le volume désiré, résister aux vibrations résultant de
l’agitation, et résister aux surpressions de gaz lors de la stérilisation
-Le stérilisateur : avant l’ensemencement de la souche productrice le milieu doit être stérilisé.
Pour les petits bioréacteurs, la stérilisation de l’ensemble (cuve + milieu) peut être assurée par
autoclavage sous pression 120-125° C. Les fermenteurs plus importants pourront être constitués
d’une double enveloppe permettant une circulation de vapeur autour du corps ou être pourvus
d’une simple résistance métallique plongeant dans le milieu (une tyndallisation est réalisée pour
éviter la détérioration du milieu). Le milieu peut être aussi stérilisé par injection directe de vapeur
sous forme de pression par le système d’aération. Toutes les sorties de prélèvement et les entrées
(substrats, antimousse, inoculum, aération, bases ou acides, etc.) doivent être stérilisables et ne
pas comporter d’espaces morts.

Dr Lamia AOUAR 18
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

-L’aérateur : le fermenteur doit posséder un système d’aération qui injecte de l’air dans le milieu
en formant des bulles qui montent à la surface. La dissolution de l’oxygène est aidée par le
système d’agitation de la cuve.
-Homogénéisateur : le système d’agitation doit assurer le brassage du liquide en favorisant la
dissolution de l’oxygène de l’air et les échanges de températures, il existe nombreux types
d’agitation :
Agitateur de type radial : turbine à pales droites, turbines à pales incurvées (Figure 1)
Agitateur de type axial : hélice type marine, hélice à grande pale mince.

Figure 1: système d’agitation de type radiale

1.2-Les fermenteurs à agitation d’air : l’injection d’air peut servir à agiter le milieu soit par
effet siphon, soit par la force d’injection, sans autre dispositif mécanique.
-Les fermenteurs à jet d’air : utilisant des pompes centrifuges spéciales qui propulsent un
mélange air-milieu à haute vitesse dans le réservoir principal, ce qui assure agitation et aération.
Des essais pilotes avec des moisissures et des actinomycètes ont montré une capacité
d’oxygénation de 150 mMoles d’O2 par litre et par heure, contre 30 à 50 pour les fermenteurs à
agitation mécanique.
-Les fermenteurs à effet siphon : l’effet siphon est obtenu par la diminution de densité
provoquée par la présence de bulles d’air. Dans le fermenteur on provoque un effet de cheminé
qui favorise la dispersion des bulles à l’aide de chicane.

1.3-Les fermenteurs à boucles : le principe est de faire circuler le milieu dans un circuit fermé
soit par adjonction d’un tube latéral (pompage par le bas et réinjection par le haut), soit par une
réalisation entièrement tubulaire.

Dr Lamia AOUAR 19
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

2-Les critères de choix d’un procédé de fermentation


Il existe non seulement différents types de fermenteurs mais aussi différents procédés de
fermentation selon que l’on travaille en milieu solide, en milieu liquide ou avec les systèmes
immobilisés. Les caractéristiques de la souche productrice, le milieu utilisé et certaines
considérations économiques déterminent le type de fermenteur idéal pour une production
optimal. Les critères de choix sont :
-La demande en oxygène du microorganisme: le système doit être capable de satisfaire la
consommation de la biomasse, certains microorganismes sont exigeants (Bacillus);
-La fragilité du microorganisme : beaucoup de fermenteurs sont équipés d’une agitation
mécanique pour la mise en solution de l’oxygène et l’homogénéisation, si l’agitation est trop
importante elle peut désintégrer les cellules. Le choix de l’agitation doit tenir compte du type de
biomasse recherchée : cellules séparées ou agglomérées en flock ou pellets;
-Les propriétés hydrauliques du milieu : une mousse plus importante lors de l’injection d’air
provoque des problèmes, la mousse peut colmater les filtres de sortie de gaz. Aussi, la viscosité
du milieu conditionne également le type d’agitation et de bioréacteur : une viscosité excessive
interdit les procédés basés sur l’immobilisation des enzymes;
-Les propriétés du produit vis-à-vis de la cellule : si le produit inhibe le microorganisme, il est
préférable de choisir un réacteur qui permet d’éliminer l’antibiotique en même temps qu’il est
produit (exp. utiliser un procédé continu).

3-Systèmes de fermentation
3.1-Systèmes en phase liquide : trois procédés peuvent être utilisés :
3.1.1-Culture en discontinu (batch en anglais) : le volume est constant sans renouvellement de
milieu. Un même volume de milieu sert à réaliser les phases de croissance, de production et
d’accumulation du produit. Tout le bouillon obtenu est ensuite retiré du fermenteur. En fin de
culture tout est traité et le bioréacteur doit être nettoyé pour une prochaine culture (Figure 2).
Elle est pratiquement la seule technique utilisée en production d’antibiotique. Ce système doit
assurer un brassage continu du milieu pour l’homogénéité de la culture et la dissolution de
l’oxygène injecté sous forme d’air comprimé.

Dr Lamia AOUAR 20
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

Figure 2: schéma d’un fermenteur en discontinu et de ses accessoires

3.1.2-Culture discontinue alimentée (Fed-batch en anglais) : avec addition contrôlé de certains


composants en cours de fermentation. Par exemple, lors de la production de la pénicilline, la
concentration en glucose est maintenue à des valeurs précises au cours du temps.

Dr Lamia AOUAR 21
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

3.1.3-Culture continue : dans ce système continu, la culture microbienne reste sous un volume
constant, tout en recevant un débit de milieu neuf. La concentration cellulaire varie en fonction de
la vitesse spécifique de croissance en phase exponentielle (µx expo, taux de croissance) de
l’espèce : dX/dt = (µx expo-D) . X , où X = biomasse initiale; D = vitesse spécifique de dilution
(rapport du débit d’entrée sur le volume du milieu h-1); t = temps.
Ce système consiste à maintenir le fermenteur et son contenu dans un même état le plus long
possible, par prélèvement du milieu fermenté et apport de milieu frais en continu. Deux
techniques sont possibles :
3.1.3.1-La technique du turbidostat : ce dispositif assure une culture continue ou la vitesse
spécifique de croissance est maximale (µx expo max) et une biomasse constante X, qui sera choisie
en phase exponentielle et restera constante grâce à une régulation de D c-à-d : µX expo = D.
L’appareillage est très simple, comprend une cellule photoélectrique réglée, sur une valeur de X
choisie, et reliée à la vanne d’entrée du milieu neuf. Il s’agit d’une autorégulation de D en
fonction de la biomasse mesurée à la sortie (Figure 3).

Figure 3 : turbidostat

3.1.3.2-La technique du chémostat ou bactogène : dans ces dispositifs µX expo > D : l’effet de
dilution est moins important que celui de la croissance. La vitesse spécifique de croissance
n’atteint jamais µX expo max, sa valeur est liée à la concentration d’un facteur limitant dans la
chambre de croissance, tous les autres aliments étant en excès. Quand D augmente, la
concentration en facteur limitant s’accroit et la biomasse, elle, diminue (on dilue le milieu) et
donc µx expo augmente (loi de Monod). Quand D diminue, c’est l’inverse (Figure 4).

Dr Lamia AOUAR 22
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

Figure 4 : chémostat

La limitation du système provient de la dégénérescence de la souche souvent entre 5 et 20


jours. On peut dans le cas de production de métabolites secondaires, d’utiliser des systèmes
multi-étages mettant en batterie des fermenteurs en continu (Figure 5).

Figure 5 : fermenteur en continu multi-étages

À l’heure actuelle, ce sont les systèmes en discontinus qui présente à la fois le plus de
flexibilité, de simplicité de conception et de sécurité, mais ceci au détriment du cout pour lequel
les systèmes en continus, surtout le chémostat, sont le plus rentables.

Dans ces trois systèmes, l’agitation est un facteur important de la réussite de la culture. Le
choix de la vitesse et le type des pales est important. Pour les microorganismes dont les cellules
sont relativement résistantes, on utilise des agitateurs de type radial et une vitesse importante.

Dr Lamia AOUAR 23
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

Dans certains cas l’agitation peut présenter un gros inconvénient créant des forces de
cisaillements trop importants. Les systèmes mécaniques peuvent être remplacés par l’agitation
par air (air-lift): système d’injection d’air par le bas (tower) utilisé par exemple dans la
production d’acide citrique par A. niger (Figure 6). Un autre système d’injection par le haut
(deep shaft reactors) dans le cas des traitements des eaux usées. Le gros inconvénient de ces
systèmes est leur cout élevé.

