Guerrero SJ PDF

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS
“Implicancias Farmacéuticas de la Conjugación de

Péptidos a Nanopartículas de Oro: efectos sobre la
interacción con proteínas plasmáticas, la estabilidad, la
toxicidad y la biodistribución”
Tesis presentada a la Universidad de Chile

para optar al grado de Doctor en Ciencias Farmacéuticas
Por:
SIMÓN JUAN GUERRERO RIVERA
Directores de Tesis
Dr. Marcelo Javier Kogan (Director)

Dr. Fernando Albericio (Co-Director)
SANTIAGO- CHILE
2013
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
INFORME DE APROBACIÓN
RESIDENCIA
Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas que la Residencia presentada por el candidato:
SIMÓN JUAN GUERRERO RIVERA
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar
al Grado de Doctor en Farmacología, en el examen de defensa de Tesis rendido el
día……de ………….. de 2013.
Directores de Tesis:
Dr. Marcelo Javier Kogan ___________________________
Dr. Fernando Albericio ___________________________
Comisión Informante de Tesis:
Dr. Guillermo Díaz A. (Presidente) ___________________________
Dra. Mª Antonieta Valenzuela P. ___________________________
Dr. Carlos Díaz V. ___________________________
Dr. Michael Seeger P. ___________________________
Dr. Roberto Ebensperger G. ___________________________

AGRADECIMIENTOS
Me gustaría comenzar agradeciendo a mis Padres y mi hermana, a los

cuales les debo todos mis logros, pues es gracias a su apoyo que he podido
salir adelante.
Al Dr. Marcelo Kogan, por quien tengo un gran respeto y admiración, le debo
mi formación como científico, al cual considero no solo mi mentor sino también
un amigo y del cual he recibido un apoyo incondicional a todas mis decisiones
profesionales desde que me integré a su grupo de investigación el 2007.
Además no puedo dejar de agradecer al Dr. Fernando Albericio, al Dr. Ernest
Giralt, a la Dra. Eliandre de Oliveira y a sus laboratorios por su acogida y apoyo
brindando en Barcelona.
A todos mis compañeros de laboratorio con los cuales he compartido estos

años, de los cuales he aprendido tanto en lo profesional como en lo personal,
les agradezco haber sido parte de este proceso. Es precioso remarcar que he
tenido la suerte de conocerlos, de compartir, convivir y llevarnos muy bien, los
quiero y respeto a todos y les deseo lo mejor. Debo agradecer especialmente a
mis amigos mas cercano Pola, Juan, Seba, Magda, Claudio, Ana, Nataly, Edy,
Caro, Natalia por su amistad y apoyo.
Quiero agradecer a la comisión por todo el apoyo dado en estos años,

realizando criticas constructivas y siempre con la mejor disposición por
ayudarme.
Finalmente agradecer a todos los que de una u otra manera influyeron para
estar donde estoy.
A todos ustedes muchas gracias.
I
El desarrollo de esta tesis de doctorado se realizó gracias al trabajo en
colaboración entre los laboratorios de Nanobiotecnologia y Nanotoxicologia,
Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica, Universidad de Chile
(Dr. Marcelo Javier Kogan) y Química Combinatoria, Departamento de Química
Orgánica, Universidad de Barcelona (Dr. Fernando Albericio)
FINANCIAMIENTO:
Este trabajo contó con el apoyo y financiamiento de los siguientes proyectos:
Beca CONICYT 2009-2012 (Simón Guerrero)
Beca apoyo tesis Doctoral CONICYT 24110109/2011 (Simón Guerrero)
Proyecto FONDECYT 113045 (Marcelo Kogan)
Proyecto AECI (Fernando Albericio-Marcelo Kogan)
II
Los resultados obtenidos en esta tesis se presentaron en los siguientes
congresos:
(2011) Guerrero S., Salas E., Vera A. M., Eggeling C., Mena J., Adura C., Albericio F.,
Kogan M. J. “Implicancias Farmacéuticas de la Interacción de Conjugados de
Péptidos-Nanopartículas de Oro con Proteínas Plasmáticas”. Modalidad Poster
en V Escuela de Nano Estructuras– 4 eNE’11 I Taller en Nanociencia, CHILE,
Antofagasta, 2011
(2011) Araya E., Prades R., Guerrero S., Salas E., Molina C., Zurita E., Teixidó M.,
Giralt E., Kogan M. J. “Mejorando la llegada de Nanopartículas de oro al
cerebro, un posible uso para el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas”. Modalidad Poster en XXIX jornadas de Química, CHILE,
Linares, 2011
(2012) Guerrero S., Salas E., Diaz R., Oliveira E., Albericio F., Kogan M. J.
“Identificación de proteínas plasmáticas de relevancia farmacocinética que
conforman la Corona de proteínas sobre conjugados Péptido-NpO con
potenciales aplicaciones en Alzheimer”. Modalidad exposición en II Congreso
de Nanotecnología, CHILE, Valparaíso, 2012
(2012) Guerrero S., Salas E., Diaz R., Oliveira E., Albericio F., Kogan M. J.
“Relevancias farmacocinéticas de proteínas identificadas en la corona de
proteínas sobre conjugados de Péptidos-Nanopartículas de Oro con potenciales
aplicaciones en la enfermedad de Alzheimer”. Modalidad exposición en 3ª
Escuela Latinoamericana de nanomedicinas y 2º Simposio Latinoamericano de
Nanomedicinas, Argentina, San Luis, 2012
III
De los resultados desprendidos de esta tesis se obtuvieron las siguientes
publicaciones:
(2010) “Improving the brain delivery of gold nanoparticles by conjugation with an

amphipathic peptide”. Guerrero S., Araya E., Fiedler J.L., Arias J.I., Adura C.,
Albericio F., Giralt E., Arias J. L., Fernández Mª. S., Kogan M. J. Nanomedicine,
5(6):897-913
(2012) “Delivery of gold nanoparticles to the brain by conjugation with a peptide that
recognizes the transferrin receptor”. Prades R, Guerrero S., Araya E., Molina
C., Salas E., Zurita E., Selva J., Egea G., López-Iglesias C., Teixidó M., Kogan
M. J. Biomaterials, 33 (29):7194–7205
(2012) “Synthesis and in vivo evaluation of the biodistribution of a 18F-labeled conjugate

gold-nanoparticle-peptide with potential biomedical application”. Guerrero S.,
Herance J. R., Rojas S., Mena J. F., Gispert J. D:, Acosta G. A., Albericio F.,
Kogan M. J. Bioconjugate chemistry, 23 (3):399-408.
(2013) “Stable conjugates of peptides with gold nanorods for biomedical applications
with reduced effects on cell viability”. Adura C., Guerrero S., Salas E., Medel L.,
Riveros A., Mena J. F., Arbiol J., Albericio F., Giralt E., Kogan M.J. ACS applied
materials & interfaces, 5 (10):4076-4085.
IV
TABLA DE CONTENIDOSº
Página
Tabla de contenidos V
Índice de Figuras IX
Índice de Tablas XII
Abreviaturas XIII
Resumen XVI
Summary XVIII
1 Introducción 1
1.1 Generalidades 1
1.2 Nanomateriales y fototermia, posibles aplicaciones en salud. 2
1.2.1 Obtención de NE y NV para fines biológicos. 4
1.2.2 Funcionalización y estabilización de NpO para usos farmacéuticos. 6
1.2.3 Caracterización de NpO y Conjugados: Tamaño y carga,

Espectrofotometría UV-Vis, TEM, DLS, pot-Z. 10
1.3 La enfermedad de Alzheimer (EA) y el uso de NpO. 15
1.3.1 Estrategias para el tratamiento de la EA empleando péptidos 18
1.3.2 Entrega selectiva de NpO hacia los AT-Aβ mediante el uso de péptidos 18
1.4 Farmacocinética, estabilidad, toxicidad y penetración celular de las NpO. 21
1.4.1 Pasaje de NpO a través de la BHE. 24
1.4.3 Estrategias para aumentar la llegada de las NpO al Cerebro. 26
1.5 Toxicidad de NpO. 28
1.6 Interacción de nanopartículas con proteínas plasmáticas, formación de la

CP y su efecto sobre la farmacocinética, estabilidad y toxicidad 29
1.6.1 Formación de la CP. 31
1.6.2 Efectos de la CP sobre la farmacocinética y la toxicidad 34
1.6.3 Posibles efectos de NM sobre la estructura y función de las proteínas. 39
2 Hipótesis 41
3 Objetivo general 41
4 Objetivos específicos 42
5 Materiales y Métodos 43
5.1 Síntesis de las secuencias CLPFFD, CALNNLPFFD, CALNN, 43
V
CpegLPFFD, Cpeg, THRPPMWSPVWPCLPFFD.
5.2 Caracterización de los péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD, CpegLPFFD,

CALNN, Cpeg y THRPPMWSPVWPCLPFFD. 44
5.2.1 Cromatografía líquida de alta eficiencia. 44
5.2.2 Espectrometría de masas desorción/ionización láser asistida por matriz. 45
5.2.3 Análisis de aminoácidos. 46
5.3 Síntesis de NE, NV, obtención de conjugados y caracterización. 47
5.3.1 Preparación del material 47
5.3.2 Síntesis de NE 47
5.3.3 Síntesis de NV 48
5.3.4 Obtención de conjugados de NE con péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD,

CpegLPFFD, CALNN, Cpeg y THRPPMWSPVWPCLPFFD. 49
5.3.5 Obtención de conjugados de NV con el péptido CLPFFD. 49
5.4 Caracterización de las NpO y de los Conjugados NpO-péptidos 49
5.4.1 Caracterización por Espectrofotometría de absorción molecular. 50
5.4.2 Microscopía electrónica de transmisión. 51
5.4.3 Dispersión dinámica de la luz. 51
5.4.4 Potencial Z. 52
5.4.5 Espectroscopia fotoelectrónica de rayos X. 52
5.4.6 Estimación del número de moléculas de péptido por NpO (NE y NV). 52
5.4.7 Activación neutrónica para la determinación de oro. 53
5.4.8 Fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo, con detector de masa o

acoplado a un espectrofotómetro de emisión óptica. 53
5.4.9 Estimación de la concentración molar de NE y NV. 54
5.4.10 Análisis de aminoácidos. 55
5.5 Estudio de estabilidad de NpO y sus conjugados en PBS y plasma. 55
5.6 Evaluación de efectos de las NpO sobre la estructura y actividad de

proteínas debidos a la interacción de NpO-péptido. 56
5.6.1 Efectos de NpO sobre la estructura secundaria de la albumina

estudiados por dicroísmo circular (CD). 56
5.6.2 Estudio de la formación de fibras del péptido Aβ1-42 en presencia de

NpO. 57
5.6.2.1 Estudio de agregación de Aβ en presencia de NpO mediante 58
VI
fluorescencia de Th-T.
5.6.2.2 Estudio de agregación de Aβ en presencia de NpO mediante TEM. 58
5.7 Evaluación de la viabilidad celular en presencia de NpO. 59
5.8 Identificación de las proteínas de suero y plasma que interactúan con

NpO-péptido (CP). 60
5.9 Distribución de NE-CLPFFD ex vivo. 61
5.9.1 Detección de NE-CLPFFD por cuantificación de oro 62
5.9.2 Detección de NE-CLPFFD por microscopía de fluorescencia. 63
5.9.3 Determinación de integridad de BHE. 65
5.10 Distribución de NE-CLPFFD in vivo. 66
5.10.1 Marcaje radioactivo de NE para estudios in vivo. 66
5.10.2 Detección y estudios de distribución in vivo de NE. 68
5.11 Mejora de la llegada al cerebro de NE empleando THRCLPFFD,

69
Distribución de NE-THRCLPFFD ex vivo.
5.11.1 Detección de NE-THCLPFFD en cerebro por TEM. 70
5.12 Evaluación de la potencialidad de la incubación de NE-péptido con ApoE,

posible estrategia para mejorar la llegada al cerebro. 70
6 Resultados y Discusión 73
6.1 Objetivo específico 73
6.1.1 Caracterización de NE y NV por espectrofotometría de absorción

molecular 73
6.1.2 Caracterización de NE y NV por microscopia electrónica de trasmisión. 74
6.1.3 Caracterización de NE y NV por dispersión dinámica de la luz y potencial

zeta 75
6.1.4 Determinación de la concentración de NpO. 76
6.2 Objetivo específico 2. 77
6.2.1 Caracterización de los péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD, CALNN,

CpegLPFFD, Cpeg, THRPPMWSPCLPFFD 77
6.3 Objetivo específico 3 78
6.3.1 Caracterización de los conjugados NpO-Péptidos por Espectrofotometría

UV-Vis-NIR. 78
6.3.2 Caracterización de los conjugados NpO-Péptidos por TEM. 79
6.3.3 Caracterización de los conjugados NpO-Péptidos por DLS y pot-Z. 80
6.3.4 Determinación de la relación de moléculas de péptido/nanopartícula. 82
VII
6.3.5 Evaluación superficial de las NpO por XPS. 84
6.3.6 Obtención, caracterización de CK y funcionalización de NE 89
6.4 Objetivo específico 4 92
6.4.1 Estudio de la estabilidad de NpO 92
6.4.2 Formación de la CP. 94
6.5 Objetivo especifico 5 97
6.5.1 Efectos de las NpO sobre la viabilidad celular. 97
6.6.1 Estudio de interacción de NpO con proteínas, efectos sobre la

agregación de Aβ. 99
6.6.2 Efectos de las NpO sobre la estructura secundaria de la albumina. 102
6.7.1 Identificación de las proteínas del plasma que se unen a los conjugados
NpO-péptido por electroforesis en 2-D y LC-MS/MS. 104
6.8.1 Determinación de niveles de oro en cerebros de rata en función del

tiempo luego de la administración intraperitoneal (experimentos ex vivo). 110
6.8.2 Determinación y comparación relativa de los niveles de oro en

encontrados en hígado, bazo y riñón respecto a los encontrados en
cerebro. 111
6.8.3 Localización de NpO en el cerebro. 115
6.8.4 Evaluación de la integridad de la BHE. 116
6.8.5 Estudios in vivo de distribución de NE-CLPFFD. 117
6.8.6 Estudio de distribución in vivo de NE-CK/CLPFFD. 119
6.8.7 Determinación de la capacidad de las NE-THRCLPFFD de cruzar la

NHE. 125
6.8.8 Localización de las NE-THRCLPFFD en cerebro. 127
6.8.9 Distribución de las NE-THRCLPFFD. 128
6.8.10 Mejora en la llegada al cerebro de NpO-péptido pre-incubados con ApoE 129
7 Discusión general y perspectivas. 133
8 Conclusiones Generales 139
9 Bibliografía 141
10 Anexo 151
VIII
INDICE DE FIGURAS
Pagina
Figura 1 Potenciales aplicaciones de NpO en aplicaciones farmacéuticas; 3

Absorción y disipación local de energía
Figura 2 Destrucción in vitro de AT-Aβ involucrados en la EA utilizando NpO 3
Figura 3 Modelo de formación de una NE a partir de una síntesis química; 4

Simulación de nucleación y crecimiento de NE
Figura 4 Representación esquemática de las 2 estructuras comúnmente 7

empleadas sobre superficie de NpO para aplicaciones en drug-delivery
Figura 5 Esquema de funcionalización de una NE con tiopronina como espaciador 9

conjugada al péptido GRGDSP.[35] B) NE cubierta con EG3SH y
monofuncionalizada con AMU
Figura 6 Esquema de una NV recubierta con una bicapa de CTAB 9
Figura 7 Síntesis de NV por crecimiento mediado por núcleos. 11
Figura 8 Concepto de pot-Z. 14
Figura 9 Modelo de EA en donde se representan las placas amiloides y los ovillos 17

neurofibrilares
Figura 10 Esquema teórico de la formación de las diferentes especies a partir de 17

monómeros de Aβ
Figura 11 Estructura secundaria del péptido Aβ B) Secuencia de Aβ. 19
Figura 12 La conjugación de NE con el péptido anfipático CLPFFD afecta la carga y 20

estabilidad.
Figura 13 Esquema para relacionar el diseño del conjugado NE-THRCLPFFD con 27

su función in vivo.
Figura 14 Representación esquemática del des plegamiento de proteínas que 31

interactúan con la superficie de una NP.
Figura 15 Representación de la CP. 32
Figura 16 Interacción de NP con la superficie celular 37
Figura 17 Biodistribución de NP determinada por interacciones con proteínas 38

plasmáticas
Figura 18 Espectro de absorción UV-Vis de NE. 73
Figura 19 Caracterización de NE y NV por microscopia electrónica de trasmisión. 74
Figura 20 Microfotografía de TEM de NE y NV 74
IX
Figura 23 Distribución de tamaños en diámetro según % de intensidad determinado 75
mediante DLS para NE y NV
Figura 24 Espectro de absorción de conjugados a NE y NV. 79
Figura 25 Imágenes obtenidas por TEM de conjugados 80
Figura 26 Esquema de funcionalización de NE con los péptidos CLPFFD, 84

CpegLPFFD, CALNNLPFFD, CALNN y THRCLPFFD.
Figura 27 Espectro generales de XPS para NE y NV 85
Figura 28 Espectros XPS de alta resolución para energías de unión de los electrones 4f del 86
oro en NE y NV-CTAB
Figura 29 Espectros XPS de alta resolución para energías de unión de los 86

electrones 2p del azufre en NE y NV-CTAB.
Figura 30 Espectros XPS de alta resolución de NV-CTAB 89
Figura 31 Espectro de absorción de conjugados de NE-CK/CLPFFD; micrografía 90

TEM de NE-CK/CLPFFD
Figura 32 Espectro de absorción de conjugados de NE-CK/CLPFFD antes y 91

después de la unión a N-succinimidil-4-fluorobenzoato
Figura 33 Estabilidad de NpO en PBS y medio de cultivo celular DMEM 92

suplementado con 10% de suero fetal bobino
Figura 34 Estabilidad de NpO en plasma humano, seguimiento por 93

espectrofotometría Uv-Vis
Figura 35 Imágenes obtenidas por TEM luego de la incubación de las NpO-péptido 95

con plasma
Figura 36 Ensayo de viabilidad en células SH-SY5Y tratadas con NE 98
Figura 37 Ensayo de viabilidad en células SH-SY5Y tratadas con NV 99
Figura 38 Intensidad de Fluorescencia de Tioflavina-T para el seguimiento del 100

crecimiento de fibras de Aβ en 24h incubadas con NpO
Figura 39 Imágenes obtenidas por microscopía electrónica de transmisión luego de 101

la incubación de las NpO junto con Aβ.
Figura 40 Elipticidad residual media de BSA en presencia de NpO. 104
Figura 41 Gel en 2-D de una muestra de plasma humano 106
Figura 42 Geles 2D de Separación de proteínas presentes en la CP de los 107

conjugados NpO
Figura 53 Perfil de acumulación en el tiempo de oro en cerebro de rata luego de una 111
administración intraperitoneal de NE y NE-CLPFFD
Figura 44 Perfil de distribución de NE y NE-CLPFFD en bazo, hígado, riñón y 112
X
cerebro luego de una administración intraperitoneal en ratas.
Figura 45 Distribución en el tiempo de NE-CLPFFD-carboxifluoresceína. 118
Figura 46 Análisis de la integridad de la barrera hematoencefálica luego de tratar 119

ratas con NE-CLPFFD
Figura 47 Imágenes representativas de escáner PET a los 120min transcurrida una 120
inyección en ratas por vía intravenosa de una solución de NE-
CK/CLPFFD*SFB[18F]
Figura 48 Gráfico de curvas del % de la dosis inyectada (DI) normalizado en gramos 121
de tejido (%DI/gr) en el tiempo para los diferentes órganos analizados y
evaluados por PET
Figura 49 Grafico mostrando el % de dosis inyectada (DI) normalizado en gramos 122

de tejido (%DI/gr) calculado a partir de corte y conteo y también por
escáner PET
Figura 50 Proporción de radioactividad en sobrenadante ( respecto de la suma total 124

de la señal del pellet+ sobrenadante) de una muestra de NE-
CK/CLPFFD*SFB[18F].
Figura 51 Perfil de contenido de oro en el tiempo determinado en cerebros de ratas 126

tratadas con NE; NE-CLPFFD; NE-THR; NE-THRCLPFFD
Figura 52 Micrografías obtenidas por TEM de cortes de cerebro en las regiones de 129
hipocampo y corteza para la detección de NE-THRCLPFFD
Figura 53 Imágenes de Fluorescencia de cerebros extraídos a 2 y 24 horas post 130

inyección intraperitoneal de NE-CLPFFD; NE-THRCLPFFD y de NE-
CLPFFD@ApoE; NE-THRCLPFFD@ApoE.
Figura 54 Determinación de fluorescencia ex vivo. 131
Figura 55 Determinación de oro por activación neutrónica ex vivo 131
XI
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1 Cuantificación de oro en NE y NV. 77
Tabla 2 Caracterización de péptidos por Espectrometría de masa, HPLC-MS y 78

