UNIVERSIDAD DE VALPARAÍSO

FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR Y RECURSOS NATURALES

ESCUELA DE BIOLOGÍA MARINA

“Optimización de técnicas moleculares basadas en ADN

ambiental para la detección indirecta de peces en sistemas
acuáticos continentales del sur de Chile”

TESIS

Franco Enzo Erazo Aguilera

2019
 COMISIÓN PROYECTO DE TESIS

Claudio Quezada Romegialli

Director de tesis

Universidad de Playa Ancha

Mauricio Landaeta Roberto Orellana

Miembro de la Comisión Miembro de la Comisión

Laboratorio de Ictioplancton(UV) Universidad de Playa Ancha

2
 TABLA DE CONTENIDOS

COMISIÓN PROYECTO DE TÍTULO………………………………………………………………………..……………………2

LISTA DE TABLAS ………………………………………………………………………………………………………………………4

LISTA DE FIGURAS ………………………………………………………………………………………………………………..….4

RESUMEN.……………………………………………………………………………………………………………………………..…5

INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………………………………….…….7

OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………………….………………….16

MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………………………………………………………….17

RESULTADOS………………….……………………………………………………………………………………………………….24

DISCUSIÓN……………………………………..……………………………………………………………………………..……….29

CONCLUSIONES..…………………………………………………………………………………………………………..………..37

LITERATURA CITADA……………………………………………………………………………………………………………….38

3
 AGRADECIMIENTOS

Se agradece el financiamiento de esta tesis en el marco del proyecto FONDECYT

11181259: “Understanding freshwater biodiversity persistence through space and time:

an ancient and modern DNA stable isotope combined approach”; Núcleo Milenio

INVASAL, Concepción.

LISTA DE TABLAS

1 Resultados de calidad de ADN obtenida con cada método de extracción..................26

2 Número de muestras con amplificación positiva para cada marcador molecular......30

LISTA DE FIGURAS

1 Cantidad promedio de ADN obtenido con cada método de extracción……………25

2 Porcentaje de éxito de amplificación según método de extracción y marcador…….28

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 RESUMEN

Con tal de prospectar la biodiversidad de sistemas acuáticos, se ha descrito en los

últimos años el empleo de una técnica novedosa que implica la detección y

caracterización de trazas de ADN disuelto en el medio. Se analizó la factibilidad del uso

de dicha técnica molecular de vanguardia para el análisis de muestras provenientes de

dos ríos del sur de Chile. Para ello se filtró agua mediante bombeo a través de filtros de

esteres mixtos de celulosa, y se almacenó aquel material filtrado en un buffer de lisis.

Luego se testearon tres métodos de extracción distintos (un kit comercial, un método de

precipitación química y ésta última más un kit comercial de purificación de

inhibidores), comparándose en sus aspectos de cantidad y calidad de ADN entregado.

También se efectuaron pruebas de amplificación con múltiples tipos de marcadores

moleculares (con capacidad de amplificación taxonómica universal, específicos para

peces, y para salmónidos), así como una RFLP para el discernimiento entre las especies

de salmónidos contenidas en las muestras (aunque la ejecución de esta última no fue

exitosa). Se obtuvo que los métodos de extracción por precipitación entregaron mayor

cantidad de ADN, mientras que la calidad (i. e. grado de pureza) del ADN fue

relativamente similar entre las metodologías de muestreo, aunque el kit comercial

obtuvo un mejor desempeño parcial en este punto. En cuanto al éxito de amplificación

de cada metodología de extracción dependió del marcador molecular utilizado, y en

menor grado, del sitio de muestreo; no hubo alguna que destacara particularmente sobre

las otras. Se sugiere que para la selección de metodología de extracción de ADN en

futuros estudios se deban considerar previamente las características físicas y químicas

del sistema, así como la especificidad (número de taxa) del estudio a realizar,

5
explotando así las ventajas que ofrece cada protocolo de extracción. Finalmente, se

propone una mayor implementación en Chile de estas técnicas moleculares debido a las

ventajas relativas que ofrece para la ecología y la conservación de la biodiversidad,

aunque deben generarse mayores estudios sobre las dinámicas locales que influirían

directamente en los resultados que con ellas se obtengan.

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 INTRODUCCIÓN

En los últimos años la biodiversidad de una amplia variedad de comunidades acuáticas

del mundo se ha encontrado sometida a procesos de degradación sostenida (Geist &

Hawkins 2016), sobre todo en sistemas de agua dulce continentales (Sala et al. 2000).

Lo anterior puede involucrar un alto impacto, ya que estos sistemas proveen una serie

de servicios indispensables para las poblaciones humanas y el medio ambiente como tal

(seguridad alimentaria, producción económica, modulación de ciclos geoquímicos,

resiliencia ante cambios ambientales, etc.) (CBD 2015, Matthews 2016). A pesar de su

importancia relativa, existen importantes vacíos en la información científica disponible

referente a la biodiversidad en muchas de estas comunidades (Dudgeon et al. 2006,

Sheth & Thaker 2017). Esto incide indirectamente en la conservación de estos sistemas,

dado que se requiere de la cuantificación de elementos constituyentes fundamentales de

cada uno de éstos (como la riqueza, diversidad biológica, tramas tróficas, flujos de

energía y materia, entre otros) para adoptar medidas apropiadas y suficientes de manejo

que ayuden a aminorar su degradación (Lundquist & Granek 2005, Minamoto et al.

2012). El deterioro de muchas comunidades acuáticas del mundo se encuentra

modulado por diversos factores, tanto antrópicos como naturales, y se espera que el

número de sistemas amenazados aumente considerando el escenario actual de cambio

climático (Dudgeon et al. 2006). Así mismo la suma de diversos factores puede generar

un efecto sinérgico que en algunos casos puede aumentar aún más los niveles de

degradación, llegando a niveles irreversibles para los ecosistemas (Sala et al. 2000). Por

lo tanto, se vuelve de carácter urgente el uso de metodologías que permitan recabar una

mayor cantidad de información biológica en marcos de tiempo compatibles con los

7
procesos de conservación (Thomsen & Willerslev 2015). En este sentido, las

tecnologías relativamente nuevas en los ámbitos de la biología molecular, genómica y

bio-informática representan una vía que pudiese ampliar significativamente la capacidad

de colección de información para un amplio espectro de comunidades biológicas

acuáticas amenazadas.

