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Microbiología de Aguas Dr.

César Cáceda Quiroz

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN–TACNA


FACULTAD DE CIENCIAS: E.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA
Curso: Microbiología de Aguas
PRÁCTICAS DE LABORATORIO Nº 06

ENUMERACIÓN DE ENTEROCOCOS EN MUESTRAS DE AGUAS

I. INTRODUCCIÓN

La calidad microbioloó gica del agua se evaluó a en todo el mundo para proteger la salud humana y la
biodiversidad en el medio ambiente acuaó tico. La deteccioó n y cuantificacioó n de microorganismos
patoó genos en el agua es importante para reducir los riesgos asociados a la salud puó blica y tomar
las acciones maó s adecuadas para prevenir la transmisioó n de enfermedades debido a que el geó nero
Enterococcus ha cobrado una gran importancia al nivel internacional por su elevada incidencia en
las enfermedades nosocomiales y por la adquisicioó n de resistencia a muchos antimicrobianos.
Varios microorganismos indicadores de la contaminacioó n fecal se utilizan para evaluar la calidad y
la seguridad de los distintos tipos de agua. Enterococcus estaó recibiendo una amplia aceptacioó n
como indicador muy uó til en la determinacioó n de la calidad microbioloó gica

Enterococcus son ceó lulas esfeó ricas u ovoides, de tamanñ o 0,6-2,0 × 0,6-2,5 µm. Son cocos
grampositivos, no formadores de endosporas. Se presentan en forma de pares o de cadenas cortas.
Son no moó tiles, con excepcioó n de las especies E. gallinarum y E. casseliflavus. Son anaerobios
facultativos, quimiorganotrofos, con metabolismo fermentativo. Fermentan un amplio rango de
carbohidratos con produccioó n principalmente de L (+)- aó cido laó ctico, pero no de gas, y producen un
pH final de 4,2-4,6. Presentan requerimientos nutricionales complejos. Son catalasa negativos o,
maó s comuó nmente, deó bilmente positivos. Crecen usualmente en un caldo de cultivo a 10 °C y 45 °C,
aunque el crecimiento oó ptimo es a 37 °C. Pueden crecer a pH 9,6, con 6,5 % de NaCl y con 40 % de
bilis. Usualmente fermentan la lactosa. Portan el antíógeno D del grupo Lancefield y poseen el
carbohidrato C. Sobreviven despueó s del calentamiento a 60 °C durante 30 min.
Enterococcus pueden diseminarse por transmisioó n fecal-oral, por contacto con fluidos de personas
infectadas o por contacto con superficies contaminadas.Existen 33 especies pertenecientes al
geó nero Enterococcus.

La enumeracioó n de estas bacterias es utilizada para valorar la calidad sanitaria de alimentos,


sedimentos y aguas destinadas al consumo humano, la agricultura, la industria y la recreacioó n.La
presencia de E. faecalis y E. faecium es usada frecuentemente para indicar contaminacioó n de origen
fecal. El anaó lisis de Enterococcus es interesante cuando se analizan muestras de aguas, ya que E.
bovis y E. equinus, son indicadores de contaminacioó n por animales de sangre caliente no humana y,
ademaó s, son las especies que maó s raó pidamente mueren en el medio exterior; por eso, cuando se
detectan, indican una contaminacioó n reciente por animales de granja. Para su anaó lisis se emplea la
teó cnica de nuó mero maó s probable (NMP), usando el medio EVA (etil violeta azida) o meó todos de
siembra en placa, empleando el medio KF-Streptococcus. E. faecalis produce colonias con un fuerte
color rojo, mientras que otras especies de Enterococcus y Streptococcus producen colonias maó s
pequenñ as y de color rosado brillante. El meó todo de cultivo requiere de un períóodo de incubacioó n de
48 h a 37ºC

Enterococcus es considerado el indicador bacterioloó gico maó s eficiente para evaluar la calidad de
agua de mar para uso recreativo, debido a que es altamente resistente a las condiciones salinas de
este medio y ademaó s estaó relacionado directamente con gastroenteritis, enfermedades
respiratorias, conjuntivitis y dermatitis, entre otras.