MALDI-TOF/MS
Tabla 3 Datos obtenidos de DLS y pot-Z para las NE y NV y sus conjugados. 81
Tabla 4 Determinación del Nº de moléculas de péptido unidas a cada NE 83

determinado a partir de Análisis de Aminoácidos y concentración de NE
y NV.
Tabla 5 Datos obtenidos por XPS para la energía de los electrones Au4f7/2, 88
Au4f5/2, esperándose la aparición de doblete en estas regiones de
energía y también se espera la aparición de la señal correspondiente a
los electrones de azufre, S2p.
Tabla 6 Evaluación de la formación de la CP por cambios en los valores de del 94

diámetro hidrodinámico de las NpO.
Tabla 7 Cuantificación de proteínas obtenidas de las NpO-conjugadas luego de 96

ser incubadas por 24h.
Tabla 8 Estructura secundaria, (α-hélice, lámina-β y espiral al alzar (RC)), 103

análisis para BSA en ausencia y presencia de NpO.
Tabla 9 Resumen de las proteínas mas relevantes en cada CP unida a los 108
diferentes conjugado identificadas desde los geles bidimensionales por
medio de LC/MC/MC.
Tabla 10 Contenido de oro en los órganos de ratas, obtención de la dosis 113

inyectada.
Tabla 11 Radiactividad obtenida en sobrenadante y pellet de una muestra de 123

orina recogida luego de 1h de la inyección de NE-
CK/CLPFFD*SFB[18F].
Tabla 12 Contenido de oro en cerebro. 123
Tabla 13 Perfil de acumulación de oro en hígado y bazo después de la 129

administración intraperitoneal de NE-THRCLPFFD a ratas.
XII
ABREVIATURAS
Aa Aminoácidos.
AAA Análisis de aminoácidos.
AAN Activación neutrónica.
ACN Acetonitrilo.
AE Azul de Evans.
AMQ 6-Aminoquinolina.
ApoE Apolipoproteína E.
AQC 6-Aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato.
AT Agregados tóxicos proteicos.
AT- Aβ Agregados tóxicos del péptido β-amiloide.
Aβ Péptido β-amiloide.
Aβ Proteína/péptido β-amiloide.
BHE Barrera Hematoencefálica.
BOC Tert-butil-oxi-carbonilo.
BZL Bencilo.
CChEN Comisión Chilena de Energía Nuclear.
CEMC Células endoteliales de los microvasos cerebrales.
Cf Carboxifluoresceína
CO3 Componente 3 del complemento.
CO4 Componente 4 del complemento.
CP Corona de Proteínas.
CTAB Bromuro de Cetil-trimetil-amonio.
DCM Diclorometano.
DHB ácido 2,5-dihidrobenzóico.
DI Dosis inyectada.
DLS Dispersión dinámica de la luz.
DLVO Teoría clásica de Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek.
DMF Dimetil formamida.
EA Enfermedad de Alzheimer.
ES Electro espray.
FBS Suero fetal bovino.
FDA Agencia del gobierno de los E.E.U.U, responsable de la regulación de
Alimentos y Fármacos.
Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonilo.
gp-P Enzima glicoproteína P.
GSH Glutatión reducido.
HCCA α-ciano-4-hidroxicinamico.
HFIP 1,1,1,3,3,3-hexafluoro- 2-propanol.
HOBT Hidroxibenzotriazol.
HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia.
HPLC/MS Cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de masa.
HPLC/PDA Cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de arreglo de
diodo.
iAβ5p Nombre para la secuencia peptídica Ac-LPFFD-NH2.
ICP/MS Espectrometría de Masas con fuente de Plasma de Acoplamiento
XIII
Inductivo.
ICP/OES Espectrometría de Emisión Óptica con fuente de Plasma de
Acoplamiento Inductivo.
IEF Isoelectroenfoque.
Ig Inmunoglobulina.
LC-MS/MS Cromatografía líquida acoplada a detector de masas en tándem.
LCR Liquido Cefalorraquídeo.
LDLR Receptor de lipoproteínas de baja densidad.
MALDI/TOF-MS Espectrometría de masa por desorción/ionización mediante laser
asistida por matriz, acoplada a un analizador de tiempo de vuelo.
MAO Mono amino Oxidasa.
mPEG-SH Metoxi-polietilenglicol-tiolado
MRI Resonancia magnética de imagen.
MS Espectrometría de masa.
MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-
tetrazolio.
MWCO Peso molecular de corte.
NE Nanoesferas.
NIR Infrarrojo cercano.
NM Nanomateriales.
NP Nanopartícula.
NPM Nanopartículas magnéticas.
NpO Nanopartículas de oro.
NT Nanotecnología.
NV Nanovarillas.
OI Imagen óptica.
PBS Tampón fosfato salino.
Pdi Polidispersidad.
Peg/PEG Polietilenglicol.
PET Tomografía de emisión de positrones.
pI Punto isoeléctrico.
PLGA Ácido poli (láctico-co-glicólico).
PMS Metosulfato de Fenazina.
Pntn Penetratina.
Pot-Z Potencial Z.
PPA Proteína precursora de amiloides..
PVDF Fluoruro de polivilideno.
QD Quantum dots
RAGE Receptores para los compuestos de glicosilación avanzada.
RCF Fuerza centrifuga relativa.
ROI Región de interés.
ROS Especies reactivas de oxígeno.
RPS Resonancia de plasmón superficial.
RSH Grupos tioles.
SDS-PAGE Dodecil sulfato de sodio-electroforesis en gel de poliacrilamida.
SEM Desviación estándar de la muestra.
XIV
SFB Succinimil-4-fluorobenzoato.
SFM Sistema fagocitico mononuclear.
SNC Sistema nervioso central.
SPFS Síntesis de péptidos en fase sólida.
tBU Tert-butilo.
TCAB Bromuro de tetra-octil-amonio.
TEM Microscopía electrónica de trasmisión.
TFA Acido trifluoroacético.
Th-T Tioflavina T.
THR Péptido THRPPMWSPVWP.
THRCLPFFD Péptido THRPPMWSPVWPCLPFFD.
TIS Triisopropilsilano.
TJ Uniones estrechas.
Trt Tritilo.
TU Tiourea.
US Ultrasonido.
UV-Vis Espectroscopia en rango ultra violeta y visible.
VDW Fuerzas atractivas de van der Waals.
XPS Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X.
τ Proteína Tau.
XV
RESUMEN
Implicancias Farmacéuticas de la Conjugación de Péptidos a Nanopartículas de
Oro: efectos sobre la interacción con proteínas plasmáticas, la estabilidad, la
toxicidad y la biodistribución.
Al exponer diferentes Nanomateriales (NM) al plasma sanguíneo estos son
reconocidos por biomoléculas, formándose una nano-bio interface denominada corona
de proteínas (CP), en la que se observan interacciones dinámicas debido a que los
ambientes biológicos son transitorios y no homogéneos. Dichas interacciones pueden
ser claves en la modulación de la biodistribución, eliminación, de las respuestas
inmunes y de la metabolización de los NM. En este contexto se propone que la
naturaleza de los NM influirán sobre las interacciones inespecíficas con los
componentes biológicos, esperándose a futuro poder regular dichas interacciones según
los intereses farmacéuticos.
En este proyecto de tesis se han obtenido conjugados de nanopartículas metálicas
de oro (NpO) con péptidos como CLPFFD formando el conjugado NpO-CLPFFD,
utilizados para destruir agregados proteicos amiloides (Aβ) involucrados en la
Enfermedad de Alzheimer (EA) mediante la aplicación de radiación electromagnética.
Dado que in vivo el conjugado NpO-CLPFFD llega en una muy baja proporción al
cerebro respecto de la dosis inyectada (DI) se incorporó la secuencia peptídica
THRPPMWSPVWP (THR), reconocida por el receptor de transferrina presente en la
Barrera Hematoencefálica (BHE) con el fin de favorecer la transcitosis y el ingreso al
sistema nervioso central. Es importante mencionar que una característica común de los
conjugados es su gran acumulación en hígado y bazo, afectando así la llegada al
cerebro. Esta elevada acumulación así como la penetración a través de la BHE esta
relacionada con la formación de la CP que se forma al ponerse en contacto las
nanopartículas con el plasma. Por lo cual, en este trabajo se realizó una caracterización
XVI
de la CP con el fin de comprender su posible influencia sobre el comportamiento
farmacocinético de las NpO. Es así que se evaluó como la CP formada sobre los
conjugados NpO péptidos puede modificarse tras incorporar secuencias peptídicas
como THRPPMWSPVWP, CALNN o Cpeg a CLPFFD
En el desarrollo de esta tesis nanoesferas de oro (NE) se conjugaron con los
péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD, C-PEG-LPFFD, CALNN, C-PEG y
THRPPMWSPVWPCLPFF (THRCLPFFD) y Nanovarillas de oro (NV) se conjugaron con
CLPFFD. Los conjugados se caracterizaron por Espectroscopia UV-Vis, TEM, DLS, XPS
y AAA y luego se emplearon para realizar estudios in vitro e in vivo. Posteriormente, los
conjugados fueron incubados in vitro con plasma humano, evaluándose la estabilidad de
los coloides por UV-Vis y el crecimiento del tamaño de las NpO por DLS debido a la
presencia de la CP. Las proteínas de la CP fueron separadas e identificadas por geles
SDS-Page, geles bidimensionales y por LC/MS/MS encontrando parámetros de
comparación entre los conjugados.
Las NpO conjugadas con los péptidos estudiados son especies coloidales estables
en el tiempo y la presencia de la CP produce un aumento del diámetro hidrodinámico
que conlleva a estabilización estérica. Las proteínas que conforman la CP tienen
relación directa con el destino de las mismas en el organismo. Así proteínas detectadas
estarían asociadas al reconocimiento por el sistema fagocitico mononuclear (SFM), la
acumulación en hígado y bazo, como son las proteínas Ig, CO3, CO4, entre otras. Otras
proteínas como la ApoE y la albúmina actuarían favoreciendo el pasaje a través de la
BHE tal como sucede con NE-THRCLPFFD y en menor proporción con NE-CLPFFD. En
base a lo encontrado se recubrieron NE-CLPFFD y NE-THRCLPFFD con ApoE, para
luego realizar estudios in vivo, observándose que existe un aumento en la llegada al
cerebro. Esto indica la importancia de la naturaleza de las proteínas de la CP sobre la
distribución de las NpO así como también la posibilidad de poder modular la misma para
un eventual tratamiento basado en NpO.
XVII
SUMMARY
Pharmaceutical implications of the Conjugation of peptides with Gold
Nanoparticles: effects on the interaction with plasma proteins, stability, cell
viability and biodistribution.
By exposing different Nanomaterials (NM) with plasma, they are recognized by
biomolecules conforming a nano-bio-interface called protein corona (CP), showing
dynamics interactions because the biological environment is transient and not
homogenous. These interactions could be the key in the modulation of the
biodistribution, elimination, immune response and metabolization of NM. Suggesting that
the features of NM has influence on non-specific interactions with biological components,
It is expected in the future that they can such interactions be regulated according the
pharmaceutical approach.
In this thesis were obtained conjugates of gold nanoparticles (NpO) with peptides as
CLPFFD (NpO-CLPFFD). This last sequence can recognize protein aggregates of β-
amyloid involved in Alzheimer’s disease. Since in vivo the conjugates reach the brain in
very low proportion, it was proposed to incorporate the peptide sequence
THRPPMWSPVWP (THR), a sequence recognized by the transferrin receptors in
endothelial cells of the blood brain barrier (BHE) promoting transcytosis of nanoparticles.
However, we observed that all conjugates were accumulated in liver and spleen,
interfering with arriving to brain. Therefore, the study for the interactions of NpO with the
proteins conforming the CP helps us to understand and explain the pharmacokinetic
behavior all them. In this work nanospheres (NE) were conjugated with the peptides
CLPFFD, CALNNLPFFD, CpegLPFFD, CALNN, Cpeg and THRPPMWSPVWPCLPFFD
(THRCLPFFD) and NpO as nanorods (NV) were conjugated with CLPFFD. Each
conjugate obtained was characterized by UV-Vis spectroscopy, TEM, DLS, XPS and
AAA. Then the conjugates were used to studies in vitro e in vivo. Next these conjugates
XVIII
were incubated in vitro with human plasma, to evaluate the stability by UV-Vis, the size
effect by DLS and by TEM. Finally, the proteins of the CP were separated and identified
by electrophoresis SDS-PAGE and 2D, and by LC-MS/MS to find comparative
parameters between conjugates.
The results obtained show that these conjugates are stable colloidal species in the
time and the CP affects the diameter of the nanoparticles. A set of proteins found in the
CP could determine the destiny of this NpO to will take in the organism. Thus proteins
detected (as are the proteins Ig, CO3, CO4 and other) are associated with the
recognition by the mononuclear phagocytic system (SFM) and their accumulation in liver
and spleen. On the other proteins as ApoE or albumin that were detected in the CP of
NE-THRCLPFFD and NE-CLPFFD favor the passage through the blood brain barrier.
Finally, due to these results, to corroborate the approach from the ability to modify the
CP, we incubated NE-CLPFFD and NE-THRCLPFFD with ApoE, then these conjugates
were used in vivo, observing an enhancement in the penetration into the brain. This
indicates the importance of CP on distribution of NpO as well as the possibility of
modulating it to a possible drug treatment based on NpO addressed to the central
nervous system.
XIX
1. INTRODUCCIÓN.
1.1 Generalidades.
En la actualidad el mayor desafío farmacéutico consiste en mejorar la acción selectiva de
los diversos principios activos, adquiriendo una mayor importancia la búsqueda de nuevos
enfoques farmacéuticos que permitan una acción selectiva.[1] Es así como el avance a nivel
mundial de la nanotecnología (NT) ha llevado al desarrollo y uso de una gran cantidad de
nanomateriales (NM) con potenciales aplicaciones en áreas farmacéuticas y médicas.[2]
Para que una terapia sea efectiva es necesario que el fármaco llegue al sitio de acción,
siendo uno de los grandes desafíos farmacéuticos el de obtener formulaciones que faciliten
su llegada al blanco terapéutico. Para lograr este propósito pueden emplearse NM para la
entrega de fármacos ya que los mismos poseen un tamaño similar a la mayoría de
moléculas y estructuras biológicas, permitiendo una interacción efectiva con los sitios de
interés. Como ejemplo, puede mencionarse el uso de nanopartículas (NP) formadas por
polímeros, dendrímeros, metales o lípidos (liposomas) que son efectivas para transportar
drogas hacia diferentes sitios de acción.[3] Otra de las aplicaciones interesantes de los NM
es la denominada fototermia para lograr una especie de “cirugía molecular” en la que se
destruya selectivamente el blanco terapeutico y no tejidos aledaños sanos.
Para los NM aún sigue sin conocerse a fondo el impacto que estos pueden tener en la
salud, debido a que su interacción con los sistemas biológicos es muy compleja por la gran
cantidad de interacciones con biomoléculas y células estableciendo una serie de interfaces
biológicas dependientes de las interacciones bio-fisicoquímicas. Dichas interacciones
pueden regular la biodistribución, aclaramiento, respuesta inmune y metabolismo de los
NM, procesos que pueden llevarlos a ser biocompatibles o bioadversos. Asimismo, se debe
considerar que estas interacciones pueden llevar a cambios estructurales de biomoléculas,
1
transformaciones de fase, liberación de energía libre, reestructuración y disolución en la
superficie de los NM.[4] Llegar a comprender la relación entre las propiedades físicas y
químicas de los NM y su conducta in vivo, contribuirá a interpretar su comportamiento
biológico y así lograr una entrega selectiva.[2]
1.2. Nanomateriales y fototermia, posibles aplicaciones en salud.
Las nanopartículas de oro (NpO) han emergido como un atractivo candidato para la
entrega de fármacos o como vectores de genes en terapia génica.[3] Al ser tan pequeñas
tienen la propiedad de difundir a través de barreras biológicas, pudiendo llegar al sitio de
interés (Figura 1.A).[3] Por otra parte, las NpO pueden absorber energía de forma eficaz
mediante la aplicación de campos magnéticos oscilantes o de radiación electromagnética y
disiparla localmente (nanométricamente) como calor (Figura 1.B).[5] Este efecto puede
conducir a una especie de “cirugía molecular” que afecta localmente a la diana terapéutica y
no a tejidos aledaños sanos.[6] Este principio es utilizado para el tratamiento local de
algunos tumores cancerígenos,[5, 7, 8] así como también podría aplicarse a la desagregación
de agregados tóxicos (AT) involucrados en enfermedades neurodegenerativas.[9] En nuestro
laboratorio se desarrollan NM para terapias de diferentes patologías como Alzheimer y
Cáncer. Para que los mismos sean efectivos deben ser estables, de baja toxicidad y
además llegar selectivamente a la diana terapéutica lo cual es crucial desde un punto de
vista farmacéutico.
En este contexto puede mencionarse el uso de NpO de diversas formas como
Nanoesferas (NE) y Nanovarillas (NV) para la destrucción de AT proteicos de la proteína β-
amiloide (AT-Aβ) involucrados en patologías como la enfermedad de Alzheimer (EA).[6, 9] En
nuestro laboratorio se demostró que es posible destruir AT-Aβ mediante el uso de NpO
luego de una irradiación con microondas de muy baja potencia (Figura 2).[6] Sin embargo,
2
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p due
nand
conjugates
We
n and
proteins
proteins
n
hwith
with
delivery
expect
to
due
ou
GSH-
nd
due n∼100
the
und
mod
u nd
ddue ob the
d
to
n
pharmacokinetic
phto
andGNP the
d mHnohd
GSH- dp
∼108
the nnn
on wp
nwith
oup nhn pon
hofioou
nprofiles.
pproteins
ofi
o ∼70 n We
mono du
mo
Wd
mo wexpect ohputhe
h31o
∼100 o
using
ese oreover, size h
couldou o on d n biosen-
their
trigger d(vide
photo-
drug h u–d b
releaseood
post). In
Zubarev withrecent
h Moreover,
Moat d m
ophob
altered
remote
et ocore
mo al. po
studies, have n
their
h we
bioavailability
place
p u
recently have
pho
[13].
13 u o n
demonstrated
succeeded andun pophob
with
w
our
ou hon n–
altered
pharmacokinetic
nanoparticles
n in nop cellular
coupling d bioavailability
b o d ofon
delivery
ntoo uonop
profiles.
∼70 be
b b and
resistant
molecules and
WeGSH-
nd n∼100 pharmacokinetic
ph
expect
too GNP
of m
exchange h o
n n w h profiles.
pp o n We
Wdue
du expect
to o p the
h
RERVEVWE–KW –KogaongaOmen Omedo dHoo sHoasGua eGueoeCuo Cuz&zAb& Abe ceoco