Una de las metodologías emergentes que puede suplir en parte dicha necesidad de

información comunitaria es aquella que involucra la detección de ácido

desoxirribonucleico (ADN) ambiental, proveniente de macroorganismos (“eDNA” a

partir de ahora) (Bucklin et al. 2011, Trivedi et al. 2016). Esta metodología combina

distintas técnicas moleculares (metabarcoding, PCR de punto final, PCR en tiempo real

o RFLP) utilizando como templado el ADN que se encuentra en el ambiente, es decir,

aquel ADN que es expelido de los organismos a través de distintas vías (excretas,

secreciones, desprendimiento de tejido epitelial, entre otras), el que es posible obtener

desde el ambiente acuático y que persiste en éste (en estado libre o asociado a otras

estructuras moleculares) durante tiempos significativos (Takahara et al. 2013). Su

tiempo medio de vida en la columna de agua puede ser de varios días e incluso semanas

(Thomsen & Willerslev 2015), dada la relativamente alta estabilidad química de esta

molécula, lo que a su vez permite su uso en diversos tipos de ambientes (suelo, aire,

sedimentos), y con distintos propósitos investigativos (e. g. paleontológicos) (Pedersen

et al. 2015). La duración del ADN de manera íntegra en el medio acuático está

condicionada por factores como las tasas de degradación por microorganismos del

medio (o de enzimas nucleasas libres), temperatura, presencia de compuestos químicos

reactivos, entre otros (Strickler et al. 2015), siendo sus preponderancias relativas

8
ampliamente variables según las condiciones propias de cada sistema (Pedersen et al.

2015). La detección del ADN remanente en el medio se realiza mediante procesos de

amplificación molecular (PCR, siglas en inglés para la reacción en cadena de la

polimerasa) y secuenciación de sus nucleótidos (mediante plataformas NGS: Next-

Generation Sequencing, principalmente), permitiendo identificar la composición

taxonómica de organismos presentes en aquel sistema acuático determinado. A grandes

rasgos esta técnica correspondería una metodología no invasiva, económica y de alta

efectividad para dicho propósito, lo cual sería de suma ayuda para el monitoreo de

poblaciones biológicas de todo tipo (Pawlowski et al. 2018).

A diferencia de otros métodos de evaluación tradicionales, como son la captura con

pesca eléctrica, uso de anestesia, otros compuestos químicos e incluso venenos (en

especies ícticas), las técnicas moleculares con eDNA no perjudican el ambiente

inmediato del sitio de muestreo, ni tampoco requieren de una alta especialización de los

investigadores en materia de taxonomía (Wang et al. 2018). Tampoco se ve

influenciada por la efectividad del aparejo de pesca, por lo críptico de algunas especies

del hábitat de estudio, ni por el estado de desarrollo vital en que éstas se encuentren

(Evans & Lamberti 2018, Pawlowski et al. 2018). Además, pueden ser aplicadas bajo

condiciones ambientales que para otros métodos tradicionales serían adversos (Takahara

et al. 2013, Thomsen & Willerslev 2015, Valentini et al. 2016). A esto se suma su

menor costo-beneficio, permitiendo a su vez abarcar mayores rangos espaciales

(Minamoto et al. 2012, Rees et al. 2014, Evans & Lamberti 2018), y una mayor

comparabilidad regional entre estudios (Pawlowski et al. 2018). Por otro lado, éstas

técnicas moleculares pueden funcionar incluso sin la presencia del ADN completo de

9
los organismos, sino que solamente con fragmentos de este (Bucklin et al. 2011). Su uso

ha probado ser altamente efectivo para la detección de la riqueza y composición

taxonómica en ambientes acuáticos, superando incluso a los métodos tradicionales en

cuanto al número de especies detectadas y requiriendo considerablemente menos

esfuerzo de muestreo (Thomsen et al. 2012, Deiner et al. 2015). Así mismo, algunos

estudios han correlacionado la cantidad de ADN detectado (mediante el uso de qPCR)

con la abundancia de los organismos en el medio, pudiendo funcionar como un

indicador de abundancia poblacional (Mahon et al. 2013, Goldberg et al. 2015). De

igual forma se ha demostrado que las técnicas son capaces de proporcionar información

relevante para la caracterización de la distribución y comportamiento de poblaciones

altamente móviles (Baker et al. 2018), así como de invasiones biológicas (ya sea en

etapas iniciales o avanzadas de propagación de estas) (Ficetola et al. 2008, Geller et al.

2010, Mahon et al. 2013, Takahara et al. 2013), teniendo este aspecto un alto impacto

en la “salud” de los ecosistemas y en las posibles medidas de mitigación para la

protección de las poblaciones nativas (Simberloff 2003).

Sin embargo, a pesar de todas las ventajas mencionadas, la metodología de técnicas

moleculares basadas en eDNA aún presenta serias limitantes que restringen su

aplicabilidad y un uso más extendido de la técnica: (1) Sus resultados finales se ven

muy influidos por contaminación o mal manejo de las muestras, estando aquel riesgo

presente durante prácticamente todo su procesamiento (Miya et al. 2015, Thomsen &

Willerslev 2015); (2) En ciertos ambientes puede existir una alta presencia de

componentes ambientales en las muestras que actúan como inhibidores de la PCR

(ácidos húmicos, principalmente) que deben ser filtrados (Cáceres et al. 2012, Thomsen

10
& Willerslev 2015). En algunos casos estas moléculas podrían llegar a persistir durante

el protocolo de extracción, pudiendo generar resultados erróneos al competir con el

ADN durante la amplificación (Goldberg et al. 2015); (3) No es posible asegurar

definitivamente la presencia de la especie en el mismo sitio/tiempo del muestreo ante un

resultado de detección positivo, debido a la influencia del transporte y persistencia del

ADN (alta influencia de estos procesos que al día de hoy son poco predecibles en los

sistemas de estudio; Pedersen et al. 2015, Turner et al. 2015); (4) Los primers o

partidores diseñados no suelen ser completamente efectivos para todas las especies, sino

que poseen distintos grados de afinidad a cada una de sus secuencias génicas, pudiendo

generarse incluso fenómenos de amplificación selectiva de ciertas secuencias de

especies por sobre otras (esto modulado principalmente por el número y ubicación de

discordancias en las secuencias de bases; Wilcox et al. 2013), por lo que la

especificidad de los primers posee alta influencia en la detección de especies (Pedersen

et al. 2015, Pawlowski et al. 2018). Incluso se ha descrito que en algunos replicados la

técnica puede pasar por alto especies con una gran prevalencia en el sistema acuático,

debido a ineficiencias en los primers (Mahon et al. 2013, Pawlowski et al. 2018); (5) La

abundancia de ADN ambiental no necesariamente se correlacionaría en todos los casos

a la de las especies en el medio acuático, debido por ejemplo a distintas tasas de

expulsión de ADN al medio (Maruyama et al. 2014, Pawlowski et al. 2018); (6)

Necesidad de diseñar, generar y optimizar los primers moleculares a utilizar en cada

estudio (Taberlet et al. 2012, Valentini et al. 2016), a veces con poca o nula utilidad

futura directa de estos (Miya et al. 2015), y requiriendo a su vez de una base de datos

genómica completa y certera de los organismos-objetivo (lo cual rara vez suele

encontrarse disponible; Taberlet et al. 2012, Thomsen & Willerslev 2015, Pawlowski et