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II. OBJETIVOS

● Realizar el recuento de Enterococcus en aguas superficiales destinadas para recreacioó n

III. MATERIAL PARA LA PRÁCTICA:

MUESTRA:

 Agua de piscina o agua de mar

MATERIALES DE LABORATORIO:

 Pipetas
 Matraz
 Tubos de ensayo
 Gradilla
 Placas Petri
 Mecheros
 Agua destilada

EQUIPOS:
 Una balanza
 Autoclave
 Incubadora
 Microscopio
 Cocina eleó ctrica

MEDIOS DE CULTIVO:
 Agar KF
 Caldo BHI
 Agua peptonada

REACTIVOS:

 Peroxido de hidrogeno

MEDIOS DE CULTIVO

A. Agar KF

El Agar KF (Kenner Fecal) Estreptococos es un medio selectivo utilizado para el aislamiento y


recuento de los cocos enteó ricos fecales en agua potable, bebidas, aguas residuales, starters aó cido
laó cticos y productos alimentarios, utilizando tanto el meó todo de filtracioó n por membrana como el
claó sico meó todo de recuento en Placas Petri. El agar KF es utilizado especíóficamente para la
enumeracioó n de Enterococcus de aguas. El medio contiene TTC; es relativamente rico en maltosa (2

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% p/v) y posee lactosa en menor proporcioó n (0,1 % p/v). Algunos Enterococcus y Streptococcus
son capaces de fermentar estos azuó cares y crecer en el medio; sin embargo, la intensidad en la
reduccioó n del TTC varíóa entre las diferentes especies. Por ejemplo, E. faecalis produce colonias con
un fuerte color rojo, mientras que otras especies de Enterococcus y Streptococcus producen
colonias maó s pequenñ as y de color rosado brillante. El meó todo de cultivo requiere de un períóodo de
incubacioó n de 48 h a 37ºC
El agar KF son medios para Enterococcus que basan su funcionamiento en la fermentacioó n de
azuó cares contenidos en la formulacioó n, y provocan un cambio de coloracioó n de los indicadores
como resultado de la acidificacioó n que producen algunas especies que pueden metabolizarlas.

COMPOSICION DEL AGAR KF


 Proteosa peptona 10.0 g
 Extracto de Levadura 10.0 g
 Cloruro de sodio 5.0 g
 Glicero fosfato soó dico 10.0 g
 Maltosa 20.0 g
 Lactosa 1.0 g
 Azida de sodio 0.4 g
 Purpura de bromocresol 0.015 g
 Agar agar 20.0 g

IV. PROCEDIMIENTO

A. TOMA DE MUESTRA:

a) Envases:
Realíócese la toma de muestras para el estudio bacterioloó gico del agua de las piscinas en la
forma descrita en la seccioó n 9060ª del libro Apha 1995.
Utilíócense envases con una capacidad de 120-480 ml, en funcioó n de los anaó lisis que vayan a
efectuarse. Anñ aó dase tiosulfato de sodio, Na2S2O3, como neutralizador desinfectante
en una cantidad suficiente como para proporcionar una concentracioó n aproximada a 100
mg/1 en la muestra.
Para ello, anñ aó danse 0,1 ml de una solucioó n de Na 2S2O3 al 10 % a una botella de 120 ml, o 0,4
ml a una botella de 480 ml. Una vez anñ adido el Na 2S2O3, taó pese o cieó rrese la botella y
esterilíócese.

b) Procedimiento de toma de muestras:

Realíócese la toma de muestras en la zona y durante el períóodo de maó xima densidad de banñ os.
Para la posterior interpretacioó n de los resultados del anaó lisis, tambieó n es importante la
informacioó n sobre dicha densidad.