ws
w
ws
w t er, rally
omolecule
ents
oreover, u
remote
nctionalization,
omolecule describing
d btheir13
describing
d b focusing
n 1
1w
w b photo-
their
place
btriggerw
w n inter-
inter-
n nw nanoparticle–biomacromolecule
n onho nop
photo-
[13].
ou o u biosen-
n on
with
inter-
nanoparticle–biomacromolecule
ho nopohu in
on steric
noph u
steric with
the
uood fid
Zubarev altered
d
molecules with
–b
our m 2 om
shielding
n nm
d
o
steric
bloodstream,
m
shielding
om d h
altered
et In
nanoparticles
hIn o al. omo
b
dd
recent
bioavailability
h ton omo
npo of
shielding
have
of o diameter
the
availabled–
bioavailability
the u
studies,
o
recently
potentially
u ton ofo
gold–thiol
h o o
gold–thiolinter-
ube n
inter-
unu could
and n
the
o w
ligands we h
resistant
h h h dbe,
have
interface.
pharmacokinetic
and
gold–thiol
succeededcreating
d un (n in
steric
steric
ophob
interface. =mo principle,
demonstrated
∼108) shielding
pharmacokinetic
to w in
exchange ud
interface.
h coupling
p
protein–carrier
shielding d
h(BODIPY), d
o
dinn
in
nnu n conjugated
BOD
profiles.
the
o
with
n
BOD o of
oof
of
o du pthe
cellular
the hPY
monolayer
profiles.
∼70 proteins
PY
hu gold–thiol
We
o b o n d–
delivery
molecules
conjugates h
gold–thiol
oh d–expectWeh
due
hmono o
mod
mod
o[31].
nd interface.
and
expect
to n
of the
interface. n
nexchange o
GSH-
o ∼108 n h mono 31
–biomacromolecule
using
ewes
–biomacromolecule macromolecule
ents
pping
nctionalization,
rally
macromolecule
u pho 1will
couldou 13 monon
focusing
n d on focus References
biosen- onn
on ou inter-
drug
d
inter- wh u–dn
biosen- inter-
in b
release
mediated
noph the In
fid d steric
–b
daltered
sterich
recent
b 9 oat doremote
steric
bloodstream,
n shielding
ophob
m
remote
release
h studies,
mo
o
shielding h b b
shielding
recent p o nof
place
p d–dnpotentially
of
we
of oahthe
u
nd
studies, the
nhave
ofph
[13].
ohydrophobic
13 the
o o wwe
gold–thiol
gold–thiol
n h
nagold–thiol
demonstrated
m n h un
creating
have unp
oexchange
∼2
our
ou notopinterface.
pinterface.
mo
Zub
won n– p
nanoparticles
dye
nm
n h
nop u
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interface.
p ofi
protein–carrier
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delivery
h on
du pas
to o
cellular
h o
mo
nop
mobe
b ma p
o hn
bresistant
conjugatesandnexpect
model
h d
delivery pGSH-
p n u
und of too
andGNP ddnGSH-
d uhd∼108
u nno ooupwith
w GNP
nGNP
h hoo w
nproteins
proteins
p w mono
∼70 n h due
h mo
du 2 nm
2 nmto o uthe
the
h oo
31
H oo
ote This
on er,
es b their
place
could
pho review
o m o photo-
[13].
trigger will w focus
drug h n with
our on
releasemolecules
nanoparticles
nd b oud
at mediated bioavailability
to w b available
to h release
placebe nd resistant
d [13].mon
ph and
ligands
of m pharmacokinetic
to o (n
hydrophobic
d
our n = ∼108)
u
nanoparticles
p with
ofid dye profiles.
the
proteins
W (BODIPY),
to monolayer
nd be We
due
G
p H
resistant as
to the a [31]. model
to exchange of with due to
ws
w oteently
This
ont t ew
using pping
ents nu
osphine
rally remote
remote db ou
will
describing
1review
place been
b on
ofocusing d
onnbn focusplace
n npublished,
References
biosen-
[13].
place published,
pub
[16] will on
non n[13].
[13].d
nop hh w
focush u
nd
biosen- dwith
our mediated
b onood In our
paclitaxel,
molecules
generally
nIn h 9
recent
nanoparticles
n
Zubarev –b
our om
ud d
mediated
mrelease
nanoparticles
ophob
et oIn
nanoparticles hmo
focusing to
al.au omo
upo
studies,
po
wrecent p
haven to hnp of
chemotherapeutic
available
nof on
don
release
be we uuuh
recently a
studies, to
b have
resistant
d
to 13
hydrophobic
biosen- be
inter-
owe
mon
be nu u o
ligands
of resistant
napharmacokinetic
nhave
demonstrated
nto
succeeded
resistant
we haveun ∼2
ou
steric
drug,
(n
hydrophobic
p
exchange
d =Zub
oto n
dye
nm
∼108)
In
on
nexchange
in n–
un–
demonstrated
nop
exchange h
to
recent (BODIPY),
shielding
cellular
with
coupling dnnadddin
dye u with
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GNP
studies,the
oud
ud d
proteins
with of
o d
of
h o
as
the
with
nwith
(BODIPY),
delivery
on ∼70
cellular nd b
proteins
hproteins
monolayer
we
nop
w
unop ma due
G h2model
gold–thiol
ohave
Hd–
2and
have
and
molecules d nm due
asdue
to
nexpect
delivery d
GSH-n
mono
the of
hdemonstrated
ao core
u[31].
demonstrated
mon too
andGNP
model
of the
interface.
nthe dGSH- h d ofnn w
cellular
d cellular
nd oupu u nh p do o
delivery
n delivery
o ∼70 n
∼70 mo du
moand
nd GSH- o
GSH-
Gu uHh o
ently
y using
ewer,macromolecule
pping n
osphine
rally m
focusing
photheir
1will n
been
b onon o focusphoto- References
biosen- pub
on
[16] w n
biosen-
on inter-
h h b hgenerally
ood
mediated n d d steric
paclitaxel,
altered
b hn
recent
9 o Ind o mshielding
ophob
focusing
o
recenth
release h a
bioavailability
studies, b chemotherapeutic
p n o d–
studies, d of
we nd a the o
biosen-
b have o
hydrophobic
ph andgold–thiol
n
o n n
demonstrated
m n un
o pdrug,
∼2 n o
demonstrated dinterface.
on
In
Zub
p n
nm
dye m to
recent
p cellular
(BODIPY),
ofi a GNP o
studies,
cellular
32
u d
W hdon n
delivery
hthe as u
hmo we
w We
delivery
ma p h n
model d nm
asphGSH-
dand
mono u core
mon
of GNP
GSH- d
dGSH- d
u of o oup d
GNP w h 2 nm o and
nd G
ws
w ote This
onyew
ssently
omolecule er, ufocusing
n(Fig.
m db 13
describing
their
place ofocusing
n on
review
b1). n bphoto-
[13]. non
inter- will ou
nouon
biosen- nopfocus
wbiosen-
n
ndwith nop
our hydrophobic
steric h on n d–b
altered
nanoparticles
Zubarev nompo
shieldingompo
om
In
ud oet
mediated oIn
recent
hydrophobic h recent
bdrugs,
drugs,
omo
bioavailability
al. w dhave ostudies,
to hhof d–
release
be studies,
using
recently n
h
udrugs,
d
resistant inter-
ointer-
we
mon nooand of we
functionalized
nhave
hgold–thiol hto
n havendemonstrated
pharmacokinetic
an
succeeded
using steric
hydrophobic
d
exchange demonstrated
wdoIn in
functionalized umhshielding
pwith
shielding
gold
hcoupling dod ddddye nproteins
nanoparticles
n profiles.
cellular
32 of
on
gold cellular
du
o(BODIPY),
of thend
∼70 oWe
delivery
G
due
nanoparticles h
nd
oh delivery
gold–thiol d–
Hd–
molecules (fGNPs)
expect
to hdemonstrated
and
the oMA
ao MA and
interface.
n(fGNPs)
model
GSH-
of nd
ws o
describing u m d
nanoparticle–biomacromolecule d ho bof the d gold–thiol
ophob dinterface.
d nBOD
steric PY of hmod gold–thiol o interface.
ents 13 n nop o b n h n w h p o
w
omolecule
This macromolecule
ents gnostic
macromolecule no
(Fig. d
opho will u been
review1).oon b
[15]
focusn15 n published,
pub
inter- will
n
applications.
wpp
on m nop
Hinter-
Hinter-
hh
focus dn hydrophobic
on generally
mediated
steric on nn
diameter
d–b
dZubarev steric
paclitaxel,This
bhhm 9o
shielding
steric m om
oud mediatedshielding
focusing
et
review [32].
release
hydrophobic oal.
shielding uwomow
of
adrugs, d have
p o
ntowill
w
the
hh
chemotherapeutic on using
of
d
of
release
u
recently
nd aa
the
biosen-
othe
drugs,
gold–thiol
ophob u n
bhydrophobic
focus o
hydrophobic
ph functionalized
h oon nhave
on succeeded
using
man
gold–thiol
of interface.∼2
mediated
m
odemonstrated
drug,
hydrophobic o
interface.
BOD
p nin
nm
dnm
dye
functionalized
interface. h
gold
recent
p
tocoupling
PY dwith
(BODIPY),
ofi n release
adrelease
dye
n unproteins
nanoparticles
studies,
GNP ud o
on
gold
W du
of
dh mod∼70
ofh
ond
as
with
(BODIPY), mo we
w o m
aap
nanoparticles
p o nd
have
h2hH o(fGNPs)
molecules
hydrophobic
model d d
nm
asp dmono
ophob
pophob mon
ofmodel
ucore n
of (fGNPs)
dof ndu ocellular
d ofd(BODIPY),
dye BOD PYdelivery
u GNP
(BODIPY), d as w a ah and
2ndnm
model
mod
h model nm GSH-
G Hof ooo
yew focusing on biosen- aauMA
on osphine b obeen n [16] w diameter In recent ostudies, we ∼2 cellular delivery and GSH-
ote
ote This
ently
on u gnostic
n no
reviewm bplace
pho will
13
place b1).oon
review
n o focus
n[15][13].
will
n15
[13]. pub focus
will
published, won
applications.
pp
ou hh
focus
w ndn on d our
nop
ourhmediated
on
hydrophobic
[9]. on nanoparticles
generally
nd
nd This
The nb
mediated
nanoparticles 9ompo
ud mediated
o o[32].
h
release
review
focusing
uparticles
o h b uwun
bw p
drelease
onto will
w
h d– ofbe using
release
on
(core
be nd
h
hnd
nd
resistant
focus
do of
biosen-
o
b
resistant mon
ph
uowe
mon doon
na
ahHo
of
= m
∼2
nhave to
hydrophobic
functionalized ahto
BDP o
n d
exchange
mediated
m
hydrophobic
nm) dd
exchangen wp
ddye
od
In
nu u h
m
featured
2 p
gold
recentp d
dye ofid
(BODIPY),
don
hdye
h u
(BODIPY),
nanoparticles
32
a nproteins
studies,
ud W
on d
du
(BODIPY),
mixed on as
of
ond mo we
w oam G
due
aG
ashmodel
ndh
have
h
monolayer
n ud to
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d
anm
Ho(fGNPs)
as the
mono
model of
demonstrated
d mon model d nddye
d
u BOD
ofd ocellular
cellular PY
u GNP d as w
delivery mod
2
and
nd GSH- GSH-
G H Hof
o
sently
omolecule
protein
p ykanethiol sing
kanethiol
u
sing n
osphine
gnostic(Fig.
review
onom o
focusing 13 nuon
n
onbeen
b d will
biosen-
[15]
delivery n15
biosen-
inter-
[17,18]
[17,18] focus
published,
pub
on
[16] m
h
biosen-
applications.
pp
ou hHusing
u h dn
d dn
on steric
ophob
d nop
ophob onGNP
dpaclitaxel,
In
generally
hhydrophobic
[9]. In nd
diameter
mediated
shielding
The nfluo
recent
This
dpaclitaxel,
GNPs recent d
h(Fig.
fluoompo
d Inhydrophobic
[9].
o
[9].
u o1).
review1 hob
focusing
o
recent
particles
o[32]. The
studies,
The
studies, u u nof
aadrugs,w
drugs, release
on n
n
theh
chemotherapeutic
particles
d–
studies,
will
w we
chemotherapeutic
drelease o on
particles
we
d
(core un
using
un nddrugs,
ophob
oofu
gold–thiol
have
biosen-
b
focus
n o
have o d
oon h H on using
(core
demonstrated
nfunctionalized
n ∼2
=demonstrated
(core BDPn dinterface.
hydrophobic dn
nm)
hfunctionalized
d d
functionalized
drug,
=oo∼2
demonstratedBOD
∼2
mediated
m
drug,
h = wd d
In
od
hydrophobic
dn n
featured
2
nh
ophob
m
to
nm)
toPY
recent
gold
nm) p dwith
dye
cellular
nop
cellular
nop onaad
drelease (BODIPY),
GNP
featured
studies,
ud
cellular
an
GNPdrugs,
nanoparticles
d
featured
32
gold
delivery
mixed
on
u du
delivery
mod
with
on of we
w
u GNP due
nanoparticles
delivery
o nanoparticles
with using
oa
GNP
as
and
have
h
monolayer
n n h2
ndho
mixed
and ua to
2hydrophobic
mixed GSH-
dGSH-
anm
(fGNPs)
un
the
model
and
ophob
functionalizedcore
monolayer
demonstrated
d mon
core
MA onGSH-
monolayer
(fGNPs)
ofnd d d dgold
dye u
(BODIPY),
oBODd n PY delivery
d
nanoparticles
nop as a model and
nd
mod G
(fGNPs)
GNP of
o
psyg.
protein g.
n u
osphine
sing gnostic ofocusing
(Fig.
review
molecule m
(Fig.
no
molecule
h b o13
1).
o
1). o n
pu
u n
on
1).
1). d
n on
on will
delivery
[15] 15
biosen-
on
[16]
inter-
inter-
o focus biosen-
ou m
applications.
pp m
h using
u d n
nd non steric
nophhydrophobic
on
steric
ophob GNPs
GNP
[9]. d
composed
o In n d
diameter
mediated
shielding
n
This
recent h
mompo
(Fig.
hydrophobic
The ud
fluo
shielding
h
d
hydrophobic
Ino recent
hydrophobic
o 1).
1
hydrophobic
[9].
u review
of o
particles hoowb
The
studies,
[32]. u nof
wd
of
tetra(ethylenenoh o
n
studies,
the
w
thehdrugs,
d–
will
h (core
o
particles
we
drugs,
d
using
d hd drugs,
nd ophob
gold–thiol
n oo
drugs,
focus
ophob
gold–thiol
un
of
have mon
u
we o
using
d
using n
on
aH
h
m = onhave
using
hydrophobic
functionalized
∼2 BDP
using n
h d
glycol)ylated
(core mb
demonstrated dn
nm)demonstrated
dinterface.
interface.
d functionalized
h BOD
w o
hydrophobic
d
functionalized
mediated
m
n
functionalized = o BOD
∼2 d
b u 2
nh
ophob
m
featured G PY
gold
p
PYdye
cationic
nm)
G dud
nop
cellular o hgoldh
release cellular
(BODIPY),
nanoparticles
32
a
nd n
drugs,
d
featured
gold
gold
non
u
gold
ligands duh
delivery
mod
nanoparticles
mixed onm
nd
mod of
o
nanoparticles udelivery
o
using n
nanoparticles
Ga
GNP a
(TTMA)as
n nd
h
monolayer
H (fGNPs)
u
hydrophobic
h o
opho
mixed
and d GSH-
and
model
ophob
and MA
functionalized
un GSH-
on
(fGNPs)p
monolayer
(fGNPs)
(fGNPs)
of
(fGNPs)
ob nddye
d md gold
om d nanoparticles
n
(BODIPY),
BOD PYnop
u as a (fGNPs)
model
mod GNP of
o
protein
pg. w
wnu gnostic
kanethiol ono
review
h
review will
bwill onp n focus
n[15] will
delivery
d
focus will15 o[17,18] on
applications.
focus
on
focuspp 9 nnon
Husing
H u
9 on mediated
h[9].
on
composed
o GNPs
GNP
mediated
h npp
diameter
3.1. d This
The n h
mediatedud
h
(Fig.
mediated
m composed
release
review
of
Glutathione-mediated
fluo
m o
composedo
release1).
1
particles o
[32].
h w nworelease
o ohwill
release
tetra(ethylenen w of
d–
of of
o
(core
of ahd
a tetra(ethylene
nd ∼2 hydrophobic
focus
ohydrophobic
o of udnnm
mon
tetra(ethylene
∼2 of nm
aH
m
a = on hydrophobic
glycol)ylated
release
∼2 mb
BDP
hydrophobic nm) d m
n u glycol)ylated
dye
mediated d
b
hydrophobic
h
of
[9].
9
u d duophob
small
dye The2
featured
glycol)ylated
d h dudm
(BODIPY),
dye
cationic m
molecules
(BODIPY),
dye p h
particles h(BODIPY),
releasend
a drugs,
d d
nmixed
cationic
dligands
u
cationic
(BODIPY), h as
mono
as
monoonm
nd of
o(corefluoaG
using
u
fluoao ligands
nmodel
aligands
(TTMA)as
n H hydrophobic
hopho
monolayer
model
as du ad=un ophob
∼2
model(TTMA)
ofon
afunctionalized
model
and
(TTMA)
of p
nm)
nm ob ofdye
of
md gold
and
dand
featured uomdd nanoparticles
(BODIPY),
BOD n aPYu
nopmixed
m asd amonolayer
model
mod
mono (fGNPs)
GNP of
o
nsing
uh 1).
bwill on on
pon biosen-
Ho
nobiosen- husing d nnophob ophob h[9].
oGNPs In
3.1.
composed np hydrophobic
recent
The
drecent
[9]. do
h
ud [9].
u
nGlutathione-mediated
The of how The
studies,
o1).
particles un
tetra(ethylenenohn
particles n particles
drugs,
d– we
(core
o(HSBDP)un nd
hophob
d have
omon using
(core on
donnnm
m H (core
∼2
demonstrated
=release BDP
mbd
glycol)ylated d∼2
=nm) dd
functionalized
of =
[9].
n o∼2
9BOD ∼2 d
small nh
2
featured
nm)
b The nm)
cationicnop
cellular
molecules
particles
pPY
featured featured
gold
hfeatured
adrugs,
hnd ddligands nanoparticles
delivery
mixedhasaon (core
mixed a
GNP n mixed
and
monolayer
oa(TTMA) opho =GSH-
dufunctionalized
∼2
monolayer
and monolayer
(fGNPs)nm)
nm
p non ob and featured au mixed
m d monolayer
uomdd nanoparticles mono
protein
p
nd
protein
kanethiol
w sing
kanethiol o on u n on delivery
d
focus
oH o[17,18]
delivery
[17,18]
d on m w h u
9ompo
using d
ddGNP h
mediatedd
GNP
dm In
fluorogenic
oGNPs
hydrophobic [9].
fluo
(Fig.
po d
(Fig. [9].
u
composed
release
The 1
bo
studies,
1). The
oligands
odrugs,
u d
on
particles hu particles
of d
we
of
using aun
ligands have
tetra(ethylene
∼2 hydrophobic
(core m(core
(Fig.d
(HSBDP)d
demonstrated h
= d ∼2 h
2a).
n =
hydrophobic
u o md
dye dduophob
ophob
The
nm)
(Fig. n
BOD
glycol)ylated nm)
G
PY udm
nop
cellular
cationic
(BODIPY),
featured
2a). The on n
cationic mod nd
nature
mono
au m
unanoparticles
deliverycationic uaG
using
fluo
mixedGNP n
and
d H
mixed
o
facilitates
ligands
model GNP
nature un
GSH- monolayer
(TTMA)
monolayerof on
facilitates md
d gold gold na nop (fGNPs)
GNP
ptrate
nd g.
g.
wn old
oh ob
h 1).
d
1).
willon u pn on
nanoparticles
onanoparticles
n d
no
nop
focus d on
o[19–21]
m w u
9ompo nn mediated
GNP GNPm
composed d
dpo
fluorogenic
hydrophobic
hcomposed n
3.1. hydrophobic
poud
ohydrophobic
[9].
fluorogenic
h composed of
fluorogenic
The
release
1
b ligands
w h d
tetra(ethylene
drugs, hparticles
onof hh uof n
nof d
drugs,
o(HSBDP)
using
drugs, ophob
d
ligands mon
tetra(ethylene
∼2 ofunctionalized
o
using
using
(core m
nm m (Fig.
mb
glycol)ylated
functionalized (HSBDP)
release d h
=d
d
dfunctionalized
d∼2 d
dfunctionalized
hydrophobic
h
2a).
nof BOD
[9].
n 9ompom
composed
u
d on
bThe
uThe
(Fig.
small
on
glycol)ylated
nm)
d
gold
hPY
BOD
cationic
gold
G cationic
udd
2a). pPY
particles
molecules
featured
m of
o nd
gold nd
The drugs,
nanoparticles
d
nanoparticles
ndhnd
gold d on
ligands
tetra(ethylene
cationic nature
has undMA
nunanoparticles
mod
cationic
au
mono mMA using
u
(coreh
fluo
mixedo(TTMA)
G n
dH
ligandsond
n dfunctionalized
(fGNPs)
facilitates
GNP
opho
nature
(fGNPs)
ond
=un ∼2 and
glycol)ylated
po
on
(fGNPs)nm)
nm
p non
ofacilitates
(fGNPs)
(TTMA)
monolayer ob and featured
md uomon
cationicdd nanoparticles
n nopmixed
m ndd (TTMA)
ligands
u MA(fGNPs)
monolayer
mono GNP and
nd
nd w wn
trate
ast du old
o ob dwillon o
u
fortynp onon n
nop
focus years
oyears doon
[19–21] m
hw
d to 9 dd
ompo n
GNP ophob h o
mediateddm n
dpThe
fluorogenic
the
n
hydrophobic composed
crossing
o[9]. po
d
composed
h
ud ucomposedof
release o w
boligands
utetra(ethylene
ofh
drugs, d
o of
ncell-membrane
n h huof nof o
d un
using aah
tetra(ethylene
(HSBDP)hd
ophob
ligands
tetra(ethylene
hydrophobic
mon
tetra(ethylene
∼2 on
hydrophobic m
nm m
d∼2
ofunctionalized mb
glycol)ylated
(Fig.
od
(HSBDP) h d
barrier,
d∼2 qun
glycol)ylated
nof
2a).
ouBODdye
composed
9ompom b u
The
glycol)ylated
[9].
glycol)ylated dnm)
dye d
non
(Fig.The
nThe
h BOD
G G
hPY
and
gold
(BODIPY),
cationic
nop ud
Hd
cationic
(BODIPY),
2a). m of
om
PYm
particles
pthe
the ndh
cationic
The
nanoparticles
cationic dligands
tetra(ethylene
on n
cationic h
mod
mono
as nd
nm
nature
cationic
MAligands
d(core
fluo
(core
GNP
ligandsaaG
h o(TTMA) model
dH
ligands
model nopho
ndGNP (TTMA)
facilitates ∼2 and
=monolayer
d(TTMA)
probes
n
nature
(fGNPs)
of
glycol)ylated
(TTMA)
of p
nm)
nm nd ob
and
non
facilitates noand md cationic
featured u mon
n d aan nligands
u m ndd
mixed dnon(TTMA)MA n and
monolayer
mono mnd
3.1. Glutathione-mediated release small G molecules
H d d p 2and n n unon n m
er the past H fluo fluorogenic fluo fluorophore ∼2
nd
nd
w
ast
trate du old
ood
er o the
on unanoparticles
forty
on u
non nop
on oH
past
ono o dforty
d
[19–21] od
forty h
m
m w to
fluo
fluo d
ompo d
d
years
GNP
years
GNP
ophob o [9].
[9].the
n dm
ohydrophobic
d
to
n
3.1.
to
n
fluorogenic
d Thecrossing
o [9]. d
fluo
composed
po
u
GSH-mediated
the
particles
nd
The
po
GSH-mediatedthe
particles
nd
The
fluorogenicbo
b
crossing
uof
ligands
oligands
crossing
drugs, h
H
particles
H dnof n
particles
d h
huBDP
uBDP (core
cell-membrane un
d(HSBDP)
(core
tetra(ethylene
n using
d
of
release
(HSBDP) ophob
ligandsof (core
ophob
release
cell-membrane
d
(core
on o=
cell-membrane
d o d
=releasem2
∼2 o
2(HSBDP)
functionalized
m (Fig.d
(HSBDP)
d
nm)
represents
(Fig. =d
h
nm)
represents=
h
h
barrier,
∼2 qu[9].
nof
h(Fig.o
2a).9
fluoompo
BOD
glycol)ylated
d n
2a). BOD
featured
d
composed
m n
small
m on
n
Theh
oh
featured
nm)
fluorogenic
(Fig.
The
barrier,
on
onh
and
BOD
an PY nop
barrier,
gold
BOD
an PY n particles
p
featured
dfluo
molecules
featured
2a).
cationic
n
PY
n
PY
of
ond
alternative
cationic a u
ligands
aligands
The
cationic uand
nanoparticles
alternative
mixed
tetra(ethylene
on
fluorophore
and
mixed
on nd modaun
nature
au
nature
mod
the
the
cationic
MA
mixed
GNPh o
(HSBDP)
ligands H
mixed monolayer
fluorophore
dBDP
non-enzymatic
monolayer
d
non-enzymatic
(HSBDP)
n
ond
o
d
GNP
nature
fluorophore
GNP
= glycol)ylated
probes
n
facilitates
(TTMA)
(fGNPs)
facilitates (Fig.
monolayer
(Fig.
nm)
nm nd
ofacilitatesprobes
non
2a).
probes
and
non
2a).
ofeatured
The
The
u
dhcationic ond onligands
cationic
cationic
mixed
m nnd
nature
nature
monolayer
mono
(TTMA)MA
facilitates
facilitates
and
nd
ast
w
trolled du old
ero dhtheforty on
nanoparticles
n nop
size.
p
past Ho years o
GNPsn 9
forty d
h wto
9fluo
ph d
ompo years ophob h
o n
the
fluorogenic
hydrophobic
[9].possible
m p
to
n dn Thecrossingd
ocomposed
fluo
fluorogenic u drug
the
fluorogenic
nd
particles on uof
drugs,
crossing n n
hHofligands
orelease
release ligands
cell-membrane
nusing un
ntetra(ethylene
BDP (core h
ligands
∼2
mechanism.
of (HSBDP)
onoonm d
functionalized
p cell-membrane
d
(HSBDP) ∼2 o
2intracellular
=glycol)ylated barrier,
d
nm)dh(Fig.qu
43 o d
composed
