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GENETIQUE MICROBIENNE

La génétique bactérienne a commencé depuis la découverte du Microscope optique, les


bactéries sont devenues un matériel de choix à cause de leur division rapide :
Escherichia coli (20 min) ou encore de leur encombrement "limité"
I- Mise en évidence de l’information génétique chez les procaryotes
Expérience de Griffith (1928)

Les travaux ont porté sur Streptococcus pneumoniae murinum, des diplocoques
déclenchant la pneumonie chez la souris.

Exp de Avery, Mac Leod et Mac Carthy(1944)


1. Introduction
• La génétique microbienne a pour objet l’étude des micro-organismes à savoir
les gènes, leurs variations génotypiques et de leurs expressions
phénotypiques.
• La nature d’une cellule et toutes ses activités, proviennent d’instructions
présentes dans la cellule sous la forme d’une information génétique.
• L’information génétique s’explique sous forme de caractères dont l’ensemble
constitue le phénotype
• Chez les bactéries comme chez la plupart des êtres vivants, cette information
est inscrite dans la structure d’une molécule qui est l’acide
désoxyribonucléique (ADN) qui forme le chromosome de la cellule.
• L’ADN et l’acide ribonucléique ARN sont des macromolécules classées dans
la catégorie des acides nucléiques. Ces deux molécules jouent un grand rôle
en génétique.
2. Localisation de l’information héréditaire
le génome de la très grande majorité des bactéries est contenu sur un chromosome
unique circulaire , il occupe un territoire cytoplasmique constituant le nucléoïde). Il
est structuré en super-hélice, comportant 50 lobes chez Escherichia coli et est relié à
la membrane plasmique au moins par 20 points d’attache
Parfois, les bactéries possèdent d’autres molécules d’ADN qui portent des
informations nécessaires à la survie dans les conditions environnementales
particulières. Ces molécules appelées plasmides sont chimiquement identiques à
l’ADN chromosomique
3. Structure chimique des acides nucléiques
ce sont des polymères formés d’unités élémentaires appelés nucléotides qui sont
eux mêmes constitués de trois composants : un sucre à 5 atomes de carbone, une
base azotée et un ou plusieurs résidus phosphates.

v les nucléotides dont le sucre est le ribose sont dits : ribonucléotides et si c’est du
désoxyribose ce sont des désoxyribonucléotides.

v les bases de l’ADN sont : adénine-guanine-cytosine-thymine.

v les bases de l’ARN sont : adénine-guanine-cytosine-uracile


4. Structure de l’ADN
Dans l’ADN, les nucléotides forment une chaine non ramifiée (brin). Il faut noter que
ce brin présente une polarité : il ya une extrémité 5’ et une extrémité 3’. L’ADN est
habituellement fait de deux brins maintenus ensemble par des liaisons hydrogène qui
s’établissent entre leurs bases azotées. Cette structure double-brin (bicaténaire)
s’appelle un duplex. Notez que dans un duplex, les deux brins sont antiparallèles ;
c’est-à-dire que quand on les lit de gauche à droite, l’un des brins va de 5’ en 3’,
tandis que l’autre va de 3’ en 5’.

Le chauffage permet de les séparer en brins monocaténaires (dénaturation ou


fusion), cette séparation est réversible (renaturation ou hybridation)

L’ADN super-enroulé, qui existe naturellement, est en général « sous-enroulé »


(c'est-à-dire super-enroulé négativement). Le degré de super-enroulement est sous
le contrôle d’enzymes appelées topoisomérases.

5. Propriétés de l’ADN

 Spécifité
Chaque « espèce » renferme une quantité déterminée d’ADN, le bactériophage T4,
2.10-4 pg (pg = picogramme ; 1 pg = 10-12 g), la bactérie Escherichia coli, 4. 10-3 pg,
la levure Saccharomyces cerevisiae, 5. 10-2 pg… Plus un micro-organisme est
complexe, plus la quantité est importante mais il existe des répétitions possibles ou
redondances.

Cette molécule détient une information codée, élaborée à partir d’un « alphabet » à
quatre lettres, A, G, C, et T. L’ordre des bases constitue le fondement de
l’information, comme c’est le cas pour les mots français par exemple, constitués de
mêmes lettres (arme, mare, rame…) mais de sens différent. Le gène (unité
informative) est constitué en moyenne de 103 pb (paires de bases).

 Stabilité
L’ADN est très stable biochimiquement. La molécule résiste de manière
exceptionnelle à une augmentation de température. Si les protéines sont en général
dénaturées à partir de 60° C, il faut atteindre prés de 90° C pour que le duplex se
sépare en ses deux simplex par rupture des liaisons hydrogène. Si la température
redescend très progressivement, il y a réappariement spontané qui reconstitue la
molécule de départ. Cette propriété est d’ailleurs utilisée en biotechnologie.

 Réparé/non renouvellé
Toutefois, dans la cellule, elle est non renouvelée. Or, elle est soumise à de
nombreuses agressions physicochimiques en provenance en particulier du milieu
environnant. Des systèmes performants existent qui permettent en permanence de
réparer les lésions occasionnées. Ils expliquent la très grande stabilité de la
molécule. Ainsi, cette molécule absorbe fortement les ultra-violets solaires. Cette
absorption entraine la formation de dimères anormaux de pyrimidines successives au
sein d’un simplex. Ces dimères bloquent toute synthèse d’ARN et même la
réplication de l’ADN. Chez E.coli et les levures existe une enzyme, la photolyase, qui
rompt ces liaisons. Par ailleurs, les UV déclenchent la perte de purines, qui
entrainerait une perturbation considérable du génome.

 Antiparallèle et polaire
Les deux chaines sont dites complémentaires, d’autre part, elle sont orientées en
sens inverse c’est à dire que l’extrimité phophorylée de l’une fait face à l’éxtrimité
hydroxylée de l’autre, elles sont dites alors anti parallèles

6. Mécanisme de la réplication
Chez les bactéries, la réplication démarre dans chaque bactérie fille, dés la fin de la
division. L’agent responsable de cette réplication est l’ADN polymérase (appelée
ADN polymérase III) ; l’intervention d’un grand complexe protéique, le réplicateur ou
réplisome permet son fonctionnement.

