NUTRIÇÃO CELULAR

Ø  as capacidades metabólicas dos microrganismos são diferentes e portanto as suas necessidades nutricionais também variam
Ø  no entanto, todos os microrganismos requerem alguns nutrientes comuns

!
Os seguintes elementos estão presentes em todos os sistemas vivos: cerca de 75 % do peso de uma célula
•  C (50 % peso seco) microbiana é água e o restante são

•  O, H (25 % peso seco) essencialmente biomoléculas

•  N (13 % peso seco)

•  P, S, Se, K, Mg (5 % peso seco)

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 NUTRIÇÃO CELULAR

Macroelementos Microelementos ou elementos vestigiais

C, O, H, N, S e P Mn2+
•  constituem os hidratos de carbono, lípidos, proteínas e ácidos •  cofactor de enzimas que catalisam transferência de grupos
nucleicos fosfato
K+ Zn2+
•  necessário para a actividade de várias enzimas •  presente no centro activo de algumas enzimas
Ca2+ Mo2+
•  faz parte dos endósporos, entre outras funções •  necessário para a fixação de azoto
Mg2+ Co2+
•  é cofactor de várias enzimas, complexa com o ATP e estabiliza •  componente da vitamina B12
ribossomas e membranas celulares Cu2+
Fe2+ e Fe3+
•  fazem parte dos citocromos, são cofactores de enzimas
(catalase, desidrogenase succínica) e de proteínas
transportadoras de electrões

para além destes elementos, alguns microrganismos têm necessidades especiais, que reflectem a sua
morfologia ou habitat:
Ø  as algas diatomáceas necessitam de ácido silícico
Ø  muitas bactérias precisam de elevadas concentrações de Na+

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 NUTRIÇÃO CELULAR

Factores de crescimento

compostos orgânicos necessários porque são componentes celulares essenciais ou precursores desses componentes e não podem ser
sintetizados por alguns microrganismos, podem ser:
•  aminoácidos
•  purinas e pirimidinas
•  vitaminas

☛  Enterococcus faecalis precisa de 6 vitaminas diferentes

Os microrganismos necessitam de uma mistura equilibrada de nutrientes; se um nutriente essencial escasseia, o crescimento
microbiano fica limitado, independentemente das concentrações dos outros nutrientes

CLASSIFICAÇÃO NUTRICIONAL DOS MICRORGANISMOS

FONTES DE C, ENERGIA E H/ELECTRÕES

Fontes de C

Autotróficos CO2 como principal fonte

Heterotróficos compostos orgânicos

Fontes de Energia

Fototróficos Luz solar

Quimiotróficos oxidação de compostos orgânicos ou inorgânicos

Fontes de H ou de Electrões
Litotróficos substâncias inorgânicas reduzidas
Organotróficos moléculas orgânicas

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 NUTRIÇÃO CELULAR

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 NUTRIÇÃO CELULAR

MEIOS DE CULTURA

i.  meios com composição definida

ii.  meios complexos preparados a partir de produtos de origem microbiana, animal ou de plantas, podem incluir caseína, extracto de
carne, soja, extracto de levedura, entre outros
☛  meios enriquecidos - utilizados para o crescimento de microrganismos com exigentes necessidades nutricionais (microrganismos
fastidiosos) – meios complexos, a que se adicionam substâncias nutritivas, por ex. soro ou sangue

Enriched media. (a) Burkholderia

growing on sheep blood agar (SBA);
the red color is from blood suspended
in the trypticase soy agar medium.
(b) Francisella tularensis growing on
chocolate agar; the brown color is due
Microbiologia Industrial to heat-lysed blood in the trypticase
70 soy agar medium.
 NUTRIÇÃO CELULAR

MEIOS DE CULTURA

meios líquidos

meios sólidos agar

1-2 % (m/V) agar

Tipos de Meios

①  meios selectivos

Ø  promovem o crescimento de alguns organismos e inibem o crescimento de outros

Ø  contêm agentes inibitórios
•  sais de bílis ou corantes, como a fucsina básica, o violeta de cristal e o azul de metileno, que inibem o crescimento de bactérias Gram +
•  antibióticos
Ex: meio sólido com verde brilhante utilizado no isolamento de células Gram – do género Salmonella

②  meios diferenciais

Ø  permitem a distinção entre diferentes grupos de bactérias e a eventual identificação, tendo por
base a aparência da cultura após crescimento

Ex: distinção entre bactérias hemolíticas e não hemolíticas.