11
al. 2018); (7) Introducción de errores propios del procesamiento in-silico, así como de

artefactos de la técnica PCR (secuencias quiméricas, sustitución de nucleótidos

individuales, “tag jumping”, estocasticidad, entre otros) (Taberlet et al. 2012, Pedersen

et al. 2015); (8) Necesidad de optimización del protocolo en cada sistema acuático a

investigar, requiriendo además abarcar un marco espacio-temporal suficiente (Goldberg

et al. 2015, Pawlowski et al. 2018); (9) Presenta desafíos propios de la capacidad de

preservación de las muestras de ADN (Pawlowski et al. 2018), sobre todo de aquellas

recolectadas de sitios remotos (Goldberg et al. 2015), presentando además poca

capacidad potencial para la estandarización de los protocolos (Pedersen et al 2015); (10)

Poca capacidad para entregar información de ciertos aspectos de relevancia para el

análisis ecológico (localización efectiva, uso de hábitat, estados de desarrollo, estructura

de población, desconocimiento de si el ADN proviene de organismos vivos, entre otros)

respecto a otros procedimientos. Si bien muchas de estas problemáticas son agudas y de

alto impacto en los estudios, su influencia podría reducirse considerablemente

aumentando el esfuerzo de muestreo, con el uso de controles positivos y negativos,

testeo cuidadoso y uso de múltiples primers (Pedersen et al. 2015), entre otras medidas

precautorias (Deiner et al. 2017). Así mismo, el potencial de esta técnica estaría

comprendido más bien como una herramienta complementaria a otras metodologías

tradicionales para el muestreo de poblaciones biológicas, no invalidando

necesariamente a estas últimas (Thomsen & Willerslev 2015, Valentini et al. 2016,

Sheth & Thaker 2017).

En base a sus limitaciones, el uso de técnicas moleculares basadas en eDNA requiere

de una serie de protocolos que deben ser llevados a cabo de la manera más rigurosa

12
posible para evitar posibles fuentes de error en los resultados finales (Miya et al. 2015,

Evans & Lamberti 2018). Si bien no existe un único protocolo a seguir (ya que

dependen de las distintas condiciones de cada ambiente acuático a estudiar), sí se

comprenden una serie de pasos generales que enmarcan esta clase de estudios. En

primer lugar, se deben diseñar primers que se adhieran correctamente a secuencias de

ADN de clados o grupos taxonómicos de interés para el estudio (i. e. que se encuentren

presentes en el sistema acuático a analizar). Generalmente, se buscarán secuencias de

tipo mitocondrial, ya que presentan una mayor concentración celular que el ADN de

tipo nuclear, por lo que las probabilidades de su detección aumentan (Adams et al.

2019). Los primers deben estar dirigidos a secuencias-objetivo cortas [entre 80 y 250

pares de bases (Evans & Lamberti 2018), aunque algunos estudios llegan a usar

secuencias de hasta 800 pb (Clusa et al. 2017)]. Es importante realizar un testeo

minucioso de dichos primers (tanto in-silico, in-vitro como in-situ), con tal de optimizar

su efectividad para con los organismos de estudio (Valentini et al. 2016). La

especificidad de acople de estos primers determinará las características de la

investigación, siendo aquellas que se adosan a una gran diversidad de clados

taxonómicos enmarcables en la categoría de estudio de metabarcoding (Deiner et al.

2017). Estos estudios hacen hincapié en la detección de una amplia variedad de

organismos, pudiendo utilizarse para describir la composición de comunidades

completas, aunque su resolución taxonómica suele ser más baja y la evaluación final de

sus datos requiere de herramientas bio-informáticas más complejas (Pawloswki et al.

2018). Continuando con el protocolo general de las técnicas moleculares basadas en

eDNA, una vez se cuente con los primers a utilizar se deben tomar muestras de agua

(generalmente 1-2 litros para cada réplica, abarcando en su conjunto un marco espacial

13
y temporal suficiente para el estudio (Rees et al. 2014, Evans & Lamberti 2018)) y

luego concentrar el ADN que en ella esté contenida. Para esto pueden usarse métodos

físicos (filtrado) y/o químicos (precipitación), seguidos de una fase de extracción

química del ADN. Así mismo, pueden aplicarse kits comerciales para la remoción de

inhibidores y otras moléculas distintas al ADN que permanezcan en el agua (Deiner et

al. 2015), las cuales de no ser removidas podrían entorpecer los pasos siguientes. Cabe

destacar que desde este paso inicial de muestreo se recomienda encarecidamente la

utilización de controles positivos y negativos que acompañen todo el protocolo restante

(e.g. ADN de una especie conocida y agua destilada, respectivamente), con tal de

determinar posibles fuentes de contaminación (las cuales suelen ser comunes en este

tipo de estudios, Miya et al. 2015) u otras limitantes del protocolo utilizado (baja

especificidad de primers, presencia de inhibidores PCR, entre otras; Rees et al. 2014).

Luego el ADN total obtenido debe amplificarse mediante técnica de PCR o qPCR (esta

última en caso de que la cuantificación de la concentración inicial de ADN sea de

importancia para el estudio a realizar; Evans & Lamberti 2018), utilizando los primers

diseñados previamente. Se recomienda realizar una serie de réplicas de PCR (entre 3 a

10) por cada muestra, con tal que la determinación de presencia de una especie sea

corroborada, siendo positiva solamente cuando se detecte repetidamente su secuencia en

más de la mitad de los replicados (Ellison et al. 2006, Miya et al. 2015). La distinción

de especies puede llevarse a cabo por diferentes métodos de análisis como electroforesis

(técnica “DGGE”) (Evans & Lamberti 2018), utilizando enzimas de restricción (técnica

“RFLP”) (Clusa et al. 2017), secuenciación mediante NGS (opción más certera y que

abarca más organismos, aunque también más cara; Taberlet et al. 2012), sondaje de

ADN (microarrays) (Minamoto et al. 2012), entre otras.

14
 En este estudio, por lo tanto, se analizará la efectividad del uso de esta técnica en

sistemas acuáticos del sur de Chile (en específico dos ríos de la X Región de Los

Lagos), donde su uso hasta el momento no ha sido empleado para la evaluación de

poblaciones acuáticas. Estos sistemas presentan condiciones desafiantes para el

desarrollo de la técnica, como la existencia de condiciones de alto contenido de materia

orgánica e inhibidores que pueden limitar significativamente el uso de esta técnica para

la detección de peces (Quezada et al., no publicado). Sin duda los distintos ambientes

acuáticos de esta región geográfica presentan dinámicas fisicoquímicas ampliamente

variables entre sí, las cuales influirían directamente en la capacidad de persistencia del

ADN en el medio y, por ende, de la efectividad de la técnica eDNA. Todo lo anterior

incide en que los distintos sistemas acuáticos de la macrozona sur de Chile conformen

un laboratorio natural para el testeo y mejoramiento de la técnica en escenarios

complejos, así como para la detección de especies nativas y/o crípticas de peces (u otros

organismos) que son difíciles de caracterizar acabadamente con las metodologías

actuales de muestreo (Estragues 2018).