Figure 6: agitation par air (air lift) de type tower

3.2-Systèmes en phase solide


Dans ces systèmes, les substrats sont simplement humidifiés et non solubilisés ou en suspension.
Les substrats les plus utilisés sont les grains céréales, les copeaux de bois, la paille, etc. Les
microorganismes doivent avoir la particularité de présenter une tolérance à un AW faible : c’est
le cas des levures et des champignons filamenteux. Plusieurs types de systèmes sont utilisés :
colonnes à lits fixe, plateaux, fermenteur rotatif (Figure 7). Leurs principaux avantages résident
dans leur simplicité, la forte productivité obtenue et le peu d’énergie exigée.

-Les avantages de la fermentation solide


Parmi les avantages des fermentations solides :
-C’est une technique simple à réaliser et ne nécessitant pas d’équipement sophistiqué;

Dr Lamia AOUAR 24
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

-L’absence d’eau libre permet de réduire considérablement le volume des installations de


fermentation et les contaminations bactériennes;
-Elle assure une forte productivité en métabolites;
-Il n’y a pas de production de mousses lors des fermentations solides, contrairement aux
fermentations liquides;

Figure 7: système en phase solide, (a) plateaux, (b) fermenteurs rotatifs

Dr Lamia AOUAR 25
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

-Cette fermentation ne nécessitant pas obligatoirement une stérilisation du substrat. Ce qui réduit
le coût énergétique nécessaire;
-En cas de production d’aliments pour animaux, tout le produit est utilisé, sans rejet d’eau usée.
Les frais de séchage éventuels sont réduits.

-Inconvénients des fermentations solides


-Les microorganismes utilisés sont limités, seuls les microorganismes se développant en faible
Aw peuvent être utilisés;
-Les problèmes de transfert d’oxygène et de chaleur rendent difficile l’augmentation d’échelle
des procédés;
-La nature solide et hétérogène des substrats utilisés complique le suivi direct des paramètres de
fermentation;
-Le contrôle on line des paramètres de culture tels que le pH, l’humidité et la concentration des
nutriments, est assez aléatoire;
-Les microorganismes étant inséparables du substrat, l’estimation de la biomasse est délicate.

3.3-Systèmes immobilisés
Dans ce type de procédé, les microorganismes producteurs n’évoluent pas librement dans le
milieu, mais sont immobilisés sur un support ou une matrice. À l’entrée il y a introduction du
milieu frais qui alimente la biomasse et à la sortie un milieu fermenté qui contient le produit
désiré. La chlorotétracycline, la céphalosporine et la bacitracine ont été produites grâce aux
cellules immobilisées. La mise au point de ces systèmes présente, au niveau théorique plusieurs
avantages :
-Conservation du matériel biologique en fin de culture qui est réutilisable pour d’autres cycles;
-Opération de récupération des produits facilités, la souche n’étant pas dispersées dans le milieu
réactionnel;
-Accroissement de la densité cellulaire et des vitesses de réaction.
En principe tous les types de cellules peuvent être immobilisés par des processus divers, dérivées
des techniques utilisées pour l’immobilisation des enzymes. Quatre types d’immobilisation
peuvent être utilisés.

Dr Lamia AOUAR 26
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

-L’adsorption, qui est un processus ancien utilisé lors de la fabrication du vinaigre, dans lequel
les Acetobacter sont adsorbés sur des copeaux d’hêtre. Maintenant, on utilise des billes de PVC,
de DEAE cellulose (exp : Nocardia erythropolis : conversion des stéroïdes).
-L’inclusion, avec incorporation des microorganismes dans une matrice d’un polymère rigide tel
que l’alginate de sodium (Sc. cerevisiae : production d’alcool, Methanosarcina barkeri :
production de méthane, polyacrylamide (Arthrobacter simplex : production d’hydrocortisone, B.
subtilis : production d’alpha- amylase, Aspergillus niger : production d’acide citrique). Plusieurs
réalisations sont possibles : le gel peut être mis dans une colonne, dans laquelle circule le milieu
frais qui en ressort avec les produits de biosynthèse. Les gels peuvent être utilisés en batch ou
culture continue dans des bioréacteurs classiques.
-La liaison covalente, qui est moins utilisée pour les microorganismes. Il s’agit d’une liaison
covalente chimique irréversible qui met en jeu les groupements des chaines latérales des acides
aminés et un ligand fixé sur le support. Outre l’irréversibilité, ce système présente l’inconvénient
d’utiliser comme ligand des réactifs souvent toxiques pour les microorganismes;
-La floculation, système par lequel on provoque l’agrégation des cellules, par exemple par
l’addition de polyélectrolytes (chitosane). Elle met en jeu des liaisons hydrogènes et de Wan der
Waals. Elle est notamment utilisée dans le traitement des eaux résiduaires en boues activées.
Divers processus sont utilisés dans les systèmes immobolisés :
*Réacteurs à lit fixe : entassement des billes dans une colonne, l’aération et les divers contrôles
étant effectués par un système externe (Figure 8 a).
*Réacteurs à lit fluidisé : où l’on évite un colmatage des billes en ajustant leur densité et la
vitesse d’écoulement, ceci permettant de meilleurs transferts de matière.
*Réacteurs à fibres creuses : on fait circuler le milieu de culture au travers de fibres creuses où
les cellules se développent (Figure 8 b).
*Réacteurs à plaques semi perméables : voisin du précédent, les fibres étant remplacées par des
membranes semi-perméables.

Dr Lamia AOUAR 27
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

Figure 8 : systèmes immobilisés, (a) lit fixe, (b) fibres creuses

4-Mesure et contrôle des paramètres de culture


4.1-Les paramètres physico-chimiques
C’est un aspect fondamental des fermentations industrielles permettant d’arriver à une
optimisation maximale des cultures. Tous les paramètres doivent être contrôlés, c’est-à-dire
mesurés avec précision. Leur mesure fait appel soit à des capteurs spécifiques ou sondes
sensibles, soit à une technique externe après prélèvement d’un aliquote de culture. Les sondes

Dr Lamia AOUAR 28
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

doivent être précisément calibrées, fiables et donner des renseignements exactes. Elles sont, en
général, connectées au système de pilotage et de régulation de culture. L’utilisation in situ de ces
sondes reste cependant très délicate : installation couteuse et complexe (électrolytes, membrane à
changer, etc.), maintien de la stérilité. Bien souvent, on aura à s’orienter vers des systèmes de
mesures après prélèvement et, ainsi, l’usage d’échantillonneurs automatiques pouvant effectuer
plusieurs dosages à partir d’un prélèvement se répand de plus en plus.

La régulation est assurée par les divers systèmes imposant les paramètres choisis à la
culture (chauffage-refroidissement, aération, agitation, adjonction d’acide et de base, antimousse,
etc.). Les Tableaux 4 indiquent les types de systèmes de mesures des paramètres physico-
chimiques et leurs systèmes de régulation éventuelle. Le Tableau 5 donne les principaux
paramètres biochimiques et biologiques mesurés et les techniques appropriés.

Tableau 4 : méthode de mesure de principaux paramètres physico-chimiques

Paramètres Capteurs Actionneurs


Température Thermomètre à résistance de platine Résistance plongeante ou double
enceinte à circulation d’eau chaude.
Circuit d’eau froide commandé par
électrovanne.
Agitation Capteur de proximité (électrique) Moteur électrique/axe/pales.
ou de positionnement (optique)
Volume de milieu Pièzo résistance Vidange
Mousses Sonde à résistance électrique Injection d’antimousse.
Viscosité Viscosimètre
pH Électrode Injection acide ou base par pompe
péristaltique
O2 dissout Électrode type électrode de Clark Aération
CO2 dissout Électrode type pH avec solution
de tampon bicarbonate
Ions Électrodes sélectives
Gaz à la sortie Analyseur paramagnétique (O2),
analyse infrarouge (CO2)

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Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

Tableau 5 : méthodes de mesure des paramètres biochimiques


Systèmes de mesure Paramètres mesurés
Électrodes spécifiques à enzyme immobilisées Glucose (glucose oxydase), urée (uréase),
acide aminé (décarboxylase), acétylcholine
(estérase)
Fluorimétrie en sortie sur prélèvement NADH+H+, NADPH+H+
Bioluminescence en sortie sur prélèvement ATP
Chromatographie en phase gazeuse (CPG) en sortie Composés volatils (éthanol, arômes), lipides
Chromatographie à haute pression en phase liquide Molécules organiques en solution
(HPLC) en sortie
Biomasse en sortie sur un prélèvement Absorbance, poids sec

