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Partie I : Matériel & Méthodes

I / Matériel :

1- Matériel biologique :

la souche Saccharomyces Cerevisiae utilisée dans ce travail pratique est une leveure de
boulanger a été fournie sous forme hyophilisée (2g/200ml ; 6g/200ml)

2- Matériel Chimique : HCl ; l’eau minéral.

3- Les appareils utilisés :

 Plaque d’agitation thermo – magnétique


 Ph mètre
 Chauffe ballon
 Balance électronique
 Montage de distillation fractionné

4- Verrerie et petit matériels :

 Bécher de 500ml ; éprouvette gradué de 500ml


 Verre de montre ; tige en verre

5- Milieux de Culture :

 Milieu de fermentation à base de sucre du table (100g/l)


 Milieu de fermentation : la Mélasse de betterave (100g /l)

II/ Méthodes :

1) Préparation des milieux de cultures :

Dans notre étude on a utilisé deux milieux de culture (la mélasse de betterave ; milieu à base
de sucre du table) , la méthode de préparation est la suivante :
 La préparation de la mélasse de betterave :
- Pelée le betterave
- Lavage de la pulpe de betterave pour le débarrasser de poussières et ainsi la charge
microbienne de betterave , puis on le coupe en petits morceaux .
- Peser 50g de la pulpe fraiche de betterave , puis on le poser (porte) dans un bécher
contient 500ml d’eau , ensuite on le porte sur la plaque d’agitation magnétique avec
chauffage et on laisse 20 minutes pour
- Laisser le mélange refroidir sous un courant d’eau froide
- Après refroidissement , l’échantillon obtenu est ensuite filtré à l’aide d’un tissu .
- La fixation de pH à valeur constant ègal à 7,5 à l’aide d’un solution d’HCl (avec pH
métre)
- Des bouteilles remplie avec 200ml de la solution de mélasse à concentration de
50g/500ml.
 Culture de la levure (Saccharomyces Cerevisiae) :
- Dans chaque bouteille on ajoute la levure (2g/6g)
 Incubation du milieu de fermentation :
Incubation a la température de laboratoire pendant 21 jours avec l’agitation.
 Préparation de milieu à base de sucre du table :
- Peser 50g sucre du table avec balance électronique , puis on le porte sur la plaque
d’agitation magnétique - sans chauffer - .
- Laisser le mélange jusqu’à il devient homogène .
- La fixation de PH à valeur constant égal à 7,5
- Des bouteilles remplie avec 200ml de la solution de sucre (50g /500ml)
 Culture de la levure :
Une quantité de la levure (2g /6g) est mise dans chaque bouteille contenant 200ml de
milieu de fermentation .
 Incubation du milieu de fermentation :
Incubation a la température de laboratoire sans agitation pendant trois semaines .
Partie II :

1) Mesure de pH final des milieux de fermentation :

Le principe consiste à introduire l’électrode d’un pH – mètre dans les différents milieux ,
ensuite on lit directement la valeur de pH sur le cadre du pH – mètre .

2) Distillation (Récupération) du bioéthanol fractionnée :

Après trois semaines (21 jours) de fermentation l’éthanol obtenu a partir de sucre ou de
betterave est distillé (l’extraire d’éthanol). la température de distillation est de l’ordre de
78°C. la distillation est effectuée dans un montage a distillation fractionnée comportant un
chauffe – ballon . des colonnes de réfrigération et une ampoule de récupération de distillat
(l’éthanol)

La distillation fractionnée est un procédé de séparation par fractionnement . son but est de
séparer les différents constituants d’un mélange de liquides miscibles , possédant des
températures d’ébullition différentes .

 Matériel requis :
- Une ballon rond (contenant le mélange de liquides à séparer)
- Un montage à distillation fractionnée : colonne à fractionnement (une colonne de
vigreux) un tube de jonction , un réfrigérant , un tube d’écoulement . éprouvette
graduée pour récupérer le distillat , une tige en verre pour l’agitation .
 Mode opératoire :

Principe :

Souvent, les liquides à séparer ont soit des températures d’ébullition très proches, soit de
grandes affinités . c’est le cas de l’eau et de l’éthanol qui forment un mélange possédant sa
propre température d’ébullition lors du chauffage , le composé arrivant en tête de colonne
vers 78°C est un mélange contenant environ 95% d’éthanol .
Distillation fractionnée :

Lorsque les vapeurs montent dans la colonne de séparation. Elles se refroidissent et se


condensent sur la surface interne de la colonne , ce liquide est ensuite chauffé
progressivement par les autres vapeurs montantes jusqu'à être vaporisé à nouveau. Toutefois,
la composition de ces nouvelles vapeurs n’est pas la même que celle des vapeurs initiales ,
elles sont plus concentrées en composant le plus volatil .

