27/06/2017

Universidade Federal de Alfenas

Programa de Pós-Graduação em Química - PPGQ

Métodos espectrométricos de
análise orgânica:
Espectrometria de Massas (MS ou EM)

Bianca Gonçalves Vasconcelos de Alcântara

Mestranda em Química Orgânica
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Daniela Aparecida Chagas de Paula

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Alfenas/MG
2017

Métodos espectrométricos de análise

orgânica

Espectroscopia Espectroscopia
Espectroscopia
no Espectrometria de ressonância
no ultravioleta
infravermelho de massas (MS) magnética
(UV)
(IV) nuclear (RMN)

massa
grupos grupos nº e tipo de 1H e
molecular e 13C
funcionais cromóforos em função da
padrões de
localização e do
fragmentação
desdobramento
de sinais

Desreplicação

Identificação

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Espectrometria de massas
• Constitui uma importante técnica analítica que
permite caracterizar e quantificar compostos, usando
pouca quantidade de amostra e exibindo baixas
concentrações da substância de interesse e, ainda,
em misturas muitos complexas.

Usos da EM
• Auxilia na identificação de novos compostos

• Análise de misturas orgânicas complexas - extratos

• Síntese – substância de interesse

• Indústria – composição e quantificação

• Medicina - análise de apenas uma célula

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Espectrometria de massas
• Fundamentos – década de 1897 - J.J. Thomson determinou a
m/z do elétron

• Wien estudou a deflexão magnética de raios anódicos

• Isótopos

• 1918 - primeiro espectrômetro de massas construído

• Vários prêmios Nobel Quí/Fís relacionados a EM

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Como o massas analisa os compostos?

• Peso da molécula
• Padrões de fragmentação

m/z
• Massa pela carga (pode ser 1,2,etc.)
• Moléculas neutras não são analisadas

• Problema?? Muitos compostos com mesmo peso

Ex. Ácido acetil salicílico

• Solução – padrões de fragmentação

MS, MS2, MS3 - fragmentos pai/filho e filho/filho

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 Exemplo (Eletrospray)

• 414 [M]+ = Substância foi protonada ganhando 1 H

Massa real 413 Da(unidade de massa atômica)

• 412 [M]- = Substância foi ionizada perdendo 1 H

Massa real 413 Da

Picos
• Pico base – íon mais estável (100% dele chega no
detector).
• Pico do íon molecular – m/z do peso da molécula
inteira
• Isótopos – massas de alta
• Aduto – Na+ e K+ (Modo Positivo)
Cl- (Modo Negativo)
Ex.: [M+Na+H]+

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Isótopos
 Massa monoisotópica?

• Maioria dos elementos possuem 1 isótopo estável

Ex: Carbono –> 98,89% = 12 Da
–> 1,11% = 13 Da (+1 neutron)

 Pico metaestável - fragmento produzido no analisador – os picos percorrem

uma trajetória incomum; são picos largos.

 Massa do íon molecular é a massa da molécula em que cada átomo esta

presente em seu isótopo mais abundante

Exact Mass: Monoisotopic Mass

H 1.007825

C 12

O 15.99492

Na 22.98977

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Funcionamento
1) Gera íons gasosos para caminhar no massas, por
voltagem;

2) Separa os íons no espaço ou no tempo com base na

m/z, a depender do analisador;

3) Mede a quantidade de íons de cada m/z. Esses

podem chegar de forma contínua ou pulsada pelo
ionizador para analisador e finalmente para o
detector – este irá gerar o gráfico.

Instrumentação
1) Preparo da amostra;

2) Fonte de íons – ESI/APCI/MALDI/EI/IC

3) Analisadores – Quadrupolo/TOF/Iontrap/FT-
ICR/Setor magnético
Alto vácuo 10 -5 – 10-8 mbar (O2)

4) Detector – Fotomultiplicador/Multiplicador de e-

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Partes de um espectrômetro
Fonte de íons Analisador de massas Detector

• IC/IE • Time-Of-Flight (TOF) • FTMS (Fourier Transform)

• MALDI • Quadrapole • Elétron-multiplicador
• Electro-Spray Ionization (ESI) • Ion-Trap • Faraday

Unidade de entrada
• Via membrana
– Amostras gasosas
• Forno EM

– Amostras voláteis
– Derivatizadas Subst. separadas pela
cromatografia
• Sonda direta
– sólidos Banco de
Amostra complexa
dados
• Cromatógrafo
– GC-MS
– LC-EM

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Métodos de ionização
Transformar as moléculas neutras em partículas carregadas