ucomposed
44non
d n
(Fig.
fluorogenic
fluoompo o
2a).
BODIPY-conjugated
featured
2a). and
G
gold nop
barrier,
on hmnThe
H
2a).dn
fluo
The the m
of
ond o
The
o cationic
d
nanoparticles
u
aligands d
and
mixed
cationic nd
tetra(ethylene
monoh
fluorophore
h n
cationic
MAd
GNPs
the GNPhH
n(HSBDP)nature BDP
monolayer
nature nnature
nd
(fGNPs)
are n n
probesfacilitates
non-n mp
glycol)ylatedo are
facilitates
n 2
nd
facilitates
n n
probesou
u h n
cationic
d cationic on n
on ligands on
ligands
on n o
nd
o u p
non
p od
(TTMA)
od MA u
n
u mndh
and
mGhH
trolled old
o and
rate dh nanoparticles
ncontrolled nop
size.
p o GNPs
[19–21] n size.
p GNPs
h composed
opossiblep o
fluorogenic possible
of
drug ontetra(ethylene
om drug
mb
n ∼2 nrelease
mechanism.
p o nmb mechanism. 43und ompo
glycol)ylated 44 d hcationic
BODIPY-conjugated
o hmn
fluod fluo
BODIPY-conjugated
of
o dtetra(ethylene
ligands
opho
cationic mono
nd p
ligands
GNPs
n h(TTMA)
H fluorophore
ob BDP nare n GNPs
glycol)ylated
and
(TTMA) (Fig.
non- m o 2and
2a).
n non- d
The h on
cationic
on nd
nature
n u (TTMA) MA
facilitates and
nd
ast
w
ast du
duerorts
orate
orts and forty
the
forty on
have
honsize.
controlled
have past o
o years
obeen
years been
b o
forty
[19–21]o nd
h
d
h to
to d
size.d
devoted
hdyears
years
devoted ophob
oto
ophob GNPs
o n
the
composed
othe
[9]. n dtostrategy
n over
on
The
strategy
overcrossingd
composed
crossing
dfluoothe u
the
GSH-mediated
u h
possible
theoffor
nd
particles for u
past
u
pastof
pcrossing
tetra(ethylene
of m H n
the
n of
the n
n forty
mb
ligands
BDP selective
cell-membrane
(core
cell-membrane
forty un
otetra(ethylene
drug un
selective h
release
h of nyears
release
years on
cell-membrane
(HSBDP)
don d
d∼22 to o
omechanism.
represents
b=glycol)ylated o nm)
intracellular
to h qu
barrier,
d qu
barrier,
d o
fluo
nd
glycol)ylated
(Fig.o
the d
d n
fluorogenic
the
hbarrier,
n n h
2a).
featured
n h and
crossing
anG activation
nop
ohodo
hcationic
barrier,
on
and
crossing
G nop fluo
The
fluo
activation
H nthe
thenfluo
alternative
BODIPY-conjugated
H maoopho
cationic
m of
ou
of d
ligands
fluorophore
and
cationic
mixed
d n
of
cell-membrane
n
ofthed
cell-membrane
d GNP
m
p
ligands
GNP prodrugs.
non-enzymatic
(TTMA) ob
nature mb
monolayer
prodrugs.
fluorophore n
probes
(TTMA)
n
probesn
GNPs
and This
p
facilitates
This
p nd
barrier,
bm areand
nd
barrier, probes
n o
nnon-
o and
nd
and n the
n the
hn n nfluorophore
fluorophore
fluo opho opho non probes
non probes
p
n ob
n obm
w trolled heero
n
od and ofh past
the h
controlled
gold
ogold p
past forty
oforty b
salts
osalts GNPsn
forty n
years
hyears 9
inp
fluod
ompo
size.
h GNP GNP o oh [9].
GNPs d
possible
dn
opossiblep
to oThe
o
nu
fluorogenic
the fluo
upon
othe h
crossing
drug
the
nd
particles
possible on
asp h orelease
crossing
m H
the no
BDP
n of
drug
mb (core
gold nas ∼2 n p
cell-membrane
mechanism.
of release
core od o
ho(HSBDP)nm
cell-membrane
= ∼2
GNP 2
bglycol)ylatedo nm)
d
mechanism.
quenches wh 43 ndh 44
BODIPY-conjugated
u m d o
featured
on
hbarrier,
fluorogenic Gho on o
barrier,
H hmn fluo n and
nfluo
nd
BODIPY-conjugated
nn a ud o
ligands
ooophou the
mixedmono
fluorophore
and nd h
via MA the n
GNPs m
(HSBDP)
energy
o p H
fluorophore on mb
BDP
monolayer
nd are
fluorophore
ob n
u h n
non-
GNPs
and/or d
n
(Fig. m b
probes 2
are
hbarrier,n probes
2a).
o2a). u
non- d
The
nThe h nd h
cationic
on on
fluo o
nature
n nu p od p
u
facilitates h
trolled he orts
n
od
o reduction
GNPs of past
hpast o GNP
have
hGNP po
size.
with been
bof–ngold
of GNPs h n9
fluo
po
inompo
pdevoted
d salts to
otohbcomposed
fluorescent
fluorogenic in
ddin dover
oo the
methodology
p GSH-mediated
upon
GSH-mediated
fluorogenic ofligands
crossing
hof
fluorescent
drug as
ontetra(ethylene
pho
past the m
release oof
ligands
n
forty
relies n (HSBDP)
gold h
n release
cell-membrane
release
∼2 non the
years
core
p h
mechanism. m o
the
nm gold
GNP represents
(Fig.
BOD
to
quenches core
dPY
odramatic
represents 2a).
PYw 43
fluo
(Fig.
the h m
quenches
The
on
hquenches
ufluorogenic
fluo 44 G cationic
2a). an
fluorescence
uoH
crossing
BODIPY-conjugated
d an hodo
differential hfluo
mn alternative
cationic
The n and
d
nd
alternative u ligands
ligands
GNP
cationic
of the
orelease
fluorescence
d nd
nature
in MA
cell-membrane
via
mono energy
no
GNPs m (TTMA)
non-enzymatic
(HSBDP)
H
fluorophore on
non
nature
non-enzymatic
intracellular BDP
nd
mb via
facilitates
are nhand/or
u and
energy
non-d
n(Fig. probes
facilitates
GSHhbm o2 and/or
nand/or un dhandndcationicnon
the
h u fluorophore nature
ndoophonu p od u non-
facilitates
probes
p ob GhH
–monodispersity
– and controlled size. GNPs possible drug mechanism. oBODIPY-conjugated GNPs p odare
GNP w h monod p fluorescent
strategy nd for
on the
o d selective GNP intracellular po fluorescence
b activation
d u of prodrugs.
m h n nm This BOD fluo
reduction gold po salts b d nu ligands m ligands h as
(HSBDP) n the (HSBDP)
m gold (Fig.
BOD core 2a).
(Fig. The
on 2a). u cationic
The d cationic
GNP h1–10
nature nature via
facilitates
non energy
facilitates nPY on on GNP u non
he and controlled size. GNPs possible drug release mechanism. fluo
BODIPY-conjugated GNPs are non-
dtrolled od
nmu
orts
o GNPs
GNP
and ofh
controlled gold
op
have
hGNP p
size.
with
ocontrolled
w oforty oo hsalts
been
bof ngold
GNPs
size. years
monodispersity
monod h n
nfluo 9
inp hGNPs
ompo
size.
devoted
d
h GNP
b o o
otoh
p
GNPs opossible
composed
fluorogenic
o o
bcomposedddinp
fluorescent
on o
over
on the
methodology and
possible othe
fluorogenic
upon
nd
o crossing
fluorescent
drug
on
possible
ndh of on
controlled
on aspast
p ho om
tetra(ethylene
release
drug
m the
tetra(ethyleneom relies
m noof
mb
drug
forty
mb d
gold nas
release
nn cell-membrane
size.∼2 n
non p
mechanism.
hH
core
release
nyears owh onm
thebmechanism.
GNPs
GNPb glycol)ylated
GNP odramatic
quenches
to
glycol)ylated dhPY
mechanism. w 43 nd
the
nd hbarrier,
44
possible
po on
m
hquenches h
oncationic
BODIPY-conjugated
u ddifferential
G bu oH
crossing
hcationic
fluorescencehodohm
fluo
BODIPY-conjugated
n drug
dn nn and
nd
fluofluorescence
BODIPY-conjugated opho
udligands
ufluorescence
oophooon
of
ligandsthemono
in
release h
via MA
cell-membranen
GNPs p
energy
m (TTMA)
intracellular
fluorophore
op (TTMA) ob
mechanism.
m mM
on
ob GNPs
nd
mb are
hun and
non-
nand
hand/or
GNPs33
n n
are
d probes
GSH
m h
34 m n
BOD
non-
are
barrier,
bemanates u
BODIPY-conjugated
non- PY
duandndon on
nu fluorophore
the
h u ndoopho
GNPs
GNP
nh
opho ho o are
u
probes
p non-
non
ob G35 hH
d
ol o
oe st
st he
he o
odnmu
orts
nts
nts
reduction
prevent
GNPs
GNP controlled
prevent
d
reduction forty
dmanner,
of
sizes
forty past
past that
o h op
have
gold
that with
w are years
oforty
forty
years n
n
particle
been
prevent
b
hsalts
particle size.
monod
whereas
preventprepared
p –
of h n
tonin
years
monodispersity
fluo
p
years
to
gold
po
fluod
ompo GNPs
devoted bsalts
particle
GNPd oo
particle
salts
op
to by
b
the
electron
fluorogenic
the d
n
electron
d
dnover
strategy
o
strategy
the
fluorescent
in h
n o
uthe
crossing
concentration
methodology
the
crossing
hum
possible
and
humnd
upon
reduction
du
transfer
fluorescent
the on
electron
ndh
crossing
transfer
electron
crossing
h
for
for n
ligands
controlled
on n
asp
of
of ohH
past
on
o
drug
o
H dthe
om
the
the
d
m
of
BDP
BDP
relies
o
processes
forty
transfer
oo
cell-membraneof d
processes
n
(1–10 gold
transfer
cell-membraneof
h
(HSBDP)
selective
release
nn
selective
goldno as dqu mM)
on
the
years
cell-membrane
size. h
core
cell-membrane
qu the H
o
salts
m
wh n
the
n
2
gold
processes
GNPs
GNP 2
processes
[43,44].
p hBOD
mechanism. G2
(Fig.
o
[43,44].
p
GNP
gold h G2 core
intracellular
to
intracellular
quenches
[33,34]
in
n fluo
d
dramatic
2a).
barrier,
hPY
barrier,
core w The
the
The h
versus
on
on
m
2b
The
[43,44].
h 2b
[43,44]. G
on
on
and
barrier,
possible
po on
barrier,
and no
bun H
fluorescence
quenches
fluorescent
Con
cationic
activation
fluorescence
crossing Con
fluo
BODIPY-conjugated
ndrug
The
the
d
activationn n
extracellular
fluorescence
differential
hodo n
The
then andd
nd
and as
o
u
o
u
o
u
GNP
of
o on
ufluorescence nthe
release
fluorescence
fluorophore
the
n h
thein
d
nature
d
via
signal
of
1–10
cell-membrane
signal
of
MA gold o m
energy
thiol nd non
prodrugs.
mM
prodrugs.
fluorophore
intracellular
o dnd on mb
mechanism.
m via
emanates
GNPsoo
facilitates
signal
probes
hsignal
emanates
nd
coreo oo
via u
levelsh
probes
energy
nh
h33
n
and/or are
quenches
qu
energyd m d
This
d34
b
probes
This
GSH
nh
[35], m
probes
non-
barrier,
o
h
emanates
and/or
w
w
and/or n duand
BODIPY-conjugated
BOD PY nd
fluorescence on the
hnun fluo
fluorophore
fluo u
viand GNPs
GNP
nenergy
n areprobes
p
and/or
u nd ob
non-
non G
o35H
d
ol euction od
n
uction
mu mucontrolled
of
manner,
sizes
prevent o GNP
gold
oppwith are
of oon salts
gold size.
whereas
prepared
particle
p – h p
dmonodispersity inpo
fluo
ompo
salts
p
nsalts GNPs GNPddooin
bsalts in
opb
by dthe
electron
fluorogenic
onmpo
mpo d
fluorescent upossible
hcrossing upon
oufluorescent
concentration hum
reduction
dundtransfer
on ligands
fluorescent as
nofonhH drugthe of(1–10
oBDP
as
otriggering o release
gold
nogold
processesh
(HSBDP)
n
hoas
the n
dqu mM) h
core
gold
hthe o
H
saltsm mechanism.
GNP
2p BOD
(Fig.
quenches
[33,34]
G2
in
[43,44].
ndramatic
core fluo
dh 2a).
w
quenchesfluo
Theh
versus on
The
m2b
wh BODIPY-conjugated
Gon H
fluorescence cationic
Con nhn
extracellular
hodo h d
nd as uGNP
fluorescence
fluorophore
ooGNP
pon the nature
via
ddom
hnature MA fluorophore
gold
signal o o
energy
thiol dn
vian non
on GNPs
facilitates
nd
core
no u
levels and/or
hME
oprobes
emanates
energy nh33 are
od[35],
quenches
qu
henergy d
nh m
and/or non-
o
h
nthiolswood
band/or fluo
n du p onm nun u viand GNPs
unenergy
nh ohh are und
onand/or 2oG35
MH
o
est ntsreduction
GNPs
GNP
GNPscore–shell
mu d forty thatGNPp with
w of years
o h
prevent
gold of
m dmonod
GNPs gold
monodispersity
fluo
b
to hpo
p particle b
oon
the upon
fluorogenic indn
methodology and
o nd
triggering
and honcontrolled
electron on
ligands
fluorescent
on
controlled d om o o bdom m mbthe
cell-membrane
relies
aso dnn
the size.
(HSBDP)
transfer n
GNPs
onsize.
nonh n
gold wh
m
b GNPs
GNP
n
bGNPs
gold
processeswith
mou hBOD
(Fig.
core core PY
2a).
GSH
barrier, nd
quenchespossible
po
fluo on
fluorescent
The
[43,44].
mb
possible in
wh on
quenches
h bucuvette,
and on
n
differential
fluo nddrug
d
cationic
fluorescence fluorescence
The
the duin
opho p release
or
fluorescenceob
n in
fluorescence 1–10
cellular
ddom
p
intracellular
viaob
nd mM
mechanism.
m non n viahsignal
facilitates
thiols
ocellular
energy h o m 34
in
GSH BODIPY-conjugated
BOD
emanates
h
and/or
hn b n
whood
fluoPY
fluorescence
p onmu GNP
u are
on non-
non2 M
ndrug release dmechanism. BODIPY-conjugated GNPs nnon-
GNP w h monod fluo fi fluo nn fib
op nd on o d GNP po b u
ethods of core–shell GNPs upon the GNPs with GSH fluorophore m h n m BOD PY dsignal
GNP non
d n olled controlled
sizes p size. are GNPs size.
prepared GNPs possible
byon nthe possible
n drug
reduction hp release
o drug of gold mechanism.
release 43 salts44 mechanism.in h BODIPY-conjugated BODIPY-conjugated
n as cuvette,
nthe GNPs
m
gold nor
n are
GNPs
core non- are
quenches non- uin via energy and/or
dethods ol mu core–shell
prevent
lthat
appropriate pp over
manner,
controlled op op of the p
m
particle
core–shellGNPs
release.
whereas
size. p
b h
nsalts
stabilizing bGNPs bdd doin o
nb
on
GNPs upon
on n
where fluorescent
hcrossing
methodology
electron
concentration
agents nohum
possible du
triggering
ndtransfer
the
on
that
upon fi onm
dpredominant
nof H
o
drug bd
prevent
p m mb
oBDPthe
relies
processes
(1–10
triggering nn
release n
d
GNPs on
mM)pn Hwh
particle the
the with
mou
2p
thiols n
G2
[43,44]. dramatic
[33,34]
mechanism. GNPs GSH
h
in fluond mb
The
blood
fluo
versus
electron
with in
2b
fluorescent hon
on on
cuvette,
differential
Con
plasma
onGSHfluofluorescence
extracellular
BODIPY-conjugated transfer fib opho
n
in o areor
onob
ufluorophorehin
cuvette, cellular pthiol
oo
intracellular
signal
glutathione
1–10
processes
p ob ormM o
GNPsthiols
oprobes
emanates
levels qu
ME h33
(2
33
[43,44].
cellular43 are n
in
GSH
d
[35],
44 34
μM) h
thiols
non- The nfluorescence
fluo inp nn u nnh
h oemanates
emanates
m nd o35
o st nol olled
nts
uction
mu
appropriate d
prevent
core–shell
pp pthat
forty
over that
op opsize. of years
the prevent
n goldGNPs
particle
m drelease.
GNPs
fluo
to
bn
stabilizing fluo
b particle
b ho o npossible
on
the
on electron
o
upon n
where
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fluorescent
n drugelectron
triggeringh
transfer
ndthe
on
thathp hnof d release
o H
predominant
o pbd
preventm as
BDP transfer
cell-membrane
the oh the
processes
nn onnmechanism.
GNPs43
qu gold
pn H44
wh
particle nprocesses
2p
thiols
mou hcore
with G2
[43,44]. hbarrier,
fluo h
in BODIPY-conjugated
quenches
GSHfluo [43,44].
The
blood
mb
electron 2b and
on
on n nfluorescence
fluorescence
Con
plasma
on n The
the
nn
transfer n o
u nn hdH
fluorescence
pare
onob
or GNPs
signalm
glutathione
81–10
processes
cellular
p viand mM areoo
emanates
thiols hnon-
signal
energy ME h (2
[43,44]. d34
in
μM)emanates
and/or
hn w
The fluorescence
fluo
u
nfluorescence u signal n ohon o35
est
o
ethods p
p n nts
olledmu
llthat
that sizes
d forty
npgold
manner, GNPhoprevent
pof
size.
preventare oon
years prevent
core–shell
d GNPs p
prepared
p w
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p ofluo
p
to
opo h
particle
ph
fluo
particle h obin
particle
d o
by
b
othe
GNPs
on human
possible un
mpo
the
dthe
un n
hcrossing quo
electron
reduction
ufluorescent
n
concentration ∼50%
electron
qu du
drugupon
liver on
electron
h fi ph onm
cells
o transfer
m
ow
releaseo
m ofmbo
olivertransfer
cell-membrane
triggering
transfer
m (1–10 o
(Hepgold n n
nd
d
ndqu
43processes
mechanism. hG2)
mM) salts
m
processes bph
44
phnprocesses
the BOD h
(Fig. in
uinnGNPs
[33,34] [43,44].
hbarrier,
PY
2b).
fluo G
[43,44].nd with
on in
wh
[43,44]. h
nd
Controlled
H
fluorescent
BODIPY-conjugated
fluo
versus and
u
hnd
cuvette,
The
fluorescence
n
The GSHfluo The
the dhfib opho
fluorescence
nofluorescence
extracellular inas
GNP n
release
hopho n the
n
cuvette,
fluorescence
n
fluorophore
n dom
8 m
GNPspo
gold pthiol
of M
M dob
n
nd signal
nor
non
the
G2 signal n
coreo
are36
o signal
probes
cellular
dye 43
qu
w[43,44].
levels
36 non- Cu
oh
quenches
was 44
emanates n
[35],
emanates
Cu emanates
h b
thiolsn
n hood
n mfluorescence
fluo
m fluo hodo
in hodo mnon via u n
energy m dnd
onand/orn
and/or
nd uo
2 M
fid
e sizes are prepared by reduction of gold salts as the gold core quenches mnonor o via nn hon
energy hd u
n uction of of gold p p salts d b h du human on o as theo d
cells gold (Hep n
core G2) fluo
quenches (Fig. 2b). n Controlled h d
release
via o
energy qu
of the n
and/or h
dye was
mical
n appropriate
ome
om ol
uction h
mu pp
core–shell
of
hpp n
manner,
over GNP
goldop GNP
ho
GNPand
p
common
ommon of the
ooosalts
saltsdgold m w
whereas
GNPs
physical
drelease. in
stabilizing
po
b
in pupon
hbn h
synthetic
salts
upon do
h obbin n
oon humand
fluorescent
upon agents
and
where
mpo u
concentration
nmethods
m n n
∼50% liver
triggering
o cysteine
hod
nliver that
the
humanfi has
onashof of
odd the
cells
m ow mpGNP
prevent
bo(8
predominant
the o GNP (8
core–shell
aso
livergold
(1–10
mbthe(Hep
gold h μM)
the nn w
wn
GNPs
h n
cells core
mM)p
hG2)m
G2)
n h
particle
b
[36].
gold
core h44 GNPs
GNP G quenches
BOD
(Fig.
mou
with
thiols
(Hep u H
[33,34]
core
quenches
Gmou H Current
G2)n
PY
2b).
in
n G
GSH nd u
electron
blood
quenchesupon
u on
fluorescent
Controlled
H
fluo
versus
mb
(Fig. in
wh u
fluorescenceon
cuvette,
methodologies
2b).plasma
triggering
o
fluo transfer
fluorescence
d
extracellular h h
Controlled
fib nGNP
release n
are
pn
n u
uob
or via
via H p
dom
the energy
processes
cellular po
rely
hGNPs h
of
p
glutathionethiol
energy
h o
non
the
G2
ob
n
GNPs
GNP
via
release
o on n and/or
n
dye
energyw
levels
thiols 43
ME
disulfide
w
and/or
n hnon-
with
of (2was
oh 44
h[35],
the in
μM) hn
G
and/orn
GSH dye b
HThehood
n fluorescence
fluo
inn
was fluorescence
fluo pu
cuvette,
uhodo or signal
u
cellular
u emanates
m
on
thiolso n2 fid
in
nM
n
o
o
n
o
ethods
mical
systems
delivery
systems
mical
systemsp
delivery
p
prevent
prevent
p
nn
ome
om
ome
om
ome
om
ol
in
in
ds
ds
olled
appropriate
ol
ds olled
appropriated
d
core–shell
mu
thods
h pp
that
rmaceuticals.
that
nhofofp
rmaceuticals.
dnh
n
mono
ofmono
p
of
n
p
over
nnof
over
Table
n
mono of
Table
n
goldop
op
GNP
gold
GNP
gold
b
b
ho
ho
ho
po
p
and
common
GNP size.
GNP
of
prevent
size.
ommon
core–shell
po of
core–shell
po
prevent
common
ommon
and
prevent
core–shell
GNP
common
GNPommon
the
the
o n
based
n
based
1.
1salts
systems
core–shell
salts
systems
particle
particle
based
n1.
1 n
salts
d
d
n
n
GNPs
m d
core–shell
GNPs
dnphysical
GNPs
physical
w
p
release.
w
p
w
p
p
p
o
o
o
particle
b
stabilizing
release. pinon
fluo
stabilizing
nd
on
po
po
inon
nd
h
ph
synthetic
po
nd
h
First,
fluo
b
upon
particle
in hum
upon
h
First, o
synthetic
fluo upon
n
GNPs
oGNPs
bo
particle
hum
syntheticn
n
based
based
GNPsn
un
un
un
hd
h
hhb
hh
bo
GNPs
o
n
n
on
possible
on
o
GNPs
on upon
fluorescent
human
possible
o
electron
nhuman
o d
mpo
d
fluorescent
electron
n
d
n
verified
don dn
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d
ofluorescent
humanon
d
verified
n
d
un
un
un
n
and
agents
where
agents
dwhere
mu para que una terapia basada en NpO pueda ser efectiva las mismas deben dirigirse hacia
methods
m un
methods
linkages
and
nd u
linkages
n
methods
m
electron
n
fluorescent
upon
nqu
upon
qu
upon
qu
n
nelectron
human
o∼50%
hod
n∼50%
electron n
hod
∼50%
n
non
hod
n
drug
triggering
h
drug
on
h
on h
upon
cysteine
upon
by
by
liver
cysteine
liver
on
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the
fi on
that
hhuman
the
that
verified
transfer
verified
transfer
human
by
human
hp
p
has
as
ph
as
hn
hn
h
o
triggering
ph H
of
o
release
m
cells
triggering
phh o
treating
between
H
triggering
between
h the
treating
of
o liver
the
ow
m
release
oocells
treating
n the
md
ow
md
o
m
m
triggering
transfer
b
prevent
p
dprevent
GNP
predominant
p
transfer
p m
mb
core–shell
mo
triggering
core–shell
predominant
cells ow m
transfer
pm
GNP o(8 G2
the
o
liver
oby
o
o
liver
core–shell
GNP o
(Hep
on
gold
processes
G2 on
(Hep
by
processes
livergold
(Hep
on h
cells
gold
h–μM)
–
h–μM)
12
n
the
the
n
u
u
o
n
n
o
u
qu
w
qu
w
n
w
n
n
h
mouse
o h
mouse
n
nd
treating
cells
nd
mouse
qucells
h
processes
43
mechanism.
GNPs
the
nd43
mechanism.
cells
the
ntreating
h n
G2)
G2)
(Hep
A
core
m
m
44
b
[36].
[36].
processes
the core m hn
h
ph
particle
p
core nu
hn
particle
pdrugs
processes ph
ph
drugs
u
u
the
GNPs
GNP
the
2b
GNPs
GNPs
GNP
2b
GNPs
GNP
(Hep
G
(Hep
G
h
with
(Fig.
BOD
thiols
h
(Fig.
BOD
[43,44].
(Hep
GNPsG (Fig.
BOD
u
hquenches
thiols
GNPs
[43,44]. H
GNPs
h
Current
GNPs
h
embryonic
h
mouse
Con
uembryonic
quenches
u
G2)
quenches
h
h
ond
H
and
mouse
H Con
and
embryonic
on
fluo
Current
[43,44].
2b).
PY
with
G2)
on
fluo n
with
in
2b).
PY
Gfluo
fluo
inGThe
[43,44].
[43,44].
G2)
with
n
2b).
on PY
(Fig.
G2)
fluo n
nd u
with
BODIPY-conjugated
GSH mb
H
with
electron
upon
mono
blood
Gcarriers H
H on
human
hum
The
o
u(Fig.
in
wh
BODIPY-conjugated
(Fig.
mono
blood
o GSH
electron
GSH
h
Controlled
uponon GSH nu
nd
nd
d
Controlled
carriers
upon
u on
mono
human
hum 2b).
(Fig. nu
n
nun
d
The
fluorescenceon
on
2b).
GSH
GSH n
cuvette,
methodologiesn
plasma
fibroblast