4.2-Les paramètres microbiologiques


Cet examen obligatoirement discontinu, permet de se rendre compte de l’état de croissance de la
souche, de la morphologie et de déceler la présence d’un contaminant.
4.2.1-Population cellulaire : la mesure de la biomasse dans le milieu de culture est le meilleur
moyen pour vérifier le développement de la culture. Une mesure exacte est difficile car le milieu
contient beaucoup d’insolubles. Il existe plusieurs techniques et sont toutes sujettes à des
critiques :
-Mesures indirectes
-La plus simple est le volume de décantation. La prise d’un volume déterminé du bouillon de
culture est centrifugée dans des conditions précises d’accélération de géométrie de récipient et de
temps. Le volume du culot est mesuré, celui-ci comprend les insolubles et le mycélium. La valeur
obtenue ne donne ni un nombre de cellules, ni un volume de biomasse, mais l’expérience permet
d’en déduire le stade de la fermentation. Au début le culot est constitué des insolubles.
Progressivement, le mycélium se développe et s’ajoute au culot, mais modifie en même temps le
milieu en hydrolysant les farines et d’autres polymères. Le résultat global est une évolution du
volume de culot qui traduit plus ou moins fidèlement une évolution de la fermentation.
-La mesure de la viscosité du milieu fournit une information globale d’état d’avancement de la
culture.

Dr Lamia AOUAR 30
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

-La méthode de turbidité est peu utilisable dans le cas des fermentations industrielles à cause des
matières insolubles.
-Dénombrement des microorganismes
Le dénombrement est possible sur des volumes microscopiques connus grâce à des
hémacytomètres mais la méthode est impossible avec des microorganismes filamenteux.
-Estimation de la biomasse
La biomasse peut être estimée par le dosage d’un constituant cellulaire (azote, ADN) ou par la
consommation d’un métabolite (ATP) ou la production d’une molécule donnée.
-Cultures d’échantillons
La mise en culture d’échantillon (1 ou 2 par jour) dans des milieux favorables aux éventuels
contaminants permet le développement rapide de ceux-ci et leur détection rapide.
4.2.2-Les paramètres de cultures à contrôler
L’aération, l’agitation, les transferts de chaleur et le contrôle de la formation des mousses
représentent des éléments importants de la réussite d’une culture en bioréacteur; il est donc
primordial de savoir les maitriser correctement.
L’aération : le transfert correct de l’oxygène vers les cellules est un élément essentiel pour une
fermentation industrielle. L’oxygène se dissout mal dans l’eau (maximum 10 mg/L). Il faut donc
en fournir en permanence en maitrisant bien la façon dont il va être transférer aux cellules. Ce
transfert gaz-liquide va être évalué par la mesure d’un paramètre, KLa : coefficient de transfert
de masse volumétrique (exprimé en h-1). Il varie en fonction du débit de l’aération, de la vitesse
d’agitation, de la température et de la technique du bioréacteur.
L’agitation : Pour assurer une bonne optimisation de la culture, le facteur homogénéisation est
essentiel. Il faut en effet assurer un accès optimal des cellules aux substrats et à l’oxygène, et
éviter les mauvaises répartitions des cellulaires. Il faudra donc prendre en considération le type
d’agitation choisi en fonction des cellules, son intensité et la composition physique du milieu
(viscosité) qui pourra être amené à se modifié (excrétion des polymères, développement de
mycélium, etc.). Ce facteur important peut être quantifié par un paramètre, le nombre de Reynold,
qui varie en fonction de la vitesse d’agitation, du diamètre du système d’agitation (pales), de la
densité cellulaire du milieu et de la viscosité.

Dr Lamia AOUAR 31
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

Le transfert de chaleur : pour assurer en permanence aux cellules une température optimale, il
est nécessaire non seulement de posséder un système de chauffage efficace mais aussi de
permettre une élimination de chaleur dégagée par les microorganismes en mettant en place un
système de refroidissement. Le système d’agitation dépendra donc de la qualité de ces systèmes
ainsi que la géométrie de la cuve, des caractéristiques du milieu, de l’agitation et de l’aération.
Ainsi, en présence de cellules fragiles pour lesquelles on sera obligé de diminuer la vitesse
d’agitation, on sera amené à augmenter la hauteur de la cuve par rapport à son diamètre afin
d’accroitre la surface de contact entre le système de refroidissement et le milieu.
Les mousses : leur apparition dépend essentiellement de deux facteurs. La composition du milieu
(protéine) et l’intensité d’aération. Les mousses empêchent l’élimination du Co2 produit et
risquent d’occasionner des débordements, il faut absolument les éliminer. On utilise pour cela des
silicones ou des huiles, en s’étant assuré préalablement que ces produits n’ont pas d’influence sur
les cellules. Les quantités à rajouter peuvent être contrôlées par l’intermédiaire d’une sonde
détectrice couplée à un système de contrôle et un système d’injection automatique.

5-Paramètres utilisés lors de la production


5.1-Paramètres de croissance
-Vitesse spécifique de croissance μx ou Qx : exprimée en h-1, est égale à la vitesse de croissance
en biomasse rapportée à l’unité de biomasse (X = biomasse en g. L-1 ; t = temps en h). Pendant la
phase exponentielle, μx est constant et maximal. Il est alors appelé μx expo.

-Vitesse volumique de croissance, est le rapport dX / dt, elle représente l’augmentation de la


biomasse par unité de volume et par unité de temps (par exemple en g. L-1. h-1).
-Temps de génération (G) est le temps de doublement de la biomasse X pendant la phase
exponentielle (ou le temps de doublement de l’absorbance pour un suivi spectrophotométrique) :

Dr Lamia AOUAR 32
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

-La vitesse volumique de consommation d’un substrat est le rapport dS /dt.

-La vitesse spécifique de consommation d’un substrat (QS), d’expression dS/dt . 1 / X.

5.2-Cinétique d’apparition des produits, quantification : l’apparition des produits de


fermentation peut être quantifiée de la même manière que l’évolution de la biomasse, on
exprime :
-La vitesse volumique de production : notée rp d’expression dP/dt et exprimé en g. L-1. h-1
-La vitesse spécifique de production notée Qp, d’expression dP/dt . 1/X, c’est à dire vitesse de
production rapportée à la biomasse. Cette cinétique va dépendre de produits formés. On distingue
généralement trois cas :
*Les produits dits associés (sous-entendu associés à la croissance), c’est-à-dire dont l’apparition
dans le milieu est concomitante à l’évolution de la biomasse (Figure 9 a). C’est le cas de la
production d’éthanol lors de la fermentation alcoolique. Dès sa formation, celui-ci est exocyté
dans le milieu;
*Les produits dits non associés, appelés aussi métabolites secondaires, c’est-à-dire dont
l’apparition se manifeste en phase stationnaire. Ils ne sont libérés dans le milieu que lors de la
lyse cellulaire (Figure 9 b);
*Les produits mixtes ou intermédiaires, apparaissant dans le milieu au cours de la phase
exponentielle (Figure 9 c).

Figure 9 : cinétique de formation du produit; associé, non associé, intermédiaire.

Dr Lamia AOUAR 33
Chapitre 3 Procédés des fermentations industrielles

5.3- bilan l’apparition des produits de fermentation : peut être exprimée de quarte manières.
-La productivité volumique horaire : c’est la masse de produit apparu par unité de volume de
milieu et par unité de temps (g. L-1. h-1).
-La productivité horaire globale : c’est l’évaluation de la productivité au volume total du
milieu (g. L-1. h-1).
-Le rendement total , par rapport au substrat principal, noté R p/S : rapport de la masse de
produit formé sur la masse de substrat utilisé à la fin du processus. On le désigne aussi sous le
nom de rendement de conversion.

-Le rendement de croissance RX/S est le rapport de la biomasse formée sur la masse de substrat
consommé.

Dr Lamia AOUAR 34
Chapitre 4 Produits des fermentations industrielles et leurs utilisations

Certains métabolites sont synthétisés et apparaissent dans le milieu de culture au cours de la


phase de croissance, et d'autre apparaissent lorsque le microorganisme entre dans la phase
stationnaire. Les métabolites primaires sont ceux produits durant la phase de croissance et les
métabolites secondaires sont ceux produits lorsque la phase stationnaire est atteinte.
Un métabolite primaire est généralement issu du métabolisme énergétique et il est nécessaire
pour une croissance continue du microorganisme.