α hemólise – Streptococcus pneumonia
β hemólise – Streptococcus pyogenes e algumas estirpes de Staphylococcus aureus
ϒ hemólise – Enterococcus faecalis

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 NUTRIÇÃO CELULAR

MEIOS DE CULTURA

③  meios selectivos e diferenciais

Ex: agar de Mac Conkey para isolamento e diferenciação de bactérias Gram -, que
fermentam a lactose; as colónias de bactérias que fermentam a lactose originam uma
diminuição localizada de pH e coram de vermelho e o crescimento das bactérias Gram + é
inibido pelos sais de bílis presentes no meio

④  meios para testes microbiológicos

Ø  microrganismos específicos são usados para medir concentrações de substâncias às

quais são susceptíveis, como antibióticos e vitaminas

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 NUTRIÇÃO CELULAR

MEIOS DE CULTURA

☛  para culturas enriquecidas

Ø  é utilizado um meio e condições de incubação que favorecem o

crescimento de uma espécie existente em baixa concentração numa
população diversa
Ø  não são utilizados inibidores de crescimento para os microrganismos
indesejáveis
Ø  várias estratégias de enriquecimento têm sido utilizadas
Ex: bactérias oxidantes de fenol isoladas de amostra de solo, utilizando meio
com sais de amónio e fenol; Azotobacter

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 CRESCIMENTO MICROBIANO

Ø  aumento da dimensão das células: em microrganismos cenocíticos (multinucleados, divisões nucleares não são acompanhadas por
divisão celular)
Ø  aumento do número de células: em microrganismos que se reproduzem por divisão binária ou por gemulação

Cultura em Descontínuo

Curva de Crescimento
1.  fase lag ou de latência: após inoculação o crescimento é nulo, a duração varia com a
condição do microrganismo e natureza do meio
2.  fase log ou exponencial: microrganismo cresce a velocidade constante e máxima
possível de acordo com o potencial genético, natureza do meio e condições do
para bactérias crescimento - taxa de crescimento constante – crescimento logarítmico, população química
ca. de 109 e fisiologicamente uniforme
células/mL
3.  fase estacionária: crescimento cessa devido a acumulação de metabolitos tóxicos e/ou
exaustão de um ou mais nutrientes essenciais; o número de células viáveis é constante
devido ao balanço entre divisão celular e morte celular
4.  fase de morte: acumulação crescente de produtos tóxicos e escassez de nutrientes
leva ao declínio do número de células viáveis; células são destruídas por lise e alterações
na parede celular das bactérias; morte é logarítmica tal como o crescimento

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 CRESCIMENTO MICROBIANO

Cultura em Descontínuo

Na fase exponencial, o aumento do número de células é dado por:

dx 1 dx x - concentração de células viáveis

=µx ου =µ
dt x dt µ - taxa específica de crescimento celular (tempo-1)

integrando as equações no intervalo t0 a t e considerando que:

•  x = x0 para t0
•  µ é constante nesta fase

obtém-se a equação que representa o crescimento exponencial:

x0 - concentração de células viáveis a tempo zero, concentração de
µ t
lnx t = lnx 0 + µ t ⇒ x t = x 0e biomassa inicial
xt - concentração de células viáveis a tempo t, concentração de
biomassa a tempo t

ln(2x 0 ) = ln x 0 + µ t d
As células multiplicam-se rapidamente e o número de células vivas duplica regularmente
ln2 + ln x 0 = ln x 0 + µ t d
com o tempo.
ln2 = µ t d
O tempo de duplicação (td ou g) é o tempo necessário para que a população com uma
concentração celular inicial xo duplique. ln2
td =
µ

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 CRESCIMENTO MICROBIANO

Cultura em Descontínuo

Nt = N0 × 2n

N0 - número de células viáveis a tempo zero

Nt - número de células viáveis a tempo t
n - número de gerações durante o período t da fase exponencial

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
EXERCÍCIOS

1. Uma cultura de E. coli foi cultivada num meio de cultura contendo acetato de sódio como fonte de carbono. A biomassa inicial foi
de 20 mg, estando a cultura a crescer exponencialmente com uma taxa específica de crescimento µ de 1,0 h-1. Determine:
a)  A biomassa ao fim de 10 h.
b)  A biomassa ao fim de 10 h, assumindo uma morte celular de 5 % entre as divisões celulares sucessivas.

2. A Escherichia coli foi utilizada para produção de uma hormona de crescimento recombinante. A bactéria cresceu aerobiamente
numa cultura em descontínuo, com glucose como substrato limitante do crescimento. As concentrações de células e de substrato
foram medidas em função do tempo de cultura, tendo-se obtido os resultados seguintes. Determine µ e td.