15
 OBJETIVOS

Objetivo general:

Optimizar un protocolo para la caracterización de comunidades acuáticas del sur de

Chile utilizando ADN ambiental.

Objetivos específicos:

* Determinar el método de extracción de ADN que entregue la mayor cantidad de este

en sistemas acuáticos con alto contenido de materia orgánica.

*Seleccionar el método de purificación de ADN que más eficientemente remueva

inhibidores de PCR

*Caracterizar la comunidad de peces mediante RFLP, utilizando el protocolo adaptado

previamente.

16
 MATERIALES Y MÉTODOS

Toma de muestras

Para la utilización de la técnica de RFLP basado en ADN ambiental se procedió a

muestrear dos ríos del sur de Chile (ubicados en la Región de Los Lagos) durante enero

de 2019. Los sitios muestreados forman parte de los ríos Maullín y Petrohué (41°19'3"S

73°2'4"O; y 41°10'50"S 72°27'33"O, respectivamente), sistemas fluviales exorreicos,

ambos con presencia de diversas especies ícticas y descritos como sitios prioritarios

para la conservación biológica (CONAF 2016). En estos sitios se procedió a filtrar 1000

mL de agua mediante una manguera conectada a una bomba peristáltica Alexis®

(Pegasus) portable, circulando dicho volumen de manera simultánea a través de tres

porta-filtros Sartorius 16508-B®. Cada uno de estos contenía a su vez un filtro

Whatman estéril de 0,45 um de tamaño de poro. Se introdujo la manguera en el lecho

del río y se dejó filtrando hasta completar el volumen deseado, cerciorado en un

recipiente posterior al sistema.

Una vez filtrada el agua, se plegó el filtro con pinzas estériles y se depositó en un

tubo de centrifugado de 2 mL conteniendo 700 uL de buffer Longmire (Longmire et al.

1997), el cual además de efectuar la lisis de estructuras celulares, permite el

almacenamiento de las muestras a temperatura ambiente (Deiner et al. 2017). Se

tomaron seis réplicas en cada sitio aplicando la misma metodología de manera

consecutiva. La totalidad de dichas muestras fueron posteriormente trasladadas al

17
Laboratorio de Limnoecología de la Universidad de Playa Ancha (Valparaíso), donde se

almacenaron hasta su posterior uso.

Extracción de ADN

Se evaluó previamente la capacidad de extracción de ADN ambiental (así como de

amplificación y análisis de efectividad a posteriori detallados más adelante) a través de

ensayos en dos mesocosmos (acuarios) con peces aclimatados (Trychomycterus

chungaraensis; Arratia 1983), ambientes con alto contenido de materia orgánica. Dichas

muestras (tres por cada método de extracción, para un total de 6) fueron acompañadas

con controles negativos y positivos (agua MiliQ y tejido de dichos organismos,

respectivamente) para evidenciar posibles contaminaciones o fallos durante el proceso.

Esta experiencia fue continuada desde los procesos de extracción y análisis, hasta la

primera instancia de amplificación de ADN, los cuales se irán describiendo más

adelante. Lo anterior con tal de comprobar la capacidad del uso de la técnica de RFLP

con eDNA bajo las condiciones propias del laboratorio donde se desarrolló este trabajo.

Para la obtención del ADN contenido, del total de muestras ambientales se extrajo

primeramente un volumen de 200 uL a cada una utilizando el kit comercial Fast DNA

Spin Kit ® (MP Biomedicals; en adelante “Fast DNA”), en base a las instrucciones

dispuestas por los fabricantes. El volumen remanente de cada muestra se dividió

equitativamente en dos tubos nuevos, y se aumentaron sus volúmenes respectivos con

buffer Longmire hasta completar 700 uL en cada uno. Uno de estos nuevos tubos fue

sometido a extracción con el método Fenol-Cloroformo (en adelante “PCI-02”) descrito

18
por Deiner et al. (2017), y el otro almacenado a -20ºC. También se sacó un volumen del

producto final (i. e. con su ADN ya eluído) de las muestras sometidas a PCI-02 (50 uL)

para su posterior purificación de impurezas, utilizando para ello el kit comercial One-

Step PCR Inhibitor Removal Set (Zymo; en adelante “Zymo One Step”). Para su

aplicación se siguieron las instrucciones descritas por los fabricantes. Dichas muestras

purificadas se consideraron como una metodología más de extracción, por lo que fueron

sometidas a los mismos análisis posteriores.

El protocolo de fenol-cloroformo (PCI-02) descrito por Deiner et al. (2017) se

describe a continuación. Al volumen de la muestra contenida en buffer Longmire (700

uL), se le agregaron 24 uL de proteinasa K (a concentración de 20 mg/mL) y, luego de

agitarlo con un equipo Vortex, se incubó por la noche a 55ºC. Al día siguiente se

esterilizaron en luz UV un nuevo set de tubos de centrifugado conteniendo una porción

pequeña (del tamaño de un guisante) de grasa High Vacuum grease® (Dow Corning), a

la que se traspasaron 550 uL de la muestra previamente agitada. A estos nuevos tubos se

les añadió 550 uL de Fenol-Cloroformo-Isoamil (en proporción 25:24:1) y se

centrifugaron (30 min, a 10.000 rpm). Luego se añadieron 550 uL de Cloroformo-

Isoamil (24:1), y se volvieron a centrifugar bajo las mismas condiciones. Posterior a

esto se pipeteó la capa superior del líquido (el volumen completo que queda por sobre la

capa de grasa) a nuevos tubos estériles, donde se les agregó además 44 uL de cloruro de

sodio (NaCl, a concentración 5 Molar) y 1100 uL de etanol (100%), dejándose por la

noche esta vez a 4ºC. Una vez pasado aquel tiempo de rigor se centrifugaron las

muestras (por 30 min, a 10.000 rpm), luego de lo cual se vertió fuera el etanol de los

tubos. Se agregó nuevamente el mismo volumen de etanol (esta vez al 70%) a cada tubo

19
y se centrifugó bajo las mismas condiciones descritas. Se vertió nuevamente el etanol

remanente y se secaron los tubos al aire (dentro de la campana de flujo laminar) hasta

no quedar restos de líquido visibles. Finalmente, se re-disolvió el ADN en 50 uL de

agua grado biología molecular previamente esterilizada, y se incubó a 55ºC por 10 min,

almacenándose aquel producto final a 4ºC.