La production de métabolites secondaires est le résultat de réactions complexes qui ont


lieu dans les phases tardives de la croissance. Les métabolites secondaires présentent la
caractéristique majeure de n’être produits que par une seule ou par peu d’espèces. Chez les
microorganismes produisant des métabolites secondaires, la phase de croissance est appelée
trophophase. La phase impliquée dans la production de métabolismes secondaires est appelée
l’idiophase. Dans certains cas, des enzymes impliquées dans la trophophase sont également
impliquées dans la production de métabolites au cours de l’idiophase.

La fermentation citrique par Aspergillus niger est un exemple de produit résultant d’un
changement de métabolisme. Au cours de la trophophase, un substrat tel que le glucose est
principalement utilisé comme source d’énergie et aussi pour les synthèses. En générant de
l’énergie, la majorité du glucose est oxydée en CO2. Au cours de l’idiophase, le glucose est
majoritairement converti en métabolite secondaire, l’acide citrique.

Dans la production des antibiotiques, qui sont également des métabolites secondaires, un
scénario différent est impliqué. Un actinomycète qui produit un antibiotique synthétise une
batterie d’enzymes nouvelles à la fin de la phase exponentielle de croissance et au début de la
phase stationnaire. Ces enzymes sont responsables de la synthèse de l’antibiotique. Plus de 300
gènes sont, par exemple, impliqués dans la synthèse des enzymes responsables de la production
de la chlorotétracycline par Streptomyces aureofaciens. Au moins 72 intermédiaires de réaction
sont formés et seulement 27 ont été isolés et identifiés. Cependant, seules quelques enzymes
impliquées dans la synthèse de la chlorotétracycline sont nécessaires pour la croissance cellulaire.

Dr Lamia AOUAR 35
Chapitre 4 Produits des fermentations industrielles et leurs utilisations

1- Antibiotiques
Environ 10000 antibiotiques différents ont été caractérisés, et environ 160 sont préparés
industriellement et commercialisés. Les antibiotiques sont des substances organiques secrétées
comme des métabolites secondaires par certains microorganismes ou produits par synthèse
chimique. Les microorganismes producteurs d’antibiotiques sont en nombre très restreint. Les
principaux groupes utilisés dans la production industrielle d’antibiotiques sont des bactéries
filamenteuses du genre Streptomyces et des moisissures des genres Penicillium et
Cephalosporum. L’expérience montre cependant que les bactéries présentant un cycle de vie
incluant la formation de spores (des endospores ou d’autres types de spores) sont les plus
efficaces pour la production d’antibiotiques utiles.

De nombreux antibiotiques sont actuellement disponibles pour la profession médicale,


mais la recherche de nouveaux antibiotiques continue, notamment contre les bactéries, les
champignons, les virus et les tumeurs. Un des problèmes majeurs dans l’utilisation des
antibiotiques et des thérapeutiques chimiques est le développement de résistances chez les agents
pathogènes. Des résistances aux antibiotiques apparaissent également par des processus de
mutation et de sélection. Ainsi, la recherche d’antibiotiques se poursuit pour combattre les
résistances qui se développent vis-à-vis de ceux actuellement utilisés Il est clair que de nouveaux
agents efficaces contre les bactéries, les champignons, les virus ou les tumeurs sont actuellement
nécessaires.

1.1-Exemples de quelques antibiotiques produits par voie microbienne

1.1.1-Pénicilline : est produite par Penicillium chrysogenum et contient un cycle β-lactame


inhabituel dans les systèmes biologiques. Cet antibiotique est utilisé depuis plus de 50 ans, et le
développement de microorganismes résistants devient un réel problème. Des pénicillines semi-
synthétiques sont plus efficaces contre les microorganismes résistants au produit naturel, et sont
des antibiotiques de choix pour les applications cliniques.

1.1.2-Céphalosporines : cet antibiotique, également de la famille des β-lactames, est produit par
le champignon Cephalosporium acremonium. Les céphalosporines sont moins toxiques que la
pénicilline et leur spectre d’action antimicrobien est plus large. Elles sont aussi résistantes aux

Dr Lamia AOUAR 36
Chapitre 4 Produits des fermentations industrielles et leurs utilisations

pénicillinases produites par les microorganismes résistants à la pénicilline. Les céphalosporines


sont produites par fermentation, et certains dérivés semi-synthétiques sont générés par
modification chimique.

1.1.3-Streptomycine : de nombreux antibiotiques sont des dérivés de sucres, et la streptomycine


est un antibiotique de ce groupe produit par Streptomyces griseus. Le milieu de fermentation
employé contenant du soja avec du glucose comme source de carbone. La streptomycine est
composée de sucres aminés liés à d’autres sucres par une liaison glycosidique. Sa découverte eut
une grande importance médicale car ce fut le premier médicament efficace contre le fléau de la
tuberculose. La résistance à la streptomycine a posé de sérieux problèmes dans les thérapies
contre la tuberculose, et des combinaisons de médicaments sont maintenant administrées pendant
un temps donné.

1.1.4-Érythormycine: c’est antibiotiques appartenant à la famille des macrolides, il possède de


grands cycles lactone liée à des sucres. Il est produit par Streptomyces erythreus.

1.1.5-Rifamycine est un antibiotique de type lactone macrocyclique produit par Nocardia


mediterranei.

1.1.6-Rifampicine : est un inhibiteur spécifique de l’ARN polymérase bactérienne, ADN


dépendante ; elle est utilisée dans le traitement de la tuberculose associé à l’isoniazide et la
pyrazinamide.

1.1.7-Tétracyclines : les tétracyclines constituent un groupe d’antibiotiques majeurs efficaces à


la fois contre des bactéries Gram-positives et Gram-négatives. Elles sont également efficaces
contre Rickettsia, Mycoplasma, Leptospira, Spirochetes et Chlamydia. Certains dérivés semi-
synthétiques ont aussi été développés pour contrecarrer les problèmes d’émergence de résistances
bactériennes.

1.1.8-Spiramycine : c’est un antibiotique de la famille des macrolides. Ces derniers sont des
molécules lipophiles basiques composés d’un macrocycle lactonique ou aglycone. Le
microorganisme producteur Streptomyces ambofaciens

Dr Lamia AOUAR 37
Chapitre 4 Produits des fermentations industrielles et leurs utilisations

1.2- La production des antibiotiques par les actinomycètes


Les actinomycètes tiennent une très grande importance dans le domaine de la biotechnologie des
antibiotiques, malgré les progrès de synthèses chimiques. En effet, 45% des antibiotiques connus,
sont naturellement issus des actinomycètes et plus particulièrement du genre Streptomyces qui
sont à l'origine de 75% des antibiotiques produits (Figure 10). Quelques antibiotiques produits
par les actinomycètes sont cités dans le Tableau 6.

Figure 10 : Origine des antibiotiques ;


■ bactéries non actinomycétales ; ■ actinomycètes ; ■ champignons microscopiques

Tableau 6 : quelques antibiotiques produits par les actinomycètes

Actinomycètes producteurs Antibiotiques


Streptomyces griseus Candicidine,
Streptomyces lydicus Streptolydigine
Streptomyces lindensis Rétamycine
Marinispora sp. Marinomycine
Verrucosispora Abyssomycine
Streptomyces venezuelae Chloramphénicol
Streptomyces nataensis Natamycine
Nocardia lurida Ristocétine
Streptomyces orientalis Vancomycine
Streptomyces fradiae Fosfomycine
Streptomyces aureofaciens Auréomycine

Dr Lamia AOUAR 38
Chapitre 4 Produits des fermentations industrielles et leurs utilisations

2-Les enzymes
Dans la nature, les microorganismes utilisent les enzymes pour dissocier les protéines, l'amidon,
la pectine, les lipides et d'autres grandes molécules insolubles. Ces dernières sont réduisent en
monomères, servant de sources de carbone et d'énergie pour eux-mêmes ou pour d'autres
organismes présents dans l'environnement. Ces enzymes hydrolytiques sont généralement
extracellulaires ou localisées sur la surface de bactéries ou de champignons. En tant qu'enzymes
extracellulaires, elles peuvent être récupérées très aisément du milieu de culture. Les enzymes
sont utilisées dans toutes les industries de la fermentation, que ce soit pour les produits
agroalimentaires, dans l’industrie pharmaceutique (antibiotiques, acides divers, vitamines),
l’industrie biomédicale (protéines recombinantes, réactifs), les industries du nettoyage et de la
décontamination (détergents, traitement de l’eau et des surfaces) (Figure 11).

