Université Abbes Laghrour de Khenchela-Matière Bioinformatique et Génomique exploratoire-Master I-

Biochimie appliquée et Microbiologie appliquée

Dr.Bouazza L.

Chapitre 1 : Séquençage
I-séquençage des protéines
1) Position du problème :
Pour déterminer la composition d'un peptide, il faut connaître les acides aminés qui le
composent ainsi que l'ordre dans lequel ils sont enchaînés.
On procède en déterminant la nature de l'acide aminé N-terminal de la chaîne. On s'intéresse
à celui -ci car il possède un groupement amino (NH2-) libre.

2) Diverses méthodes:
On distingue deux types de méthodes:
- Celles qui permettent d'identifier l'acide aminé N-terminal, le reste de la chaîne du peptide
étant complètement dégradé lors de cette opération et donc inutilisable pour la
détermination de l'agencement des autres aminoacides présents dans la chaîne . C'est par
exemple la méthode de Sanger ou la méthode des dansylaminoacides (DNS-AA).
- Celles qui permettent de détacher l'aminoacide terminal de la chaîne, en conservant le
reste intact, d'identifier le maillon terminal ainsi détaché, puis de détacher le suivant,
l'identifier et ainsi de suite.
De telles méthodes sont dites récurrentes (la récurrence désigne, la suite renouvelée
d'opérations semblables). C'est le cas de la méthode d'Edman.

3) Méthodes non récurrentes:

3-1) Méthode de Sanger:
Le peptide est traité par le 2,4-dinitrofluorobenzène (DNFB). Le groupement amino de l'acide
aminé terminal joue le rôle de réactif nucléophile pour le DNFB et se substitue à l'atome de
fluor sur le noyau aromatique:

On hydrolyse ensuite le peptide :

puis on identifie l'acide aminé marqué (Dinitrophénylaminoacide ou DNP-AA) par

chromatographie par exemple.
3-2) Méthode des dansylaminoacides (ou méthode de Gray et Hartley).
On utilise le chlorure de l'acide 5-diméthylaminonaphtalène-1-sulfonique (ou chlorure de
dansyle) pour réagir avec le groupement amino terminal du peptide:

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Cette opération est suivie d'une hydrolyse acide du DNS-peptide, qui conserve le DNS-AA et
décompose le reste de la chaîne en aminoacides séparés.
Le DNS-AA fortement fluorescent en lumière UV est facilement repérable lors d'une
chromatographie comparative.Cette méthode a supplanté la méthode de Sanger car elle est
beaucoup plus sensible.

4) Méthode récurrente d'Edman (ou méthode des phénylthiohydantoïnes):

Elle se produit par étapes; le processus est le même que pour les précédentes, sauf que lors
de l'hydrolyse acide du peptide "marqué" le reste de la chaîne n'est pas dégradé et l'opération
peut se renouveler avec l'aminoacide terminal...

Le réactif utilisé est l'isothiocyanate de phényle .Il y a addition avec le groupe amino terminal:

On hydrolyse ensuite en milieu acide, mais plus dilué que dans la méthode de Sanger, et on
forme une phénylthiohydantoïne, que l'on identifie par chromatographie comparative.

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On recommence à traiter le reste de la chaîne par l'isothiocyanate de phényle et ainsi de

suite.....

On détermine ainsi la séquence d'aminoacides dans le peptide. Cette méthode est utilisée
dans les automates (séquenceurs).

Exercice 1.
L'hydrolyse totale (HCl 6N, 110°, 24 H) d'un peptide P suivie d'une analyse d'acides
aminés montre une composition de 20 acides aminés:
Ala2, Arg, Cys2, Glu, Gly2, Leu2, Lys, Phe2, Pro, Thr, Tyr2, Val3
- La chymotrypsine donne 2 acides aminés séparés, Phe et Tyr et 3 peptides A, B et C
dont le séquençage par par la méthode d'Edman donne:
A = Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe
B = Val-Cys-Ala-Leu-Tyr
C = Thr-Pro-Lys-Ala
- Un nouvel échantillon du peptide initial est soumis au clivage par la trypsine. Il en
résulte une Ala et 2 fragments, D et E qui donnent après séquençage par la méhode
d'Edman:
D = Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
E = Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg
Déterminer la séquence complète du peptide P
Réponse 1 :
La chymotrypsine ne coupe pas à droite de Ala: le fragment C est donc la séquence
terminale. La carboxypeptidase confirme que Ala est bien l’acide C terminal
17 18 19 20
Chymotrypsine 1 ? ? ? ? ? .. Thr Pro Lys Ala
Chymotrypsine Fragment C
L'hydrolyse par la trypsine donne le fragment D se terminant par Lys, il s'agit de Lys19
et la comparaison des séquences de C et D permet de mieux préciser l'extrémité du
peptide.
La reconstitution de la séquence complète est facilement réalisée en partant du peptide
porteur du C terminal et en cherchant les recouvrements des fragments.