Une colonne de vigreux comporte des petits picots de verre tout le long de la colonne , leur
rôle est d’améliorer le contact entre la vapeur qui monte et le liquide qui redescend , ainsi la
séparation est meilleure.

Schéma annoté du Montage

Figure 1. le montage de distillation de l’éthanol


1) Mesure du pH de distillat (bioéthanol) :

Après la distillation du bioéthanol on mesurer le pH. La détermination s’effectue par Ph -


mètre

Détermination de volume de distillat :

La détermination s’effectue par

Milieux de Milieu 1 de sucre Milieu 2 mélasse de betterave


fermentation
La masse de la 2g 6g 2g 6g
levure (ferment)

pHi 7.5 7.5 7.5 7.5

pHf de milieux 4.06 4.3 4.8 5.03

pH de distillat 2.4 6 / /

Volume de distillat 56ml 7ml 2.8ml Quelque gouttes

La quantité de ++++ +++ ++ +


biomasse obtenue
La formation du + ++ +++ +++++
mousse
avant
Fermen- Transparent
tation Jaune claire Violette Marron
La couleur des
milieux de
fermentation Apres
Fermen- Jaune Jaune
tation Marron Marron
fansè

Figure 2. Tableau des résultats obtenus et remarquer


1) La mousse et la couleur des milieux de fermentation :

La mousse est une ensemble des bulles de gaz d’oxygène qu’il existe dans les milieux de
fermentation .

La quantité de cette mousse est réfère à la quantité d’oxygène dans le milieu de fermentation

La couleur des milieux de fermentation est changé après la culture de la levure ce qui réfère à
la biomasse de la levure qui démine le dosage de la couleur initial des milieux .

2) La biomasse des levures :

Définition de la biomasse
La biomasse est une source d’énergie renouvelable unique puisqu’elle peut se présenter
sous forme liquide, solide, ou encore gazeuse. Dans le domaine de l'énergie, la
biomasse regroupe « la fraction biodégradable des produits, déchets et résidus provenant
de l’agriculture, y compris les substances végétales et animales, de la sylviculture et des
industries connexes ainsi que la fraction biodégradable des déchets industriels et
ménagers » [3].

Après trois semaines d’incubation la levure Saccharomyces Cerevisiae a donnée une


biomasse évolue normalement, est se développe (précipitation de la levure au fond des
bouteille)

Les observation indiquant que la quantité de biomasse dans les milieux à base du sucre est
plus élevée que celle dans les milieux à base de mélasse de betterave .

La plus grande quantité de biomasse est apportaient dans le milieu à base du sucre de
concentration 2g /200ml .
Au lieu de la consomation de 50g du sucre par 2g de la levure on a la meme quantité de
sucre (50g) sera utilisée on consomée par 6g de la levure , ce qui permet de meilleur
rendement de production de levure 2g / 200ml.
3) Production de gaz :

Aprêt la fermentation nous observons un gonflement des bouteilles ce qui montre la


production des gazes lorsque le milieu est dépourvu de dioxygène les levures utilisent la
fermentation alcoolique la première étape de la fermentation alcoolique est la même que
celle de la respiration c’est la glycolyse la molécule de glycose est donc dégradée en 2
molécules de pyruvate mais cette fois ci , les molécules de pyruvate restent dans le
cytosol ou elles vont êtres partiellement dégradées en alcool (éthanol) et en Co2 selon
l’équation : [2]

C6H12O6 2C2H5OH + 2Co2 + 2ATP


(Sucres + Levures Ethanol + gaz + Energie)
Ou par la voie aérobie : transformation du glucose en Co2 à l’aide de l’oxygène

C6H12O6 + O2 6Co2 + 6H2O + 36ATP

4) Le pH des milieux de fermentation :

Une variation dans le pH enregistrée, le pH initiale des différents milieux de fermentation , la


consommation des substrats carboné et azotés s’accompagne de la production des
métabolites acides (la fermentation de certaine acides gras ; acide citrique pendant la
fermentation) et de l’éthanol ce qui justifie la d’immolations du pH ne sont pas les mêmes
dans tous les milieux , ce dépend aux composition et la nature des milieux donc la quantité
des acides produisè n’est pas la même (d’après les résultats obtenus dans le tableau 1)

 Dans le milieu à base de mélasse de betterave :

pH final (2g/200ml) < pH final (6g/200ml)

 Dans le milieu à base du Sucre :

pH final (2g/200ml) < pH final (6g/200ml)

pH final (2g/200ml) milieu du Sucre < pH final milieu de mélasse de betterave (2g/200ml)

 La quantité des acides dans le milieu à base du sucre est plus élevée que celle dans
le milieu à base de mélasse de betterave .
5) pH de distillat :

L’éthanol distillé n’est pas pure (voir le principe de montage de distillation), donc le
distillat contient une quantité faible d’eau vaporisé (quelque gouttes) , ce qui signifie une
variation des ph des distillats dans les deux milieux à base du sucre (2g/200ml,
6g /200ml)

Le pH (2g/200ml)=4.2 < pH (6g/200ml) = 6

6) Volume de distillat :

Le volume de distillé d’éthanol (distillat) obtenue a partir les milieux à base de mélasse .