L’expérience de Cairns sur E. coli a montré que cette réplication démarre en


un site précis appelé site d’initiation (oriC). Il se produit une « fusion » localisée
(c’est-à-dire une séparation des brins d’ADN) dans une partie adjacente d’oriC .
Après initiation, il y a deux emplacements où l’ADN duplex se sépare en deux
simplex : ce sont les fourches de réplication. L’ensemble de la structure constitue un
œil de réplication ou réplicon. Dans cette région désappariée, les brins d’ADN
séparés peuvent être stabilisés par liaison à ce qu’on appelle les protéines liant
l’ADN simple-brin ou protéines SSB, pour « single-strand-binding ». Elles évitent
sans doute des replis et permettent une exposition correcte de bases azotées. Elles
favorisent l’ouverture de la double hélice et protègent le simplex de l’action
d’enzymes nucléolytiques .
La machinerie est complexe car l’ADN polymérase ne peut pas coulisser sur un
simple brin pour en assurer la lecture et la réplication ; elle doit impérativement
s’associer à un duplex. En fait, l’initiation de la nouvelle chaine simplex est possible
grâce au fonctionnement d’une ARN primase qui construit tout d’abord au site
d’initiation, face à chaque simplex d’ADN, une amorce d’ARN d’une dizaine de
nucléotides. Ainsi les ribonucléotides sont polymérisés (reliés covalentiellement l’un à
l’autre) enzymatiquement, dans la direction 5’- 3’, pour former un brin d’un court
duplex hybride ARN/ADN. Une amorce d’ARN est nécessaire au démarrage du
processus parce qu’aucune ADN polymérase ne peut initier un brin - mais peut
seulement prolonger un brin existant.

Au fur et à mesure que les brins se séparent, de nouvelles bases sont exposées et
s’apparient avec des molécules de désoxyribonucléoside triphosphate. L’amorce est
ainsi prolongée dans la direction 5’- 3’, par un brin d’ADN neuf. Un simplex est donc
fabriqué en continu, c’est le brin meneur ou avancé.

Cependant, parce que les brins d’un duplex sont antiparallèles et parce que l’ADN ne
peut être synthétisé que dans le sens 5’- 3’, l’autre brin d’ADN est synthétisé sous
forme d’une série de courts fragments:les fragments d’Okazaki. Chacun de ces
fragments d’Okazaki est long d’environ 2000 bases. Régulièrement, les fragments
d’Okazaki sont réunis entre eux, ce qui donne une portion de simplex plus grande.
Ce brin est appelébrin suiveur ou retardé

Enfin, les deux fourches de réplication se rencontrent au site ter (terminaison) du


chromosome, à 180° d’oriC (origine de la réplication). Avant l’achèvement de la
réplication, toutes les amorces sont remplacées par de l’ADN. La réplication donne
deux duplex super-enroulés qui, initialement, se trouvent unis à la manière des
maillons d’une chaine.

Par ailleurs, une topoisomérase intervient en fin de réplication pour séparer les deux
molécules filles. Toutes ces molécules, topoisomérases, hélicase, primosome, SSB-
proteine, ADN polymérase III, sont étroitement associées en un grand complexe, le
réplicateur

7. Mutations et mécanismes de réparation de l’ADN


Mutations

Chez les bactéries, une mutation est un changement stable, héréditaire dans la
séquence des nucléotides de l’ADN. Il s’agit d’une modification brutale d’une base
azotée, de plusieurs nucléotides voire d’une grande partie du chromosome. La
transcription d’un ADN modifié produit un ARN modifié, et un ARNm modifié peut
coder pour un polypeptide différent, doté d’une activité biologique différente.

Contrairement aux eucaryotes, les procaryotes sont haploïdes. Tous les gènes
s’expriment à un moment déterminé. La mutation apparait donc d’emblée dans le
phénotype, de manière plus ou moins directe. Ainsi, lors de repiquages sur milieu de
culture de pneumocoques S encapsulés, il peut apparaitre quelques colonies
rugueuses (R) caractéristiques de cellules qui ont perdu leur capsule de façon
héréditaire. C’est une mutation.
7.1. Caractères des mutations
• Spontanéité
• Rareté La mutation est un phénomène rare qui n’affecte qu’une faible
proportion de l’ensemble de la population bactérienne
• Stabilité: Le caractère acquis est alors transmissible à la descendance, donc
héréditaire La stabilité n’exclut cependant pas la réversibilité de la mutation.
• Brusque: La mutation s’effectue habituellement en une seule étape (loi du tout
ou rien).
• Indépendance et spécificité: La mutation n’affecte habituellement qu’un seul
caractère. La mutation d’un caractère donné ne modifie pas la probabilité de
mutation d’un autre caractère
7.2. Taux de mutation
• Il se définit comme le nombre de mutations survenues pour un gène donné au
cours d’un cycle cellulaire
• Probabilité d’apparition d’une mutation dans un intervalle de temps
correspondant à une génération
• Ne pas confondre avec le taux de mutants
• Il varie entre 10-3 et 10-20 selon le caractère considéré et la bactérie.
7.3. Origine de la mutation
7.3.1. Les mutations spontanées:

Une mutation spontanée résulte d’un processus naturel dans des conditions
normales, ce sont principalement des erreurs de réplication ou de réparation
7.3.2. Les mutations induites:

Résultent d’une interaction provoquée entre l’ADN et un agent extérieur ou


mutagène
 Les mutagènes physiques

La chaleur engendre des réactions d’hydrolyse des bases, surtout des purines,
aboutissant à des sites AP ou des sites apuriniques (sans purines).