Chymotryp Va Cy Al Le Ty
sine l- s- a- u- r

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Va Cy Al Le Ty Va Le Va Cy Gl Gl Ar
Trypsine
l- s- a- u- r- l- u- l- s- y- u- g-
Chymotryp Va Le Va Cy Gl Gl Ar Gl Ph
sine l- u- l- s- y- u- g- y- e
Chymotryp Ph
sine e
Chymotryp Ty
sine r
- - - - -
Gl Ph
Trypsine Ph Ty Th Pr Ly
y- e
e r r o s
Al
Trypsine
a
- - -
Chymotryp Al
Th Pr Ly
sine a
r o s
La séquence totale du peptide P est:
Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-
Lys-Ala

Exercice 2 :
Le peptide P0 est constitué de 6 acides aminés différents dont un acide aminé
précurseur de la sérotonine et un autre sans pouvoir rotatoire. Le bromure de cyanogène
coupe P0 en libérant un fragment P1 de deux acides aminés du côté N-terminal et d'un
fragment P2 de 4 acides aminés contenant un acide aminé hétérocyclique, comme
révélé par le réactif d'Edman. Il a été montré que P1 et P2 sont susceptibles d'être coupés
par la trypsine. Parmi les séquences suivantes, choisir celle(s) qui correspond(ent) au
peptide P0:
a) LYS-MET-PRO-TRP-ARG-GLY.
b) ARG-MET-PRO-ARG-GLY-TRP.
c) c) HIS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE.
d) d) LYS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE.
e) e) ARG-MET-PRO-GLY-HIS-PHE.

Réponse 2
- Le seul acide aminé sans pouvoir rotatoire : la glycine
- Le seul acide aminé précurseur de la sérotonine : le tryptophane.
- La réaction au BrCN indique qu'il y a une méthionine (Met) en 2ème position, car il
y a une coupure de la liaison peptidique (côté COOH). Il n'est pas en dernière position
car il n'y a pas de transformation en homosérine (Hse).
Rappel: Le bromure de cyanogène (BrCN) coupe le côté COOH d'une méthionine (Met). Si la méthionine
est en dernière position, elle sera transformée en homosérine (Hse)
- La réaction avec le réactif d'Edman indique que le 1er acide aminé du fragment P2 ou
le 3ème du peptide P0 (côté NH2) est un acide aminé hétérocyclique. Le seul acide
aminé hétérocyclique est la proline (histidine et tryptophane en moidre degré).
Rappel: Le réactif d'Edman permet de séquencer jusqu'à 50 Acides aminés. Il permet de révéler les
acides aminés du côté NH2.
- La réaction avec la trypsine nous apprend qu'il y a un acide aminé basique (Arg ou
Lys) en 1ère position du peptide P0 et un autre qui peut être en 4ème ou en 5ème
position de P0 (car il y a une coupure du côté COOH). Attention, il n'est pas exclu qu'il

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y ait un 3ème acide aminé basique en 6ème position de P0, mais on ne dispose pas
d'informations nécessaires pour le déterminer.
Rappel: La trypsine, endopeptidase, coupe un acide aminé basique (Lysine ou Arginine) du côté COOH.
Elle ne coupe pas
après une histidine.
6
1 NH2 2 3 4 5
Résumé: COOH
Arg, Lys Met Pro ? ? ?
-Pour les 3 derniers Acides aminés restant, il y a un acide aminé basique (Arg ou Lys)
en 4ème ou 5ème position de P0, une glycine et un tryptophane.
- De plus, les 6 acides aminés de la séquence doivent être tous différents.
- Avec ces informations, nous pouvons être sûr qu'il n'y a pas d'acide aminé basique en
dernière position
- La séquence ARG-MET-PRO-GLY-HIS-PHE (e) est à éliminer, car il manque un
tryptophane. Aussi, la trypsine ne peut pas couper après une histidine, bien qu'il soit un
acide aminé basique.
- La séquence ARG-MET-PRO-ARG-GLY-TRP (b) est à écarter, car il faut 6 acides
aminés différents, or cette séquence montre 2 arginines.
- La séquence LYS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE (d) est Impossible car il n'y a pas de
tryptophane et la trypsine ne peut pas couper après une histidine.
- La séquence HIS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE (c) est à éliminer.En effet, elle ne
contient pas de typtophane
- La séquence LYS-MET-PRO-TRP-ARG-GLY (a). Possible car cette proposition
respecte tous les critères énoncés.
Donc ici, seule la réponse a) est à retenir.

II-Séquençage des Acides nucléiques