Con tal de analizar la eficiencia de estos procedimientos, se procedió a efectuar un

examen cuantitativo del ADN obtenido de las muestras con un equipo Take 3®

(BioTek; anexado a una plataforma de lectura multi-modal Cytation 5® del mismo

fabricante), utilizando además el software Gen5® (BioTek). Para su calibración, antes

de cada uso se cargó la bandejilla de lectura del equipo con 2 uL de agua grado biología

molecular. El mismo volumen fue cargado con el producto de extracción de cada

muestra (previa agitación por Vortex). Como resultado, la cantidad de ADN extraído de

cada una fue entregado por el equipo en términos de ng/uL, y el grado de pureza

inferido a partir de la relación entre los coeficientes de absorbancia para las longitudes

de onda 260/280 (nm). La cantidad de ADN obtenido fue corroborada utilizando un

fluorómetro Invitrogen Qubit 2.0® (ThermoFisher). Para el marcaje se empleó el

producto Qubit dsDNA HS Assay kit® (ThermoFisher), el cual contiene un fluoróforo

específico para ADN de doble hebra. Por cada réplica a analizar se utilizaron 2 uL de

producto de extracción y 198 uL del buffer incluido en el kit. El resultado de la lectura

fue entregado en términos de ng/uL. Los valores obtenidos, tanto con Take3 como con

Qubit, fueron ponderados considerando tanto el volumen inicial de muestra utilizada en

cada réplica, como el volumen final de elución (sucesivamente mediante regla de tres

20
simple), con tal de comparar de mejor forma los resultados obtenidos con cada método

de extracción.

Amplificación de ADN

Para comprobar la capacidad de amplificación del ADN obtenido con los distintos

métodos de extracción, se procedió a efectuar una primera PCR en 17 muestras

aleatorias del total de muestras extraídas, con los marcadores moleculares 16sar y 16sbr

(Palumbi et al. 2002), los cuales son capaces de amplificar un extenso número de taxa

(i. e. se consideran primers universales). La polimerasa utilizada en esta y en las

siguientes PCR de este estudio fue Takara Taq® (Takara Bio). En esta PCR particular

se agregaron 0,5 uL de cada marcador molecular (forward y reverse); 6,25 uL de buffer

Mastermix (Takara); 1 uL de ADN templado y 4,25 de agua grado molecular. Luego en

un termociclador XP Cycler® (BIOER) se sometieron a la siguiente secuencia de

temperaturas: denaturalización inicial de 95ºC (1 min), seguido por cuarenta ciclos de

95ºC por 10 s, 55ºC por 10 s y 72ºC por 45 s; y una fase de extensión final de 72ºC por

2 minutos. Para el resto de PCR en el marco de esta investigación se utilizaron 15 uL de

mezcla de amplificación por muestra, conformados por 0,6 uL de cada marcador

molecular; 7,5 uL de MasterMix Takara®; 4,95 uL de agua; 0,75 uL de BSA y 0,6 uL

de ADN templado.

Los productos de todas las PCR efectuadas fueron visualizados en un gel de agarosa

al 1,2% en buffer TAE, más 1 uL de tinción SyBr® (Invitrogen). Posteriormente, se

instaló el gel en una cámara de electroforesis y se dispusieron 6 uL de producto PCR en

21
cada carril, además de ladders de peso molecular conocido (1 uL en sus carriles

correspondientes), aplicándose finalmente un voltaje de 70 voltios en la cámara durante

al menos 40 min. El desplazamiento de las bandas fue registrado con una cámara

fotográfica Canon Powershot G16 adosada a un armazón plástico Safe-Blue

(MajorScience). Se utilizó además el software Picasa® (Google) para la edición y

añadidura de texto de las imágenes resultantes.

Una vez realizada la primera PCR para comprobar capacidad de amplificación, se

efectuó una nueva PCR a los productos de extracción de cada muestra, esta vez con los

marcadores 12S (MiFish-U) descritos por Miya et al. (2015). Dichos primers amplifican

específicamente el gen ribosomal 12S ubicado en mitogenomas de peces. Los ciclos

térmicos esta vez consistieron en 95ºC por 2 min, seguido de treinta ciclos de 94ºC por

30 s, 55ºC por 30 s y 72ºC por 30 s; además de una fase de extensión final de 72ºC por

10 min.

Para ahondar aún más en la identificación del ADN contenido en las muestras se

buscó identificar la presencia de salmónidos. Para ello se realizó primeramente una PCR

con los marcadores 16S-F-new y 16SBr, descritos por Clusa et al. (2017) y Palumbi et

al. (2002), respectivamente. Con los productos de ésta, se efectuó una nueva PCR (de

tipo nested) con los marcadores 16S-F-Salmo y 16S-R-Salmo descritos por Zaiko et al.

(2015). La amplificación con estos últimos marcadores daría cuenta de la presencia de

este grupo taxonómico, el cual sería de interés para el presente estudio. Además se

efectuó un análisis RFLP (restriction fragment length polymorphism) de los productos

22
PCR aquí obtenidos, utilizando las enzimas específicas para los genomas de trucha

arcoíris (Oncorhynchus mykiss; Walbaum 1792) y salmón del atlántico (Salmo salar,

Linnaeus 1758), “Tru1I” y “SchI”, respectivamente; ambas formando parte del paquete

comercial FastDigest enzymes® (Thermofischer). Dicha digestión se efectuó en tubos

de centrifugado con 15 uL de volumen, los que consistieron en 5 uL de ADN templado

(en este caso, el producto de la PCR anidada con los marcadores 16S-F-Salmo y 16S-R-

Salmo antes mencionados); 1,5 uL de Buffer Tango 10X; 0,3 uL de enzima y 8,2 uL de

agua molecular. Una vez hecha la mezcla se incubó por toda la noche a la temperatura

óptima descrita por los fabricantes (37ºC para “SchI” y 65ºC para “Tru1I”) con tal de

obtener un patrón de restricción determinado, lo cual fue registrado mediante

electroforesis con la metodología ya descrita para este último paso.

Los análisis estadísticos utilizados consideraron el análisis de Mann-Whitney-U. Los

factores considerados incluyeron los sitios y las metodologías de extracción,

contrastados según la cantidad y calidad de ADN extraído con ambos métodos de

análisis a posteriori empleados (Qubit y Take3). El análisis fue efectuado en base a

iteración sucesiva de los datos con tal de abarcar todos los factores anteriores. Para el

análisis estadístico antes mencionado se empleó el software R (versión 3.6.1).

23
 RESULTADOS

Los experimentos con filtrados de mesocosmos demostraron la capacidad de extracción

y amplificación del ADN ambiental allí contenido bajo las condiciones propias del

laboratorio. Más adelante se detallan los resultados de amplificación con marcadores

universales para estas muestras. Para el caso de aquellas obtenidas en ríos del sur de

Chile, en base a los resultados arrojados a partir de lectura en fluorómetro Qubit se

comprobó que la cantidad de ADN obtenido con los métodos de extracción Fast DNA y

PCI-02 no fue significativamente distinta (p = 0,256). Sin embargo, al utilizar la

metodología PCI-02 más purificación posterior con Zymo One Step la cantidad

obtenida fue superior en la mayoría de los casos, obteniéndose 6 ng/uL en promedio con

dicho protocolo (en comparación, los otros métodos entregaron un promedio cercano a

1 ng/uL) (Figura 1). Sin embargo, al comparar la cantidad de ADN registrado con

Take3, se observó que los métodos más efectivos en este aspecto serían tanto el PCI-02,

como su variante con purificación posterior. Estos dos métodos arrojaron valores de

decenas e incluso cientos de ng/uL de ADN en la mayoría de las muestras analizadas.