Les rayonnements sont aussi à l’origine de certaines lésions qui affectent la


molécule d’ADN :

*les rayons X en interagissant avec l’ADN donnent naissance à des radicaux libres
(molécules d’oxygène réactives) qui peuvent rompre la double hélice.
*les rayons UV sont à l’origine de mutations résultant de liaisons anormales
(covalentes) entre les bases de pyrimidines voisines ou adjacentes (sur le même
brin), comme les dimères de thymine.
 Les mutagènes chimiques
• Les analogues de base:

Des substances, comme le 5-bromouracile sous une forme cétonique, peuvent


prendre la place d’une base azotée normale, ici la thymine en s’associant avec
l’adénine du brin matrice. Dans ce cas la forme cétonique peut se transformer
spontanément en forme énol et devient capable de se lier à de la guanine. À la
réplication suivante, la guanine se lie à de la cytosine dans le nouveau brin, la
mutation est alors stable
• Agents intercalants:

ces agents sont des molécules planes qui s’intercalent entre les bases créant des
déformations qui peuvent causer des délétions ou insertions aboutissant à des
décalages du cadre de lecture. C’est le cas de l’acridine orange, du bromure
d’éthidium, et de l’actinomycine D.
• Désamination:

ce sont des agents qui agissent en modifiant chimiquement une des bases de l’ADN.
Ils provoquent une désamination oxydative dans laquelle les groupes amino sont
convertis en groupes cétoniques ; les résidus cytosine sont ainsi convertis en
5méthyl cytosine (uracile) qui s’apparie à l’adénine plutôt que la guanine.
7.4. Types de mutation

Elles peuvent être ponctuelles, en modifiant une seul base. Il s’agit alors d’une
substitution, remplacement d’une base par une autre. On distingue

latransition s’il s’agit du même type de base, pyrimidique ou purique, la transvertion


si une base d’un type est remplacée par une base de l’autre type.

Ce peut être :

unedélétion s’il y a perte d’une base,

uneinsertion s’il y a ajout d’une base. Il y a alors décalage du cadre de lecture ce qui
modifie tous les codons situés en aval.

Une inversion s’il ya échange au sein du simplex de deux bases (G-T donnant T-G).
Cela conduit souvent à la perte de l’activité du gène et à l’auxotrophie

Elles peuvent être larges, on parle de translocation lors de la perte d’un fragment de
gène puis sa réintégration à un autre endroit, ça peut être une délétion, insertion ou
duplication
• Les mutations non-sens sont facilement détectées. Un codon est remplacé par
un codon STOP et la synthèse de la protéine est tronquée. Elle devient en
général non fonctionnelle.
• Le site muté peut être à nouveau affecté, avec retour au triplet initial. C’est
+ -
une mutation réverse, plus rare. Par exemple, la mutation His → His (perte
-
de la faculté de synthétiser l’histidine) peut être suivie de la mutation His →
+
His .
7.5. Conséquences de la mutation
Les mutations peuvent entrainer la modification des produits de l’expression de
l’information génétique. En effet, un codon peut être transformé en un autre, codant
un acide aminé différent de l’originel. C’est une mutation contresens, qui peut
entrainer une perturbation dans le fonctionnement de la protéine.

Par ailleurs, la mutation peut ne pas entrainer de changement d’acide aminé : on


parle alors de mutation silencieuse. L’acide aminé « nouveau » présente parfois des
propriétés voisines de l’ancien. On parle de substitution neutre. L’acide aminé modifié
peut enfin appartenir à un domaine de la protéine qui intervient peu dans le rôle de
celle-ci et la mutation n’a alors pas d’effet visible.
Mécanismes de la réparation de l’ADN

Les mécanismes de réparation de l’ADN regroupent un ensemble de phénomènes


que toute cellule (eucaryote ou procaryote) met en œuvre pour identifier
(reconnaitre) et corriger les dommages de son ADN génomique. La faible fréquence
de mutations spontanées est indicative de l'efficacité de ces systèmes réparations.

o Réparation par photoréactivation des photodimères pyrimidiques

Le photodimère Pyrimidine cyclobutane peut être réparé


par une photolyase. L'enzyme se lie à la photodimère et
coupe les liaisons covalentes entre lesbases adjacentes,
en présence de certaines longueurs d'onde de la lumière
visible, pour régénérer les bases d'origine. Ce mécanisme
est aussi appelé photoréparation ou photoréactivation car
la photolyase ne peut pas fonctionner dans l'obscurité, et
ainsi d'autres voies de réparation sont nécessaires pour
éliminer les dommages dus aux UV en l'absence de
lumière visible, mais aussi les lésions plus importantes.
o Réparation par excision de base (BER)

Mécanisme de réparation d’un dommage au niveau d’une base individuelle de l’ADN.


Un tel dommage est réparé par simple élimination de la base, suivi du clivage du
désoxyribose, puis d’une nouvelle synthèse.

Une ADNglycosylase élimine la base endommagée et une endonucléase clive le


désoxyribose. Une ADNpolymérase remplit à nouveau l’espace libéré en utilisant la
base opposée comme matrice. Enfin, une ADNligase suture le brin réparé

o Réparation par excision de nucléotide (NER)

Il y aurait plus de dommages que de glycosylases. Plutôt que de reconnaître une


base particulière endommagée, le système NER détecte les déformations de la
double hélice provoquées par la pression d'une base anormale

Chez E. coli, ce complexe est composé de trois activités enzymatiques codées par
les gènes uvrABC, détecte la déformation et coupe la partie endommagée dans deux
sites de part et d’autre de la lésion. l’écart est ensuite comblé par l'ADN polymerase
I, en utilisant le brin matrice pour produire une copie exacte de la séquence d'ADN
d'origine. L’ADN ligase scelle alors le nouvel oligonucléotide .
o Réparation des mésappariements (système MMR)
Cette réparation survient après le passage de la fourche de réplication, où le brin
d’ADN nouveau est apparié au brin parental par une exacte complémentarité. Si un
défaut survient, le système Mut doit être capable de reconnaitre le nouveau et
l’ancien. Les deux brins sont distingués par le système Dam. Il est fondé sur la
présence de nombreux motifs GATC, échelonnés le long de l’ADN. Cette petite
séquence est symétrique. Elle est la cible d’une méthylase, codée par le gène dam,
qui méthyle l’adénine à ces positions. Par ailleurs, le passage de la fourche de
réplication fait apparaitre des motifs dam nouveaux, qui n’ont pas encore eu le temps
de se faire méthyler. Ils le seront au bout de quelques minutes mais la présence
d’adénine non méthylée est un signal qui veut dire que la réplication vient d’avoir lieu
à cet endroit. C’est donc un motif de reconnaissance à MutS pour distinguer le brin
nouveau du brin parental.

