UNIVERSIDAD DEL CAUCA – FACULTAD DE CIENCIAS

AGROPECUARIAS

Santander de Quilichao.
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Fax: 8245976-78-79 ext. 115.
Correo electrónico: facagro@unicauca.edu.co

INFORME DE LABORATORIO
EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO

Daza Maya Isabella – 103217012412 – imayad@unicauca.edu.co

Gómez Calambas Wilton Aldiver – 103217012422 – wagomezc@unicuca.edu.co
Molina Blanco Evelyn Nathalia – 103217012419 – enmolina@unicauca.edu.co
Ortiz Nascón Jhon Wilder – 103217012415 – jwortiz@unicauca.edu.co
Universidad del Cauca, Facultad de Ciencia Agropecuarias,
Departamento de Agroindustria,
Programa de Ingeniería Agroindustrial,
Santander de Quilichao, Cauca, Colombia
2019

ABSTRACT
Deoxyribonucleic acid or its acronym DNA is formed by two chains which are wound between them
complementing each other by means of hydrogen bridges. For its study it is necessary to apply certain
extraction techniques where the development of these are strongly linked to the quality of the DNA obtained.

In this paper we examine the methodology of bacterial DNA extraction through the CTAB technique for its
study, where a particular procedure has been developed following laboratory guidance, thus achieving a
result.

RESUMEN

El ácido desoxirribonucleico o en sus siglas ADN está conformado por dos cadenas la cuales se enrollan
entre ellas complementándose entre sí mediante puentes de hidrógeno. Para su estudio se deben aplicar
determinadas técnicas de extracción donde el desarrollo de estás están fuertemente ligado a la calidad del
ADN conseguido.

En el presente artículo se examina a la metodología de extracción de ADN bacteriano a través del método
CTAB para su estudio, donde se ha desarrollado un procedimiento determinado siguiendo la guía laboratorio
alcanzando de esta manera un resultado.