fluorescence
embryonic
Theon o
fluorescence
triggering
fluo
in
in
triggering
plasma
fluorescence
Controlled
methodologies
fibroblast
The
embryonic
2b).n
fluorescence
ndn
fluorescence n [37–42].
liver
in
o
[37–42].
liver
Controlled
2b). b
triggering
fibroblast o
d h
transfer
transfer
fibin
opho
fluorescence
h
in
Controlledn
cuvette,
b
hnGNP
fluorescence
dcuvette,
Controlled
fluorescence
d h
b
Controlled
GNPGn
p
release
GNP
cuvette,
b n n
n
n
are
are
release
cells
release
Gn nn
cells
nu
cuvette,
n
ob
orw
cuvette,
n
uw
Gofibroblast
ofibroblast
u w
H
cells
HH
via
cells
H
HWhile
via
via H
While
cells
cellular
dom
the
8
the
8
h
h
OE
m
rely
or
n p
processes
p
p OE
hsignal
h m
GNPs op
of
glutathione
8(Hep
(Hep
signal
OE H
H
release
the
h or
n pof
rely
d
of
n
h
energy
M
M
M
h
hrelease
energy
glutathione
or
processes
n o
pd nd
(MEF,ob
n
G2
o
GNPs
GNP
nd
(MEF,
p
(MEF,
nd
p
h
G2
release
hrelease
energy
n
nor
signal
the
GNPs
non
GNP or
the
G2
the
non
GNPs
GNP
o
0
this
this
0
on
cellular
cellular
hnon on
G2)
signal
G2
G2)
G2
ud
are
n
d
are
do5
0emanates
cells
signal
w o
cells
emanates
w
cellular
o o
of
d
cellular
thiols
36
36
36
5 n
n
w
dye
u
w
w
dye
ME
with
w
cellular
n
5dye with
w
emanates
disulfide
h
having
nd
approach
(Fig.
and/or of
approach
u the nd
o
[43,44].
and/or
u 43
non-
of
having
nd
43 (2
[43,44].
(2
disulfide
having
(Fig.
of
with
w
and/or
h
was
h
was
Cu
h
thiols
Cu 44
the
thiols
(MEF, h44
emanates
emanates
(MEF,
h the
thiols
was
Cu
n dye
the
h
in
nd
20
μM)
nd
20
μM)
2b).
2b
20
2b).
2b
nd
h
GSH
G
GSH
thiols
Gdye
GSH
G
b
H
thiols
dyemM
mM
n
mM
was
dye
n
H
n
mp
H
in
Theh
in
The
Con
n
ood
having
in
in
hnin
having
nin
n
m
was
m
Controlled
was
m
Controlled
Con was
n
in
in p
cuvette,
37–42
fluorescence
fluo 37–42
cuvette,
nfluorescence
fluo ouhodo
o hodo
cuvette,
u d
37–42
m ono
o Wh
onor
release
dnrelease
o or
o n
Wh
Wh
u
cellular
signal
signalu
n
n the
cellular
hou
of
of
o
cellularu the
h
h
hh
h
on
on
on
n
on
thiols
h d
emanates
m
emanates
m
thiols
dh d
dye
dye
d
o
pp
pp
do
thiols
h pp
o
n
n was
37 w
w
2
u
u
was
in
o
o
n
n
in
M
fid
uoin
fidh
fid
n
h
h
delivery
micalprevent
areome
om
core–shell ds
in ored n b p of
Table anchored
b with
b
and
common
ommon
core–shell
d systems
onparticle
1.
1 n GNPs thiol-
h
physical on
withhum
synthetic based
nnun
GNPs u hfion on nn
thiol-
upon∼50%
electron
d on
fluorescent and
b m n
methods
nd n human
upon hod
triggering verified
transfer
lower
cysteine
non ∼50%p
p n H
of
o liver
triggering p
mou othe
lowerG2 by
processes
intracellular
(8ocells
core–shell 12–μM) treating
43
GNPs
43hthethe (Hep
A
mb44
[36].
44 2b
GNPs
GNP
intracellular [43,44].
GNPs
with GSH
G2)onmouse
h
h Con
Current
ond levels
fluo
(Fig.
with
GSH o
The
upon
GSH
human
hum embryonic
GSH
in
ob dthan n
methodologies
fluorescence
2b). n Controlled
triggering
b[37–42].
fluorescence
levels
cuvette,
nn in
liver Hep
cuvette, n
ofibroblast
orn
than
cells
n MEG2)h h
cellularm
signal
release
the
(Hep
m HHep
or d
rely with
nwith
h n
GNPs
GNP
p
n ud w
cellular
G2)
G2 cells
emanates
on of
G2) varying
nvarying
thiols
n wnd (MEF,
disulfide
the
withwith
(Fig. ndye
h
thiols
in Giswas
GSH
2b).
2b having
mp inin
HControlled
varying
Con cuvette,
ouu 37–42
n fibroblast d or
nrelease n
ocells cellular
hof
o u the
h nthiols
dye
d 37was
hhaving
o w in
n h
mical are
core–shell
delivery
prevent dsored ystems
d
rmaceuticals.
ic ch hb monon [12].
groups
of po
oup
anchored and
with
b
core–shell
d based
onn A
systems
particle n hphysical
have
GNPs thiol-
h
secondp on
First,
nd
with
fluo o
hum GNPs
based u
fabricated
b no
thiol-
upon∼50%
dd
verified
nverified
electron n
d
onand
linkages
can
b d n be
delivery
upon
d cysteine
lower
on
triggering
human h h by
∼50%
verified
transfer n
treating
between
effective,
ph o
triggering
n H d
systems
liver mou m (8
intracellular
lower
the
plower G2 on
by m
cells
processes
–μM)the
includingo
mouse
uqu
GNPs based
b
treating [36].
n
drugs u
intracellular
mb
(Hep 2bGNPs
d h
with GSH an
on
G2)
[43,44]. onhCurrent
embryonic
and
mouse
Con on
fluo levels
example
fluo
with
GSH
(Fig. fib mono
carriers
verified
o
TheGSH methodologies
GSH
in
ob
2b). n
dthan
n currently
d
levels
fibroblast
cuvette,
embryonic in
Controlled by
b Hep b G n
treating
cuvette, than
or
o w H
in
MEG2)
cells
While nOE
the
cellular
h release
signal rely
n
or
Hep (MEF,
h
dncellsnd
mouse
mou 0
this
clinic
h on
cellular
w do
G2)5
thiols
ofn
cells
emanates disulfide
having
approach
u [37],
the embryonic
thiols
mb
with
(MEF, in
dye 20
ndit mM
on in
varying
having
was ob Wh (MEF,
ME h h pp no
very
delivery
prevent inic
ored
ch dystems
nh hbmono ngroups
pTable[12]. b po
oup
systemsbd
with based
n
systems
1.
1 AnGNPs
n
particle hthiol-
haveo pfluo
hbased
second on
nd ofabricated
hum nun
based
n uh
b fi
on on no
n don
∼50%
electron n
dlinkages
can
bnddnn d be
delivery
verified
monod on
non h
lower by
hverified
transfer ph
effective,
phbetween n
treating
opsystems
H by dmoup m
intracellular
G2o on
processes including
m
12
treating
by n o
mouse
qu
u
43 based
bnop
treating A 44 nu2b dhGSH
mouse
[43,44]. an
on h
embryonic
h
ond
mouse
Con on
example
fluo fib
levels mono
verified
embryonic
human
hum
o d fi
n
d n currently
fithan n
fluorescence
fibroblast
n
embryonic n do u by Hep
bfibroblast
b[37–42].
liver bo Gn nw
fibroblast
treating
cells
o H
cells
in
unG2)h nOE
the
m
(HepHn d h (MEF,
nd
withh
clinic
n
mouse
mou
p 0G2)
ud
G2w on5
d
cells u
(MEF, nd
having
[37],
nvaryingembryonic
(Fig. mb
ndye
(MEF, nd20
having
2b).
2b mM
it oisvarying
onmp
having
Controlled
Conh fibd ou 37–42
ob
u nrelease
dfidrelease Wh
cells
nn o(MEF,
hof
of ME hh
theAdd hpp
dhaving
n dye
dye 37on wno h
was
∼50% hThe signal emanates
are h
core–shell olayer anchored
GNP on
protected with
upon thiol-
upond
concentration n
triggering ncells GNP of the w
glutathioneGNPs intracellular
h
mb G with Hon nGSH
monoester fluo u GSH ob
in fi levels
cuvette, fibroblast than
ufibroblast
or ME cellular Hep
h o
h G2)
thiols with in fibroblast
fib
wvery
y
y h in rmaceuticals.
ch nhh
rmaceuticals.
ored
ic
erse olayer
nctional
n of
ofpTable
hgroups
[12].
on
n
systems
n boup hd1994
monolayer
GNP b 1994
with oon 1.
1n
protected
nanoparticles
monolayer A have
hthiol-
moieties,
mo h based
osecond h
First,
upon
First,
onh nmm
n bh
protected
∼50%
fabricated
u
protected on
fi on
which
wh n 1
human
1 ∼50%ow linkages
concentration
can
nd
difficult
h verified
dnmonod
human
d
human
are beliver
delivery
nnon
lower concentration
n∼50% p hto
between
effective,
anchored
n
concentration o by
psystems
liver
liver
ho GNP
tuneof u
intracellular treating
(Hep
dcells
m
cells n
the
the
w
the
glutathione
including
12 with
w Gbased
43 G2)
b nop
(Hep
hof
h
AHdrugs
drugs
44 G
reactivity
(Hep
of mouse
(Fig.
thiol-
h dGSH G2)
glutathione on
H
G2)
glutathioneo an h
ond
and
and n(Fig.
2b).
monoester carriers
levels
example
(Fig. of human
embryonic
fib hum 2b).
Controlled
verified
n
uControlled
carriers
the
∼50%2b). H fi(GSH-OEt:
fluorescence
dmonoester
fithan
n nn o
b
disulfide liver
u
Controlled
monoester dplower by
[37–42].
(GSH-OEt:
currently
Controlled
ow G2
bG2 Hep o
releasecells
treating
u
n w un
in
While
(GSH-OEt:
While
G2)
linkage.
n
(GSH-OEt:
0,
0,(Hep
m
the H
release
hn of
release
intracellular h 5
5 n cells
h o
withand
p
the
mouse
mou
and
n u
this
G2)
G2
this
clinicud of
of
20
(MEF,
0,
dye
n0,
20
n the mM)
approach
(Fig.
5embryonic
was
approach
varying
Additionally,
the
GSH
G5 mM)
[37], and
mb
n
H
anddye 2b).
having
2b
it ois
20
levels
20was
on Controlled
Con
mp
was h than
mM)
mM) do ud
ob
fibroblast
fib
h un fid
n
Hep
H p nn h
cells
G2)
G2 o the
(MEF,
ME
with
w hAdd
h n d h37on
having
varying was
w n
n
wvery are
core–shell
are h ored
erse olayer
nctional
nanchored
ch w hh hbb p h anchored
onsystems
n
GNP
anchored
groups
h ouph
b
with
1994 o
nanoparticles
oprotected n GNPs
moieties,
mo ho
with
have h based
thiol- with
on
upon
with∼50%
h∼50% nm
thiol-u
nbnh
fabricated fion on
which
wh human
thiol-
upon
n 1d
thiol-
n d
∼50%ow b
bndhdomn
difficult
concentration verified
are
∼50%
monod liver
triggering
delivery
d lower
nnon n p n
hto
anchored
1n∼50%nm n cells
o
lowerho
pby GNP
systemsmou
omou lower
uthe
lower(Hep
intracellular
tuneof 150 treating
d 12
m the
glutathione
wnw
with G
GNPs
43
intracellular
nm G2)
b intracellular
AH
mb44
hreactivity
noph G (Fig.
mouse
thiol-
intracellular
based h with
db GSH
boon Hon
on h
ond 2b).
GSH
monoester
1 n GSH
fluo
of
fluo h
embryonic
levels
fib GSHn
the
∼50% ob
in
uControlled
GSH
verified d H
levels
hfi levels
cuvette,
than n p
ndisulfide
b
o(GSH-OEt:
olower
levels
d ow
ub bythan
bG2 release
Hep
fibroblast
uo than
or
n
ufid
than
treating w ME
linkage.
n un
Hep h
cellular
G2) 0,h
intracellular n m of
Hep
h 5nh
Hep G2) the
cells
h
withn
and
omou uw
mouse
h
mou ud dye
G2)
n(MEF,
thiolsvarying
n[37],
Additionally,
nG2) 20
with GSH was
with
mM)
G5embryonic
withHinin
embryonic
n
mb having
levels
varying
o oisvarying
ump
varying
on hwthan hunob
hdh uuHep
ob n p cells
H nn h with
G2)
G2 w hn o
n Add
(MEF,
ME p37on
ovarying
having
hp n n
on n
w core–shell
y
ble ic ofd hgroups
[12].
fashion
w hd
monolayer h oon A N GNPs second
using
BH hum protected
n fi n upon
human
h ow can triggering
beliver n
concentration
H
effective,cells p uthe
G2 (Hep GNPs
includingGbased G2) mb
of
H2b with
glutathione
(Fig. on
anCon GSH
2b).
example fibho ob
nin d ficuvette,
monoester
H fi plower
–d
currently o5
releaseor w ME
h
incellular
(GSH-OEt: the d
of h the
clinic nwith
thiols
0,
dye wasand 20
itlevels mM) fibroblast
fib fid
ww
very
ystems
y
ble
very
y
ble
ystems h
mono
h
o
monolayers.
n
ic
oerse
monolayers.
mono
ystems
ch
anchored
nctionalwin
hp
olayer
in
anchored
olayer
nctional
n
erse
n 1994
nctionalw h pof
pof
dh
150
d
150
monolayer
in
b ho
o h
[12].
h
nd
on
fashion
w
on
on
n
GNP
n
GNP
w
fashion
oup
systems
scalable
systems
scalable nm
monolayer
oscalable h
nm
monolayer
h
o
1994
1994based
ho
protected
nanoparticles
based
protected
h
obased
o1994
dnanoparticles
(Schemeon
nanoparticles
Amo
d
d N
N
have
with
h
moieties,
(Table
with
(Table
moieties,
mo
d
hN mp
moieties,
mo
o
o BH
BH
using
based
fashion
second
using
A
on
based
A
fashion
on hum
protected
fashion
oon
h
upon
h
upon
hum wide
w
wide
w
1)
fabricated
∼50%
∼50%
thiol-
on
on
on
nm
1).
n
1).
md
dd
bnh
protected
thiol- n
protected
h
fiwhich
on
wh
on n
n
which
wh b
hn
using
which verified
human
h1
variety
no ow
human
using
dn
verified
ow can
b1)
hdom
1concentration
concentration
variety
using
verified
n hh los AT- Aβ presentes en cerebro.
difficult
difficult
∼50%
delivery
d
verified
are
on
monod
thiol–disulfide
∼50%
on
monod
thiol–disulfide
hom are
be
n oby
nliver
verified of
of
o
1
by
concentration
on
are liver
by
o
n
1n
nm
anchored
nm h
mono
n
hto
monolayer
mono
oconcentration
H
monolayer
oconcentration
anchored
n
nn
lower
treating
Hcells
effective,
treating
lower
d
cells
treating
to
anchored
ho
u systems
by
upby
upmou
ho
poofu
GNP
tune
poofu
GNP
mou
tune
G2
G2
150h
h d
(Hep
150
un
hdd
(Hep
mintracellular
treatingonwith
w
glutathione
exchange
treating the
on nw
glutathione
exchange
on nw
with
of
w
nm
mouse
including
mouse
G
nm
G
mouse
the
with
b
G2)
nop
hof
nop
protected
pon
intracellular
protected
p
mono
h
o
mono
h
oH2b
hof
2b
glutathione
G2)mb H
mono
G
reactivity
G
h
moused
mouse
thiol-
(Fig.
hb
thiol-
reactivity (Fig.
thiol-
embryonic
can
glutathione
can
glutathione
oHanCon
d
oHCon
d
embryonic
on on
1
2b).
GSH
example
monoester
embryonic n
occur
GSH
monoester
1 n
occur
2b).
of
of
o verified
embryonic
∼50%
G
hmonoester
hou ∼50%
Gob
ob
levels
uControlled
Gthe
embryonic nwith
n d
Hh
with
concentration
on H
levels
concentration
on
Controlled
the
∼50% HnH
fio
OE
OE nd
fibroblast
monoester
fi
OE n
hfibroblasth
uby
ow
–d
currently
(GSH-OEt:
fibroblast
Hdisulfide
dmonoester o surface
plower
o(GSH-OEt:
o
p
disulfide u
surface
ow
–d
onhlowerow
than
than
G2
G2 b0
0 u
fibroblast
on
treating
o
0(GSH-OEt:
release
fibroblast
ono
uood
ood
release
ufid
5u
5fid
w of
o
Hep
intracellular
cells
n hnd
in
linkage.
ofun
oun
(GSH-OEt:
cells
hnd
Hep 0,
intracellular
w n
cells
ME nd
linkage.
intracellular
n
n
hthe
cysteines
(GSH-OEt: h
dh
of
du
of 5
(MEF,
20
0,glutathione
cysteines hu5
hh
glutathione
20
h
m
(MEF,
omouse
G2)
cells
(MEF,
20 G2)
o
h
cellsand
the
hand
0,
the
uw
uw
u
mM
clinic
mM
mM
h
h
n
nn n
(MEF,
n20
Additionally,
of
(MEF,
on
0,
dye
of
5dye
po n 20
on
0,and
GSH
having
G
[37],
having
with G
having
Additionally, 5
GSH
GSH
G
mb
mM)
was
mM)
Hvarying
n
proteins
5nwasmonoester
mono
and
proteins
and
H 20
H20
o
having
it
having
varying
monoester
mono
n olevels
olevels
ois
o20
20
mM)
on
u
u mM)
hwthan
mM)
h wthan
wthan
hd
hd
h n
nuuHHep
fibroblast
fib(GSH-OEt:
Gn
GnuH
uuH
(GSH-OEt:
hG
H
fid
Hep
H
H
fid
pHepOE
OE
op
p cells
p n–
G2)
G2n0,
n
G2)
G2
n–
G2)
G2
0 5
0,
0
0 5with
(MEF,
5withME
n
with
w and
wand
w
nd
nnd
h 20
Add
Add
h o20
h
having
h
varying
onpmM)
varying
varying mM
o
on
mM)
mMon
uon
n n
monolayer protected dwh h ∼50%
concentration ho w
of h
glutathione uh o
monolayers. anchored et al. in mpwith A (Scheme
wide d
thiol- b ∼50%
variety of monolayerd
lower un pon
intracellular
protected don GSHfib monoester n
levels
concentration thanb (GSH-OEt: ofHep glutathione m
G2) 0, 5
po and
with nmonoester
varying mM) n
(GSH-OEt:p o 0, and on u
can
ystems
ble
mono
ble h
h o erse red
1994w
anchored
red
1994w
b
in
bet non
do
150
on
monolayer
d h
b
al. w with
fashion
nd
functionalization,
be
scalable
h
nd w u
d
with
pfunctionalization,
fashion u
d
(Scheme
nm
in o
(Scheme
on
on
hon
obased
formed
h n h
1994
d
h N m thiol-
(Table
with
thiol- BH
using
BH
using o
d
fashion hum
protected
oon w
1)
(Scheme
hum1) 1).
on pd
thiol-
rapidly nfi
n nn d
h o
no
∼50%
using
verified
h
dn
b
b
difficult
thiol–disulfide
in
and
1)
innd om
om ∼50%
the
the
lower
in oby
nof
lower
concentration
on 1
mono
nm
n
1oscalable
nmn
to
Hlower
bloodstream,
treating
H
bloodstream,
intracellular
u b tune
poo G2
intracellular
p
mou
G2150
150hexchange the
onof hnm
intracellular
fashion mouse
nm onmb o
reactivity
2b
potentially
glutathione
mb mono 2b using
potentially
GSH
GSH b
on
can
bon
Con
nCon
embryonic 1
levels
1occur
GSH of
fib
levels on
the
ocreating
monoester
o Gob
creating
d
H
d
than
with
than
h
disulfide
hfibroblast
levels OE
o surface
–d Hep
than
Hep on
u o5
protein–carrier
0(GSH-OEt:
u o
protein–carrier fid ME
ME
G2)
oHep
linkage.
G2)
cellshnd
cysteines
h du
d
with
h G2)
with
20
(MEF,
h h0,
h w
mM
w
hnn
n 5bof
n
varying
on
Additionally,
varying
and
having
conjugates
mono
proteins
conjugates
with n
n 20varying
o mM) u w
u h
h u
OE nnd
n o20
o pmM)
p
mM o n
o n
can monolayers.
scalable
ystemsmono
h o
ith
monolayers. u
m red in
etp n
hon
150 h o
bndal.be
scalable
b
NaBH h
uh
with
hd in
nm formed
o o
based
oonoon fashion
d
1994 mp
mthiol-
(Table
in
nin n fashion
AAdon wrapidly
wide
(Scheme
∼50%
theh1)
wide on
1). d
p
usingd fi
h d busing
variety
n
verified
o∼50% ow
variety and
1)ndh on
thiol–disulfide inno
lower byo scalable
monolayer
mono
n scalableMo d
treating u b o
intracellular unh fashion
uoglutathione on
exchange h
mouse
G on on
protected
p h o
mono
Ho using using
u pho
GSH n d
embryonic
can on o fib
levels
occur G
hmonoester
nob Hn
concentration
on w than
with OEpn
h
fibroblasth –d G2
surfaceHep b 0 onood5wfidd of
o
cells
G2) bnd glutathione
cysteineso
o5uwithu
hglutathione20 m
(MEF, mM h po
n onhaving
varying
of n monoester
mono
proteins nd ph m n
(GSH-OEt:
G o Hp no
OE n– 0,
0p 5
ofi and
nd 20
W on u
mM)
mM p
canmono
scalable
duced
olayer
eover,o ith u
m 1994 monolayer
b n
h oh
150 h
b be
bdeveloped
NaBH m
functionalization,
monolayer h nm o
(Schemeformed
with
protected
their fashion
1 4 m
h(Table
mp n nNaBH
protected
d
od
protected
photo- w
∼50%
theh rapidly
1). dd44h
using
p h din bo d oow–theand
concentration
b nd
thiol–disulfide
in
with the nof
on
concentration
in
hnconcentration alteredmonolayer
mono
Mo
n in
bloodstream, b of
mou
dnintracellularu un fashion
exchange
bioavailability of
ofGhprotected
ponhonglutathione
H
mb uGSH
potentially
glutathione phocan
on don
1and ooccur
nmonoester h concentration
n on w
with
creating
monoester Hn pn
hhsurface
(GSH-OEt: G2 on
(GSH-OEt:
protein–carrier
b(GSH-OEt:
ood w dME of
ocysteines
bh
0, hand
m0, 0,hn 5b
po
5 20on
of and mM) monoester
mono
proteins
conjugates
and nexpect20
20 ndmM) mM)ph m(GSH-OEt: nG oH p nOE
o n– 0,
0p ofi 5 and nd 20 W onmM) mMu p
ocol by – hpharmacokinetic profiles. We
o
duced
scalable
olayer et al. d inwith
protected 11994
nfashion op NaBH busing
(Scheme fiSchiffrin
in ho
∼50% the 1)
concentration et al. 1994
of glutathione (Scheme h m 1)
monoester fib (GSH-OEt: 0,
can
al. h
eover,
ocol
o h ith m
u red
1994 b
et h
non
onoh b
h
in nd
NaBH
al.be dmh uh
with
d (Scheme
bdeveloped
1994
u in
developedouoon
theiron
formed 4
11994h
4d mp
m thiol-
opn in nNaBH
(Scheme o
photo-
d d 1)
∼50%
theh
(Scheme
by
rapidly
b pd fi b o
Schiffrin
1)
dsize d
h
∼50%ow
– b with
1)
and ndh nthe lower
et
in nn altered
al. n
Mo
scalable d
in mou umo
1994
nintracellular
b un
bioavailability
o fashion G
(Scheme
hp on
hon
on mb
Hpotentially
h m using
uGSH pho on 1)
1 on
and
nmonoester levels
fib
olevels nobw Hthan
n
pharmacokinetic phh n G2 Hepb ood w dMEG2) bh o5
profiles. h and
with
m n
po20
b varying
We mM)
n expect nd ph mn n op now n– hpp ofi W on u p
can
al.duced
olayer
scalable
ocol
or
o BH
eover,
emote
p
s.
pe
m
s.
u
red
eth
th
calablen
h h
oo
The
in
ligands.
fashion
The
hbNaBH be
b
NaBHdwith
m
functionalization,
functionalization,h nhcore
1994 with
protected
ouoformed
core
their
place ooh hd
fashion
d1 4op
fashion dm thiol-
size
(Scheme
The
using
n in
size d
photo-
nNaBH
[13]. d
− of
core
∼50%
hcore
the ofon
rapidly
by
busing
on p
using hdsize
in
4Schiffrin 1)
on huuow the
concentration
–the in
and
of
in
nconcentration nd
with
our
on
ndu
on the
lower
in
etn no al.
nanoparticles Mo inu
bloodstream,
scalable
bloodstream,
oaltered unb of umo
1994 o
h glutathione
on
fashion
on(Scheme
hglutathione
bioavailability h
Gtoph mono
h
H
be m using
u
potentially
mono pho
resistant
13
13 n 1)
1and oh
G
G nH
creating
creating
H
hpharmacokinetic
to
ou
ou
w
than
HOE (GSH-OEt:
OE
exchange hn G2
ph G2
Hep
nop
0
0 5
protein–carrier
nop
protein–carrier
5w w dnd
G2)nd0,
bh h 520
o520
profiles.
with
and o
omM
mM
b
bnb 20varying
conjugates
We
mM)
conjugates
expect nd
n
n ph o
o mh h n o n nw hp pp ofi
o
o n n W du
du o op hh
al.duced
olayer orBH paration, ligands.
hin
fashion mon
1994
n with
protected AuCl
AuC The
(Scheme
using salts in1) are of reduced al.d with
w of h NaBH
N BH 4 uin n the hmonoester (GSH-OEt: 0h with 0, proteins and 20 due mM) to the
emote
6
6
ed
ed duced
olayerocol
varying
al. o
or
ocol
o BH
eover,
eover,
varying
emote
al.
ed or BH s.
s.
m
u
s.
p 994
esired
p 994
aration,
e on
aration,
e oonnm
hThe
w
wo
oh
The
o
cromolecule
o
arying
onnm The
o
b
in
with
ligands.
fashion
inwith
ligands.
with
fashion
u
u
dm
d
h
nd
on
nd
n
by
hcore
developed
on d
developed
d 1994
dcore
(Scheme
u(Scheme
nd1994
by
n
o
place
ou
with
their
nh
place
ou
o
protected
their
nthe
the
thiol
core
ou nthe
hd1
NaBH
d
NaBH
d
4d
AuCl
AuC
oAuCl
AuC
varying
varying
h NaBH
d o o
op
op
dThe
d
n in
size
The b
usingn
(Scheme
bh
size
(Scheme
using
size
[13].
NaBHn
photo-
thiol–
h
−
d
4
−
d
∼50%
h
the
ou
n−inter-
photo-
thiol–
[13].
capping
h
thiol–
4 4
1)
ou
4core
4pp
1)
ou
of
core
of
on
by
salts
b
on
of
on
in
by
binn h
nnhthe
salts
the
the
in h
4h the
thedsize
nop
nop
d
d
in
4Schiffrin
o
Schiffrin
1)
1)
size
h
h
nare
thiol–
hu
uow
nconcentration
are
ligand
thiol–
n hu
– the our
of
with
with
our
on
reduced
n
n du
reduced
steric
of
nd on
on
du
or
o
et
no
o
o