MutS est le détecteur. Elle a une affinité naturelle pour l’ADN, mais cette affinité
devient 20 fois plus forte quand elle rencontre un défaut qui se traduit par une
déformation de la double hélice d’ADN. La liaison de MutS avec une anomalie sur
l’ADN localement tordu déclencherait un changement conformationnel autorisant la
liaison avec l’ATP. Une protéine partenaire qui est elle-même une ATPase, MutL,
serait alors activée en venant s’accoler à MutS et stabiliserait son attachement à
l’ADN. Elle coulisse sur sa longueur, tout en hydrolysant de l’ATP. Elle est
accompagnée du troisième larron, MutH. Le complexe formé, MutS-MutL-MutH se
déplacerait dans un sens ou dans l’autre, jusqu’à rencontrer une séquence GATC
dont il a été question plus haut. Si le site contient un GATC non méthylé, celui-ci est
coupé par ‘endonucléase H. D’autres protéines vont alors parachever le travail. Une
hélicase débobine l’ADN coupé sur un brin, en direction de la zone malade, des
exonucléases décapent toute cette partie et même un peu au-delà. Une nouvelle
synthèse réparatrice par la polymérase III a lieu, et la ligase fait la soudure.

8. La recombinaison

Par « recombinaison », on entend le réarrangement d’une ou de plusieurs molécules


d’acides nucléiques : les molécules peuvent, par exemple, s’associer, séparer ou
échanger leurs brins, une séquence au sein d’une molécule peut être perdue ou
inversée, etc.

Les mécanismes de recombinaison peuvent être classés en :


• Recombinaison homologue : lorsque cette recombinaison implique la réaction
entre des séquences homologues de l’ADN
• Recombinaison transpositionnelle : transposition-insertion enzymatique d'un
transposon dans un nouvel emplacement dans le génome.
• Recombinaison spécifique de site : insertion de phages entre deux sites de
recombinaison spécifique.

8.1. La recombinaison homologue

La recombinaison homologue implique généralement un échange de brins entre


deux duplex. Ceci ne peut se produire que si une longue séquence de nucléotides
dans l’un des deux duplex est très similaire à une séquence de l’autre duplex ;
autrement dit, les deux séquences doivent présenter de grandes régions
d’homologie. Il faut aussi que se forment une ou plusieurs coupures ou brèches

La juxtaposition des deux brins homologues produit un hétéroduplex (ADN double-


brin, qui contient une ou plusieurs bases mésappariées). Ce dernier est ensuite
prolongé par continuation de l’échange de brins, ou par synthèse. L’hétéroduplex
peut être corrigé par le système de réparation des mésappariements utilisant l’un ou
l’autre des brins comme matrice.

La recombinaison homologue s’observe, par exemple, lors de l’interaction plasmide –


chromosome.
o Modèle de holliday
Les deux duplex d'ADN homologues sont juxtaposées de sorte que leurs séquences
sont alignées. Ce processus d’appariement des chromosomes est appelé synapse.

*Il avait suggéré que la recombinaison commence avec l'introduction de coupures


simple brin dans l'ADN au niveau des sites homologues sur les deux chromosomes
appariés

*L’ouverture d’une brèche dans un brin de DNA et le déroulement de la double hélice


permet à des fragments de DNA simple brin de s’hybrider de façon anormale.

*L’existence de séquences homologues sur l’autre chromosome de la même paire


peut conduire ce brin libre à s’hybrider avec la séquence complémentaire du
chromosome homologue. Dans ce cas les brèches au bout des deux brins échangés
peuvent être refermées par la DNA ligase .

Une telle structure avec entrecroisement de brins de deux DNA homologues est
appelée Jonction de Holliday.

*Cette structure est mobile et l’échange peut se propager par glissement de la


structure le long des deux hélices en allant dans le même sens.

*La structure de Holliday est représentée par des hélices en croix après
isomérisation (rotation de la moitié de la molécule de 180° ou demi-chiasma) les
hélices seront résolues de deux façons :
Lorsque la coupure se fait « est- ouest »: un échange de fragment de DNA entre les
deux chromosomes est obtenu,

Alors que la coupure « nord- sud »: un échange complet des DNA des deux
chromosomes s’effectue au delà du point de croisement

8.2. Recombinaison spécialisée (transposition)

La transposition est le transfert d’un petit morceau spécialisé d’ADN d’un site à un
autre dans le même duplex, à un site dans un duplex différent de la même cellule,
ou à un duplex dans une autre cellule. Le « petit morceau spécialisé d’ADN »
s’appelle un élément transposable (« gène sauteur »). Les éléments transposables
se trouvent dans les chromosomes bactériens, dans l’ADN des bactériophages et
dans les plasmides.

Les deux principaux types d’éléments transposables sont la séquence d’insertion et


le transposon. Chacun code pour une ou des protéines nécessaires à la
transposition, dont une transposase.