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B. PRUEBAS PRESUNTAS:

1) Preparar el material para las diluciones de la muestra


2) Colocar 225ml de agua peptonada en un matraz, en el cual se le agregara una muestra de 25
ml y la serie de tubos hasta 10-4 con 9ml de agua peptonada y realizar diluciones hasta 10 -4
3) Pipetear alíócuotas de 1 ml de cada una de las diluciones en placas Petri, utilizando dos
placas por dilucioó n
4) Raó pidamente anñ adir a cada una de las placas 15 ml de agar KF para Streptococcus, fundido y
templado a 44-46 ºC
5) Mezclar el inoculo y el agar haciendo girar y balancear las placas
6) Una vez solidificado el agar, incubar las placas en posicioó n invertida a 35-37ºC durante 48
horas (agar KF)
7) Utilizando el contador de colonias y el dispositivo de recuento automaó tico contar todas las
colonias de color rojo intenso (S.faecalis) y rosa claro ( S.faecium) en el agar KF. En ambos
casos, elegir para el recuento las placas que presenten entre 30 y 300 colonias
8) Calcular el nuó mero de presuntos enterococos por gramo de muestra. (I.C.M.S.F, 2000)

C. PRUEBAS CONFIRMATORIAS:

1) Escoger de 5 a 10 colonias de color purpura en las placas del medio de Packer o un nuó mero
igual de colonias rojas y/o rosa claro de las placas de agar KF. Tomarlas con el asa de
siembra e inocularlas individualmente en tubos de caldo infusioó n cerebro corazoó n, que
seraó n incubados a 35-37ºC durante 18-24 horas o hasta que aparezca turbidez.
2) Hacer una tincioó n de Gram de cada uno de los cultivos y observar la presencia de tíópicos
cocos ovales, Gram positivos en pares o en cortas cadenas
3) Tomar aseó pticamente unos 3ml de cada uno de los cultivos de estreptococos y mezclarlos en
otro tubo con aproximadamente 0,5 ml de peroó xido de hidroó geno al 3 %. El caraó cter
catalasa negativo (ausencia de produccioó n de burbujas) confirma que se trata de
estreptococos.
4) Inocular con cada cultivo confirmado de estreptococos un tubo de caldo infusioó n cerebro
corazoó n. Templar los tubos en banñ o de agua a 44-46 ºC e incubarlos a la misma temperatura
durante 48 horas, observando el crecimiento.
5) Sembrar con cada cultivo confirmado de estreptococos un tubo de caldo infusioó n de cerebro
corazoó n conteniendo 6.5% de NaCl. Incubar a 35-37ºC durante 72 horas y observar el
crecimiento
6) Un estreptococo catalasa negativo que crece a 44-46ºC y tambieó n en presencia de un 6.5 %
de NaCl corresponde a un enterococo. (I.C.M.S.F, 2000)

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Flujograma de Recuento de Enterococos probables

REFERENCIAS:

1. Barrow, G., & Feltham, R. (1993). Identificacion de bacterias medicinales. Cambridge.


2. Diaz, M., Rodriguez, C., & Zhurbenko, R. (2010). Aspectos fundamentales sobre el geó nero
Enterococcus como patoó geno de elevada importancia en la actualidad. Revista Cubana de
Higiene y Epidemiología.
3. Diaz, M., Zhurbenko, R., Rodriguez, T., Quinñ ones, D., & Rodriguez, C. (2014). Determinacioó n
cuantitativa de enterococos en aguas utilizando un meó todo cromogeó nico alternativo. Revista
cubana.

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4. Grupo de Trabajo Federal, P. (1992). Pautas para la calidad del agua recreativa canadiense.
Canada.
5. I.C.M.S.F. (2000). Microorganismos de los alimentos. Vol. I: Su significado y métodos de
enumeración. Espanñ a: Editorial Acriba.
6. Vergaray, G., Mendez, C., Morante, H., Heredia, V., & Bejar, V. (2007). Enterococcus y Escherichia
coli como indicadores de contaminacioó n fecal en playas costeras de Lima. Revista del Instituto
de Investigación de la Facultad de Ingeniería Geológica, Minera, Metalúrgica y Geográfica.

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