nanoparticles
et altered
–b al.
altered
–b
nanoparticles
dMo
dom
shielding
ligands.
om in
in
nd
u
with
wn
n
with
w mo
u
u
of u
1994
1994
o
mo
mo
h hglutathione
homo
hThe
h
omo
h
Non(Scheme
NaBH
bioavailability
NaBH
N
bioavailability
on
of
on
Gto
BH
BH
to
phmono
(Scheme
p
the
core
o
p
H
be
h
h 4u
4
mono
be
mono
in
m
m
in n
n
pho
resistant
resistant
gold–thiol
size
13
the
the
13
13
h
h
1)
1
nof
o
o
monoester
n1)
1 and Gton
and pharmacokinetic
G
Gto
H
H
wH
ou
pharmacokinetic
interface.
H ou
OE
exchange
OEn
exchange
ou OE
p n nop
(GSH-OEt:
n 0h with
nop
0
nop
5 dd
with
5 d nd
5
nd
nb
0, o
nprofiles.
nd
520
proteins
o
profiles.
o omM
20
proteins
20
and omM
o
h
hbNWe
mM
bnb
b
20 due
We o
o d–
due
mM)
d– toh
expect
expect
to
nd
hthe
no ph
the
n
n
on mh n
o on h n w h p o n du o h
o h
o
n
w h p ofi
w h p
o n W
o n
du op h
du o h
6ed or BH
gands.
gands. 994
esired ecromolecule
aration,
esired o
mote
aration,nm
h w ligands.
fashion
nMMPC
with
n m d
d
onn
bydplace
(Scheme
on thiol
The
Theh1varying
thiol
h h
b
b oAuCoThe
AuCl
AuCl
AuC
NaBH o
bcapping
using
core
n[13].
core
n
n
h
capping
−
4inter-
pp
pub
4
1)
pub
pp
core nn the
salts
size
the
salts
in
size n
nop
nsize
of
h are
ligand
thiol–
of
h b
are
ligand dof
d
steric
nd
our
nd
reduced
reducedor
du
on
du
or
o
–b shielding
nnanoparticlesdom
ligands.
d
ligands. nd
nd
with
wo
with
w oh The
hThe uomo
u h
h
Nofn
NaBH
NaBH
N to
BH the
core
BH
ncore o
o on
be
on4u gold–thiol
in
size
in nresistant
n
size b the
b
the
oh
o hnof
o
of
o n to
n
interface.
exchange n h with
n nd n ud
n ud o hw due
proteins w
oh d–tohdthe
h d
omon
mon
n d
d u d
u d nd G
nd G H H
h mote
arying
on hhh
cromolecule
w NaBH m nd h
u(Scheme
MMPC dhTheplace o
the
1d
nthe do–from in hthe
thiol–
bh the
[13].
h ou
ninter- n hnm nthiol–
nop h
bto our
steric nanoparticles
shieldingomvarying omo of tothe be resistant
ugold–thiol n– demonstrated to exchange
interface. h hcellular with d n delivery proteins
o h h oand due to
d– GSH- ho the
o n n
A) B)
6ed ocusing be
b
gands. 994
h oonnm with
varied
NaBH by
nd NaBH
on
varying
d – incoreombiosen-4
41.5
4
1)
ou in
1sizethe
5pp the of ond ∼6 6or In nm –brecent by
bom studies, nncore the honwe4
thiol–
h have o
arying u n o thiol– nhnm h
4
6 ocusing esired
be
b o hh
nm w nMMPC
m
varied dbyd thiol
h1on
d bon
varying o from b
omn n
h
biosen-
capping pub
pp 1.5
1 n
the
5 nm nop
n h b
thiol–
ligand do
to ∼ nnm
oIn recent
ligands.
–b by
b ndvarying ostudies,
varying Theuomo
hw n othe
the h we u size b
thiol–
oh have unof
o of
o–on n
demonstrated dn cellular d nd n ud o
delivery o w oand hhd– dGSH- h d mon d d BOD u PYd nd G Ho
m d 994 by no(Scheme
varying
hthiol o 4oo the
15 1) thiol– on h by w m d ophob BOD mod
h NaBH 4 in the
ded H
esired n cromolecule n through
d h –from o
cappinginter-
the
pp MPC n ligand Ato steric
ond 6or
o shielding
ligands. bndrelease The of
nncore the gold–thiol
size interface.
m
mbe
be
gands.
ded
ocusing be
db
gands.ry.H
view
h n The
by
cromolecule
ThehhNaBH
by
h
varied
nn varying
no
extended
MMPC
m n core
through
varying
extended
MMPC
m will
hwill
core
The
h
The o
1
d
1on
onb
bon size
in
size
core
om
core
focus the
15 through
h
biosen-
o
n
n the inter-
of
the
pub 1.5
1
MPC
through
the
h of
pub
size
thiol–
size5
onpp
thiol– nh
n
of
h
of bA
b the
d
the
d
∼
on
steric
mediated nnm
In
n
h
shielding
recent ostudies,
o uhw
u
of w o
the
of honwe thiol–
o h
agold–thiol
bhave oo–on
u
o
hydrophobic demonstrated
n m
interface. dye n (BODIPY), d
cellular n ud NE(
delivery as o wa NE( hh dGSH-
and
model ophob
d of mon d d d u PYd d modnd G G H Ho
mbe ded
be
ocusing
o
MPCs) be
b d
b ry.
ry.
H
view
h n Thebyhp varied
NaBH n
no
extended
varied o through
h
core
hthrough
varying that h od
o
p
dn4
on ––from
in
d
size
from focus
om
can
om
o15 the
the
theMPC
through
biosen- of 1.5
1.5
be
1 5pp
on
1thiol–
5 hnm nm
u nn
A to
the
to o ∼
on
omediated
GNP
∼ 66In nm
nm h by
recent b release
by
b varying
1
varying studies, w nnwof
n the
the hon
h we a ohb
thiol–
h have
thiol– u–
hydrophobic
o
o –on n
demonstrated m
h dye
d dnophob d n dud
(BODIPY),
cellular u
delivery as ow u a nmodelh h dun
and GSH-d
ophob mon
of on d d oBOD d un PYnop modnd GNP o
m1).
beal ocusing
o
MPCs) ded
d d sters
H
view
sters n
n rying
Theou
by p o
extended
diversity
dextendedn
no
h h (MMPCs)
varying
core the
will
that
(MMPCs) h pn
on
o
on
4
on
h dthiol–
size cano
focusbiosen-
15
o15the
of the
through
othroughof that
MPC
beMPCs
MPC
that
MPC onpp
h
thiol– u can
n
can nA
can be
the
benon GNP
mediated
on
hydrophobic
be In
b extended recent
h
extended nd 1
release studies,
drugs, w
dwthrough through
hwouw of ou we
using a o have
ho the hydrophobic
u
the demonstrated
on
functionalized
hfunctionalized h
m d
dyed ophobgold cellular
(BODIPY),
d N d
nanoparticles u
delivery as o u a n and
model
h d un
(fGNPs) GSH-ophob of on d d o d
BOD n PYnop mod GNPo
MPCs)
be
1).
al o dedd ry. H
stersxtended
view
rying
The
rying
h
ou
ou pdiversity
d on
no
hhthrough
h
core
h the
that
(MMPCs)
the
willo
ho pnhhthrough thiol–
size can
dthiol–
focus of
o the
of beMPCs
MPC
that onpp
hu the n nA
can canthe
be GNP
hydrophobic
n
mediated be
b h nd 1 drugs,
release d h of usinga h uh
hydrophobic on m
h9 dyedd ophob hgold d p nanoparticles
(BODIPY), d u as o uo a h(fGNPs)
nmodel dun ophob
∼2 of onnm d d uoBOD dd n PY nopNE(
N
m d mod
mono GNPo
al
MPCs)
1). oed ry.
d tion
xtended
view
tionalization
tion h 18
18 p diversity
dmonolayer
ohh of
ofwill
n n
that
on p
o
n bMPCs.
–
MPCs. d h
through
focus
h can of
o of p
pbe A
MPCs
MPC
A o
on
o MPCs.
h o
the
u
o n o
o ncan nAGNP
mediated be
b The
hydrophobic extended ndrelease
1 d through
drugs, hthat of ou usingacanhhydrophobic the h functionalized h 9 dye
d h
ophobgold(BODIPY), p nanoparticles d u as ua NE( omonolayer
nmodel (fGNPs)
un ∼2ofon nm d uo dd n nop m d mono GNP
MPCs)
al o d
ed sters
sters xtended
tion rying
ryingd
tionalization
h ou
18
dou
tionalization mono
pdiversity h
ohh
dmonolayer
monolayer
mono h (MMPCs)
the
that
ofthen
(MMPCs)onnnhop hb–
MPCs.
– through
thiol–
can
dthiol–
hthat of
oqu of that
protected
p be
ppthat o MPCs.
h
AooMPCs.
MPCs
MPC
protected
of the
u
ocancan
n oncan d be
dbe [9].
clusters
n A
AGNP
[9]. u
clustersbe
b The
ube extended particles
(MMPCs)
MMPC
(MMPCs)
MMPC nd
particles1 drugs, d through through
hthat h
that
h (core
ou
(core h nthe
can n thed
dhbe
b
be
b = ∼2
= ∼2 nm) nm) h9ompo featured
dfeatured
ophobh a
ad mixed
p nanoparticles mixed
u uhomonolayer
n n(fGNPs) un ∼2 oon nm d uo on dd n nop m ndd mono GNP
1). sCs h (MMPCs)
go d n b nop can be hydrophobic using functionalized gold d
dpo onm d MA
MA nd
eal
e
MPC
1).
MPC ed xtended
ssCs
ed
tion
xtended hd18
tionalization 18 diversity
d
place-exchange
(MMPCs)
goMPCmono
is dof
through
place-exchange hor n
the
on
nn nnb MPCs.
– A n
nthrough
nop that of
o
place-exchange
hthat
through the
qu ofph MPCs
MPC
protected
p Aoo
can b
oMPCs. the
obe beum ocan
bpost-functionalization
the um d n
clusters
ub
hydrophobic
[9].
Au
composed The extended (MMPCs)
MMPC nd
particles
of
d
drugs, h hou using
(core h
can n dh be
bfunctionalized
∼2 nm)9
=glycol)ylated 9ompo featured hgold onanoparticles
a ligandsmixedho
NE( o n(fGNPs)
monolayer ∼2
omnm
d u on d m ndd d mono nd
MPC ed
ed
Cs
ed
ed
ctly
tion
ctly
ou
h
tionalization
h (MMPCs)
MPC
d(MMPCs)
alization MPC is
mono
is h o
dof
through
place-exchange
go monolayer or
o
through
h
monolayer
the
no
n
the n
h
through
bMPCs.
– h
A
through
h
An nop h ou
place-exchange
ouqu the
place-exchange
of of
pp
MPCs.
the p can
A
protected
hcan
protected
b po
ooMPCs. o um Aodd
post-functionalization
po un A
clusters
composed
un
[9].
clusters
on
on
The
on (MMPCs)
(MMPCs)
MMPC of tetra(ethylene
particles
on
tetra(ethylene
on of
o
of
o that
othat
h(core MPCs.
MPC
MPCs.
MPC can
can n dbe bA
be=glycol)ylated
A ∼2 nm) nm) fluoompo cationic
h
ocationic
featured ndpo aa ligands nd hH
mixed
(TTMA)
H(TTMA) BDP n ∼2
monolayer
and
and 2 dh u on d on mnndu u mono MA nd
1)
MPC
MPC
d1)
1)
In
ssIn
In
Cs
Csed
ctly
ou
ou
ctly
PCs) d
alization
alization
PCs) go
(MMPCs)
forMPC
o
mono
this
[18].
place-exchange
this
is hh or
o
d
through
place-exchange
go [18].
this
is h h dthat
or
o the
thatnn
the
h
the
u
n
u
n
u
h
protocol,
hthroughIn
In
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An
protocol,
through
h can
nop
u
of
ncreation
protocol,can
nopof
u
that
ou
uthat this
qu
place-exchange
qu
this bep
MPCs.
MPCs.
the
place-exchange
ou be ph
p
h
on
o
cano b po
oprotocol,
protocol,of
o
d
be
bpost-functionalization
d
um
dum
be A
A ddun
MMPCs
MMPC
d
post-functionalization
po
un
[9]. u The
composed
fluorogenic on is
MMPC
theparticles
h ofligands on of
tetra(ethylene
place-exchange
p
on of
o
h MPCs.
MPC
(core
(HSBDP)
MPCs.
MPC h
n
n dbA =
A
∼2
glycol)ylated
(Fig. 2a). 2a).fluoompo
ompo
featured
The o
o
cationic Nn do
cationic
n d o ligands nd
mixednature
nd
h(TTMA)
hH
BDP
monolayer
n and
facilitates
BDP n o 2
o 2
dh on
d h
onon nnd
on n
nd
u
MA nd
MA nd
d hn n ed salization
ctlyPCs) nMPC
for
for o
the
an
o through
[18].
othis hor the
othat
no h b
equilibrium
the h nd In
place-exchange
n hin A
through creation
can
hcreation
of ooub the
thisbh be
MPCs. on
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po po of
o
npost-functionalization
dof
o A MMPCs
MMPC
oun
MMPCs
MMPC do
composed
fluorogenic oonis the is the h
hhof of p ligands
place-exchange
p
ptetra(ethylene
tetra(ethylene
on
place-exchange
p of
oo o MPCs. (HSBDP)
MPC h
h n
n (Fig.
o
glycol)ylated
Aglycol)ylated fluo The
h cationic o n
cationic cationic n o oligands
ligandsm nature m (TTMA) facilitates
mb n nand
andb b nd h h fluo fluo opho opho p p obob
h
1) f
In
fsou s ou on
alization
PCs)past npthe
MPCs
an
the o
[18]. h
oof
hthatn
that place-exchange
u
hbh
MPCs.
equilibrium
nd protocol,
o Increation
place-exchange
forty n
u can u
ofan
uano this
years MPCs.
h be p
pA n
o
equilibrium
A o topo pod
protocol, d A d o d
composed
fluorogenic
the h
Entrega(de(genes(
crossing ligands
ofEntrega(de(genes(
cell-membrane (HSBDP) o
(Fig. 2a).
barrier, h
fluo The o
and o cationic
n the nature
nd
Entrega(de(fármacos( H (TTMA) mb
facilitates
BDP probes 2 h nd on n u
p1)
p hn fIn
18]. on
PCs)
oned
past
ed
o d
MPCs
npan
for
d
p this
oGNP
o[18].
MPCs h
doof
by
bh
oof
by
b In no
theoh
forty nh
nd Murray
Mu
in
MPCs.
equilibrium
bhin protocol,
oIn
Murray
Mu
this
MPCs.odw can anothis
years
ph bhbe equilibrium
Aon n
equilibrium
protocol,
monod (Scheme d
protocol,
to
(Scheme od
of h MMPCs
h dmopfluorogenic
MMPC
m the d1) 1)
1ocrossing
1 [18].
is18
[18].
18
nd thehh on In
In n pof this
npplace-exchange
hcell-membrane
this
h
o protocol,
p
odprotocol,
p oh o
o ono o (Fig. o barrier, h The
fluo o
and o cationicndthe nu ofluorophore nd
fluorophore mHm Entrega(de(fármacos(
BDP
mbhprobes n mb 2 h ndonhon u fluo nd opho u p non
ob
phu u
n 18]. ructure
sson
olayer
qu
ructure
fructure ed
oMPC
past for
MPC d
n o
the
an
place-exchange
the
MPCs oGNP
d by
bbIn the h
o
forty
o nd
equilibrium
n A
provided
place-exchange
Murray
Mu
this
structure
b
um
hin A
place-exchangew
provided
d creation
anop
yearshbh protocol,
h monodon n
equilibrium(Scheme
to po
providedw
wdof
o h dMMPCs
d MMPC
mopfluorogenic
the dof 1)
1 ocrossing is
[18].
18
nd the
hhin In
onligands
npplace-exchange
p
ligands
of this
o (HSBDP)
odprotocol,
hcell-membrane p (HSBDP)oh onGNP o (Fig.
GNP o barrier,
2a).
2a). po
poh The
b
bo cationic
and dthe nu o ofluorophore
nature
nature facilitates
mmfacilitates
mb hprobes n
n n mb
BOD PY
b BOD PYnd ndonhu fluo fluod opho
GNP
GNP
opho p non
ob
pnhPCs n
uf18]. olayer
qu
olayeronntrolled
place
pedoMPC p
n an
place-exchange
MPCs
ntrolled
place
p d
p o d
GNP o bIn
oof
of
by
bb n oo
o nd
the b inthis
MPCs.
equilibrium
h o
structure
um d size.
provided
MPCs.A
Murray
Muo
structure
the h w
size. ano
native
nyears
phb
native
n
protocol,
GNPs
An
monod
equilibrium
A
GNPs po
ligands
provided
(Scheme
providedwd
ligands hbd nd
nd m o possible
pbthe d o1)
possible
of
o MPCs
MPC
1hocrossing
MPCs
MPC nd
[18].
18 drug
h
drug in n
on
In
n npof an
anrelease
n o
this equilibrium
qu
o
hcell-membrane
release
n equilibrium
qu po mechanism.
dprotocol,
protocol,o b o um
mechanism. um GNP
o n o BODIPY-conjugated
poh
BODIPY-conjugated o dnthe
bEntrega(de(genes( n u fluorophore GNPs
GNPsmm mmb are
oarehprobes non-
nn
non- m BODfluo PY onhunEntrega(de(fármacos( d GNP mpnd ob
non
n and
andu 18].
PCs
ement,
PCs
u 18].
ement,
quo place-exchange
ructure
olayer
qu
ructure
past
ed
place
p
past
ion MPC
ntrolled
oMPC
gether,
o
d
oplace-exchange ud
this
pthis
ud dh
GNP
d
GNPh
in
by
b
in
oinb
In
In
of
forty
other
othern
nothe
forty
o
an
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d
um
h Murray
Mu
this
structure
an um
gold Addh b
provided
A
and
protocol,
this w
b
provided
the
and
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n ppost-
oyears
native
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dequilibrium
size. o p hon
post-
salts
p
protocol,
omp
p
other
omp
control GNPs
monod
protocol,
other
p to
(Scheme
pto
provided
in
o whof
ligands
w o b dd
dnd
post-
d
post-
m pbthe of
o
possible
monolayer
mono
1)
1 MPCs
MPC
hcrossing [18].
18
nd
du
du
drug in In
n n on
of
onan
Entrega(de(genes(
on
structureas u
this
n h
release
the ou
o
oequilibrium
qu
cell-membrane
gold
p
dprovided
p o
odb
dbcore
o mechanism. o um
d
o
GNP d n barrier,
quenches
barrier, fluo
BODIPY-conjugated
po
fluo and
and
b d dnthe u fluorophore
h
GNPs
o
od
hviaEntrega(de(fármacos(
energy dmm oare hprobes
and/or
qu
qu
nnon- m
n
n h hBODfluo PY on on u un d GNP
GNP
n
n nd
non
o
o
n and
ement, oplace-exchange
olayer
qu place
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gether, p ud h
ho bo the
of n
other dprotocol,
structure
the hthe
um
gold and
the w
b
h d o
native
nsalts h
post-omp
p monod
other
control
on pin
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ligands
oligands b dnd
obpost-
of p fluorescent
bpossible
monolayer
mono oh MPCs
of MPCs
MPC nd du in on
n
structureas u onan n
the o oequilibrium
qu
gold d o mechanism.
provided dbcore um GNP n BODIPY-conjugated
quenches po b
fluorescence u
n n hvia o d oare
energy h and/orn
qu m BOD
n h h fluo PY nn d n m nd non o
pu p o pd d
n o er pthis oin
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pp dprotocol,
op da provided b n n h p fluo
n
andPCs
o
PCs
ement, o
oe pntrolled
eplace
ion
erhp p
gether,
ntrolled
er pan p ud
used
this
o
display
o
display h
structure
pp
in other
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o oponan
equilibrium
of po an h
o
op
gold
d o to and
protocol,
size.
h
b PEG
size.
PEG
d
native
n
aequilibrium
wide
control
oparticle
post-
display on
salts
equilibrium
wideomp
p
GNPs
GNPs
provided
other
providedmo
mo pino ba of
o nd
adisplacement,
wide
d
post- b
fluorescent
monolayer
mono
npossibleof
o
fluorescent hm MPC nndu drug
drug
du in
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structureas uon release
an n
release
the uoequilibrium
qu
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providedodbcore
nmechanism. p dum dquenches
n BODIPY-conjugated fluo
fluorescence
fluorescence
on
on n n nEntrega(de(fármacos( hvia
p
p GNPs o
GNPs
od
energy d emanatesoare and/or
43
non-
non-
43
qu
44
44n h h h fluo fluo
fluo
fluo nn
n
nn
n m nd
n
n o
nd o
n
and
n o
ement, at
ato eu h an
gether,
hp an p prevent
ud
synthesis,
used
display
this
usedo h
n
hpp
o
prevent
synthesis, n othern
h
equilibrium
o h
po
equilibrium d o
op to and
the
protocol,
to hb PEG
d a o post-
display
wide
display omp
place
p p
onother
control
particle
place
p mo p o b dof
o b wide
d
post-
andisplacement,
wide
displacement,
dof pb
n electron
monolayer
monoelectron
pfluorescent h m hod n transfer
Entrega(de(genes(
n h and
structure
transfer and nd
u
nd on p u o processes
other h
processes
other
o h on
provided
p od post-
po
p
post-
po d [43,44].
d
[43,44].n The
fluo
The fluorescence
on n h signal
p
signal o o
emanates qu
43 44n h fluo n n n m n
ng
,ng d o nt,
ion
gether,
er
ion
nt, m om h
b and
of
structure
biocompatible
synthesis,
om
display
includingo n of
and
o h um
hodo gold
gold
o the ommon
h PEG
ommon other
other
a osalts
control
on
provided
place
p
salts
wide
biocompatible mo post-
in
o
in
post- ndo h hmonolayer
h mono
p fluorescent mm
m hod
n andas
structure
as ou
nd
o the
the u oother
o o gold
h
gold –provided
p ho core
h core
post-
po d GNP
GNP d quenches
quenches upon
upon
fluorescence
fluorescence n via
n via h energy
h energy GNP
GNP and/or
w43h
and/or
w h44G G H Hh n nfluo u
u o
o u
u ho
h on n n
ng o
o at
ucture
d
,at
d oe
cation
ucture e uu
ofer
nt,
hp an m prevent
used
display
including
m o pp
structure
b
biocompatible
on
pp and
o
biocompatible
b pow um
hodo
equilibrium
core–shell hodo
w umm provided
op
o to
methods
op d
provided
d PEG other particle
owide
display
adisplay
hod provided
GNPs
biocompatible
o mo post-
[22]
22 b
b hwide
andisplacement,
h wide
can n
n electron
upon
n be
b n
triggering
used
u n transfer
d h
hto o p
display
d p processes
the
p – n
n GNPs
a p
wide
w
p d [43,44].
with GSH The fluorescence
in on
Acuvette,
fluorescence
on m n or n signal
p
cellular
p o
mo GNPthiols emanates 43 in
44 h n
n n
n m
m n
,sed
cation
ucture of h dan om
used
synthesis,
including
psynthesis, n
on
prevent
n to h
po
equilibrium
core–shell w to
methods
m d
provided
display
bd ommon hod
1o place
p
biocompatible
particle
placeGNPs a [22] [22]
22
wide a d hcan p upon
n be
b
electron m m used
u hod
n
triggeringd
transfer and
to o o
nd display
d o other
othe
p h
processes – h
GNPs
a post-
po
wide
w GNP
d with
[43,44]. The GSH upon
The
hum in cuvette,
n n
or h
cellular
signalH GNP p G2 G2 thiols
emanates w h in2b G H Con n fluo u
ou d d o o u
ou h h d h
dh o wo wn n
n h pGNPs ndisplacement,
dhh pn bmmused n transfer andond d oother op h– GNPs post-
po
cation nt,
l) on
(PEG) and dum methods moietiesother post- can be d to display fluorescence
ng
ene
ng
ene nd
nd
sed
sed at
d
ucture
d ,uu
of
nt,
l)
l) omp
ality
omp
d
p
p
m
including
m om
(PEG)
o
on
prevent
b
nand
to
biocompatible
omo
(PEG) b
glycol)
core–shell
other
n
to
biocompatible
glycol)
n
other whodo
d
hodo
at d um
mpo
m display
mpob
display
provided
mpo the
bthe dommon
hother
moieties
ommon
moieties
hod
1 particle
(PEG)
post-
biocompatible
oparticle
p hGNPs
(PEG)
post-
naa
n
n
22p
wide
moieties
post-
wide
moieties p
p
n huh
surface,
electron
upon
human m
utriggering
including
n hod
liver
hod ud noo o
cells processes
the
(Hep
biocompatible
b oo op omp haG2)
h
wide
w GNP dwith
bGNP
[43,44].
(Fig. 2b).GSH hum
upon influorescence
Controlled
upon n
cuvette, release or
n cellular
n
signal
hH
h of GNP pthe emanates
thiols
dye w was
w hin
h 2b G H
G HCon n o
n u obd o o uME hho wnn
,sed
ndcation
ucture
cation of d
ne
omp
ality including
luding non
glycol)
other
core–shell
onhto w
at b
methods
m b d
provided h
biocompatible
oup
methods
mdisplay 1biocompatible
hod
(PEG)
post-
hod particle
p a wide[22]
[22]22
moieties
22
wide can
surface,
b u can n
human
upon
n be
b
be
b d used
u
including
ndused
u liver
ud
triggeringd
d to
n
to o cells display
d (Hep
biocompatible
b
display
d the
p omp
m – GNPs a
a b G2) wide
w
wide
w b d
d (Fig.
with
d on 2b).GSH hum
Controlled
in n
cuvette,
d b release or cellular
n H of pthe
mou G2 dye
thiols was
mb in2b on Con o o h d
G h
hodologies
h sed ned
hodologies of
l)ality
luding
p
d
ne (PEG)
display
luding mo o n h npo
core–shell at d mpo
methodologies
topo
glycol) b the
display ha post-
biocompatible
oupmoieties
d
biocompatible is
1 particle
pthat
wide
(PEG)
is that
h GNPs
n a moieties p issurface,
b uthat upon
human d including
nd ud ncells
triggering
liver biocompatible
b othe (Hep omp
m GNPsb G2) bd(Fig.
with on 2b).
Célula(Anormal( GSH Controlled
hum fi
infifibroblast
cuvette,
n d b release orcells cellular
n H of mou
pthe G2 thiols
dye mb
was in2b on Con fib
fib o ob d o ME h d h w n
G nd
nd y
ycol)
ned
hodologies
h ned l) omp
ne
ality
ompp
ddisplay (PEG)
display
mo o
systems
onglycol)other
h n d
(OEG)
OEGmpo
methodologies
po
other at
methodologies b
bbthe
oup moieties
dha abased based
is
wide
(PEG)
post-pand nd
1particle
that
h n on
poly(ethylene
po moieties p is
is bu
surface,that
uthat verified
hhuman nincluding
dn n glycol)
d glycol) ud by o treating
ntreating (PEG)
PEG
biocompatible
bPEG o(Hep mmoieties
omp mouse
moieties
mo bG2) bhd(Fig. embryonic
on 2b). hum Célula(Anormal( ndow b release nHof(MEF, (MEF,pthe
mou G2dye having mb 2b on Confib o obdH p G2 owME h dh wn n
G y
ycol)
glycol) unsystems
mo
o OEG
(OEG) on (PEG) wideand
mo ndmoieties on
po
poly(ethylene wh hverified h liverbyo n cells
ho (PEG) d momouse embryonic Controlled
∼50% fifibroblast cells having was
h
hesis,
G ycol)
hodologies
glycol)
g y
ned
ality
important
important
glycol)
luding
luding un o
systems h
biocompatible
mo
display
w
po
w
at
(OEG)
an OEG
on
methodologies d the
(PEG)
h
d oup
(PEG)
h
biocompatible
important
biocompatible is
based particle
pand
aspect
mo
aspect nd
that
hmoieties
moieties poly(ethylene
po
on aspect surface,
isb wh
bcombined
aspect that hhuman
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nd glycol) ud
liverbyo nntreating
cells
ho biocompatible
b
(PEG)
PEG o domp
(Hep mw wmoieties
momousebis h
G2)
hh b o
hd(Fig.
oon m
embryonic 2b). Controlled
∼50% fi dow
fibroblast bHep release n
n
cells n ofwith (MEF,
mou u
the
u dye G
G was
having H
H
mb on fib h
h n nobH p G2 wME MEh h h h n n
Ghhodologies
hesis,
hesis, chored
g
chored
g
y ious
important
ned
ycol) ious ou
ou un omono
mo
display h
biocompatible
biocompatible
systems
methodologies
po
b
benefit
w an
an
b(OEG)
benefit on
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(OEG)
OEG n
d
h
h
n with
oup
with aafi
important
fi
important wide
is
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wide
based o
of
mo
and
ond
of
that
h
nd thiol-
thiol- h
these
h
these
A poly(ethylene
po
ison w that is
aspect
d omb
wh
that
omb
combined ∼50%
hverified
∼50% n
nhdn dd lower
m
methodologies
dglycol)
lower
m
methodologies
o bymono nhodo
o hodo ho
treating intracellular
(PEG)
PEG
intracellular o
o dmw b
moieties
mo
mouse
p ismhthat h
that hdGSH
GSH oon
Aembryonic levels
levels ∼50% than
fi
than d ow b Hep nG2)
G2)
cells n D
withmou
(MEF, u on varying
G mb H A on m fib
Célula(Anormal(
varying
having h nob H p G2 w h 20
ycol) o OEG and poly(ethylene
po h hn dglycol) o (PEG)
PEG moieties
mo ho d on n on o u uh mono hG nH HOE 0
0 5 wnd h 20 mM
omp glycol) ious ou benefit
b b (PEG)
n fibased of
o moieties
these
h dcombined
omb n methodologies
m is opthat fibroblast
y systems on verified oby nhodo treating od w mouse hhGSH embryonic cells (MEF, having
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hesis,
omp
omp
s,
)s,
hesis,
s,
s,
omp
g
chored
)glycol)
g onolayer
m
menable
)chored
chored
m
menable
menable
m
m
ious
onolayer
ious
onolayer
odologies
))menable
lable
odologies
menable
odologies
m
mportant
lable
onolayer
onolayer
odologies
mportant
odologies n
mportant
methodologies
ou
ou
un
(PEG)
n
methodologies
un
nan
methodologies
o,able
o
oable
mo an
methodologies
mo
dnnan
(PEG)
(PEG)
d
mono
biocompatible
mportant
(PEG)mono
mono
mono
delivery
mo
delivery
d
mo
mo
an
an on
delivery
o
n
biocompatible
n
(PEG) nn
n
w
w
nob
o noimportant
1994
delivery
dp
an
b
an
benefit
b bp
b
on
p
on
p
important
nbenefit
b
important
b
b
important
nnoimportant p
b
fashion
p
fashion
hdbu
fashion
b
h
b
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d
b(PEG)
dh
n
h
don
with
moieties
bnmoieties
with
with
important
moieties
moieties
bbdmoieties
bu
(Scheme
bu
to
important
to
to
to
to
fi
o
o
o
aspect
aspect
protected
protected
fi oo
protected
is
is
protected
o
vehicles.
protected
aspect
is o
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vehicles.
is
mo
mo
d
d
of
o
dof
that
vehicles.
isod dh
that
m
that
vehicles.h
hop
o divergent
op
m
that
hm
op
that
thiol-
moieties
divergent
thiol-
divergent
o divergent
mthiol-
om
using
divergent
using
using o
od
A
A
A
these
h
d
is
is
aspect
d
these
his w
aspect
d
Ais
aspect
dddb
aspect
oaspect
d1)
w
w
w
that
that
that
that
1)b p
bn
aspect
n
np
n
pd
d
aspect
d
wh
wh
combined
omb
pdcombined
npd dsynthesis,
dh
∼50%
concentration
n
synthesis,
∼50%
n
∼50%
h h
n
concentration
nh
synthesis,
dsynthesis,
omb hnd
nd
n dlower
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synthesis,
nh hndn noan
concentration
hconcentration
n
h ndndu
ndn n
d
lower
n
o
m
oan
an
an
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methodologies
m
lower an n
nmethodologies
mono
n
mono
nmono
n nfototérmica(
hodo
hodo
mpo
mpo
ho
ho
important
important
important
Terapia(
nmono
mpo
important
mpo
nb
important
mpo
n
nb1994
intracellular
bof
of
intracellular
b
b1994
glutathione
o d
of oglutathione
intracellular
glutathione
of glutathione
of
1994
glutathione
n
n
nh
w
Terapia(
nhpaspect
n h on
paspect
p
fototérmica(
h
is
on
on
h
isop
aspect
hpaspecton
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hp
h
on
h m
o
p
op u
that
thath
hu
m
m u
h
uGSH
uA n
GSH o
n
n1
1m
d Célula(Anormal(
omonoester
d
monoester
nmonoester
d levels
d
Célula(Anormal(
n1monoester
levels
monoester (GSH-OEt:
∼50%
levels than
on than
∼50%
on than
on (GSH-OEt:
on
n ow
fibroblast
(GSH-OEt:
n
(GSH-OEt:
n Hep
n
(GSH-OEt:
owHep
Hep G2)
on n
on
on
no
o
G2)
G2) 0,
0, 5with
o 0, 5u
on Direccionalidad(
o 0, 5
0,
5 uwith
u
u and
5 and
and
and
u
and 20
with
h on
h
h on
h
varying
20
on GGmM)
varying
varying
20
on
Direccionalidad(
20 mM)
20
mM)
mM)
mM)
mono
H
H
mono
mono
mono
h Gn
G
G H
G
HH
H
H OE
OE
OE
p G2
p
OE 0
G2
0
0 5
5w
5
5 nd
nd
nd h
nd 20
20
20 mM
mM
mM
mM
n
n
REV EW – Kogan O medo Hos a Gue e o C uz& Abe co
FgFguFgue1ue12e12Ta2TanTasnmsnmssmsosnoneeoneeceecocnonmcoonmcomcoggapgahpashposhosoheheshoseousou
mportant n d
np1994 1994
delivery fashion
p (Scheme aspect
vehicles.
AuCh using d w h
Terapia( N BH n h D Terapia( Direccionalidad(
D
mportant n
o
withoablen
n udp1994
using o ng
o
nd
ndop
o
fashion
p
NaBHhd
h go
bbuaspect
(Scheme
dgold
on
bbuaspect
odAuC
od d4AuC op
op
nin
usingod
o bu
d
the
nop
nanoparticles bu 1)b b on on h
h ndu dmw
n n 1994
n 1994 hN N BH BHh h m m n h 1
h1 fototérmica( m Direccionalidad(
mportant n
with u ng NaBH on
go
d (Scheme h d o nin nop the
nop pp 1) du dw h n
n
with nusing
sitive
n
u
ributes dp1994 ongnd
nd pNaBH
p om gold
go
on
d (Scheme
btood
attributes
b odhaad 4AuC nanoparticles
nin
o‘free’
‘free’ bu
the
pp
to
bu d aun
1) non on‘free’ nd nd
nd du o
du
o Terapia( d nd nd w fototérmica( hh N BH
hN BH o
o n n h hoo
nds.
nds. with nudpbong
ributes
sitiveusing
using
u
The
ng
The NaBH om on
attributes
d
gold
go
gold
go
core
to
core h dd
d
4AuC
o n
size
nanoparticles
nin
size
nanoparticles
om nop
nop to
pp
the d
of
of1 aun
5 ‘free’
nm o ∼ 6 o nm
d
b ndw h h n o h h o o – Direccionalidad(
nds. with
ility, n
sitiveDD
ributes
ributes d biodistribution.
o
obo and The NaBH
and om d to
attributes
om core n h da in
nd
4 ‘free’
o sizeompp
biodistribution. the
pp
to d
of
d11d d un u
5un‘free’
a nm nd
ond ∼6 o
6o nm nmattributes nd
bndbu hn
fototérmica( h nto o h ‘free’ ho oo– o –
y DD d
varying
biodistribution.
systems m dto n(DDSs)
thehDDa o‘free’
4
ndthiol– p‘free’
provide oa5 ‘free’
u d positive po ∼ o oh D
nds.
m
nds.
m
yility,
ve
some
y
ve
sitiven
nDD ob
varying
systems
varying
bobu The
attributes
The
biodistribution.
attributes m m
attributes
‘free’ core
core
nn the
n(DDSs)
the
d
DD drugs.
ddrugs. to
size
nd
nnd
to
om
biodistribution.
size
thiol–
thiol–
om ahto
a
ofd
provide
p‘free’
of1d o5drugs.
nm
u
nm d positive po
o
ob ∼ ∼6 6 nm
b
mb bu nto
nmattributes o aah ‘free’
h
ho o–
mnetics
some ility, n
ng nDD
lity,
systems ob
biodistribution.
o o mo ofub
and
solubility,
dand
m on some
n (DDSs) biodistribution.
d n
biodistribution.
DD om‘free’
in hnprovide1vivo
provide
p‘free’ REVIEW – Kogan O medo Hos a Guerrero Cruz & A ber c o
o5drugs. u
nm dstability, o
positive
po and nd b biodistribution.
attributes bbu
buod od nto obu buh ‘free’
aa ‘free’ on h –
REV EW – Kogan O medo Hos a Gue e o C uz& Abe co