Chez les bactéries, les éléments transposables sont caractérisés par des extrémités
répétées inversées courtes (de 20 bases pour la séquence d’insertion à plus de 1000
pour certains transposons). Voici un exemple de ces séquences répétées inverses :

5’-CTGACTA……..TAGTCAG-3’

3’-GACTGAT……..ATCAGTC-5’
8.2.1. Les transposons de classe I

Les transposons de classe I consistent en une paire de séquences d’insertion (qui ne


sont pas nécessairement identiques) encadrant la séquence de gènes (6). Ils sont
appelés quelquefois transposons complexes ou composites. Des exemples
classiques sont : Tn5, Tn9, Tn10, Tn903. Le transposon Tn10, par exemple,
transporte des gènes de résistance aux tétracyclines, à la bléomycine, à la
néomycine, et plusieurs cadres de lecture de gènes bactériens impliqués dans le
métabolisme des acides aminés. Ces unités et celles du même type sont mobiles par
transposition conservatrice (non réplicative).

8.2.2. Transposons de classe II (non composite)

Les éléments non composites codent pour une transposase et pour des protéines
accessoires à la transposition, ils ne contiennent pas d’IS mais des séquences
répétées inversées (ITR), parmi les éléments non composites, les plus étudiés sont
les transposons bactériens tn3 et tn7, ces éléments subissent une transposition
réplicative
La transposition est le mécanisme capable de générer le plus de diversité. Il n’y a en
effet aucune similitude de séquence entre les sites échangés. Les réarrangements
provoqués auront donc un très fort caractère aléatoire. Deux processus sont
possibles. Il s’agit de la transposition conservatoire durant laquelle l’élément est
excisé puis déplacé à son nouveau site, et de la transposition réplicative où il y a
réplication de l’élément restant en place, la copie étant insérée à un nouveau site

Une séquence d’insertion consiste en une paire de séquences répétées inverses


encadrant les gènes de transposition

Dans la transposition conservative, l'ADN donneur perd son transposon. en


revanche, après la transposition réplicative, le donneur et le receveur possèdent une
copie du transposon chacun.
8.2.3. Transposition non réplicative (couper-coller)

Les deux brins d’ADN sont coupés de façon à libérer le transposon sous une forme
linéaire, l’intégration du transposon dans sa cible est initiée par l’attaque nucléophile
des extrémités 3’OH libres, générant des extrémités 5’ sortantes. Après insertion du
transposon les séquences d’ADN simple brin flanquant l’élément inséré sont réparés
par réplication

8.2.4. Transposition réplicative (copier-coller)


Seule l’extrémité 3’ du transposon est coupée sur chaque brin, comme
précédemment, ces extrémités 3’OH attaquent et clivent le site cible en générant des
extrémités 5’ sortantes, les extrémités 3’ du transposon se lient à ces extrémités 5’ de
la cible, la structure ainsi formée subit une réplication semi conservatrice à partir des
extrémités 3’ de la cible, il en résulte un co-intégrat dont la résolution par la résolvase
(codée par le transposon)aboutit à la libération de deux molécules portant chacune
une copie de l’élément transposable

8.3. Recombinaison spécifique de site (RSS)


À l’inverse de la transposition ou de la recombinaison homologue, la RSS est
conservative puisqu’elle n’engendre ni synthèse ni dégradation des fragments d’ADN
impliqués. Le premier processus biologique identifié pour cette voie de
recombinaison a été l’intégration du bactériophage lambda dans le chromosome d’E.
coli, dès les années 60. C’est à ce jour un des mécanismes de recombinaison les
plus étudié tant in vivo qu’in vitro.

L’intégration nécessite que la recombinase réunisse dans l’espace deux sites de


recombinaison, les maintienne dans une synapse catalytique, et procède à
l’événement de recombinaison entre les deux partenaires

Dans ce type de recombinaison, l’échange génétique a lieu au niveau de courte


région d’ADN homologue (plus de 25 nucléotides) qui sont reconnues par une
enzyme spéciales de recombinaison (recombinase). Selon les cas, ces courtes
régions de recombinaison sont présentes sur les deux molécules d’ADN impliquées
ou sur une seul des deux.

Le phage lambda, existe sous deux états chez son hôte bactérien: lytique et
lysogène, dans l’état lytique, l’ADN du phage est sous forme circulaire indépendante
du génome bactérien, dans l’état lysogène, l’ADN est intégré au chromosome
bactérien, la transition entre ces deux états repose sur des évènements de
recombinaison spécifique de site, ainsi l’intégration ou l’excision ont lieu au niveau de
sites spécifiques, appelés « sites de fixation » (att)

 Intégrons
Segments d’ADN spécialisés, permettant l’expression de gènes sous forme de
cassettes ,pas de système; ni de réplication ni de transposition

Ce sont des éléments génétiques qui peuvent capturer des gènes d’une autre
source. Ils expriment une enzyme, intégrase qui permet de repérer dans le génome
des gènes non fonctionnels (gènes cassettes) et de les intégrer. Les cassettes sont
des éléments mobiles capables d‟être intégrées ou excisées par un mécanisme de
recombinaison spécifique de site médié par une intégrase présente sur l‟intégron
9. Transfert horizontal de gènes

les cellules de micro-organismes ne sont pas des boites étanches à tout échange
d’information génétique. Elles ont le pouvoir fantastique de modifier leur patrimoine
génétique par l’accueil de nouveaux réplicons qui peuvent s’intégrer par
recombinaison au chromosome ou se laisser propager comme unités indépendantes
9.1. Conjugaison bactérienne

Il s’agit d’un transfert du matériel génétique de cellule à cellule, sans libération dans
le milieu extérieur. Il exige un contact plus ou moins prolongé des deux cellules
impliquées.

Le contact entre les deux souches est indispensable. La confirmation est fournie par
des clichés pris au microscope électronique, montrant la liaison de bactéries en
couples, par un pont cytoplasmique.

