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Contréle bactériologique de la qualité de Peau L’analyse bactériologique de I’eau de consommation consisterait & la recherche des micro-organismes pathogénee qu’elle peut contenir. Cette perspective est impossible a réaliser en raison du nombre important de tests a effectuer, des difficultés qu’elles présentent et de leur cotit. La grande majorité des micro-organismes pathogdnes sont éliminés par la matiére fécale ou les urines. Ainsi, estimation de leur présence en recherchant des germes fécaux qui les accompagnent est plus simple. Ces germes sont appelés alors des indicateurs de contamination fécale, ce sont des saprophytes, toujours isolés du tube digestif de l'homme ou de I’animal. Ils sont en outre plus résistants que les germes pathogénes dans l'environnement. Pour toutes ces raisons, leur mise en évidence est relativement simple, facile mettant ceuvre des techniques peu cotteuses. La flore fécale est extrémement variée, mais trois facteurs doivent étre pris en considération pour le choix d’un germe témoin de contamination fécale Sa spécificité : un germe peut étre exclusivement d'origine fécale. Sa sensibilité et son importance quantitative : 1a recherche sera d’autant plus facile que le germe sera présent en plus grande abondance dans I’intestin de l'homme et l'animal. Sa résistance : plus la bactérie est résistante, plus les chances de Pisoler seront grandes, dans le temps. La prise en considération des ces facteurs conduit a faire lee recherches suivantes : 1. Dénombrement des germes totaux. 2. Recherche et dénombrement des coliformes fécaux. 3. Recherche et dénombrement des Streptocoques fécaux 4- Recherche et dénombrement des Clostridium sulfuto-réducteurs. 5. Recherche des bactériophages. Amalyse de Peau: Préliévement : L’échantillon qui doit étre soumis a analyse sera prélevé soigneusement dans un récipient stérile dans des conditions d’asepsie rigoureuse et de telle sorte qu’il soit représentatif de I’ean a analyser. L’analyse devra suivre rapidement le prélévement ( au maximum 8h) de I’échantillon qui sera toujours transports et stocké an froid a+ 4°C. 1-Dénombrement de la flore aerobic mésophile totale (FTAM) : Il s’agit de micro-organismes se développent bien sur milieu ordinaire ce qui exclut un nombre important de germes : bactéries filamenteuses, bactéries sulfureuses, des germes anaerobies stricts.... Etc. Cependant la grande majorité de la flore banale et pathogene pourra se développer. La technique consiste simplement a incorporer une quantits d’eau connue ou ses dilutions sur un milion gélosé (GN, PCA). Deux séries de boites de Petri (expérience en double pour chaque dilution) sont onsemencées. On incube a la température 20-22 °C durant 72 h pour les germes saprophytes et 37°C pour les germes pathogénes. Répétée dans le temps, cette technique quantitative renseigne sur 1évolution du nombre de micro- organismes dans une nappe et par voie de conséquence sur le degré de protection que lui confére son site géologique : la constance du nombre de germes indique que la nappe évolue peu et qu’elle est relativement protégée des contaminations. Au contraire, de grandes variations sont un signe de fragilité de la protection en méme temps que les signes dune contamination. 2-Recherche et dénombrement des coliformes fécaux Selon Organisation Internationale de Normalisation ({S.0), les coliformes sont des bacilles Gram négatif, non sporulés, oxydase négative, aérobies anaerobies facultatif, capables de se multiplier en présence de sels biliaires ou d'autres agents ayant de propriétés analogues, capables de fermenter le lactose avec production d’acides et de gaz en 48 h A des températures de 30 435°C. On appelle coliformes fécaux, les coliformes résidents du tube digestif de ’homme et l’animal. Ce sont des thermotolérants capables de se développer 444°C, cette catégorie inclut exclusivement E. coli. 1- les techniques sur milieux liquides : Le test original de mise en évidence des coliformes supporte le test de présomption, de confirmation et de démonstration (figure) L’étape présomptive : Elle est exécutée an moyen de tubes inoculés par trois volumes différents d’échantillon pour donner une estimation du nombre Ie plus probable (NPP) de coliformes dans l’eau. Le milieu utilisé est un bouillon lactosé (au pourpre de bromocresol BCPL) munis de cloche de Durhan pour la mise en évidence de la production de gaz, aprés 24 & 48 h d’incubation a une température de 30 a 35°C. Ls tubes oit le Iactose est