En el caso de Fast DNA en cambio, los valores de cantidad obtenidos con Take3 no

superaron los 15 ng/uL. Quedan por tanto expuestas diferencias de hasta dos órdenes de

magnitud en la cantidad obtenida según el método elegido. En cuanto a la calidad de

ADN obtenida con cada método, dada a cuenta por los valores de la relación 260/280

obtenida con Take3 (Tabla 1), se observó que con Fast DNA se consiguió una calidad

aceptable de ADN en el 100% de las réplicas (valores superiores a 1,6). Con la

metodología PCI-02 si bien sus valores superaron a los obtenidos con Fast DNA en uno

de los sitios, hubo otro sitio (Petrohué) en que no lograron alcanzar valores aceptables

24
en ninguna de las réplicas (resultados no mostrados). No obstante, los valores de calidad

mejoraron notablemente luego del proceso de purificación en todos los casos (aunque

en un par de réplicas no fue posible para alcanzar valores aceptables mínimos de

calidad).

Figura 1.- Cantidad promedio de ADN ambiental obtenida con cada método de

extracción (“Zymo OS”: Zymo One Step). Se consideraron el total (N=12) de muestras

ambientales provenientes de ambos sitios (Maullín y Petrohué), y se representó la

desviación estándar con la barra de variabilidad de cada columna. Los valores fueron

previamente ponderados según el volumen de muestra inicial utilizado en cada método,

para una comparabilidad directa.

25
 Fast DNA PCI-02 PCI-02+ Zymo

N de muestras con alto

0 4 2
grado de impurezas (< 1.6)

N de muestras con valor

9 4 2
aceptable (1.6 - 1.8)

N de muestras con valores

2 3 2
óptimos (1.8 - 2.0)

N de muestras con valores

aceptables, aunque con 1 1 6
presencia de ARN (> 2)

Promedio (Coef 260/280) 1,76 1,69 2,30

Tabla 1.- Resultados de calidad de ADN obtenida con Take3 para cada método de

extracción, realizada para la totalidad de muestras (N= 12 con cada método). La calidad

se evalúa en base a la relación entre los valores obtenidos de absorbancia a las

longitudes de onda 260/280 (nm), clasificándose sus resultados de la manera que allí se

indica. Promedio considera la totalidad de muestras por método de extracción.

Respecto a las pruebas de amplificación de ADN ambiental utilizando marcadores

universales 16S (Palumbi et al. 2002), en aquellas provenientes de un mesocosmos se

obtuvieron resultados positivos en el 100% de éstas (n=6), no existiendo en este caso

diferencias entre ambas metodologías de extracción. Para el caso de muestras

provenientes de ríos del sur de Chile se testeó un subtotal de 17 muestras para la

utilización de dichos marcadores universales, cuyo éxito (expresado como el porcentaje

26
de réplicas con amplificación positiva) fue de 100% para las extraídas con Fast DNA

(n=7), 33% para las extraídas con PCI-02 (n=6) y 50% para las PCI-02 purificadas

posteriormente con Zymo One Step (n=4). A partir de este punto se utilizó la totalidad

de las muestras (N = 36; constando de 12 por cada metodología de extracción) para el

resto de los análisis de éxito de amplificación. Para el caso de los marcadores

específicos de genomas de peces (12S MiFish, Miya et al. 2015), el éxito fue de 83%

para Fast DNA; 41,6% para PCI-02 y de 33,3% para Zymo One Step (Figura 2).

Siguiendo la misma lógica, el éxito obtenido utilizando los marcadores de salmónidos

(16S-new-F y 16S-Br, descritos por Clusa et al. 2017 y Palumbi et al. 2002,

respectivamente), a manera de paso inicial para la detección definitiva de salmónidos

utilizando el próximo set de primers, fue de 75% para Fast DNA; 41,6% para PCI-02 y

de 75% para Zymo One Step. Para el último set de primers específicos de salmónidos

(16S-F-Salmo y 16S-R-Salmo, descritos por Zaiko et al. 2015) el éxito de amplificación

correspondió a 33,3% para Fast DNA; 81,8% para PCI-02 y de 66,6% para Zymo One

Step.

27
Figura 2.- Porcentaje de éxito de amplificación en la totalidad de muestras (N=12)

según método de extracción y marcador molecular utilizado. Las letras F, P y Z dan

cuenta de los métodos Fast DNA, PCI-02 y Zymo One Step, respectivamente. Los dos

últimos marcadores moleculares serían específicos para la detección de salmónidos.

El resultado de la RFLP no fue claro en ningún caso, debido a la mala visualización

de sus productos en gel de agarosa, lo cual no permitió discernir claramente entre

bandas con números de pares de bases similares.

28
 DISCUSIÓN

En esta investigación quedó de manifiesto la capacidad de amplificar exitosamente

ADN ambiental con cualquiera de los métodos de extracción aquí utilizados, aunque

con distinto grado de éxito entre sí. Lo anterior se comprueba por los resultados de

amplificación y análisis posteriores, en los que se obtuvieron resultados positivos en la

mayoría de las réplicas. El método de obtención de muestras aquí considerado,

correspondiente al proceso de filtrado de las muestras y su conservación en buffer

Longmire, presentó al parecer una alta efectividad denotando una importante integridad

del ADN allí contenido a pesar de haber permanecido almacenadas por varios meses

antes de su extracción. Esto debido a las propiedades químicas de dicho buffer, el cual,

si bien presenta capacidad lítica, es inocuo para las estructuras de ADN ambiental.

Además, presenta la ventaja logística de poder conservarse a temperatura ambiente, lo

cual lo distingue considerablemente de otras formas de extracción y/o buffers de

almacenamiento (Deiner et al. 2017).

La cantidad de ADN obtenida con cada método fue variable, y la preponderancia de

cada uno varió según el método con que se analizó. Al medirlo con el aparato de

detección por refracción de luz de micro-volumen Take3, se vislumbró que el método

de extracción con fenol-cloroformo (PCI-02) sería el que entregaría mayor cantidad de

ADN en todos los sitios, seguido por el método de fenol-cloroformo más purificación

posterior (Zymo One Step). Con el kit comercial el resultado sería notablemente menor.