Le transfert du facteur sexuel qui est à sens unique, est le premier plasmide connu.
L'information génétique qu'il porte code pour la biosynthèse de pili sexuels, pour son
insertion possible dans le chromosome bactérien et pour son transfert de ce dernier
vers des bactéries réceptrices (F-).
Plasmide F
-
Le transfert de F se fait avec grande facilité ; en une heure de contact, 95% des F
+
sont transformées en F . Le transfert du matériel se fait très facilement, ce qui prouve
que ce n’est pas le chromosome bactérien, ce matériel est indépendant du
chromosome. Il s’agit d’un plasmide libre dans le cytoplasme, qui porte donc
+
l’information génétique conférant le caractère type sexuel F

Les souches donneuses sont appelées F+ tandis que les souches dépourvues sont
appelées F-

Modèle du cercle roulant :

Le pont cytoplasmique formé, le transfert génétique peut commencer. Il ne porte


d'abord que sur un brin d'ADN, ce qui permet de restaurer l'intégrité du génome de la
bactérie donatrice par un processus de réplication asymétrique.

Une queue simple brin est générée par une endonucléase au niveau du site ori T,
l’extrémité 5’ migre vers la cellule réceptrice, et peut être converti en la forme double
brin par la synthèse d'un brin complémentaire. Alors que le DNA du coté 3’ sera
répliqué par complémentarité de manière continue, l’extrémité 5’ est répliquée de
manière discontinue par les Fragments d’Okazaki
Conjugaison Hfr x F-
Dans de rares cas, le plasmide F s’intègre dans le chromosome de la cellule hôte. Il
en résulte une cellule donneuse Hfr. Ces cellules Hfr forment des pili et peuvent se
-
conjuguer avec les cellules F
Une souche Hfr (Haute fréquence de recombinaison) résulte de l’intégration du
facteur F dans le chromosome.

Le brin transféré commence avec l’ADN du plasmide, mais celui-ci est suivi par
l’ADN chromosomique et finalement – si le brin ne casse pas – par le reste du brin du
plasmide. Si les brins plasmidique et chromosomique sont transférés en entier, la
cellule réceptrice devient une cellule donneuse Hfr, mais habituellement le brin casse
à un endroit donné et la cellule réceptrice (qui ne reçoit pas tout le brin plasmidique)
-
reste F . La forte proportion de cellules recombinantes, résultant des croisements Hfr
-
× F , explique la désignation « Hfr » – c’est-à-dire « haute fréquence de
recombinaison ».

Croisement F’ x F-
Un plasmide F peut aussi quitter le chromosome, c’est-à-dire qu’une cellule
+
donneuse Hfr peut devenir une cellule donneuse F . Parfois en partant, le plasmide
emporte avec lui un morceau adjacent du chromosome ; il en résulte un plasmide F’.
-
Lors de croisement F’ × F , la cellule donneuse F’ transfère habituellement à la cellule
+
réceptrice le caractère donneur (comme le fait une cellule donneuse F ) mais elle
transfère aussi de l’ADN chromosomique (comme le fait une cellule donneuse Hfr).

9.2. Transformation bactérienne

Par Définition, la transformation est le premier modèle connu de transfert de matériel


génétique, qui est fixé et absorbé par des bactéries réceptrices, dites en état de
compétence. Ce modèle a permis de démontrer que l'ADN était le support chimique
de l'hérédité en 1944.

Dans la transformation, une bactérie absorbe un morceau d’ADN présent dans son
environnement. Un brin de cet ADN donneur est assimilé et peut transformer
génétiquement la cellule réceptrice en se recombinant avec une région homologue
du chromosome. La réplication de l’hétéroduplex conduit à deux molécules d’ADN,
l’une identique à celle de la bactérie receveuse, l’autre recombinée : une bactérie est
génétiquement semblable à la cellule mère, l’autre est recombinée.

En 1928, Frederick Griffith démontre que l'inoculation sous-cutanée à la souris d'un


mélange de pneumocoques capsulés (virulents) tués par la chaleur et de
pneumocoques acapsulés (non virulents) vivants, entraîne une septicémie mortelle à
pneumocoques capsulés vivants. Il y a donc eu transformation ou « réversion » des
pneumocoques acapsulés (R)en pneumocoques capsulés (S).En 1944, Avery Mac
Leod et McCarty démontrent que le« principe transformant » est l'ADN bactérien. Ils
réussissent à reproduire in vitro la transformation en présence d'ADN fortement
polymérisé. L'activité transformante est perdue en présence de désoxyribonucléase

La cellule reçoit des portions d’ADN nu à deux conditions:


• Le nouvel ADN doit pouvoir s’intégrer dans son génome et
• la bactérie doit se trouver dans un état de « compétence ».

La compétence est un caractère induit, dû à une modification de surface contrôlée


par un facteur protéique. Elle correspond à un état d’autolyse partielle et très
localisée des enveloppes cellulaires, permettant la pénétration du matériel nucléique.
Elle dépend de l’environnement et de l’état physiologique

Développement de l’état de compétence

Chez les bactéries à Gram positif et à Gram négatif, la bactérie excrète un activateur
spécifique d'espèce, qui se fixe à la surface de la bactérie. Il y a ensuite synthèse
d'une protéine fixatrice de l'ADN, d'une autolysine et une endonucléase. L'ADN fixé
est ensuite partiellement hydrolysé puis converti en un fragment monocaténaire

Etapes de la transformation

• apparition de l'état de compétence


• fixation puis pénétration
• intégration de l'ADN donneur dans le génome de la bactérie réceptrice par
recombinaison homologue.

Les bactéries transformables sont capables de fixer des ADN de multiples sources
mais ne sont capables de former des recombinaisons génétiques que si la bactérie
donatrice et la bactérie réceptrice sont génétiquement très proches
9.3. transduction :
En 1952, N. ZINDER et J. LEDERBERG tentent d'obtenir des recombinants après
croisement de mutants auxotrophes de souches de Salmonella typhimurium. La fréquence
des recombinants histidine+ tryptophane+, de l'ordre de 10-6, n'est pas modifiée lorsque les
souches parentales, séparées par un filtre en verre fritté, ne sont plus en contact. L'existence
d'un agent filtrable, vecteur de l'information génétique est démontré (bactériophage tempéré
produit par la souche parentale lysogène.
o Lyse et lysogénie
La lyse est la rupture et la mort d’une cellule bactérienne à la suite de la libération de
la descendance d’un phage infectant

Lysogénie Lorsque des bactéries sont infectées par des phages, une petite fraction
de cellules infectées ne se lysent pas, mais deviennent lysogènes. Les bactéries
lysogènes contiennent un prophage dont la présence protège la cellule de l’infection
par un autre phage, ou surinfection, et qui est dupliqué et transmis aux cellules filles
lors de la division.