1. INTRODUCCIÓN
En el presente informe de laboratorio se desarrolla
con el objetivo de precisar los conceptos de ADN
bacteriano y su funcionamiento genético haciendo
uso del método CTAB ya este que permite la
extracción de ADN de alta calidad.
El ácido desoxirribonucleico o ADN, es el
ácido nucleico que contiene las
instrucciones genéticas usadas en el
desarrollo y funcionamiento de todos los
organismos vivos conocidos y algunos
virus, y es responsable de su transmisión
 hereditaria. El papel principal de la
molécula de ADN es el almacenamiento a
largo plazo de la información. (Minjarez,
2014)
Para este iniciar la aplicación de este método
necesario inocular una colonia bacteriana, luego
incubación para poder tomar una fracción de esta
muestra de la cual se realizará la extracción del
fragmento de DNA bacteriano. Cabe mencionar
que las bacterias son microorganismos que se
adaptan fácilmente a diferentes condiciones
ambientales. En base a ello nace el interés por
entender la esencia de dicha capacidad, de lo cual
es necesario conocer cómo está organizada la
información genética.
En el ADN podemos encontrar toda la
información genética de un ser vivo, en las
bacterias este contenida en una única
molécula de ácido desoxirribonucleico
(ADN) de doble cadena y circular, cerrado
por un enlace covalente. Dicha molécula se
denomina cromosoma bacteriano este está
estructurado en cromosomas circular y
covalentemente cerrado, a la que podemos
referirnos como “cromosoma bacteriano”
(L. Betancor, 2008).
El fin de conseguir una determinada cantidad y
calidad de ADN, depende directamente de la
técnica o el método aplicado para su extracción.
Este a su vez se convierte en un paso esencial para
el estudio de la secuencia de DNA que se desea
obtener; sin embargo, está actividad no dependerá
únicamente de la técnica o método aplicado sino
también del organismo que se desea estudiar.
En el entorno bacteriano, existen bacterias,
que poseen además ADN extra
cromosómico, también circular cerrado,
denominado ADN plasmídico, por estar
contenido en estructuras llamadas
“plásmidos”, que portan información
génica para una variedad de funciones no
esenciales para la célula en condiciones
normales de crecimiento. (Laura Betancor,
2002)
La importancia de la extracción del ADN radica en
que, únicamente ahí se encuentra en el cromosoma
de la célula es donde se almacena la información
genética de la bacteria, la cual va a será heredada
y al mismo tiempo transmitida a sus células hijas.
Es a través de este medio de supervivencia que
estás se le facilita resistir los cambios de
condiciones extremas puesto que su adaptación
continua y que sean los organismos más
abundantes del planeta.
El CTAB es un detergente catiónico que
posee la propiedad de precipitar ácidos
nucléicos y ácidos polisacáridos en
soluciones de baja concentración iónica.
Bajo estas condiciones las proteínas y los
polisacáridos neutros permanecen en
solución. Pero en soluciones de alta
concentración iónica el CTAB forma
complejos con las proteínas y
polisacáridos, pero no precipita ácidos
nucleicos. Por esta razón es especialmente
útil para precipitar ADN genómico de
organismos que producen grandes
cantidades de polisacáridos como las
plantas y algunas bacterias Gram negativas
(incluyendo algunas cepas de E. coli).
(Probiotek, 2017)
El objetivo principal de la extracción de ADN es
obtener un fragmento que por un lado sea buena
calidad que permita el almacenamiento de este por
un lapso de tiempo indeterminado, en el cual se
logra conservar su estructura y propiedades. Esta
calidad representa se refleja en las aplicaciones
que este tendrá su utilidad mediante experimentos
posteriores de reproductibilidad. Por otro lado, la
cantidad es un término relativo puesto que esta
estará sujeta al número y estado de las células para
una buena extracción. Al final se debe tener en
cuenta que para realizar una buena aplicación de
este método CTAB para la extracción de ADN, es
necesario conservar con gran cuidado la integridad
física y bioquímica del ADN de manera que se
logre aumentar las calidades de pureza y
concentración.