Tempo (h) x (kg m-3) [S] (kg m-3)

0,00 0,20 25,0

0,33 0,21 24,8

0,50 0,22 24,8

0,75 0,32 24,6

1,00 0,47 24,3

1,50 1,00 23,3

2,00 2,10 20,7

2,50 4,42 15,7

2,80 6,90 10,2

3,00 9,40 5,2

3,10 10,90 1,7

3,20 11,60 0,2

3,50 11,70 0,0

3,70 11,60 0,0

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
1. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS

Câmaras de Contagem:

•  contagem directa em lâminas especiais com

câmaras de profundidade conhecida

Ø  Petroff-Hausser (bactérias)
Ø  N e u b a u e r i m p r o v e d o u
hemocitómetro (eucariotas)

•  método simples, rápido e económico

•  fornece informação sobre tamanho e
morfologia
•  a população microbiana deve ser elevada
porque é utilizado um pequeno volume de
amostra

The Petroff-Hausser counting chamber, The Neubauer improved chamber

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
Contador Electrónico Coulter:

•  para protozoários, algas e leveduras

•  resultados rigorosos com células grandes
(muito utilizado em laboratórios hospitalares para contagem de eritrócitos e leucócitos)
•  são interferentes pequenas partículas e fragmentos
•  contabiliza células viáveis e não viáveis

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
Técnica de Diluição em série de Placas:

•  a amostra diluída é espalhada sobre um meio sólido, cada célula desenvolve-se numa colónia distinta

•  contabiliza células viáveis a partir do número de colónias formado

•  método simples e sensível
•  vastamente utilizado na quantificação de microrganismos em alimentos, águas e solo
•  devem ser obtidas 25 a 250 colónias
•  pode ocorrer sobreposição de colónias

•  resultados expressos em CFU (Colony Forming Units)

Ø  a contagem é mais rigorosa se forem utilizados contadores de colónias

especiais:
(a) contador de colónias Quebec
(b) contador automático de colónias

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 CRESCIMENTO MICROBIANO

Filtração em Membranas:

•  a amostra é filtrada através de um filtro de membrana

•  o filtro é colocado sobre meio sólido e incubado até cada célula formar uma colónia separada

•  podem ser utilizados meios especiais para seleccionar o crescimento de organismos específicos:

•  podem ser utilizados para contagem directa de bactérias coradas com corantes fluorescentes (filtros de policarbonato)

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
2. DETERMINAÇÃO DA MASSA CELULAR

Com o crescimento da população aumenta também a massa celular total.

Determinação do Peso Seco

•  recolha das células do meio de cultura por centrifugação, lavagem, secagem e pesagem
•  muito utilizada na quantificação do crescimento de fungos, mas pouco adequada para bactérias
•  morosa e pouco sensível

Espectrofotometria

•  técnica sensível e rápida

•  a quantidade de luz desviada é proporcional à concentração de
células presente
•  quando a concentração bacteriana no meio é 107 / mL, o meio
torna-se turvo
•  quanto maior a concentração bacteriana maior a quantidade de luz
desviada, que pode ser medida utilizando um espectrofotómetro

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 CRESCIMENTO MICROBIANO

Outros Métodos

•  se a quantidade celular de dada

substância é constante, a quantidade
total de constituinte celular está
directamente relacionada com a
massa celular
Ex: análise de proteína total, de
azoto, quantidade de ATP (método
de doseamento enzimático rápido,
sensível em que o número de células
viáveis é determinado com base na
quantificação de ATP; a luciferase
detecta ATP produzindo luz verde
que é proporcional à quantidade de
ATP e ao número de células viáveis
presentes)

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 CRESCIMENTO MICROBIANO

EFEITO DE UM SUBSTRATO LIMITANTE

•  a taxa de crescimento apresenta uma dependência hiperbólica com a concentração do substrato.