Certains phages sont capables de mobiliser des gènes bactériens et de les


transporter d’une cellule à une autre. Ce phénomène est appelé transduction. Il
existe deux types de transduction: généralisée et spécialisée.

Dans la transduction générale, les phages peuvent transporter n’importe quelle


région du chromosome, alors que dans la transduction spécialisée ou spécifique, les
phages transfèrent des parties bien précises du chromosome bactérien.
Transduction généralisée :

Quand il est excisé normalement, le nouveau phage est complet et ne contient pas
de gènes bactériens. Rarement l’excision se produit de manière asymétrique, et les
gènes bactériens sont assimilés et certains gènes phagiques sont perdus. Le
résultat est un phage lambda défectueux qui porte des gènes bactériens qui peuvent
être transférer à une autre cellule
Transduction spécialisée

La transduction est limitée aux gènes localisés en des sites immédiatement


adjacents aux sites spécifiques d’attachement de l’ADN du prophage et de l’ADN de
la bactérie donatrice

Allan Campbell proposa en 1962 que le phage tempéré l (lambda) se fixe au


chromosome bactérien par un crossing-over réciproque entre son chromosome
circulaire et le chromosome circulaire d’E. coli. Le crossing-over se produirait au
niveau d’un site spécifique du chromosome l appelé site de fixation l et un site du
chromosome bactérien d’ E. coli situé entre les gènes gal et bio.

Ces deux gènes encadrent normalement le chromosome phagique intégré, toujours


au même endroit, dans la bactérie lysogénique. Lors de l’expulsion du chromosome
phagique, une séparation défectueuse peut intervenir. Le matériel comporte une
partie du chromosome phagique et un des deux gènes bactériens.

La transduction spécialisée se distingue de la précédente par le fait que le phage


défectif renferme une partie du chromosome phagique (qui n’est plus fonctionnel) et
+ +
le gène bactérien situé à proximité (soit gal , soit bio )
10. Restriction de l’ADN
C’est le clivage de molécule d’ADN étranger par de véritables ciseaux génétiques,
les enzymes de restriction. Ce sont des endonucléases qui rompent les liaisons
phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur d’un ADN. Elles reconnaissent un
site précis sur la molécule d’ADN, site de reconnaissance qui déclenche la section du
duplex. C’est une séquence de 4 ou 6 paires de bases possédant un centre de
symétrie. Ce site constitue un palindrome : la succession des nucléotides sur un brin
est identique à celle des nucléotides complémentaires de l’autre brin, lu en sens
inverse.

Les enzymes reconnaissent le site et pour la plupart coupent l’ADN au-delà en une
région plus ou moins spécifique, qui est le site de coupure. Mais un bon nombre
coupe au niveau du site de reconnaissance, soit de manière droite, soit en chicane.
Dans le premier cas, on obtient des segments à extrémités « carrées » ou encore à
bords francs. Dans le second, il s’agit d’extrémités « cohésives » ou bouts collants
car ces extrémités sont susceptibles de se réassocier, via une intervention
enzymatique adaptée.

La position à laquelle l'enzyme de restriction coupe est généralement représenté par


le symbole "/" et les nucléotides méthylés par l'enzyme de modification sont
habituellement marqué d'un astérisque(*).
Régulation de l’expression génétique

Une cellule n’exprime pas la totalité de ses gènes à tout moment. Par exemple, si un
substrat particulier n’est pas disponible, la cellule gaspillerait de l’énergie en
synthétisant les enzymes nécessaires pour métaboliser ce substrat. En fait de
nombreux gènes peuvent être induits ou réprimés - ou leur expression augmenter ou
diminuer – selon les conditions.

Une telle régulation implique souvent un mécanisme qui stimule ou inhibe la


synthèse de l’ARNm du gène concerné. L’expression génétique est donc souvent
contrôlée « au niveau de la transcription ».
• En 1961, François Jacob et Jacques Monod ont proposé l'hypothèse de
l'opéron pour expliquer la régulation coordonnée des enzymes métaboliques.
L'opéron est considéré comme étant l'unité d'expression génique, consistant
en deux classes de gènes : les gènes de structure pour les enzymes et les
gènes de régulation qui contrôlent l'expression des gènes structuraux.
• Ils ont proposé qu’un répresseur pouvait bloquer la synthèse d’ARNm d’un
ensemble spécifique de gènes: l’opéron lactose (Lac) à moins qu’un inducteur,
le lactose, se lie au répresseur
Régulation transcriptionnelle

Notion d’opéron

Chez les bactéries, les gènes codant pour les enzymes d'une voie métabolique
particulière sont souvent groupées adjacents les uns aux autres dans une structure
sur le chromosome appelée opéron, Chaque opéron comporte un nombre variable
de gènes appelés cistrons..

Le contrôle coordonné de l’expression de ces gènes est possible grâce à des


protéines régulatrices, elles régulent le taux de transcription en se liant à l’ADN au
niveau de séquences spécifiques.