La técnica empleada en la práctica de laboratorio
es por el método CTAB, es adecuado para extraer
y purificar ADN de vegetales y alimentos
derivados de vegetales, está indicado para eliminar
los polisacáridos y los compuestos polis fenólicos
los cuales alterarían la pureza y calidad del ADN
(Murray y Thompson1980, publicado en 1987). El
método CTAB consta de unos principios: lisis de
la membrana celular, extracción: separación de las
fases acuosa y orgánica, precipitación: separación
de los ácidos nucleicos del detergente. (Minjarez,
2014)
En la práctica de laboratorio se escogieron las
bacterias acido lácticas que son microorganismos
que no forman esporas, son inmóviles, y carencia
de catalasa, tienen forma de cocos de pared Gram
positiva con propiedades facultativas. (Huertas,
2010)
2. MATERIALES
-Incubadora
-pHmetro
-Centrifuga
-Vortex
-Micropipetas de diversos volúmenes
-Balanza analítica
-Plancha de calentamiento
-Estufa de secado o desecador
-Cámara de electroforesis
-Fuente de poder
-Hielo picado o cajitas refrigerantes
-Baño serológico a 37°C
-Baño serológico a 65°C
-Fotodocumentador o transiluminador
-Puntas nuevas y estériles de diferentes
volúmenes
-Tubos eppendorf (3 por grupo)
-Tubo falcon de 15 mL (1 por grupo)
-Medios de cultivo: 1 tubo por grupo con 10 mL
de caldo TSB o LB
-Reactivos: (SDS 10%, NaCl 5M, CTAB,
cloroformo-alcohol isoamílico 24:1, alcohol
isopropílico 99%, etanol 70%, tampón TE 1X,
tampón TAE 1X, agarosa)
-Enzimas: (Proteinasa K 20 mg/mL, RNAsa 20
mg/mL)
-Agua grado molecular
-Máscara y gorro de protección
-Guantes de nitrilo
-Frascos de descarte
-Libreta de notas
-Lápiz marcador-
-Flotadores para incubación en baño serológico
-Jabón antibacterial
-Papel toalla
3. METODOLOGÍA
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
• A. Solución SDS 10% (Dodecil Sulfato de
Sodio)
• B. Solución de NaCl 5M
• C. Solución CTAB 10% (Bromuro de
Hexadeciltrimetilamonio)
• D. Tampón TE (Tris-EDTA, 10 mM Tris-
HCl, pH 8.0 y 1 mM EDTA, pH 8.0)
• E. Solución stock de Tris-HCl 1M, pH 8.0
• F. Solución stock de EDTA 0.5M, pH 8.0
3.1 PROCEDIMIENTO
• Inocular una colonia bacteriana en 9 mL de
medio de cultivo (MRS para bacterias
ácido lácticas o caldo Luria Bertani (LB)
para bacterias no acido lácticas).
• Llevar los tubos a incubación por 18 horas
a 35°C.
• Realizar un pase al 10% de cada aislado
activado en 25mL del medio de cultivo
respectivo e incubar nuevamente por 12 a
18 horas.
• Centrifugar los 25 mL del microorganismo
activado a 10000 rpm por 10 minutos y 4
°C.
• Lavar la biomasa obtenida con 2 mL de
buffer TE 1X y nuevamente se centrifugar
a 10000 rpm/10 minutos/ 4 °C.
• Eliminar el sobrenadante, tratar el pellet
obtenido con 2,4 mL de tampón TE 1X,
aplicar vortex fuerte por 20s y mantener los
tubos en hielo.
• Adicionar 500 μL de lisozima (20 mg mL-
1 preparada en TE 1X) y llevar los tubos a
incubación en baño termostatado por 1
hora a 37 °C.
• Retirar los tubos del baño termostatado y
adicionar 62,5 μL de SDS al 10%, aplicar
vortex fuerte por 20s.
• Agregar 6,25 μL de proteinasa K (20 mg
mL-1), agitar suavemente y llevar a
 incubación en baño termostatado por 1
hora a 37°C.
• Retirar los tubos del baño termostatado y
mantener sobre hielo.
• Adicionar 300 μL de NaCl 5 M, 188 μL de
CTAB 10% y aplicar vortex fuerte por 30s
• Incubar por 20 minutos en baño
termostatado a 65°C.
• Retirar los tubos del baño termostatado y
mantener sobre hielo.
• Agregar igual volumen de cloroformo -
alcohol isoamílico (24:1), agitar
vigorosamente por 30s
• Centrifugar a 8000 rpm por 20 minutos.
• Transferir la capa superior a otro tubo
falcon de 15 mL.
• Agregar 3 μL de RNAsa (10 mg mL-1) e
incubar por 1 hora a 37°C en baño
termostatado. Adicionar igual volumen de
cloroformo, agitar vigorosamente por 30s
y centrifugar a 8000 rpm por 20 minutos.
• Transferir la capa superior a otro tubo
falcon de 15 mL.
• Precipitar el ADN con 0,6 volúmenes de
isopropanol frío*. Agitar suavemente.
• Centrifugar a 10000 rpm por 20 minutos.
• Eliminar el sobrenadante y lavar el pellet
obtenido con 200 μL de etanol.
• Centrifugar nuevamente a 10000 rpm por 5