• Ionização por elétrons (EI)

• Ionização química (CI)
• Ionização química a pressão atmosférica (APCI)
• Foto ionização (APPI)
• Ionização por eletrospray (ESI)
• Ionização por dessorção (FAB e MALDI)
• Outros (avançando muito rápido)

Impacto Eletrônico - EI jjj

Feixe de elétrons

Feixe de íons

Placa repelente Placas aceleradoras Fenda colimadora

(entre elas há diferença de potencial)
Bombas
.
Excesso de energia cinética -> fragmentações
Vantagens: Robusto, comparar padrões de fragmentação com base de dados (70 eV)
Desvantagens: Fragmentação do íon molecular; amostra deve ser volátil (ou derivatizada)

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Impacto Eletrônico - EI jjj

• Por pólos magnéticos forma-se o feixe de elétrons à 3-4000 °C
por um filamento de tungstênio

• Um repulsor de elétrons direciona os íons formados para o

analisador;

• Geralmente sem o pico do íon molecular – fragmentação

drástica

Ionização por elétrons - EI

• Diminuir a energia para tentar detectar o íon molecular antes
de fragmentar
Abundância relativa

m/z

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Ionização química - CI
• Amostra voláteis e termo-estáveis, assim como
a EI
• Colisão com gás reagente ionizado
– > transferência de prótons
– > transferência de elétrons
– > formação de adutos Placas
aceler.

• Técnica soft – presença do pico do íon

molecular
• Quase todos os gases ou líq. voláteis podem ser reagentes
– Comuns: metano, amônia, isobutano e metanol -> (M+H)+ / NF3 -> (M-H)-

Vantagens: adutos formados podem diferenciar isômeros; ionização branda -> pouco
ou nenhuma fragmentação; robusto

Ionização química - CI
C2H5+ aduto M+CH2H5

CH4

CH3+ + H .

e- CH4
. 2e-
CH4 + +

CH4

CH5+ + CH3
.

doa H+ M+H+

Diferentes gases reagente tem diferentes afinidades protônicas -> diferentes

seletividade e grau de fragmentação - sem biblioteca!

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EI versus CI

Ionização por eletrospray - ESI

Gás nebulizador

Solvente/Amostra

- +

 Um gás nebulizador forma o spray da amostra/fase móvel, sofrendo influência de um

campo magnético (modo positivo ou negativo) na agulha, promovendo assim a ionização.
Após no cone de Taylor vira spray e forma gotículas contendo os íons.
Após ocorre a fissão de Coulomb liberando a molécula ionizada para o analisador.

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• Técnica soft
• Trabalha com compostos não voláteis
• Hifenação com técnicas de separação, como HPLC
• Têm o pico do íon molecular
• O spray aumenta a superfície de contato do líquido

Ionização química a pressão

atmosférica - APCI
Forma os íons por uma descarga de
coroa ou corona;
Íons secundários do gás reagente que irão
colidir para formação do analito carregado.

Desvantagens:
• Pode ocorrer degradação
térmica
• Ruído químico em massas
baixas
• Técnica não apropriada para
compostos > 2000 m/z
Vantagens:
• Informação de massa molecular
• Fonte robusta
• Ionização muito eficiente
• Compatível com altos fluxos de LC 2.0 ml/min
• Boa sensibilidade
• Bom complemento á técnica de ESI

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Foto ionização - APPI

Aplicada:
•Compostos não polares
•Mínima fragmentação
•Não apresenta sinal para o solvente
•Mínimo efeito de competição
por carga
•Vazões menores que 100 µL/min

•Lâmpada de UV-> fótons de energia

(10.0 e 10.6 eV) alta suficiente para
ionizar compostos orgânicos de várias
classes, mas baixa o suficiente para
minimizar a ionização do ar (N2, O2) e
de solventes comuns em HPLC, não
produzindo ruído de fundo.
•Pouca ou nenhuma fragmentação
=>M+. ou MH+

Ionização por dessorção

• Amostra dissolvida ou dispersa em matriz
• Feixe de íons de
– átomos neutros - Ar ou Xe (FAB) <20.000 Da
– fótons de alta intensidade – laser (MALDI) <300.000 Da
femtomoles 10-15!
• Íons formados são acelerados na direção do analisador de massa
como ocorre com os demais métodos de ionização
MS M+H+/M-H-/M+Na+/M+K+ Popularidade
(ionizados)
Vacum (FAB)
(não ionizadas)

(MALDI)

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Matrizes
• Matriz deve ser não volátil, inerte, eletrólito razoável para
permitir a formação de íons
– Comuns em FAB/SIMS: glicerol, trietanolamina, álcool3-nitrobenzila
– Comuns em MALDI (capazes de absorver luz UV do pulso de laser): ác.
nicotínico, ác. Cinâmico

• Protege de irradiação
excessiva

M+H+
M-H-
M+Na+/M+K+
+ íons da matriz – íons clusters
(de fundo <600 m/z)

Matrizes de MALDI

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Direct Analysis in Real Time - DART

Aplica-se potencial elétrico em gás (ex.: N2 e
He) para formar um plasma de átomos e
moléculas no estado excitado que interage
com a amostra.