Figure 11 : parts de marché occupées par les enzymes dans différents secteurs

La production de protéases bactériennes est un processus industriel important en volume


et en valeur. Plus de 500 tonnes de ces enzymes sont produites chaque année. Elles sont
majoritairement utilisées dans la fabrication de détergents et de fromages. Les enzymes utilisées
dans les détergents sont des protéases de souches sélectionnées de Bacillus amyloliquefaciens.
Elles sont ajoutées aux détergents pour augmenter la solubilisation des taches présentes sur le
matériel à laver. Un des problèmes majeurs soulevés par l’utilisation de protéases dans les
détergents est la réponse allergique aux protéines bactériennes.
La production industrielle des enzymes est obtenue à partir des cultures industrielles des
bactéries et des champignons par fermentation, une fois la fermentation est achevée, les enzymes
sont purifiées, et elles sont alors commercialisées sous des formes variées : liquide, concentrée,

Dr Lamia AOUAR 39
Chapitre 4 Produits des fermentations industrielles et leurs utilisations

poudre. Les enzymes les plus répandues, parmi celles qui sont produites à l’échelle industrielle
sont les protéases et les amylases.
Dans l’utilisation industrielle des enzymes, qui sont de nature soluble, il est souvent
bénéfique de les immobilisées sur un support insoluble. Les enzymes sont immobilisées de 3
manières principales :
Fixation : l’enzyme est fixée sur un support insoluble (charbon actif, cellulose modifié, verre
poreux, etc.) par divers types de liaisons.
Inclusion : c’est l’incorporation physique des enzymes dans des structures semi-perméables :
microcapsule, gels, dans ce type d’immobilisation, l’enzyme garde sa forme soluble initiale qui
est bien sur la plus avantageuse.
Polymérisation : les molécules enzymatiques sont liées les uns aux autres en réseau, grâce à des
agents de liaisons bifontionnels tel que le glutaraldehyde, les liaisons entre enzymes sont
covalentes et donnent des structures insolubles et à haut poids moléculaire.

2.1-Les amylases : sont des enzymes qui hydrolysent l’amidon. Plusieurs amylases microbiennes
hydrolysent l’amidon par différentes voies pour générer des polymères de courte chaîne
(dextrine) et du maltose. D’autres enzymes hydrolysent les dextrines et le maltose en glucose.
Les α-amylases clivent les liaisons internes α-1,4 glycosidiques et sont produites par des bactéries
thermophiles du genre Bacillus, formant des endospores. Des champignons tels que des espèces
d'Aspergillus produisent également ces enzymes.

2.2-Les glucoamylases clivent le glucose de l'extrémité non réductrice de l'amidon. Ces enzymes
sont commercialisées pour la fabrication des sirops de fructose. Le fructose est plus doux que le
glucose et est le sucre préférentiel des sirops et des boissons sucrées. Aspergillus niger est un
producteur de glucoamylase. La conversion du glucose en fructose peut être accomplie par une
glucose isomérase bactérienne dont les producteurs principaux sont des espèces de Streptomyces
et Bacillus coagulans.

2.3-Les protéases
Les protéases hydrolysent les protéines et les peptides, en leurs unités constitutives : les acides
aminés. Les protéases alcalines sont utilisées dans l’industrie des lessives, industrie de la viande,
industrie fromagère. Les microorganismes utilisés dans la fabrication industrielle d’enzymes

Dr Lamia AOUAR 40
Chapitre 4 Produits des fermentations industrielles et leurs utilisations

protéolytiques sont des bactéries appartenant aux genres Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces,
Streptococcus et des champignons des genres Penicillium et Aspergillus.

2.4-L'asparaginase est utilisée dans le milieu médical pour traiter certaines leucémies et
lymphomes. Le métabolisme de ces cellules tumorales nécessite l'acide aminé L asparagine.
L'asparaginase clive l'asparagine en acide aspartique et ammoniac, empêchant ainsi la cellule
tumorale d'utiliser son substrat. La production commerciale de cette enzyme s'effectue par des
mutants sélectionnés d’Escherichia coli, d’Erwinia carotovora et d'autres espèces.

2.5-les pénicillines acylases, sont produites par différentes bactéries et champignons, mais la
production industrielle s'effectue par des mutants sélectionnés d’E. coli. Ces enzymes clivent la
pénicilline en acide 6-amino pénicillanique et acide phénylacétique. Ainsi, l'amine libre de l'acide
6-amino pénicillanique peut être chimiquement modifiée pour produire des pénicillines semi-
synthétiques variées.

2.6-La Taq polymérase


La Taq polymérase est employé pour les réactions de polymérisation en chaine cette enzyme est
produite par Thermus aquaticus, une bactérie thermophile dont la température optimale de
croissance est de 70° C, est de ce fait cette enzyme est stable à la chaleur. Elle est largement
employée en recherche pour réaliser la PCR, diagnostic et en médecine légale.

2.7-Autres enzymes, produites industriellement sont citées dans le Tableau 7.


Tableau 7 : enzymes microbiennes et leurs applications commerciales.

Enzymes Microorganismes Utilisation


Lipases Micrococcus Production de fromage
Β-glucanase Bacillus sublilis, A. niger Brasserie
Β-galactosidase A. niger, Candida pseudotropicalis Suppression lactose du lait
Cellulase A. niger, Trichoderma reesii Hydrolyse cellulose
Invertase Sc. cereviseae Hydrolyse saccharose
Pectinase A. niger, Trichoderma reesii Clarification jus de fruit.
Rénine Alcaligenes, Aspergillus, Candida Fabrication du fromage
Catalase A. niger, Micrococcus lysodeikticus Stérilisation lait, beurre

Dr Lamia AOUAR 41
Chapitre 4 Produits des fermentations industrielles et leurs utilisations

3-Les acides organiques : Les principaux acides organiques issus de l’industrie microbienne
sont : l’acide acétique, l’acide glutamique, l’acide lactique, et surtout l’acide citrique. Ils
totalisent une production annuelle supérieure au million de tonnes.

3.1-L’acide lactique : sa production à l’échelle industrielle est réalisée avec des cultures
fermentaires d’Aspergillus niger, qui peuvent atteindre des rendements de 125 g/l du milieu.

3.2-L’acide glutamique : est industriellement fabriqué à partir de la fermentation des mélasses


par Clostridium glutamicum.

3.3-L'acide citrique : c’est un acide organique important synthétisé par une fermentation
microbienne. Plus de 130 000 tonnes sont produites par an dans le monde. L'acide citrique était
extrait à l'origine à partir de citron (un citron contient 7 % à 9 % d'acide citrique). En 1923, une
fermentation microbienne produisant des taux élevé d'acide citrique a été développée, et le prix a
diminué avec l'augmentation de la production. Environ les deux tiers de l’acide citrique produit
et commercialisé sont destinés aux aliments et aux boissons, tels que les boissons sucrées, les
desserts, les confiseries, les fruits glacés, les compotes, les gelées et les crèmes glacées.

Dans l'industrie pharmaceutique, le citrate de fer constitue une source alimentaire de fer.
L’acide citrique est également utilisé comme conservateur du sang stocké, de médicaments et de
pommades. Le citrate a également remplacé les polyphosphates dans les détergents, en raison de
l'élimination des phosphates qui constituent des polluants environnementaux.

La majorité de l’acide citrique provient de fermentations dans des grands fermenteurs en


acier inoxydable, en utilisant des souches du champignon Aspergillus niger. Le saccharose est
également le substrat pour la production de l'acide citrique en tant que métabolite secondaire au
cours de l'idiophase. Durant la trophophase, le mycélium est produit et du CO2 est libéré. Au
cours de l'idiophase, le glucose et le fructose sont métabolisés directement en acide citrique. Peu
de CO2 est produit. Dans les conditions optimales, environ 70 % du sucre est converti en acide
citrique. Les taux de fer et d'autres minéraux inhibiteurs constituent des facteurs critiques au
cours de la fermentation. Le fermenteur doit ainsi être en inox ou recouvert de verre, et
l'utilisation du cuivre est prohibée.

Dr Lamia AOUAR 42
Chapitre 4 Produits des fermentations industrielles et leurs utilisations

3.4-L'acide itaconique : utilisé dans les résines à méthacrylate en tant que copolymère. L'ajout
de ce produit à raison de 5 % à de l'encre d'impression augmente la capacité de celle-ci à se fixer
sur le papier. C'est également un détergent potentiel. L'organisme impliqué dans la production de
l'acide itaconique est une souche d'Aspergillus terreus. En fermentation submergée, le taux de
production à partir de mélasses de betterave est de 85 % du taux théorique.