netics
y n
ng varying bu o ‘free’
of
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on
ve
ysome
ve
on
netics
some onibutes
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can
can
and
and
attributes
varyingoDDSs
attributes
o bu dm
md m
render biodistribution.
‘free’
renderof to
u ncan
some
biodistribution.
on n
(DDSs)
the
a
DD drugs. to
nto
‘drug
drugs.
‘free’n thiol–
render
in
o
o
‘free’a
h
a
h
n p vivo
MPC
MPC
‘free’ d
d
o
drugs.udstability,
u
‘drug
positive
po n b b and attributes nd
nd biodistribution.
d to
d ho
h ou
ou h
h h
h N
er
on
netics on ng
n
ibutes
ng nded
nded un
unfavorable dof
solubility,
bu
DDSs do through
‘free’ub
u
to osome
on
through cana‘free’ ‘drug
b‘free’ renderph
in
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pharmacokinetics
o ndrugs.
the MPC
vivo m drugs.
‘drug o b
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of
and
o ndsome om
omnd d‘free’
biodistribution.
b od od h hbu ou
bu du
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d uh on h NE(
er
maintain
on
on onnd
n
ibutes
soand
can
nded
ase
so
can
andofDDSs
of
biodistribution. dsolubility,
d
unfavorable
un o
some
todmono
render
some
d
render
d
ub
biodistribution.
ou
through the
dbiodistribution.
mono uto maintain can
aarender
b‘free’drug
‘drugrender
in
o
n p
pbe
the
drugs.
vivo
pharmacokinetics
ph
o the MPC
MPC
o
om m‘drug drug
stability,
od dn n ub
n b Fig. of
Fig. MMPC
some
MMPC
1. nd
nd
biodistribution.
b Various ‘free’
dFig.
d
drugs.
happlications
h 1.hou
applications
Various
on
h n
nh hb
b of gold nanoparticles
applications of gold nanoparticles in therapy.in therapy.
1.hou uhu
maintain
MMPCs)
er o
on
oading
ibutesase dDDSs d
unfavorable
un n
d
to mono uto ou
of the
that
maintain can ‘free’
ph drug
can
‘drugrender
pharmaceuticals
b‘free’ m p
pharmacokinetics
ph the o u drug
‘drug od on u DDSs DD of
o some MMPC
some can
1.om n on
Various render nd
‘free’ drugs.
d du
‘drug un b of gold nanoparticles in therapy.in
MMPCs)
er
DDSs
maintain nd
oading
o biodistribution.
nded
s
nded o unfavorable
un
ofdbu some
n candonthrough
of
o
through that
the ph b
‘free’h can
pharmaceuticals
drug ouphm thebe
pharmacokinetics
drugs.
the h
‘drug m upo o n
un on DDon
DDSs of
o om
can n Fig.
render nd
‘free’ o Various
drugs.
d
MPC d
‘drug applications
A of gold nanoparticles therapy.
MMPCs) soof d‘free’
somemono that can pbe o po dunu u on MMPC hVarious nb
ou hdrug ouumdrugs. h on othe MPC Aof gold nanoparticles
DDSs
ome
maintain n nd ase hod
biodistribution. to candon maintain
u the render
drugs.
‘free’ the drug Fig. 1. Various Fig. applications
1. of
applications gold nanoparticles
of gold gold nanoparticles in
nanoparticles therapy. in therapy.
therapy.
zation
o n
oading ase
ntrolled dbu to
n mono of
dmaintain
o and MPCs.
nd h
pharmaceuticals
ph ou
sustained p‘drug
thehA o nu po drug
d release d un on DDSs on
DDSs
DD to oFig. m MMPC
1.
maintaincan Various
n on
render nnd o hh
applications
MPC drug unnb A 1.inVarioustherapy.applications
ome
MMPCs)
DDSs
MMPCs)
DDSs
n
zation
zation
nd
oading
o biodistribution.
od
ntrolled
n od tod
to
h
bu dn
‘free’
maintain
o
omaintain can
ocan
d
udon dof
on of
o
ou
that
h
that
h and drugs.
MPCs.
nd
renderMPCs. hcan
can
pharmaceuticals
ph
render the umbe
sustained
theou
be
‘drug
hA
drug
on
A
drug
on nu po o
odd releaseMMPC
MMPC un on DD to
on mcan
o maintain h
hFig.Fig.nn
n on p
p1.
Fig.
render
1.n
nd
othe
Various
1.
h Various
MPC
d
‘drug
d
drug
‘drug h
h
u
applications
nA
applications
A
of
of gold nanoparticles
Fig.
Fig. 1. Various in therapy.
in of gold nanoparticles in therapy.
applications of gold nanoparticles in therapy.
ome n
n he an
od
ntrolled
nan ho
bu render
d ‘free’ud
place-exchange
o dofo uh and drugs.
nd h
‘drug ouu ‘drug
sustained hon npo o MMPC
releaseun on
to mh
maintain
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Various
nVarious the h MPC dh
drug applications
un of gold nanoparticles in therapy. [3]
ome zation toho render
‘free’ drugs.
MPCs. A
Figura 1: A) Potenciales aplicaciones de NpO en aplicaciones farmacéuticas.
Fig. 1. 1. Various
Various applications of of goldgold nanoparticles
nanoparticles in in therapy.
therapy.
aintainzation ntrolled
he
n
he
.an
d
od
an
od
d
op
to
op
opIn
dplace-exchange
maintain
d
render
d
Inrender
od
maintain
d u
place-exchange
ubu
dodthis
this
d
bu
b of
the hand nd
h protocol,
‘drug
Mu
MPCs.
Mu drug
‘drug
Mu
sustained
the
the u drug
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500 nm 500 nm
[6]
Figura 2: Destrucción
A mages oin he
vitro de AT-Aβbound
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oA aggen
egalaesEA
a eutilizando
ncuba on oNpO.
AuNP–Cys–PEP w h
10 µM A o 48 h B mages o he p ev ous AuNP–Cys–PEP bound o A a e 8ho ad a on
Ho zon a a ows nd ca e he p esence o d me s and me s ve ca a ows nd ca e he p esence o
B 500 nm 500 nm 5
so a ed pa c es and c c es nd ca e he p esence o sma be s
Asimismo, para terapia
Rep oduced w h pe my ssdiagnóstico
on om 47 © 2006 deAmediferentes patologías
can Chem ca Soc ey se ha propuesto el uso de
pa Bamagne c de
AA A
NV,[7, 8] que absorben
F gu 13 The au ho s c a med ha he esu s sug
energía en el rango del infrarrojoRecen y cercano
u asma supe
(a diferencia O las NE que
ges ed ha h s b nd ng a n y s p esen n o he USP O NPs have been con uga ed o he H V
na u a p o e ns pep des ha ho d co agen ke Ta pep de o abe CD4+ T ce s o MR
absorben en sequences
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B omed ca app ca onsde o hasta varios ha
500 nm
organismo con una penetración cm,cove s he magne c NP
facilitándose de su
estaace manera Two el proceso
pep de ONP con uga es USP O unc ona zed NPs we e ob a ned n he
ONPs have magne c p ope es and o e many s he mean va ence numbe [10] o Ta pep de
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1.2.1. Obtención de NE y NV para fines biológicos.
Existen numerosos protocolos de obtención de NpO dependiendo del tamaño y la forma
que se pretenda obtener. Dependiendo de la forma y del tamaño de la partícula se
producen cambios en la RPS lo que se refleja en variaciones en la coloración,[11] Para
obtener Nanoesferas (NE), uno de los métodos más utilizado es la síntesis química
mediante la reducción de una sal áurica (AuCl4-) con citrato de sodio en presencia de calor,
descrito inicialmente por Turkevich y cols.[12] y modificado por Levy y cols.[13] Las NE
obtenidas poseen una gran homogeneidad y presentan tamaños homogéneos que pueden
variar desde los 7 a los 100nm de diámetro lo que es dependiente de la relación de
citrato/HAuCl4 empleada en la síntesis. En la formación de las NE se genera un centro
teórico de nucleación, que adsorbe capas sucesivas de oro hasta alcanzar el tamaño
esperado.[14] La estabilidad de las nanopartículas obtenidas está dada por el recubrimiento
de las NE con el citrato en solución, debido al alto potencial de superficie que éste posee.[15]
En la Figura 3 se observa la formación de un centro teórico de nucleación, sobre el cual se
adsorberían capas sucesivas de átomos de Au (precipita Au0 sobre los núcleos debido a la
sobresaturación de la solución), hasta alcanzar el tamaño de partícula esperado.[16]
Nucleación
A B
Sobresaturación
Crecimiento
Tiempo
Adición de reductor
Figura 3: A) Modelo de formación de una NE a partir de una síntesis química (por Redox). Se
esquematiza la formación de un centro teórico de nucleación sobre el cual se adsorberían los átomos de
oro para dar origen a las NpO. Obtenido desde Referencia [16]. B) Simulación de la Nucleación y
crecimiento de las NE en el tiempo.
4
Para el caso de las Nanovarillas de oro (NV) existen varias formas de obtención, se han
descrito métodos electroquímicos utilizando celdas sumergidas en el surfactante catiónico
CTAB (Bromuro de cetil-tri-metil-amonio) como electrolito soporte y estabilizador e inductor
de la forma de las NV y el co-surfactante TCAB (bromuro de tetra-octil-amonio) que ayuda a
la formación de micelas de CTAB para controlar la forma de las NV.[17] Otros métodos
consisten en la deposición de oro electroquímicamente sobre poros de una membrana de
policarbonato o alúmina que actúan como moldes que inducen la formación de las
mismas.[18, 19] Sin duda la forma más usada de obtención de NV es el método químico de
síntesis de crecimiento mediada por núcleos descrita inicialmente en el año 1989 y
adaptado en el año 2001 por Jana y cols.[20-22] El inconveniente de este protocolo es la alta
cantidad de NE como contaminantes, a lo cual en el año 2003 Nikoobakht y El-Sayed
desarrollaron una variación del método en la primera etapa consistente en la formación de
los núcleos. Este método consiste en la preparación de núcleos de oro de diámetros de 3 a
5nm, obtenidos por la reducción de HAuCl4 utilizando para esto el agente reductor NaBH4 y
como estabilizador CTAB. Luego que los núcleos son obtenidos se agregan a una solución
de crecimiento que contiene CTAB como surfactante e inductor de la forma en presencia de
AgNO3 y ácido ascórbico como reductor débil enlenteciendo el proceso de reducción. Este
último reduce el Au+3 a Au+ y luego la reacción de Au+ a Au0 es catalizada por los núcleos
para dar origen a la NV. El CTAB, como se mencionó anteriormente, induce la forma de
varilla y estabiliza a la NV frente a la agregación coloidal. El AgNO3 es utilizado para
controlar la relación de aspecto de las NV y los núcleos preparados en una primera etapa
se utilizan como centros de nucleación de la NV. La modificación dada en los núcleos
consistió en reemplazar citrato por CTAB puesto que se podría unir a distintas caras
cristalográficas de los núcleos permitiendo la interacción más eficiente en la solución de
crecimiento con el cristal en formación. En los últimos años diferentes autores han ido
5
generando mejoras a la síntesis de NV descrita. Por ejemplo la adición de HCl a la solución
lo cual lleva a un mejor control de la relación de aspecto posiblemente debido a que
disminuye el poder reductor controlando mejor la formación de la NV.[23] Es necesario
considerar que la síntesis de NV resulta sensible a muchos factores que afectan la
obtención reproducible de las mismas; estos son temperatura, agitación, tiempo de
reacción, centrifugación; el tipo, la marca y el lote de surfactante utilizado.[24, 25]
1.2.2. Funcionalización y estabilización de NpO para usos farmacéuticos.
Existen muchas formas de funcionalizar NE para darle una cierta actividad biológica. La
funcionalización muchas veces llamada conjugación, se refiere a la unión de las NM a una
molécula a nivel superficial lo que da origen a una nueva especie, lo cual le confiere nuevas
propiedades al NM en cuestión. Para esta tesis, la conjugación se refiere a modificación
superficial de NpO con péptidos, las cuales serán nombradas como NpO-Péptido.
Para utilizar las NpO en aplicaciones farmacéuticas por un lado se deben dirigir
selectivamente a un blanco terapéutico determinado con una biocompatibilidad aceptable.
Para esto se utilizan moléculas que reconozcan el sitio de acción e idealmente no se unan a
otras macromoléculas biológicas.[132] Se debe además considerar que las moléculas con las
que se funcionalizen las NpO deben poseer la capacidad de mantener e inclusive aumentar
la estabilidad de las soluciones coloidales de NpO en diferentes condiciones tanto
biológicas como de almacenamiento. Algunos autores han agrupado en 2 tipos las
diferentes modificaciones para las NpO dependiendo de la naturaleza del ligando, una
llamada monocapa sintética y otra dada por el revestimiento biomolecular (Figura 4).[26]
Los péptidos poseen excelentes propiedades que los llevan a participar en interacciones
moleculares del tipo ligando-receptor y proteína-proteína haciéndolos candidatos para ser
utilizados como moléculas para funcionalizar NpO.[9, 27, 28] Así es como se ha demostrado
6
que NE pueden ser dirigidas a los agregados proteicos involucrados en la EA
funcionalizándolas con el péptido CLPFFD que reconoce dichos agregados, mantiene la
estabilidad coloidal de las NE y reduce su toxicidad respecto de las NE sin conjugar.
Asimismo recientemente se demostró que dicho péptido mejora la estabilidad de NV y
permite disminuir la toxicidad de las mismas al permitir eliminar una mayor cantidad de
CTAB.[29] Como se mencionó previamente en este capítulo, es la secuencia LPFFD quien
reconoce el núcleo putativo de agregación ((aminoácidos 17 y 21) del péptido Aβ1-42[30]
además de impedir la agregación. S. Rana et al. / Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 200–216
Recubrimiento en Monocapa Recubrimiento biomolecular 2. Organic monolayer coated gold nanop
Fármacos The initial purpose of introducing synth