Cinética de Monod

[S]: concentração do substrato

µmax ⎡⎣S⎤⎦
µ= Ks: constante de utilização do S
K S + ⎡⎣S⎤⎦ é a [S] para a qual µ é metade de µmáx

medida de afinidade

Zona A-B: fase exponencial, S em excesso e crescimento com µmáx, se

[S] > KS então µ ≈ µmáx
Zona C-A: fase de desaceleração, S limita o crescimento
Ø  KS baixo - organismo com elevada afinidade para [S], zona C-A curta:
µ só diminuirá se [S] baixa
Ø  KS elevado - organismo com baixa afinidade para [S], zona C-A
grande: µ diminuirá muito para [S] elevada

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
EXERCÍCIOS

µmax ⎡⎣S⎤⎦
3. A equação seguinte é uma das equações básicas associadas aos processos biológicos. µ=
K S + ⎡⎣S⎤⎦
a)  Linearize a equação na forma 1/µ em função de 1/[S].

b)  Demonstre matematicamente que para KS=[S], µ=µmáx/2.

c)  Indique graficamente como é que o valor de µ é afectado pelo valor de KS.

d)  A concentração que dá origem a µ=0,99× µmáx é frequentemente designada por concentração crítica de substrato. Obtenha

uma relação entre [S]crítico e KS.

4. Os dados experimentais indicados na tabela foram obtidos com um microrganismo que obedece à cinética de Monod.

[S] (kg/m3) µ (h-1)

0,025 0,095

0,057 0,180

0,125 0,270

0,250 0,360

0,500 0,430

0,800 0,460

Utilizando um método conveniente de cálculo, determine, para as condições de cultura:

a)  A taxa específica de crescimento máxima do microrganismo.
b)  A constante de utilização de substrato.
c)  A concentração crítica de substrato.

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
FACTORES FÍSICOS

1. TEMPERATURA

•  influencia vários factores como: o tipo de reprodução, a morfologia das células, os processos metabólicos, as necessidades nutricionais
e a taxa de crescimento.

Temperaturas de Crescimento Cardinais

Ø  variam com o tipo de microrganismo, com a etapa do ciclo de

vida e com o conteúdo nutricional do meio e são:

a.  mínima - processos de transporte lentos

b.  óptima - reacções enzimáticas com velocidade máxima
c.  máxima - desnaturação proteica e lise celular

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
FACTORES FÍSICOS

1. TEMPERATURA

Os microrganismos podem ser divididos em classes, em função da temperatura óptima de crescimento:

i.  psicrófilos: algumas bactérias, fungos, algas e protozoários que habitam nas regiões do
Ártico e Antártico
ii.  psicrotolerantes: bactérias e fungos que degradam alimentos refrigerados
iii.  mesófilos: várias bactérias, fungos algas e protozoários, microrganismos patogénicos
iv.  termófilos: microrganismos que habitam nas furnas dos Açores, em pilhas de
compostagem, sistemas de aquecimento
v.  hipertermófilos: Bacteria e Archaea que habitam em zonas quentes do fundo do mar Methanopyrus 122
ºC

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
FACTORES FÍSICOS

1. TEMPERATURA

extermófilos ou supertermófilos:
eventual existência de Archaea que se desenvolvem nas chaminés de enxofre,
localizadas no fundo do oceano, onde a T é 250-350ºC ou superior e a pressão
é 265 atm, suficiente para água permanecer no estado líquido

2. pH

i.  acidófilos: 0 - 5,5

ii.  neutrófilos: 5,5 - 8,0
Os microrganismos são classificados de acordo com o pH óptimo de crescimento em:
iii.  alcalófilos: 8,5 - 11,5
iv.  alcalófilos extremos: ≥ 10

•  os microrganismos crescem bem em gamas largas de pH, mas existem limites para a sua tolerância, variações drásticas de pH podem provocar:
a.  desintegração da membrana citoplasmática, inibição da actividade enzimática e das proteínas membranares transportadoras
b.  ionização das moléculas de nutrientes, reduzindo a sua disponibilidade

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
FACTORES FÍSICOS

2. pH

•  os microrganismos podem alterar o pH do meio produzindo produtos metabólicos ácidos ou básicos: ácido sulfúrico (Thiobacillus) ou amónia
•  soluções tampão são frequentemente incluídas no meio

3. AREJAMENTO (CONCENTRAÇÃO DE O2)

i.  aeróbios obrigatórios: dependentes do oxigénio atmosférico, o oxigénio é o

aceitador final de electrões na cadeia transportadora de electrões da respiração
aeróbia, necessário para síntese de esteróis e de ácidos gordos insaturados
ii.  anaeróbios facultativos: não necessitam de oxigénio para o crescimento, mas
crescem melhor na sua presença
iii.  anaeróbios aerotolerantes: crescem igualmente na presença ou na ausência de

oxigénio, não produzem energia por respiração e muitos usam as vias de

fermentação ou respiração anaeróbia (Enterococcus faecalis) i.  v.  ii.  iv.  iii. 