3.5-L’acide succinique est un intermédiaire du cycle de l’acide tricarboxylique et un des


produits résultant du métabolisme anaérobie. Il est synthétisé par la majorité des cellules
microbiennes, végétales et animales. De nombreuses recherches ont été menées pour développer
des procédés de production biologiques d’acide succinique en utilisant des souches telles que
Aspergillus niger ou Saccharomyces cerevisiae et des souches recombinantes d’Escherichia coli
et en travaillant sur leur métabolisme pour améliorer les rendements de production.
Actuellement, parmi les bactéries, Actinobacillus succinogenes et Mannheimia
succiniciproducens semblent être les meilleures souches productrices d’acide succinique. Cette
production pourrait s’élever à plus de 66 g/l en 84 heures (pour une consommation de 98 g/l de
glucose).

3.6-Autres acides organiques : sont utilisés comme additifs alimentaires.

Tableau 8: utilisation des acides organiques comme additifs alimentaires.

Additifs Microorganismes Exemples d’utilisations


alimentaires producteurs
Acide acétique Acetobacter aceti Agent de conservation dans les
mayonnaises, produit pharmaceutiques.
Acide Aspergillus niger Acidulant pour viandes, renforce le gout
gluconique Penicillium chrysogenum dans la margarine, etc.
Acide Rhizopus Acidulant dans les jus de fruits, desserts à
fumarique Mucor la gélatine, biscuits secs, lait en poudre.
Acide malique Penicillium brevicompatum Acidulant dans les confiseries, jus de
Leuconostoc fruits, crème glacée, etc.
Aspergillus oryzae
Acide tartrique Penicillium notatum Acidulant pour boissons, gelées, etc.
Acide Propionibacterium sp. Agent de conservation de nombreux
propionique aliments, dont les pâtisseries, etc.

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4-Les acides aminés : sont des produits industriels majeurs avec une production mondiale
annuelle excédant les 400 000 tonnes. Les principales utilisations des acides aminés sont
indiquées dans le Tableau 9. Les acides aminés sont utilisés pour améliorer la qualité des
aliments, en médecine ou comme éléments de base pour la synthèse chimique. L’acide aminé
produit en plus grande quantité est l'acide glutamique (80% de la production totale), suivi de la
lysine (10%). La forme biologiquement active des acides animés est la forme L, isomère produit
par fermentation. La synthèse chimique conduit à un mélange des isomères D et L.

Tableau 9: les utilisations de quelques acides animés.

Acide animé Utilisations


Glutamate de sodium Exhausteur de goût
L-méthionine, L-thréonine, L-tryptophane Antioxydant dans le lait en poudre
L-histidine, Aspartate Amélioration du goût des jus de fruits
L-aspartyl-L-phénylalanine Méthy1-ester Édulcorant faiblement calorique
(aspartame)
L-lysine Ajout aux aliments d'origine végétale Pour
augmenter la qualité nutritionnelle
Mélange d'acides animés Solutions pour des patients post-opératoires

Les acides animés sont synthétisés par des microorganismes qui se distinguent en fonction
du métabolite précurseur utilisé comme élément de base pour la synthèse. Par mutation et
sélection, des microorganismes ont été développés pour produire des quantités importantes de la
plupart des acides animés courant. La majorité des processus de fabrication des acides animés ont
été initiés au japon et certaines souches utilisées industriellement. Les principaux
microorganismes produisant l'acide glutamique nécessite un apport en biotine.

-L-lysine, peut être produit en grande quantité par fermentation directe en utilisant un mutant de
Brevibacterium flavum qui nécessite un apport en homosérine et en leucine. La lysine est alors
excrétée dans le milieu par transport actif (Tableau 10).

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Tableau 10: rendements et sources de carbone dans la production de quelques acides aminés.

Acide aminé Microorganisme Rendement (g/l) Source de carbone


L-glutamate Corynebacterium glutamicum > 100 Glucose
L-lysine Corynebacterium 39 Glucose
L-lysine Brevibacterium flavum 75 Acétate
L-thréonine E. coli K12 55 Saccharose

5- Les vitamines
Les processus de mutation et de sélection pouvant conduire au développement de souches
microbiennes prototrophes capables de produire en grande quantité quasiment toutes les
vitamines B. Cependant, seules deux vitamines B, la riboflavine (vitamine B2) et la
cyanocobalamine (vitamine B12), sont produites par fermentation, car la synthèse chimique des
autres est moins coûteuse. La vitamine B12 est une molécule complexe qui n'est synthétisée que
par des microorganismes procaryotes. Nécessaire aux humains, elle est apportée par
l'alimentation ou produite par la flore microbienne intestinale normale. Des anémies peuvent
apparaître chez des humains présentant des taux insuffisants en vitamine B12.

5.1-La vitamine B12 : la production annuelle de vitamine B12 est d'environ 10 000 kg. La
vitamine B12 non purifiée est ajoutée à l'alimentation des volailles à raison d'environ 12 mg par
tonne, ceci montre son efficacité à des concentrations excessivement faibles. La vitamine B12 est
synthétisée par des bactéries à partir d'intermédiaire commun à la synthèse des hèmes. Les micro-
organismes impliqués dans la fabrication de la vitamine B12 sont Propionibacterium shermanii et
Pseudomonas denitrificans. Ce dernier produit environ 60 mg par litre dans des conditions de
culture appropriées.

5.2-La riboflavine (vitamine B2), est présente naturellement dans les œufs, le lait, la viande et
d'autres aliments. Elle est ajoutée comme complément alimentaire dans le pain, le lait et d'autres
aliments pour augmenter la valeur nutritionnelle. Des levures telles que Ashbya gossypii sont
utilisés pour la fabrication industrielle de la riboflavine, qui peut alors produire des quantités
excédant 7g par litre.

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5.3-La vitamine C (acide ascorbique) : est produite par une combinaison de synthèse chimique et
microbiologique. Elle est également utilisée comme antioxydant. La production mondiale
dépasse les 35 000 tonnes par an. Le substrat de départ, le D-glucose, est réduit chimiquement en
D-sorbitol, et une oxydation microbienne conduit à la transformation du D-sorbitol obtenu en L-
sorbose, lequel est chimiquement converti en acide ascorbique. Acetobacter suboxydans est le
microorganisme impliqué dans la déshydrogénation du D-sorboiol en L-sorbose..

6-Biocides

Le produit commercial le plus connu est celui généré par un microorganisme pour le contrôle des
populations d’insectes, est une protéine synthétisée par Bacillus thuringiensis. Cette protéine
apparait comme un cristal parasporal au cours de la sporulation. Elle est libérée avec la spore lors
de la désintégration de la bactérie sporulante. La cellule végétative de Bacillus thuringiensis n’est
pas toxique, mais le cristal de protéine est efficace en tuant les lépidoptères. Cette molécule est
très efficace contre les insectes ayant un pH intestinal alcalin, car la protéine toxique est
solubilisée à des pH élevé. Les protéines des spores ingérées sont clivées par des protéases
intestinales et les toxines détruisent les cellules épithéliales de l’intestin. Les contenus de
l’intestin passent dans le sang, entrainant une paralysie et la mort de l’insecte. La toxine est
inefficace contre les animaux en raison de leur pH intestinal neutre ou acide.

Bacillus thuringiensis se multiplient aisément en fermenteur submergé, et produit dans les


conditions appropriées des spores et des corps parasporaux en trente heures. Après l’inoculation
du milieu de culture dans le fermenteur, les spores et les cristaux sont récupérés et incorporés
dans un adjuvant inerte avant d’être vendus comme insecticide a pulvérisé sur les plantes. Le
produit actif est naturel, et est dégradé par les microorganismes du sol.

7-Les protéines d’organismes unicellulaires (POU)


La recherche de nouvelles ressources alimentaires est l’une des préoccupations de ce siècle et de
nombreux pays doivent faire face. A l’heure actuelle, le régime alimentaire de beaucoup de pays
accuse un grave déficit en protéines animales et particulièrement en viandes rouges. Ses besoins
protéiques sont essentiellement couverts par les protéines végétales (céréales, légumineuses).
Cependant, les protéines d’origines animales sont de qualité supérieure aux protéines végétales,
car mieux équilibrées en acides aminés indispensables.