Ce modèle d’organisation permet à tous les gènes du groupe d'être exprimé de


manière coordonnée et transcrits en un seul ARNm polycistronique codant pour
toutes les enzymes de la voie métabolique.
Structure générale d’un opéron

L’opéron c’est un ensemble de gènes qui sont impliqués dans un processus


métabolique, ils sont groupés sur le chromosome et organisés en unités de
transcription, il est sous le contrôle de protéines régulatrices, il comprend

une région régulatrice, l’opérateur (la séquence d’ADN où se fixe un activateur ou un


répresseur), un promoteur commun (où se fixe l’ARN polymérase), et un ou plusieurs
gènes structuraux qui sont contrôlés de manière coordonnée grâce à l’opérateur, ces
gènes sont co-transcrits sous forme d’ARNm polycystronique
1. Régulation négative
La transcription des Opérons chez les procaryotes est contrôlée par induction et
répression. L'expression de l’opéron est déterminée par l'accès de l'ARN
polymérase au promoteur, et l'occupation de l'opérateur par des protéines
régulatrices influençant cet accès. L’Induction active la transcription à partir du
promoteur ; alors que la répression l’empêche

Les opérons inductibles et les opérons répressibles sont des exemples de régulation
génique négative. En effet, dans ces deux types d’opérons, la liaisons d’un
répresseur protéique à l’opérateur de l’opéron a pour effet de bloquer sa transcription
en ARN

1.1. Opérons inductible


Les opérons inductibles codent pour des enzymes de la voie catabolique (voie de
dégradation)

Parmi ces gènes nous prendrons celui qui est sans aucun doute le plus utilisé pour
illustrer ce type de régulation, celui de l’opéron lactose dans le génome d’E.coli

L’opéron lactose ne fonctionne que s’il est induit par une molécule effectrice capable
de lever l’effet du répresseur, il est dit inductible.

Au niveau de l’opéron lactose on peut mettre en évidence trois gènes de structures :


les gènes Lac Z, Lac Y et Lac A, codant pour des protéines différentes. Les gènes de
ces protéines faisant partie d’une même unité de transcription, on parle alors d’unité
polycistronique.

Le gène Lac Z code pour la β-galactosidase qui hydrolyse le lactose en galactose


et en glucose,
le gène Lac Y code pour la β-galactoside-perméase qui permet l’entrée du lactose
dans les bactéries et

le gène Lac A code pour la β-galactoside-transacétylase.

Le gène lacI (gène adjacent n’appartenant pas à l’opéron) code un répresseur qui
bloque la transcription de l’opéron lactose.
En absence de lactose, le répresseur est sous sa forme active. Il va se lier
spécifiquement au niveau de l’opérateur de l’opéron lactose bloquant l’accès de
l’ARN polymérase au site d’initiation de la transcription.
Ainsi, il y a régulation négative de la transcription des gènes de l’opéron lactose. Les
enzymes nécessaires au métabolisme du lactose ne sont pas synthétisées car
inutiles en absence de lactose.

En présence de lactose, c’est l’allolactose, un isomère du lactose, qui va jouer le


rôle d’inducteur en se liant au répresseur pour l’inactiver. Cette liaison entraine un
changement conformationnel du répresseur qui perd alors son affinité pour
l’opérateur.
Le site opérateur étant libéré, l’ARN polymérase peut atteindre le site d’initiation de la
transcription et synthétiser l’ARN polycistronique. La production des enzymes
nécessaires au métabolisme du lactose est donc dépendante de la présence du
substrat.
1.2. Opérons répréssibles

La molécule effectrice provoque la répression de la transcription, l’opéron est dit


répressible. Les opérons répressibles codent pour les enzymes de la voie anabolique
(biosynthèse). On prendra comme exemple l’opéron tryptophane (acide aminé
essentiel).

Dans l’opéron on visualise différents gènes : Trp A, Trp B, Trp C, Trp D et Trp E qui
codent pour les enzymes requises pour la synthèse du tryptophane ainsi que les
éléments de contrôle et le répresseur.

La synthèse de l’ARNm de l’opéron est contrôlée par un répresseurqui bloque la


transcription lorsqu’il est lié par le tryptophane (co-répresseur)

En absence de tryptophane, le gène régulateur trpR, qui ne fait pas partie de


l’opéron, synthétise un répresseur, celui-ci possède une particularité; en absence de
tryptophane il ne se lie pas à l’opérateur, ce qui entraine la transcription des gènes
de structure de l’opéron

En présence de tryptophane, le répresseur se lie au tryptophane (co-répresseur) et


devient ainsi « actif », pouvant se lier à l’opérateur, ce qui entraîne l’inhibition de la
transcription des gènes de structure de l’opéron.

Le tryptophane est ici un co-répresseur.


2. Régulation génique positive

La transcription par l'ARN polymérase de certains promoteurs se fait avec une faible
efficacité, à moins d'être assistée par une protéine accessoire qui agit comme un
régulateur positif. Une telle protéine est dite CAP, ou protéine activatrice du
catabolisme.

L’opéron lactose est également soumis à un contrôle positif. Les enzymes exigées
pour métaboliser le lactose (Bgalactosidase)sont seulement synthétisés si le glucose
est épuisé et le lactose est disponible. Cependant, si l’on ajoute du lactose, l’opéron
n’est pas transcrit tant que le glucose n’est pas épuisé. La présence de glucose ne
permet pas une transcription efficace de l’opéron lactose. Ce phénomène, qui
concerne de nombreux opérons du catabolisme est appelé «effet glucose» ou encore
répression catabolique
En présence de glucose Il a été montré que le glucose freine la production d’AMPc à
partir de l’ATP et maintient un très faible niveau d’AMPc. En présence de glucose il n
y a pas de complexe CAP-AMPc disponible: le niveau de transcription de l’opéron
lactose est donc très faible

En absence de glucoseLorsque le glucose diminue, la concentration en AMPc


augmente, or cette molécule peut former un complexe spécifique avec la protéine
CAP. Il en résulte une modification de la structure tridimensionnelle de cette protéine
et le complexe est capable de se fixer sur l’ADN, au niveau d’une séquence
particulière appelée site CAP, située en amont du promoteur. La liaison entraîne une
contrainte topologique de la double hélice d’ADN qui favorise l’initiation de la
transcription.