iv.  microaerófilos: aeróbios que não toleram a concentração de oxigénio atmosférico, necessitam de níveis inferiores para o crescimento

2 -10% (Campylobacter)
v.  anaeróbios obrigatórios: não toleram oxigénio e morrem na sua presença, não produzem energia por respiração e muitos usam as

vias de fermentação ou respiração anaeróbia (Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium pasteurianum, Methanococcus)

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
FACTORES FÍSICOS

3. AREJAMENTO (CONCENTRAÇÃO DE O2)

Bactérias e Protozoários: todos os 5 grupos

Fungos: são normalmente aeróbios, algumas leveduras anaeróbias facultativas
Algas: são maioritariamente aeróbias obrigatórias

As diferentes relações com o oxigénio podem ser devidas a vários factores:

Ø  inactivação de enzimas: oxidação de grupos sulfidrilo (nitrogenase)

Ø  efeitos tóxicos do oxigénio: formação de espécies tóxicas como o radical superóxido, radical hidroxilo e peróxido de hidrogénio

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
FACTORES FÍSICOS

3. AREJAMENTO (CONCENTRAÇÃO DE O2)

Espécies Reactivas de Oxigénio

(ROS)

☛  muitos microrganismos aeróbios obrigatórios e anaeróbios facultativos sintetizam enzimas que lhes conferem protecção
contra os produtos tóxicos:

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
FACTORES FÍSICOS

3. AREJAMENTO (CONCENTRAÇÃO DE O2)

aeróbios obrigatórios anaeróbios obrigatórios anaeróbios facultativos microaerófilos anaeróbios aerotolerantes

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
FACTORES FÍSICOS

Cultura de microrganismos anaeróbios em laboratório:

i.  adição de agentes redutores ao meio (tioglicolato de sódio e cisteína)
ii.  remoção do ar com uma bomba de vácuo ou borbulhando azoto no meio
iii.  utilização do sistema Gas Pak
iv.  sacos de plástico contendo catalisador e carbonato de cálcio

The GasPak Anaerobic System, Hydrogen and carbon dioxide are

generated by a GasPak envelope, Palladium catalyst in the chamber
lid catalyzes the formation of water from hydrogen and oxygen,
thereby removing oxygen from the sealed chamber.

Cultura de microrganismos aeróbios em laboratório:

i.  agitação do meio de cultura
ii.  ou introdução de ar estéril no meio

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
FACTORES FÍSICOS

4. PRESSÃO
☛  grande parte dos microrganismos como habitam na superfície do solo e água, vivem à pressão de 1 atm, mas os microrganismos
que habitam no fundo dos oceanos vivem entre 600 a 1100 atm!
i.  não tolerantes
ii.  barotolerantes: aumento de pressão afecta adversamente mas não tanto como os não tolerantes
iii.  barofílicos: crescem mais rapidamente a pressões elevadas
Ex: bactérias no estômago de invertebrados do fundo do mar

5. RADIAÇÃO

☛  muitas formas de radiação electromagnética são prejudiciais para os microrganismos:

i.  radiação ionizante - raios X e γ: baixos níveis podem originar mutações e a morte, enquanto níveis elevados são directamente
letais
ii.  raios UV (≈ 10-400 nm): a radiação de 260 nm é a mais letal porque é eficazmente absorvida pelo DNA
iii.  radiação visível em algumas intensidades

6. SOLUTOS E ACTIVIDADE DA ÁGUA

i.  não Halófilos

ii.  osmotolerantes ou halotolerantes: alguns microrganismos conseguem crescer
numa gama relativamente ampla de actividade de água ou pressão osmótica
Ex: Staphylococcus aureus e Saccharomyces rouxii
iii.  halófilos: adaptaram-se de tal forma a concentrações elevadas de sal (> 0,2 M)
que é necessário para o crescimento
iv.  halófilos extremos: necessitam de elevados níveis de NaCl para crescerem
(2,8 M e 6,2 M)
Ex: género Halobacterium isolado do Mar Morto

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 CRESCIMENTO MICROBIANO
FACTORES FÍSICOS

6. SOLUTOS E ACTIVIDADE DA ÁGUA

Os microrganismos aumentam a concentração osmótica interna através de:

•  síntese ou absorção de diversos aminoácidos tais como prolina, ácido glutâmico, etc (bactérias)
•  síntese ou absorção de sacarose, arabitol e glicerol (algas e fungos)
•  vacúolos para eliminar o excesso de água, quando vivem em ambientes hipotónicos (protozoários)

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