minutos.
• Eliminar el sobrenadante y secar a
temperatura ambiente por 6 horas.
• Resuspender el ADN obtenido en 250 μL
de TE 1 M.
• * si no se observa precipitado, dejar los
tubos a -20°C por 12 a 18 horas y continuar
con el procedimiento.
4. RESULTADOS
Al finalizar la práctica se pudo evidenciar en el
tubo donde se encontraba la muestra, la formación
de una hebra de color blanco la cual, se alcanzaba
a visualizar con mucha dificultad.
5. DISCUSIÓN
La obtención del fragmento se llevó a cabo bajo
los principios del método CTAB el cual, se utilizó
para la extracción. Durante el desarrollo de la
práctica se tomó la muestra donde se fueron
realizando una serie de procedimientos, técnicas,
la adición de ciertos reactivos, enzimas y
soluciones con soluciones previamente preparadas
por el personal de laboratorio como: SDS 10%,
NaCl 5M, CTAB 10%, tampón TE, stock de Tris-
HCl 1M y stock de EDTA 0,5M la cuales
permitieron el éxito de la extracción.
Este método CTAB cuenta con unas
ventajas de utilizar, la cual es su bajo costo,
así como un alto rendimiento. Sin
embargo, en ocasiones el material obtenido
está fragmentado. Estos métodos son
susceptibles de contaminación, variación y
errores por los múltiples pasos de
manipulación (Störmer et al. 2007) tomado
de (Laura Patricia Alejos Velázquez)
Seguidamente se dará una explicación de cada uno
de los procesos realizados en la práctica a fin de
definir por qué sucede cada etapa y la función de
cada solución adicionada a la muestra.
• En el primer paso del procedimiento se
inoculó la bacteria y se llevó a un medio de
cultivo MRS para bacterias acido lácticas
porque este contiene las propiedades
adecuadas para el crecimiento de este tipo
de bacterias.
• La centrifugación es un procedimiento que
utilizado para acelerar la sedimentación de
la muestra, como resultado logró la
separación de biomasa y el sobrenadante.
• La agregación del tampón TE tiene como
propósito solubilizar el ADN o el ARN, al
mismo tiempo que lo protege de la
degradación. Este es utilizado
especialmente en procedimientos que
implican ADN, ADNc o ARN. La
terminación "TE" se deriva de sus
componentes: Tris, un tampón de pH
común, y EDTA, una molécula que quela
cationes como Mg2 +.
• El uso del Vortex se realiza con el fin de
homogenizar la muestra de manera que se
evite la rotura mecánica de la molécula.
• Seguidamente se llevó la muestra a hielo
buscando promover eficientemente la
homogenización de esta.
• La adición de Lisozima tiene como
finalidad debilitar la pared celular
rompiendo los enlaces que hay entre las
moléculas del ácido N-acetilmurámico y la
N-acetil glucosamina.
• La agregación de SDS 10% permite la
eliminación de la membrana celular y
nuclear liberando los ácidos nucleicos.
• La función de la Proteinasa K es
romper/degradar a las proteínas que están
unidas al ADN para lo cual se utiliza el
baño termostático para atemperar los
medios de cultivo.
• El cloruro de sodio en sus siglas NaCl, se
adiciona para neutralizar la carga negativa
de los grupos fosfatos y el bromuro de
hexadeciltrimetilamonio en sus siglas
CTAB es un detergente catiónico que tiene
la propiedad de precipitar ácidos nucleicos,
para homogenizar la solución agregada se
utiliza el Vortex
• Se utilizaron como solventes para separar
el ADN de los lípidos y proteínas
cloroformo - alcohol isoamílico por medio
de dos fases acuosa y orgánica.
• Al centrifugar nuevamente se logra separar
las fases y realizar una sedimentación
gracias a una fuerza giratoria. Una vez
terminado este proceso de lisis celular y la
inactivación de nucleasas, se procede a
retirar los restos celulares para la
purificación de la muestra.
• La ARNasa es una enzima que se utilizó
para eliminar los restos de ARN
contenidos en la muestra los cuales si no
son eliminados en consecuencia estos
actuarán como interferencia en el proceso
de cuantificación y amplificación del ADN
aumentando la incertidumbre de la
veracidad de los resultados.
• Para precipitar el ADN se utilizó etanol ya
que los ácidos nucleicos son insolubles en
soluciones alcohólicas.
• El uso del alcohol Isopropanol es con el fin