Le volume plus grande égal à 57ml dans le milieu à base du sucre et de concentration de
levure 2g / 200ml

7) Les meilleurs condition pour meilleur production de levures :

A l’aide des résultats obtenus à partir de notre travaille nous confirmes que le meilleur
milieu de fermentation pour la levure Saccharomyces Cerevisiae c’est le milieu à base du
sucre avec une faible quantité de ferment «la levure » égal à 2g donc tout processus de
fermentation est lié à la qualité du milieu de culture utilisé .

 La mélasse est un liquide visqueux contient plus de 40% de sucres c’est un résidu
non cristallisable de la fabrication du sucre, de couleur foncée et qui contient une
quantité variable de particules en suspension, il contient : éléments azotés ; sels
minéraux ; sucres ; vitamines ;……etc
 Le milieu à base du sucre (solution) contient le sucre saccharose et l’eau minéral
ajouté est constitue de éléments azotés (sils d’ammonium comme le sulfate) , des
sels minéraux ……etc
 La meilleur composition des milieux de culture de la levure Saccharomyces
Cerevisiae permet à cille de faire les voix métaboliques suivantes :
 Métabolisme oxydatif
Le métabolisme oxydatif permet la multiplication par bourgeonnement, ce
métabolisme est l’un des métabolismes les plus énergétiques, avec un rendement
cellulaire important. Il repose sur la production d’une biomasse et de dioxyde de
carbone
grâce à l’oxydation complète du glucose via les voies métaboliques de la glycolyse
(Figure. 3A), du cycle de Krebs (Figure. 3B) et de la phosphorylation oxydative.
Il nécessite la présence d’oxygène et des concentrations en limitation de substrat
mg.L-1 environ) (Sanchez, 2008). L’équation suivante présente le bilan énergétique
théorique maximal de cette voie métabolique:
C6H12O6 + 6O2 + 28 Pi + 28 ADP → 6 CO2 + 6 H2O + 28 ATP

Figure. 3: Schéma de la glycolyse (A) et du cycle de Krebs (B)


 Métabolisme fermentaire
Ce métabolisme se caractérise généralement par un ensemble de réactions qui se
produisent en absence d’oxygène comme accepteur final d’électron. Dans ces
conditions, le pouvoir cellulaire à réoxyder les coenzymes réduits (NADH et FADH2)
est fortement diminué (Fritsche, 1972). De plus dans cette situation, la biochimie
cellulaire est modifiée de telle sorte que le pyruvate est réduit en acétaldéhyde puis en
éthanol (fermentation), dont la dernière étape nécessite la présence du NADH [2]

Figure 4. Utilisation du glucose par Saccharomyces sous conditions anaérobies (fermentation)

Le bilan énergétique de la réaction est:


C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP →2 C2H6O+ 2 CO2 + 2 ATP
De plus, la formation de l'éthanol permet à la cellule de réoxyder le NADH qui a été
produit durant la glycolyse.
Cependant en condition anaérobie, le cycle de Krebs n’est pas complètement
fonctionnel, car l’activité de la succinate déshydrogénase nécessite la présence d’un
coenzyme strictement respiratoire; le FAD (Furukawa et Kimura, 1971). Par contre,
certaines enzymes du cycle de Krebs reste toujours actives (Camarasa et al., 2003). Cette
portion active du cycle de Krebs (de l’oxaloacétate au succinate) génére le NADH qui
sera réoxydé par la formation de glycérol à partir de la dihydroxyacétone. De plus,
l’acide succinique est formé non par voie oxydative mais par la voie réductrice du cycle
de Krebs en anaérobiose (Camarasa et al., 2003): oxaloacétate _ malate _ fumarate _
succinate.
 Métabolisme oxydo-réductif ou Métabolisme Respiro-fermentaire
En présence d’oxygène la levure S. cerevisiae a la particularité de présenter un
métabolisme mixte: fermentation (production fermentaire d’éthanol) et respiration
(production oxydative de biomasse).
Cependant en aérobiose, le métabolisme de la levure S. cerevisiae est purement oxydatif