fermenté (virage de couleur du blow au jaune) avec production de gaz sont retenus. Ils contiennent éventuellement des coliformes (test présomptif) Raq: sily a virage de 'indicateur sans production de gaz le résultat est considéré comme négatif. Le nombre de coliformes est évalué en se roportant aux tables de Mac Grady pour calculer indice NPP. Les résultas de cette culture doivent étre confirmer car il existe de fansses réactions dues a la fermentation du lactose par d’autres bactéries, autre que les coliformes (Bacillus , Clostridium). Le test confirmatif : La confirmation des coliformes est réalisée a partir des bouillons lactosés positifs par subculture a une température de 35 a 37°C sur un milicu plus spécifique (bouillon lactosé a la bile et au vert brillant BLBVB) munis de cloche. La croissance avec dégagement de gaz constitue une confirmation. ‘Malheureusement, les coliformes comprennent une large gamme de bactéries dont la source principale peut ne pas étre le systme intestinal. Pour faire face @ cette difficulté, plusieurs techniques ont été développé permettant de vérifier la présence des coliformes fécaux dans "eau. © L ——— Echantillon d'eau Inoculation de 1S tubes : S avec 10m d°échantillon, $ avec 1,0m ¢’échantillon et $ avec 0,1 ml d°échantillon CTE Tie yy PT Ta Bouillon en concentration double Bouillon en concentration normale Sernr moa VNU VV 10 10 19 10 10 10 10 10 10 10 01 01 ol o1 of a) (a) (ab Bouillon lactosé ou lauryl tryptose Présomptif négatit. <— om —>' Aprés 24h dincubation Liabsence de gaz dans 30 a35°c les tubes de bouillon lactose les tubes de bouillon traduit Sont examiner pour vrifier Pabsence de coliformes. | ‘La production de gaz WY sean a. ‘Aucun gaz produit. Le groupe coliform est absent ] Toutes les cultures présomptives Positives sont ilisées pour inoculer des tubes de bouillon lacos¢ & la bile et au vert brillant. Incubation 8 30~35*C pendant | aa 48h Test posit: production de gaz | utiliser fes tubes confirmatits posits pourtad | J determiner le nombre le NEP. Negauf 7S Posiif Bouillon lactosé Les boites de milieu gélosé EMB @labileet au sont striées partir des tubes positifs vert brillant @: incuber & 35°C pendant 24h | a sprint, Gram — nonsporulants et produisent de gaz & partir du lactose Le test démonstrat La chatinwattantd> 1a présence des coliformes teat) est réalisée a partir des miliewx présomptifi ou confirmatifS ( BCPL ou BLBVB), par subculture ef isolement sur un milieu solide sélectif pour les Entérobactéries, par exemple une gélose lactosée EMB. On incube a une température de 30 a 35 °C pendant 24 h. ‘La mise en évidence et le dénombrement d’E. coli peuvent ére effectuer a partir des tubes positifs (présomptif ou confirmatif)par le test de Mackenzi : ensemencement d’une eau peptonée et d’un tube de BLBVB avec cloche et incubation a 44 +- 0,5°C pendant 48 h. la production d’indole sur une eau Peptonée et la culture avec production de gaz sur BLBVB caractérisent £. coli. Cos techniques de recherche et dénombrement des coliformes sur milieux liquides, sont rigoureuses et précises mais elles sont longues et nécessitent un matériel important et un personnel de qualité. On tend les remplacer actuellement par des techniques plus simples et plus spécifiques. 2-Les techniques sur membrane filtrante : L’eau est filtrée a Paide d’appareils spéciaux (figure) de conception simple, a travers une membrane ou un filtre moléculaire en cellulose ou acétate de cellulose. Les germes en suspension dans I’eau sont retenus sur la membrane. Celle ci, déposée sur un milieu approprié, permettra aux bactéries de puiser a travers la membrane les substrats nutritifS nécessaires @ leur croissance et de former des colonies. Pour les coliformes, deux membranes sont utilisées Pune est incubée pendant 24 h a 37 °C (coliformes totaux), I’autre est incubé pendant 24h a 44 °C (coliformes thermotolérants). Ce procédé a I’avantage d’étre extrémement rapide tout en étant rigoureux et simple. Il est spécialement indiqué dans le contrOle des eaux de distribution qui sont habituellement peu souillées plutét que dans Panalyse des eaux de qualité bactériologique inconnue qui sont susceptibles de contenir un nombre élevé de germes. 