Diferentes mecanismos de ionização

-> ioniza moléculas de água => M +H+
-> moléculas de O2 e H2O carregadas
negativamente => M -H+

Vantagens:
•polares e apolares
•não requer: elevadas temp., irradiação por UV
ou laser
•não altera a amostra

Paper spray ionization - PSI

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Principais métodos de ionização

Publicações em 2012 de LC-MS

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Analisadores
Separação dos íons segundo sua m/z

• Dupla focalização - Setor Magnético e Eletrostático - BE

• Quadrupolo - Q
• Tempo de Vôo - TOF
• Q-TOF
• Armadilha de íons - IT
– “Íon-Traps 3D” QIT
– “Íon-Traps Lineares”
• Ressonância Ciclotônica
de Íons FT-MS - ICR
• “Orbitraps - FT”

Todos sob alto vácuo –íon não se chocar com o ar

Setor magnético e eletrostático

• Íons acelerados quando passam por um campo magnético
traçam uma rota curva, cuja a curvatura será maior quanto
maior for a razão m/z
• IE ou IC
m/z=B2r2/2V

Única curva detectada (m/z)

BE ou EB

Variando B detecta cada m/z

Lento!!! Campo eletrostático corrige a
velocidade dos íons

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Quadrupolo
• Composto de 4 barras paralelas na direção do feixe de íons
em que são aplicadas uma voltagem de corrente contínua e
uma radiofrequência, gerando um campo eletrostático
oscilante entre as barras
• Íons com m/z correta passam por uma oscilação estável de
amplitude constante numa trajetória tipo “saca-rolha” sem
atingir as barras
• Usual em CG-MS
• Baixa resolução
• LC-MS

Varredura no potencial RF

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Características do Quadrupolo
- Baixa resolução: resolução "unitária’
ideal discriminatória

-Análise discriminatória

- Varreduras rápidas RF

-Facilmente acoplados MSn

Triplo-Q

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MSn - Massa de segunda ordem ou Tandem

• Fullscan – gera o TIC (cromatograma de íons totais)

• SIM – MS2 (escolhe apenas determinado íon – m/z-

selecionado do TIC, para refragmentação)

• Product íons – são os íons filhos, gerados da refragmentação

• MRM – após a refragmentação escolhe apenas um dos íons

para análise

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Tempo de Vôo - TOF

• Analisa o tempo de vôo
gasto por determinado íon.

• A m/z mais leve chega

primeiro no detector,
sendo feita essa separação
por diferença de voltagem.

• Geralmente acoplado com

o quadrupolo,
possibilitando massas de
alta resolução.

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Ion trap 3D - QIT

• Corrente alternada e potencial radiofrequência
• Todos os íons oscilando em trajetórias concêntricas
• Mais sensíveis que os Q
• Como os Q:
– resolução baixa
– MSn
– Rápido – varreduras RF
• Suscetível a auto-CI
(colisão com moléculas neutras dentro
da armadilha) pico anormalmente alto
M + H+

Ressonância Ciclotrônica de Íons

(ICR) e transformada de FourierFT
Aprisionamento de íons em uma campo magnético/elétrico,
seguido da medida de suas frequências de ressonância
ciclotrônica, que são relacionadas com seu valor de m/z.
=>Varredura de RF
•Altíssima resolução (em função de B como em RMN) que diminui com o aumento de
m/z.
•Alta sensibilidade. 10-100 íons precisam normalmente oscilar para serem sentidos
pelos eletrodos receptores.
•Alto custo (supercondutores), difícil manutenção.
• MSn. Operação semelhante aos “ion-traps”.
• Trabalham sob altíssimo vácuo (< 10-8 Torr) enquanto a quantidade de íons
aprisionados na cela é pequena ("charge-spacing").
• Muito utilizados em estudos de reações íon-molécula (estudos cinéticos) e em análise
de altíssima resolução-precisão.