de acelerar el proceso, obteniendo un
tiempo de incubación menor, y para que la
precipitación se pueda realizar a
temperatura ambiente.
• El alcohol isoamílico se emplea para
reducción de espuma que se genera al
agitar la solución. Del mismo modo ocurre
una desnaturalización de proteínas
incluyendo nucleasas y se mantiene la
separación de la fase orgánica y acuosa tras
la centrifugación de la muestra.
• La incubación a -20°C permite la
obtención de una pastilla o botón del ácido
nucleico en el fondo del tubo, al decantar
el alcohol.
Al realizar la técnica de extracción de ácidos
nucleicos de manera eficiente se obtuvo el
fragmento; sin embargo, es imposible cuantificar
si el ADN obtenido es de calidad o no, puesto que
es impreciso saber si en realidad fueron eliminadas
todas las proteínas celulares presentes en la célula
que se encuentran junto al ADN. Para ello es
necesario realizar una prueba de electroforesis,
debido a que el espectro de absorción de luz con el
fin de determinar la pureza o impureza del
fragmento del obtenido o si por el contrario no se
extrajo ADN si no otro compuesto totalmente
diferente al este.
Para dicho análisis, se añade bromuro de etidio,
sustancia que se intercala entre las bases del DNA
y es fluorescente cuando se ilumina con luz
ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el
gel con una lámpara de luz UV, y se verán las
bandas correspondientes a las muestras de DNA
aplicado y los marcadores de peso molecular.
(Carmen Alicia Padilla Peña, págs. 2-8)(Padilla C.
et al. s.f)
6. CONCLUSIONES
Se logró desarrollar la práctica tal como se
estableció en la guía de laboratorio de manera que
se cumplió con el objetivo de conocer una
metodología básica para la extracción de ADN
bacteriano adquiriendo destreza en la
manipulación de equipo y reactivos utilizados en
el proceso.
Es necesario resaltar que para realizar dicha http://higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap
extracción es necesario tener conocimiento de %2012.pdf
ciertas consideraciones como él origen e identidad
Laura Patricia Alejos Velázquez, M. d. (s.f.).
de la muestra con la cual se va a realizar la
Extracción y purificación de ADN.
práctica, el método de preparación, la calidad de la
Herramientas moleculares aplicadas en
muestra, puesto que lo que se busca en la
ecología. Obtenido de
extracción de ADN es un fragmento sin impurezas
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2
o contaminantes de manera tal que se logre obtener
/libros/710/extraccion.pdf
resultados con el menor grado de incertidumbre en
su validez. Minjarez, Q. A. (2014). "EXTRACCIÓN DE
ADN. Instituto Nacional de Ecología y
A pesar de que hubo ciertos recortes de tiempo en
Cambio Climatico , Laboratorio de bilogía
el desarrollo de la guía por motivos de ajustes de
molecular. Obtenido de
horario, el final de la práctica se logró visualizar la
https://monitoreoybioseguridad.files.word
hebra del fragmento de ADN en el tubo.
press.com/2014/02/extraccion-de-adn.pdf
Se concluyó que el tiempo de acción de los
Probiotek. (2017). PROBIOTECK . Obtenido de
reactivos sobre la muestra, así como los periodos
PRODUCTOS Y EQUIPOS
de exposición en la centrifuga, vortex y baño
BIOTECNOLÓGICOS S.S DE C.V.:
maría pueden influyeron de forma directa en la
https://www.probiotek.com/productos/rea
obtención de ADN ya que este se logró visualizar
ctivos/ctab/
con cierto grado de dificultad.
Por último es fundamental destacar la necesidad
de eliminar contaminantes como proteínas o
ARN, para obtener un fragmente de DNA de
calidad para el análisis de electroforesis.

7. REFERENCIAS

Huertas, R. A. (2010). Review. Bacterias Acido

Lácticas: Papelfuncional en los alimentos.
SCielo, 94-95. Obtenido de
http://www.scielo.org.co/pdf/bsaa/v8n1/v
8n1a12.pdf
L. Betancor, M. G. (2008). TEMAS DE
BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA
MÉDICA. Obtenido de TEMAS DE
BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA
MÉDICA:
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/Gen
eticaBacteriana.pdf
Laura Betancor, P. G. (2002). GENETICA
BACTERIANA. GENETICA
BACTERIANA. Obtenido de