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Les protéines d'organismes unicellulaires (P.O.U.), ou S.C.P. (de l’anglais Single-Cell


Protein) sont une source non conventionnelle de protéines. Ces protéines sont obtenues à partir
de culture de microorganismes (levures, champignons filamenteux, bactéries, cyanobactéries)
utilisant le plus souvent des substrats non comestibles pour l’homme afin de combler le déficit
alimentaire (aussi bien humain qu’animal. Les protéines d’organismes unicellulaires sont très
importantes dans l’alimentation humaine et assurent une sécurité alimentaire car elles sont mieux
équilibrées en acides aminés indispensables que les protéines végétales et contiennent une forte
teneur en acides aminés essentiels.
Les POU sont intéressantes dans les régions où les conditions climatiques sont
défavorables aux cultures, où les terres cultivables sont rares, et pour les populations soumises à
un risque élevé de famine. Les microorganismes constituent des sources alimentaires attractives
pour différentes raisons :
 Croissance rapide
 Croissance généralement indépendante du climat
 Faible encombrement des unités de production
 Substrats peu coûteux pour leur croissance.

Les sources potentielles de POU sont la biomasse de levures et de bactéries. Par rapport
aux bactéries, les levures et les champignons filamenteux sont plus prometteurs comme source
d’alimentation humaine. Les levures, qui se multiplient en présence de substrats peu d’azotés et
riches en carbone et en lipides, présentent un taux protéique plus élevé si elles sont cultivées en
présence de substrats riches en azote. Les critères qui guident le choix du microorganisme :
 Taux de croissance élevé.
 Facilité pour la récolte.
 Bonne résistance aux variations dans les conditions de production.
 Non pathogène.
 Contenu en protéines élevé

Avantages des POU


 permet de résoudre un problème environnemental.
 la croissance rapide de la biomasse (50 fois plus rapide que la production bovine).

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 demande peu d'espace et peu d’eau.


 la production est indépendante des conditions climatiques.
 offre un contenu protéique élevé.
 génère peu de résidus.
 permet la modification génétique des microorganismes.

Inconvénients des POU


 peuvent produire des toxines ou autres métabolites nuisibles.
 possèdent des propriétés physiologiques qui peuvent ne pas convenir à la consommation.
directe par les humains.
 présentent un contenu élevé en acides nucléiques.

8-Biogaz
Le biogaz est un mélange contenant principalement du méthane (50 à 60%), du dioxyde de
carbone, de l’eau, de l’azote, de l’hydrogène sulfuré et de l’oxygène. Ce processus s’observe
fréquemment dans certains milieux naturels comme par exemple les marais (gaz de marais).
Cependant, Il peut être initié artificiellement dans des enceintes closes (digesteurs) où sont
associés des substrats organiques solides ou liquides (d’origine végétale ou animale) et des
cultures bactériennes et les différentes réactions fermentaires sont contrôlées et optimisées. Du
fait d’une forte concentration en méthane, le biogaz est un bon fournisseur d’énergie (1m3 de
biogaz a un pouvoir calorifique de 6 kWh soit l’équivalent de 0,6 litre de fuel).

8.1-Production du biogaz
Les réactions qui se déroulent dans un fermenteur anaérobie (digesteur) sous l’action de
populations bactériennes (Methanobacillus, Methanococcus et Methanosarcina) comprennent
trois phases :

-Hydrolyse et acidogénèse : la matière organique (lipides cellulose, amidon, protéines)


complexe est hydrolysée en molécules simples, en sucres fermentescibles, qui sont utilisées par
des bactéries acidogènes qui vont produire des alcools, des acides organiques, H2, CO2.

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-Acétogénèse : cette étape permet de transformer les divers composés de l’étape précédente
(alcools, acides organiques, acétate, H2, CO2) en précurseurs directs du méthane (acétate, H2,
CO2). On distingue des bactéries productrices obligées d’H2 et CO2; et des bactéries acétogènes,
dont le métabolisme est orienté pour produire l’acétate.

-Méthanogénèse : Elle est assurée par des microorganismes anaérobies stricts appartenant au
domaine Archaea. Cette étape aboutie à la formation du méthane à partir du Co2, acétate et H2.
Les produits de la digestion sont du biogaz (environ 60% de méthane dans les meilleurs
cas, le reste étant principalement du CO2, mais aussi des composés azotés et soufrés. Le biogaz
est utilisé pour la production de chaleur ou d’électricité. Le digestat, résidu de la fermentation
anaérobie, est transformé en compost. La qualité de ce compost est variable et dépend du type de
déchets. Plus les déchets sont fermentescibles, meilleur est le compost.

8.2-Les utilisations de biogaz


 combustion dans un moteur à gaz ou une turbine, pour produire de l'électricité et de la
chaleur en cogénération ;
 alimentation de centrale thermoélectrique, cimenterie, chaufferie collective, etc.) quand il
en existe près de la source;
 chauffage et enrichissement en CO2 de serres.

- Les avantages
 réduction des émissions de gaz à effet de serre ;
 substitut à d'autres énergies exogènes (fossile et nucléaire), source de revenus pour
l'exploitant qui économise sur ses dépenses énergétiques ;
 diminution de la charge en carbone des déchets végétaux.

8.3-Biogaz et environnement : la production et l’utilisation du biogaz ont un impact positif sur


l’environnement. En effet, le biogaz se substitue très fréquemment aux énergies fossiles ce qui
contribue à réduire les émissions de gaz à effet de serre, responsables en partie du dérèglement
climatique. Au cours de leur transformation, les matières organiques végétales utilisées
directement ou indirectement pour produire du biogaz émettent la même quantité de CO2 que
celle absorbée pendant leur croissance ou leur production.

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9-Biocarburants
Les biocarburants proviennent de plantes cultivées (tournesol, betterave, colza, etc.), les produits
obtenus sont le bioéthanol ou l'ETBE (Ethyl tertio-butyl ether) et le biodiesel ou EMHV (Esters
méthyliques d'huiles végétales).

9.1-Biodiesel
On obtient le biodiesel suite à un processus chimique dit transestérification à partir d’un mélange
d’huile végétale ou de graisse animale avec un alcool en présence d’un catalyseur. L’huile
servant à la production de biodiesel peut provenir de n’importe oléagineuse. Les plus
couramment utilisés sont le colza en Europe et le soja au brésil et aux états unis d’Amérique. On
emploie également de faible volume de graisse animale provenant de l’industrie de
transformation des poissons et des produits animaux.
Le biodiesel peut être mélangé avec le diesel habituellement utilisé comme carburant, ou
utilisé tel quel dans les moteurs à allumage par compression. Sa teneur en énergie équivaut 88-95
% de celle du diesel. La forte teneur en oxygène du biodiesel favorise une combustion plus
complète, ce qui réduit les émissions dans l’atmosphère des particules polluantes de monoxyde
de carbone et des d’hydrocarbures.

9.2-Bioéthanol
Tout matériau pouvant être converti en sucre tel que la cellulose ou l’amidon peuvent servir à
produire de l’éthanol. L’éthanol commercialisé actuellement est produit à partir de sucre ou
d’amidon. Les principales cultures sucrières sont la canne à sucre et la betterave à sucre. Les
amylacés les plus courantes sont le mais, le blé et le manioc.
Pour obtenir du bioéthanol (ETBE) on procède à partir de végétaux sucrés tels que la
canne à sucre, les betteraves, les céréales ou pommes de terre. Un traitement permet d'obtenir du
sucre, et sous l'action des levures, une fermentation alcoolique donnera outre l'éthanol quelques
sous-produits. Ensuite par un processus de synthèse dans lequel intervient de l'isobutène, l'éthanol
devient ETBE ou bioéthanol. Le bioéthanol peut être mélangé à de l’essence ou utilisé dans sa
forme pure dans des moteur à combustion interne légèrement modifiés. Un litre d’éthanol
contient 66 % de l’énergie fournie par un litre d’essence. Il améliore la combustion
d’hydrocarbure des véhicules en réduisant ainsi l’émission du monoxyde de carbone,
d’hydrocarbure non brulé et des particules cancérigènes.

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10-Les biosurfactants

Les biosurfactants sont des molécules tensioactives produites par certains microorganismes. Leur
nature tout comme leur pouvoir tensioactif, sont fortement dépendants du type de micro-
organisme utilisé (bactéries, levures, champignons), de la souche testée ainsi que du substrat
nutritif disponible pour le développement cellulaire. On obtient souvent de bon rendement avec
des substrats insolubles. Parmi les différents biosurfactants recensés, on trouve aujourd’hui des
glycolipides, des lipopeptides, des phospholipides, des lipides neutres, des acides gras ou des
lipopolysaccharides. Les biosurfactants d’origine microbienne les plus largement utilisés sont les
glycolipides.