lorsque l’apport en glucose est faible. Dans ces conditions, la biomasse et le CO2 sont les
seuls produits synthétisés par la levure; le rendement en biomasse est alors maximum et
égal à 0,5 g de biomasse par g de glucose (Blom et al., 2000; Flikweert et al., 1999; Van
Hoek et al., 2000). Par contre le métabolisme cellulaire devient oxydo-réductif une fois
que l’apport de glucose dépasse un certain seuil. Dans ce cas-là, les produits synthétisés

sont la biomasse, le CO2, le glycérol, l’acétate, l’éthanol et le rendement en biomasse est


fortement réduit. De plus, le NADH générée à partir de la glycolyse est réoxydé par la
production d'éthanol (fermentation) plutôt que par les voies combinées au métabolisme
oxydatif (glycolyse, cycle de Krebs et phosphorylation oxydative) (Fritsche, 1972).
Cette bascule métabolique est appelée transition respiro-fermentaire ou effet Crabtree
(Crabtree, 1929; Deken, 1966; Fiechter et Seghezzi, 1992) qui est du point de vue
oenologique très important car cet effet Crabtree permet de réaliser la fermentation en
présence d'une faible concentration d'oxygène. [4]
Certaines levures sont fortement Crabtree positives et leur production d’éthanol dépend
de la concentration en glucose; chez certaines, comme S. cerevisae, la synthèse
d’éthanol débute au-delà de 2.5 g.L-1 de glucose (Meijer et al., 1998) tandis que chez
d’autres, il faut 20 à 50 g.L-1 de glucose (Ratledge, 1991). Les levures Crabtree
négatives sont les levures pour lesquelles la présence de glucose n’arrête pas la
respiration.
Le transport du glucose est l’un des facteurs qui distinguent les levures Crabtree
positives et des Crabtree négatives (Fiechter et Seghezzi, 1992; van Urk et al., 1989). En
excès de glucose dans le milieu, le comportement des levures est différent : i) chez les
levures Crabtree positives, le transport est facilité ce qui implique un afflux important de
glucose, ii) les levures Crabtree négatives utilisent un symport-H+ pour réguler l’entrée
du glucose (Pronk et al., 1996). [2]
IV – Conclusion :

Après la comparaison entre tous les paramètres résultant qui ont été cités précédemment, le
développement du Saccharomyces Cerevisiae dans le milieu du sucre est encore meilleur
qu’avec le jus de betterave montrant clairement qu’il constitue une matière première par
excellence pour la croissance de cette levure.

 Conclusion générale :

L’utilisation de la biomasse pour produire du bioéthanol est aujourd’hui largement


répandue. Concernant la première génération, de plus en plus de pays utilisent cette
technologie, bien qu’elle soit en fin de vie à cause de sa concurrence directe avec le secteur
alimentaire. Cette première génération a été indispensable pour développer la deuxième
génération de bioéthanol. Cette dernière est plus fiable, mais reste néanmoins encore en
L’objectif du présent projet était la production de bioéthanol à partir de ressources
d’agriculture de deuxième génération qui conduit conjointement à la production de
coproduits valorisables commercialement (protéine, acides organiques, etc.)

Les levures de type S. cerevisiae utilisées dans ce travail ont été choisies pour plusieurs
raisons : la disponibilité, la croissance rapide, la résistance à certains contaminants, le
pouvoir fermentaire et surtout la capacité de consommer la plupart des sucres.

 Domaines d’utilisation du bioéthanol


Le bioéthanol peut être utilisé, sous certaines conditions, comme carburant dans les moteurs à
essence, soit de 5 à 20% dans les moteurs à essence sans modification et/ou de
85 à 100% dans des moteurs à essence spécifiquement adaptés. En outre, l’éthanol peut
être converti en divers produits de base de l’industrie chimique tels que, l’éthylène, l'éther
et l’éthyle tertio butyle (ETBE), conventionnellement, produits à partir du pétrole
est à signaler que le plastique résulte de la polymérisation de l’éthylène et de l’ETBE
mélangé à raison de 15% à l’essence, permet d’augmenter l’indice d’octane du carburant,
contrairement à l'éthanol, il ne favorise pas l'évaporation des carburants et n'absorbe pas
l'humidité de l’air [1].
Références :

[1] Fennouche . I, 2017 , Production de bioéthanol à partir de résidus d’agriculture,


Mémoire de Master, Université Badj Mokhtar, Annaba, pages

[2] Salima . M, 2013, Etude et caractérisation de l’état «Viable mais Non Cultivable» chez
Saccharomyces cerevisiae , Thèse de Doctorat, Université de Bourgogne, France, pages
22, 23,24

[3] Volle F., Les biocarburants


http://www.iutsd.univparis13.friutsd/images/Developpement_durable/F-
VOLLEBiocarburants le11/04/2017

[4] Agudo, L. del C. (1992). Lipid content of Saccharomyces cerevisiae strains with
different degrees of
Ethanol tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 37, 647–651.