UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS – UNICAMP

CENTRO SUPERIOR DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA– CESET

DIVISÃO TECNOLÓGICA DA SANEAMENTO - DTS

ST107 - BIOLOGIA APLICADA I

ROTEIRO DA AULA PRÁTICA: MORFOLOGIA BACTERIANA
COLORAÇÃO DE ESPOROS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM

COLORAÇÃO DE GRAM
A coloração de Gram é uma coloração diferencial, através da qual as bactérias são
classificadas em Gram-positivas ou Gram-negativas, dependendo da retenção ou não do
corante cristal-violeta, esta reação é de grande importância para a sistemática bacteriana.

1.1. Reagentes
- Solução de cristal violeta, Solução de lugol (iodeto de potássio - KI), Solução de safranina,
Solução álcool – acetona

1.2. Material
- Suspensão bacteriana, lâminas, lamínulas, alça de inoculação, bico de Busen, pinças,
microscópio, óleo de imersão, pipeta Pasteur.

1.3. Preparação do esfregaço bacteriano

a) Limpar bem uma lâmina de vidro, (passar algodão embebido em álcool).
b) Quando se tratar de uma cultura em meio líquido, com uma alça de inoculação, tomar uma
pequena porção da cultura, observando as precauções de assepsia, e colocá-la sobre a
lâmina espalhando-a para formar uma película bem fina.
c) Quando for uma cultura em meio sólido, colocar uma gota de água destilada sobre a lâmina
e com uma alça de inoculação, colher uma pequena quantidade de crescimento bacteriano
da superfície do agar e suspendê-la na gota de água destilada, espalhando suficientemente
para obter um esfregaço fino.
d) Fixar o esfregaço, ao ar ou passando a lâmina três vezes sobre a chama.
e) Deixar a lâmina esfriar.

1.4. Método de coloração de gram

a) Cobrir a esfregaço seco e fixado com a solução de cristal violeta (corante básico), esperar
um minuto.
b) Remover o excesso da solução de cristal violeta da lâmina, lavando-a levemente com água
corrente ou destilada.
c) Cobrir o esfregaço com solução de lugol durante um minuto.
d) Descorar o esfregaço usando uma solução de álcool – acetona (gotejar a solução até que
não saia mais o corante, ou deixar sobre a lâmina por 30 segundos).
e) Cobrir o esfregaço com solução de safranina, durante 30 segundos.
f) Lavar levemente com água corrente.
g) Esperar a lâmina secar naturalmente ao ar livre, ou enxugá-la delicadamente com papel
filtro, através de leve compressão do mesmo sobre a lâmina.

1.5. Microscopia
Examinar a lâmina ao microscópio, usando objetiva de imersão. As bactérias coliformes
são bacilos, gram-negativos (coradas de vermelho) e podem aparecer aos pares ou raramente
em pequenas colônias. As bactérias gram-positivas são coradas de roxo (violeta azulado)
 A Tabela abaixo mostra as reações e o aspecto das bactérias coradas por este método.
Soluções em ordem de GRAM - POSITIVAS GRAM - NEGATIVAS
aplicação
1- Cristal violeta - CV Células coradas em violeta Células coradas em violeta
2- Solução de iodo Formação do complexo CV-I no Formação do complexo CV-I no
(lugol) - I interior das células, que interior das células, que permanecem
permanecem violetas violetas
3- Álcool Desidratação das paredes Extração dos lipídios da parede
celulares, diminuição da celular, aumentando a porosidade: O
porosidade e da permeabilidade: complexo CV-I é removido das células
o complexo CV-I não pode sair
das células que permanecem
violetas.
4- Safranina As células não são afetadas, As células tomam o corante, tornando-
permanecendo violetas. se vermelhas.

1.6. Resultados
Expressar o resultado evidenciando ou não a presença de bactérias gram-negativas e
gram positivas .

2. COLORAÇÃO DE ESPOROS
Certas bactérias, como por exemplo, espécies de Bacillus e Clostridium, forma esporos
(ou endosporos) que se desenvolvem em determinadas posições e tamanhos, que servem de
características no trabalho de identificação. Devido a sua natureza, o esporo precisa de
tratamento forte para de colorir. Uma vez colorido, é relativamente difícil de descolorir.

2.1.Reagentes
- Verde malaquita 5%, safranina.

2.2. Material
- Suspensão bacteriana, lâminas, alça de inoculação, bico de Busen, pinças, microscópio,
óleo de imersão, pipeta Pasteur.

2.3. Preparação do esfregaço bacteriano

- Preparar o esfregaço de acordo com o item 1.3.

2.4. Método de coloração de esporos

a) Cobrir a esfregaço seco e fixado com a solução de verde malaquita.
b) Aquecer até que se desprendam vapores (três minutos), sem deixar ferver ou secar.
c) Lavar em água corrente.
d) Cobrir a lâmina com solução de safranina, durante 30 segundos.
e) Lavar em água corrente e secar.

2.5. Microscopia
Examinar a lâmina ao microscópio, usando objetiva de imersão. Observar os
microrganismo que se apresentarão da seguinte maneira:
- célula vegetativa: vermelha
- endósporo: verde
- esporos bacterianos livres: verdes brilhantes
- microrganismos não esporulados: vermelhos

2.6. Resultados
Expressar o resultado em relação a forma, dimensão e localização do esporo ou
endósporo.