Respecto a la calidad de ADN, detectada por el mismo aparato, se consideró similar

29
entre los distintos métodos siendo generalmente buena en las réplicas analizadas

(superiores a valores 1,6), aunque se debe resaltar que el kit comercial entregó

resultados aceptables en todas las muestras. Por otro lado, el análisis con Qubit muestra

que el método Zymo One Step sería varias veces superior a las otras dos metodologías

en cuanto a cantidad de ADN obtenida. Si bien ambos métodos de análisis son válidos,

las diferencias existentes entre ellos están probablemente asociadas a su efectividad

inherente, siendo el método de fluorescencia (Qubit) más sensible y específico para la

detección de ADN en las muestras, aunque a la vez sus valores de cantidad entregados

suelen ser significativamente menores (He et al. 2018). En general los resultados

concuerdan con los obtenidos por otros investigadores, siendo las metodologías de

extracción con fenol las que entregan una significativamente mayor cantidad de ADN

respecto a kit comerciales (Cáceres et al. 2012).

12S (Miya) Porcentaje 16S (Zaiko) Porcentaje 16S (Clusa) Porcentaje

Maullín Fast DNA 4 66,7 4 66,7 3 50
PCI-02 0 0 0 0 4 66,6
PCI-02+Zymo 2 33,3 3 50 6 100

Petrohué Fast DNA 6 100 5 83,3 1 16,7

PCI-02 5 83,3 5 83,3 5 100
PCI-02+Zymo 2 33,3 6 100 2 33,3

Ambos sitios Fast DNA 10 83,3 9 75 4 33,3

PCI-02 5 41,6 5 41,6 9 81,8
PCI-02+Zymo 4 33,3 9 75 8 66,6

Tabla 2.- Número de muestras con amplificación positiva para los marcadores

moleculares 12S MiFish (“12S Miya”), 16S-Fr y 16S-Br (“16S Zaiko”); y 16S-F-Salmo

y 16S-R-Salmo (“16S Clusa”). El porcentaje es respecto al total posible de dicho set de

30
muestras (n=6 para Maullín y Petrohué, excepto PCI-02 con marcadores 16S Clusa

donde el total es 5. Para ambos sitios en conjunto N=12, y n=11 para el caso

excepcional antes mencionado).

En cuanto a la capacidad de amplificación del ADN ambiental obtenido con cada

método de extracción se pudo observar que el éxito de cada uno es altamente

dependiente del marcador utilizado. Para el caso de los marcadores 16S universales

(Palumbi et al. 2002) y 12S para peces (Miya et al. 2015) el uso del kit comercial Fast

DNA fue más efectivo respecto a los otros métodos; mientras que para la detección de

salmónidos (con la PCR tipo nested descrita por Clusa et al. 2017) los métodos más

efectivos fueron PCI-02 y Zymo One Step. La eficiencia de la purificación con Zymo

One Step por sobre la extracción con PCI-02 no fue tan aparente como podría esperarse.

Si bien en algunos casos aumentó el número de detecciones positivas para sitios

específicos, en otras no fue así, incluso inhibiendo la detección en muestras que sí

amplificaron sin purificación (resultados no mostrados). En Maullín se tuvo que

ninguna de las muestras extraídas con PCI-02 amplificó con los marcadores 16S de

Zaiko en una primera instancia (Tabla 2), aunque sí en algunas de las mismas sometidas

a purificación posterior. Esto sugiere que la presencia de compuestos húmicos en las

muestras obtenidas de aquel río (caracterizado por poseer una carga importante de

materia orgánica, mayor a la presente en Petrohué; CNR 2003) inhibió la amplificación

de manera total, considerando que este tipo de extracciones con fenol-cloroformo suelen

co-extraer una mayor cantidad de estos compuestos indeseados (Cáceres et al. 2012).

Por otro lado, hubo otras muestras que amplificaron con ambas metodologías de

extracción (PCI-02 y Zymo One Step), pero que con purificación posterior se mostraron

31
patrones de bandas mucho más claros que sin éste; tal vez asociado al fenómeno antes

descrito, aunque en un menor grado: tan solo compitiendo con el ADN durante el

proceso de amplificación (Cáceres et. al. 2012). La prevalencia entre estos dos últimos

métodos dependió del sitio, mostrándose efectivas en el 100% de los casos la alternativa

con fenol-cloroformo en Petrohué, y esta misma, aunque con purificación posterior

(Zymo One Step) en Maullín. Esta diferencia en efectividad podría deberse a la cantidad

de materia orgánica (con posible presencia de inhibidores de amplificación como, por

ejemplo, ácidos húmicos) contenida en cada muestra, siendo aquellas provenientes del

río Petrohué presumiblemente más oligotróficas que aquellas del río Maullín (CNR

2003, CONAF 2016). Por lo tanto, de ser correcta esta suposición se sugeriría que para

la amplificación de ADN ambiental a partir de ambientes oligotróficos (e. g. ríos u otros

cursos de agua con buena circulación) se preferiría la extracción con fenol-cloroformo,

mientras que para otros con alta carga de materia orgánica el método con purificación

posterior sería el más efectivo; lo cual tiene sentido lógico en primera instancia. Por otro

lado, al mostrarse las extracciones con el kit comercial Fast DNA Spin Kit más

eficientes con aquellos marcadores con múltiples especies objetivo (16S universales,

12S para peces; a diferencia de las anteriores que al parecer serían más útiles en la

detección específica de salmónidos), independiente del sitio de muestreo (y por ende del

contenido de materia orgánica), este método de extracción se sugeriría para estudios

tipo metabarcoding, o aquellos en los que se deba muestrear en un amplio rango de

condiciones hidrológicas (i. e. corresponde a un método más “generalista”). Sin

embargo, las conclusiones anteriormente expuestas deben tomarse con cautela, dado a

que se requerirían de mayores estudios para su corroboración.

32
 Por otro lado, en cuanto al precio relativo de cada método, la utilización de Fast

DNA Spin Kit sería la más costosa, con un valor estimado de $4120 por muestra (5

USD aprox.), lo que no incluye el valor de los insumos e implementos de laboratorio.

Le seguiría el método de fenol-cloroformo más purificación posterior, con un valor de

aproximadamente $2200 por muestra (2,77 USD), constatando solamente los reactivos

principales. Por último, la metodología más barata de realizar sería la PCI-02, cuyo

valor de sus reactivos principales no supera los $200 por muestra (0,25 USD) (Quezada

com. pers.). Eso si se debe mencionar que los últimos dos métodos trabajan con

reactivos catalogados como peligrosos (fenol-cloroformo-isoamil y cloroformo-

isoamil), por lo que se requiere de un mayor resguardo en su manipulación. A esto se le

debe considerar además su mayor tiempo de extracción (siendo de hasta tres días,

mientras el kit comercial demora unas pocas horas). Por lo tanto, a la hora de escoger un

método de extracción determinado para estudios de ADN ambiental, deben considerarse

aspectos como: especificidad de los marcadores moleculares a utilizar (en cuanto al

número y complejidad de taxa a investigar), características físicas y químicas del

sistema (e. g. contenido de materia orgánica), así como factores “blandos” como precio,

factibilidad, disponibilidad de insumos e infraestructura, entre otros.