3-Recherche et dénombrement des Streptocoques fécaux : du point de vue physiologique les Streptocoques sont regroupés en deux entités ( enterocoques et non ‘enterocoques), Les enterocoques sont trés résistants, généralement résidents du tube digestif (il existe des enterocoques @'habitat non fécal). Les Streptocoques fécaux sont les Streptocoques classés dans le groupe sérologique D de Lancefield : Streptococcus fecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus durans, Streptococcus bovis, ‘Streptococcus equinus. IIs sont caractérisés par leur aptitude & cultiver dans des conditions hostiles de croissance. Ils supportent, la présence d’agents chimiques inhibiteurs comme le téllurite de potassium, Pazothydrate de sodium ou I’éthylviolet. Leur recherche met a profit cette propriété. Dans des milieux contenant de P’azothydrate de sodium et éventuellement de I’ éthyiviloet (milieu de Rhote et de Litsky), ils se multiplieront seuls tandis que les autres micro-organismes qui les accompagnent sera totalement inhibs. Comme pour les coliformes, le dénombrement des Streptocoques fécaux est basé sur la succession de deux milieux liquides : présomptif et confirmatif. Test présomptif : La numération présomptive est réalisée l'aide de milieu a l’azide (milieu de Rothe): cing tubes a double concentration sont ensemencés avec 10 ml d’eau, 2 tubes a simple concentration avec 1 ml d’eau et 1 tube de milieu & simple concentration avec 1 mi de chaque dilution. Aprés une culture pendant 48h 37 °C, les tubes positife (présentent un trouble) sont présumés contenir un enterocoque. Test confirmatif : La confirmation est réalisée par une subculture pendant 24 a 48 ha 37 °C sur milieu de Litsky. Une culture positive avec éventuellement apparition dune pastille violette traduit la présence d’enterocoque. Les streptocoques fécaux constituent des indicateurs trés fiables d’une pollution ancienne : sont plus résistants que les coliformes fécaux. Ils ont une relative spécificité d’habitat : contamination humaine (Streptococcus fecalis) et contamination animale (Streptococcus bovis). 4- la recherche et le dénombrement des Clostridium sulfito-reducteurs (BSR) : les Clostridium sulfito-reducteurs, principalement Clostridium perfringens, sont des anaerobies srtictes, sporulés, hétes intestinaux du tube digestif de homme. Les Clostridium sulfito-reducteurs ont Ia propriété commune de réduire les sulfites de sodium en sulfures de fer. Le dénombrement des anaerobiessulfito-réducteurs est réalisé en tube de gélose profonde en utilisant des milieux sulfités : miliou VF (viande de foie) sulfts. Destruction des formes végétatives : L’échantillon de 250 ml d’eau a analyser est placé dans grand tube (220 x 22 mm) et porté au bain - marie 75 ou 80 °C pendant 5 10 mn, Préparation du milieu: Faire fondre de 250 ml de gélose VF au bain-marie bouillant et y maintenir pendant 10 mn. Reffoidir a 30°C environ et ajouter 2,5 mi d’alun de fer ot 6,25 ml de sulfite de sodium, Répartir dans quatre tubes stériles, 1 ml d'eau traitée précédemment, couler dans chacun deux 20 ml du milieu, mélanger doucement sans incorporer air, reftoidir et incuber &37 °C pendant 24 & 48h. On distingue aprés culture des colonies entourées d'une auréole noire par formation de sulfure de fer, cette coloration facilite leur dénombrement. Les bactéries sulfito-reductrices détectées appartionnent tres souvent & l’espéce Clostridium perfringens mais il est impossible de le conclure a priori. Le test confirmatif de la présence de Clostridium perfringens nécessite Visolement et l’identification de ce germe. 6- Recherche des bactériophages fécaux : Dans tous les milieux od végétent des bactéries, on peut rencontrer des bactériophages qui parasitent et se développent a leurs dépens. Les bactériophages fécaux étant en faible quantité pour pouvoir étre décelés directement sur V’échantillon, ce dernier est enrichi en lui inoculant, aprés addition d’un bouillon nutritif, une souche £. coli, La mise en évidence de ces bactériophages se fait on deux temps : -En premier temps, on assure leur développement dans un milieu péptoné ensemencé avec une abondance suspension d’une culture £. coli (souche sélectionnée pour sa sensibilité). On rajoute a 50 ml de bouillon nutritif, 50 mi d’ean a analyser. On mélange et on rajoute 20 gouttes “une culture jeune en eau péptonée d’E. coli (a1 moins de 9 h). Incuber 4 37 °C durant 10 h (cette étape constitue la multiplication des phages) ~ Aprés cet enrichissement éventuel, on recherche leur présence sur un milieu solide ensemencé avec la méme souche £. colt en déposant sur surface une goutte du milieu chanffé a 56 °C pendant 40 mn pour détruire les germes tout en conservant les bactériophages résistants. A I’endroit du dépdt on observera aprés 5 6 hune zone de lyse totale ou subtotale fa de présence de bactériophages. C u