Ces composés possèdent des régions hydrophiles et hydrophobes distinctes. Ils peuvent
avoir des propriétés émulsifiantes, moussantes, mouillantes ou encore dispersantes, mais
également des propriétés plus spécifiques (propriétés antibiotiques). Certaines de ces propriétés
peuvent être conservées dans des conditions extrêmes d’utilisation telles que pH acides,
températures élevées, etc. Compte tenu de leurs potentialités et de leur innocuité, ils sont
aujourd’hui utilisés dans différents domaines d’application tels que l’environnement, l’industrie
pétrolière, l’agronomie ou encore la cosmétologie.

De nombreux surfactants utilisés dans des buts commerciaux sont produits par synthèse
chimique. Mais les biosurfactants suscitent actuellement de plus en d’intérêt, car ils trouvent des
applications particulières importantes dans le domaine de l’environnement, où l’on exige des
substances biodégradables

11-Les biopolymères : sont des polymères produits par des microorganismes. Ils modifient la
fluidité des liquides et servent d’agent gélifiant. Ils sont utilisés en de nombreux domaines des
industries pharmaceutiques, alimentaires et du papier (Tableau 11). L’avantage d’utiliser les
biopolymères microbiens est que leur production est indépendante du climat. On utilise 75 %, au
moins, de tous les polysaccharides extracellulaires microbiens comme agents stabilisants ou pour
disperser les particules, former des biofilms ou faciliter la rétention d’eau dans des produits
divers. Les polysaccharides aident à maintenir la texture de nombreux aliments congelés soumis à
des modifications drastiques de températures.

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Tableau 11: polysaccharides extracellulaires microbiens.

Polysaccharides microorganismes Utilisation


Xanthane Xanhomonas campestris Modification de la viscosité, entre dans
la composition des gels, émulsions
cosmétiques
Dextrane Aerobacter sp. Stabilisation de plasma (sang),
Streptococcus bovis polyélectrolytes, anti-adhésif.
Leuconostoc mesenteroides
Alginate Pseudomonas aeruginosa Stabilisateurs dans des yogourts,
Acetobacter vinelandii gélifiant alimentaire.
Gomme de Pseudomonas elodea Entre dans la composition de gels pour
gellane des solutions microbiennes.
Zanflo Erwinia tahitica Agent épaississeur pour peinture
Curdlane Alcaligenes faecalis Entre dans la composition de gels
alimentaires
Pullulane Aureobasidium pullulans Floculant
Heteroglycane Flavobacterium uliginosum Marqueur (traitement anti-cancéreux)

12-Hormones

Des hormones naturellement présentes telles que la progestérone, la testostérone, l'œstrone et


celles du cortex peuvent actuellement être synthétisées par des microorganismes et à faible coût.

12.1-L’hormone de croissance humaine : ou HGH (Human Growth Hormone) utilisée pour


traiter les déficiences hypophysaires entrainant le nanisme (hypopituitarisme), était
précédemment obtenu on prélevant les glandes pituitaires d’humains décédés. Obtenir
suffisamment d’hormone était à la fois difficile et coûteux, l’utilisation de cette hormone était très
limitée. L’hormone de croissance extraite des animaux n’est pas efficace sur l’homme. Le gène
pour la synthèse de l’hormone de croissance a été introduit chez E. coli, et cette bactérie
génétiquement modifiée, constitue à présent, la source commerciale de l’hormone. Près de 30 000
enfants prenaient cette hormone aux États-Unis.

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12.2-L’insuline humaine : Avant de produire l’insuline par des microorganismes, on utilisait


celle, extraite des porcs ou des bœufs. Du point de vu structural, ce n’est pas précisément la
même que l’insuline humaine, et elle n’est de ce faite pas aussi efficace. En plus, Le nombre de
cas de diabètes augmentant continuellement, il a fallu trouver une autre méthode afin de produire
de l’insuline en grande quantité et à faible coût. Avec le développement du génie génétique, on
s’est donc tourné vers les microorganismes. Depuis 1984, la production à grande échelle de
l’insuline est réalisée commercialement avec la bactérie E. coli génétiquement modifiée. En
1987, on a également commencé à produire de l'insuline avec la levure Saccharomyces
cerevisiae.

13-Vaccins
Les antigènes génétiquement modifiés sont maintenant une réalité grâce aux avancées des
biotechnologies. Ces antigènes présentent plusieurs avantages par rapport aux antigènes extraits
de bactéries pathogènes ou de virus, et sont généralement plus efficaces que les préparations
bactériennes ou virales atténuées. Les antigènes générés par des bactéries sont moins couteuses,
plus facilement purifiés et exempte de contaminants par d’autres protéines. L'hépatite B est une
maladie du foie causée par le virus HBV (Hepatitis B Virus). Afin de prévenir l’infection causée
par ce virus, on a mis au point un vaccin qui, en administrant au corps de petits fragments du
HBV, lui permet de beaucoup mieux se défendre lorsque le virus complet se présente.

Le premier vaccin contre l'hépatite B provenait du sang de personnes infectées par le virus
HBV. On isolait, dans le sang de personnes malades, un fragment de virus susceptible d'être
reconnu par notre système immunitaire. Administré à des personnes saines, ce fragment donnait
alors l’occasion au corps d’identifier le virus pour ensuite l’éliminer. Cette méthode de
vaccination comportait des risques. Malgré les étapes de purification, il pouvait parfois arriver
qu’un virus complet se retrouve dans le vaccin. Sans le vouloir, c’est alors la maladie elle-même
qu’on donnait à une personne saine. Par ailleurs, le recours à des personnes malades pour
fabriquer un vaccin n'est plus pratiqué. On s'est donc tourné vers les microorganismes afin de
produire des fragments du virus.
Le sang d’individus chroniquement contaminés par ce virus présente une particule
protéique appelée Hbs. Cette particule n’est pas toxique en elle-même mais elle constitue un

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Chapitre 4 Produits des fermentations industrielles et leurs utilisations

inducteur efficace pour la production d’anticorps anti-hépatite B. Cette protéine a été clonée chez
Saccharomyces cerevisiae et constitue maintenant la source d’antigène pour l’immunisation
humaine.
14-Autres produits de fermentation, ainsi que leurs utilisations sont portés dans le Tableau 12

Tableau 12: exemples de produits de fermentations industrielles et leurs applications.

Production Microorganismes Utilisation


Produits pharmacologiquement actifs
Ergotamine Claviceps purpura Migraine
Valiomaline Streptomyces hygroscopicus Diabète
Compactine Penicillium. citrinum Cholestérol
Cyclosporine Tolypocladium inflatum Immunosuppresseurs
Prednisone Curvularia lunata asthme et dans le cas d'autres
Corynebacterium simplex allergies
Arômes
Anis-aldéhyde Trametes suavolens Anis
Géraniol Ceratiocystis variospora Rose
Méthyl-phénylacétate Trametes odorata Miel
Hormones végétales
Gibbérelline Phaecosphaeria sp. Suppression de la dormance,
floraison
Lipides Aspergillus Fumigatus, Mucor Alimentation
miehi, Penicillium spinulosum
Pigments
Bêta-carotène Blakeslea trispora Colorants
Rhodotorula gracilis
Nucléotides
5’ IMP Bacillus subtilis
5’GMP B. ammoniagenes
ATP B. ammoniagenes

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15-Biotransformations

Les biotransformation ou bioconversion sont des réactions biochimiques réalisées par des
microorganismes ou catalysées par leurs enzymes. Elles permettent la transformation chimique
d’un substrat donné en un produit spécifique, il existe divers types de bioconversions pratiquées à
l’échelle industrielle. Parmi les principales biotransformations d’antibiotiques on peut citer
(Tableau 13):

Tableau 13: quelques bioconversions d’antibiotiques

Réactions de Microorganismes Substrats Produits


biotransformation
Β-lactames Ps. aeruginosa Pénicilline Acide pénicillanique
Peptides Alcaligenes sp. Novobiocine Novenamine
Acylation Streptomyces griseus Chloramphénicol Chloramphénicol 3 acétate
Phosphorylation Bacillus circulans Kanamycine Kanamycine 3 ortho-phosphate
Sulfoxydation Streptomyces armentosus Lincomycine Lincomycine sulfoxyde

Dr Lamia AOUAR 55
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