Cabe mencionar la importancia que tuvieron los controles tanto positivos como

negativos durante esta fase, así como durante la extracción. Lo anterior debido a la alta

influencia de contaminación que se ha descrito como recurrente en este tipo de estudios

(Miya et al. 2015), los cuales fácilmente podrían dar origen a resultados erróneos. Los

controles negativos permitieron cerciorarse de la pulcritud en la ejecución del protocolo,

así como descartar posibles contaminaciones, por ejemplo, en los reactivos utilizados, lo

33
cual pudo haber ocasionado una acumulación en cascada de errores de ejecución a

través de la investigación. Así mismo, los controles positivos entregaron una mejor

aproximación de varios aspectos que se buscó obtener en las muestras ambientales,

denotando por ejemplo cómo se visualizan los resultados a partir de las especies

objetivo propiamente tal.

En cuanto al desempeño de la técnica RFLP para la distinción de taxa específicos en

el ADN ambiental, no fue posible discernir entre los productos obtenidos de la

digestión, ni por ende una clasificación taxonómica del material genético detectado a

nivel de género (siendo la máxima resolución taxonómica a nivel de familia:

Salmonidae). Lo anterior puede haberse debido a un rendimiento sub-óptimo del equipo

utilizado (ya sea del propio aparato de electroforesis, los reactivos utilizados, la tinción

adjunta a la polimerasa, o algún otro no considerado), ya que no se obtuvieron imágenes

nítidas en ninguna de las visualizaciones de productos en agarosa realizadas en este

proyecto. Lo anterior no fue tan importante en el análisis de productos PCR debido a

que su objetivo fue más bien la determinación de presencia/ausencia.

Si bien esta técnica es deseable por su relativo bajo precio y facilidad de uso respecto

a otras técnicas moleculares, también debe tenerse en cuenta que ésta requiere de una

mayor optimización caso a caso, sobre todo en lo referente a las enzimas de restricción

a utilizar y su efectividad en genomas tanto de las especies objetivo como de otras con

las que pudiesen compartir hábitat. En este caso, su utilización no fue lo suficientemente

fiable debido presumiblemente a problemas originados en la visualización en agarosa,

34
aspecto crucial para evaluar los resultados que esta técnica nos entrega. No se descarta

que la presencia de ácidos húmicos que hayan persistido a la extracción de las muestras

pueda haber inhibido la acción de las enzimas de restricción (Cáceres et al. 2012). Sin

embargo, lo anterior pareciera refutarse por el hecho de existir productos de ADN con

alto grado de pureza (radio 260/280), y que algunos incluso parecieron arrojar signos de

haber sido exitosos en su digestión (bandas de visualización en niveles esperables para

aquella RFLP), aunque los resultados observados no fueron lo suficientemente claros

para comprobarlo del todo. Por lo tanto, no fue posible discernir certeramente entre

distintas especies de salmónidos que pudiesen existir en los sistemas de estudio. En ese

sentido su uso requiere de un cierto nivel de instrumentación y protocolos que aseguren

una alta calidad en la electroforesis con tal de distinguir de forma clara los distintos

patrones de bandas obtenidos.

Otra opción que pudiese entregar una mayor caracterización del ADN contenido en

las muestras sería con la utilización de la técnica qPCR. Si bien esta técnica molecular

involucra una mayor inversión económica, su elevada capacidad de detección (incluso a

concentraciones traza de ADN ambiental), especificidad, e incluso su capacidad de

entregar valores de abundancia de ADN asemejables a aquella de las especies que

originaron dicho material genético (Cristecu & Hebert 2018), le otorgan cualidades lo

suficientemente favorables que justifican su mayor coste. Esta herramienta, junto a otras

como las secuenciaciones de próxima generación (NGS), sin duda expande las

posibilidades de la técnica considerablemente, aunque siempre en el marco de sus

limitaciones inherentes.

35
 Hasta el momento, el uso en Chile de técnicas moleculares basadas en eDNA para la

detección de macro-organismos no ha sido extendido, abarcando solamente algunas

investigaciones puntuales en sistemas fluviales, por ejemplo para el análisis de

composición de especies ícticas (Estragues2018), así como otro estudio que busca

abarcar también a mamíferos, aves y anfibios (Saenz et al. resultados no publicados).

Una mayor implementación de esta técnica sería deseable, sobre todo considerando las

metas que se ha propuesto Chile en cuanto a conservación de la biodiversidad en el

contexto actual de cambio climático (MMA 2017). Estas nuevas políticas de manejo

necesitarán de la actualización de bases de datos ecológicas de relevancia (e. g.

distribución de especies amenazadas, así como de especies exóticas invasoras), así

como protocolos para el monitoreo de sus dinámicas. En este sentido, la técnica eDNA

se presenta como una alternativa relativamente barata y fácil de ejecutar (al disponerse

previamente de una planificación logística que incluya planes estratégicos, objetivos de

conservación e indicadores claros para la toma de decisiones) para complementar las

metodologías tradicionales de muestreo, aunque esta clase de estudios de optimización

de protocolos son necesarios para su correcta implementación.

36
 CONCLUSIONES

En esta investigación se comprobó la posibilidad de un uso exitoso de técnicas

moleculares basadas en ADN ambiental en sistemas fluviales del sur de Chile. Esto a

pesar de su presumiblemente importante contenido carga de materia orgánica e

inhibidores, lo cual permanecía siendo un desafío vigente de esta clase de estudios hasta

antes de la realización de este proyecto (Quezada et al., resultados no publicados). Esta

técnica permitiría corroborar la riqueza biológica de este tipo de sistemas, e incluso (si

se adaptan protocolos adecuados) la abundancia relativa de los organismos que allí

habitan. Si bien no fue posible discernir entre especies de salmónidos por fallos en la

visualización del protocolo de la digestión enzimática del ADN obtenido, sí se pudo

comprobar la validez de las metodologías de filtrado, extracción y amplificación del

ADN ambiental obtenido; esto deja en claro la factibilidad de la utilización de esta

técnica para futuros estudios. Se desprende, por ejemplo, la hipótesis que posiblemente

la elección de metodología de extracción tenga que considerar aspectos como el alcance

taxonómico del estudio y la naturaleza físico-química del sistema a estudiar. Se

considera necesario enfatizar la importancia de esta clase de estudios, los cuales

permitirían ahondar en la optimización de protocolos, aportando a un uso más extendido

de esta y otras técnicas para complementar estudios ecológicos y de conservación

mediante la detección de especies, y a un bajo costo relativo. En esta línea, se reconoce

el potencial de esta técnica en sistemas fluviales de Chile, sobre todo para la detección

de aquellas especies de carácter críptico cuya presencia, de otro modo, sería difícil de

detectar; así como para catastros de especies, establecer distribuciones efectivas,

controlar invasiones biológicas a nivel local, entre otras.

37
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