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Orbitrap
• Alta resolução

Analisadores

3D - IT

BE

IT-CID- IT

Orbitrap

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Parâmetros importantes

Parâmetros importantes

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Detecção
• Detectores:
Ex.: multiplicadores de elétrons produz uma corrente proporcional ao
número de íons que o atingem
• É capaz de detectar um único íon!
Detector Material
condutivo

Registrador

 Sinal é registrado -> abundância de íons X m/z

Pico base é o mais intenso (abundância relativa o considera 100%)

Forma de representação de espectro

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Tempo de vida do M.+

Compostos aromáticos
Alcenos conjugados
Compostos alicíclicos
Sulfetos orgânicos
Hidrocarbonetos não ramificados
Cetonas
Aminas
Ésteres
Éteres
Ácidos carboxílicos
Hidrocarbonetos ramificados
Alcoóis

Estudo de fragmentação
• EI - fragmentação de alta energia (carga e radical)

– Processos unimoleculares (baixa pressão, na fase gasosa) e por etapas

– Perda de e- mais fácil em orbital não ligante>π>α
– Regra de Stevenson => fragmento com energia mais baixa
• Segue a estabilidade de carbocátions : CH3
.
CH3
CH2CH3
Benzil, Alil > 3o > 2o > 1º H3C C CH2CH3 H3C C

– Fragmento sem carga, detecta-se a diferença CH 3 CH3

– Seta de meia ponta (perda de 1 elétron) e ponta inteira (2 elétrons)

– Abrangente banco de dados (70 eV)

• ESI - fragmentação direcionado pela carga

Alguns padrões de fragmentação estabelecidos (ácidos clorogênicos),
cálculos teóricos importantes no entendimento da fragmentação em fase
gasosa

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Mecanismos de Fragmentação
Impacto de elétrons

1) Clivagem alfa

2) Clivagem beta

3) Clivagem sigma

4) Rearranjo MacLafferty

5) Rearranjo Retro Diels Alder

6) Aromáticos

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Clivagem alfa
• Ocorre no sítio do íon radical – tem que ter dupla no
heteroátomo

Clivagem Beta
• Clivagem na carga do íon – migração do par de elétrons
O O

NCH3 NCH3

O O

NCH3
CO

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Clivagem Sigma
O espectro vai
mostrar onde
ocorrem as
fragmentações

Perda de 14 uma – CH2

Rearranjo McLafferty
• Compostos carbonilados – a quebra ocorre no carbono gama
à carbonila.

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Rearranjo Retro Diels Alder

• Compostos insaturados e cíclicos.

Aromáticos
• Rearranjo da carbocátion com formação do íon tropílio m/z 91

91 m/z 65 m/z 39 m/z

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Bancos de dados abertos

• EI
– Wiley
– NIST
• ESI
– ChemSpider
– Metlin (inclusive fragmentos)
– Metlin (espectro MS/MS)
– MassBank (espectro MS/MS)
– Knapsack

Não é reprodutível como EI

Menos informação (fragmentação)

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Eliminar candidatos!

• Exercício – 2-metil hexano

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• O isômero 2-metil hexano tem a presença do fragmento m/z = 43 (cátion

isopropil) como pico base. Neste caso fragmento m/z = 57, de baixa
intensidade, representa um carbocátion menos estável C4H9+ que é
formado devido a perda do radical isopropil por parte do íon molecular.

• Exercício - Limoneno

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• O limoneno, um monoterpeno constituinte do óleo essencial da casca de laranja,

sofre sua principal fragmentação pela reação de retro Diels-Alder e o principal sinal no
EM é o íon radical a m/z 68.

Conclusão
OH
O

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Bibliografia
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• CREWS P., RODRIGUEZ, J., JASPARS, M. Organic Structure Analysis (Topics in Organic
Chemistry). 2nd edition. Oxford University Press, USA, 2009.
• HOFFMANN, E. Mass Spectrometry: Principles and Applications, Wiley-Interscience; 3 edição,
2007.
• MCLAFFERTY F. W. , TURECEK, F. Interpretation of Mass Spectra, 4a. Edição, University
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Artigos
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• WOLFENDER, J.; MARTI, G.; FERREIRA Q UEIROZ, E. Advances in Techniques for Profiling
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Artigos
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• BEDAIR, M.; SUMNER, L. W. Current and emerging mass-spectrometry technologies for
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• BRETON, R. C.; REYNOLDS, W. F. Using NMR to identify and characterize natural products.
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• CREEK, D. J. et al. Toward global metabolomics analysis with hydrophilic interaction liquid
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Muito obrigada
pela sua atenção!

Exercícios

37