NPs is to improve their stability by prevent
approach uses reduction of HAuCl4 by citr
Proteínas ~20 nm diameter, where the citric acid a
ADN
agent and stabilizer [20]. The size of the N
trolled by varying the feed ratio of gold sa
elegant method of preparing monolayer-p
of AuNPs was reported by Brust-Schiffrin u
ADN
strategy [22]. In this method, AuCl4− is tra
by the surfactant tetraoctylammonium bro
reduction using sodium borohydride (Na
Lípidos nethiols. The functional diversity of MPCs
the formation of mixed monolayer protecte
Proteínas directly or through post-functionalization
Carbohidratos place-exchange reaction with different liga
Entrega dirigida
2.1. DNA/RNA binding monolayers
Figura 4. Fig. 1. Schematic

Representación presentationde
esquemática of the
lastwo
2 AuNP surface structures
estructuras commonly empleadas
comúnmente employed sobre superficie de
in delivery applications. Successful transfection of DNA/RNA re
.[26]
NpO para aplicaciones en drug-delivery ation and condensation of the genetic
through endocytosis coupled with endo
starting point for carrier construction [10]. Secondly, AuNPs with a from nuclease in cytoplasm, and finally d
wide range of core sizes (1–150 nm) can be fabricated easily with nucleus. AuNP provides an attractive platfo
Para anclar un péptido a la superficie
controlled dispersity [11]; bothde laand
size NE,dispersity
se requiere
are key que el mismo
aspects due toreaccione con
its high surface-to-volume ratio
for drug delivery systems. AuNPs can be readily fabricated with carrier ratio. Also, the high surface area e
la superficie de la sizes
NE. commensurate
Es sabido que with ciertos grupos
biomolecules funcionales
such as proteins and presentes
DNA, en los anpéptidos
compaction, important parameter for ge
facilitating their integration into biological systems. Furthermore, The monolayer coverage of AuNPs allo
the high surface area-to-volume ratio of nanoparticles (NPs) provides hydrophobicity to maximize transfection
pueden reaccionardense con loading
la superficie formando uniones fuertes o débiles.toxicity.
of functionalities incorporating targeting and thera-
Los grupos tioles
NPs functionalized with cationi
peutic materials [12]. For example, ~ 100 ligands are covalently conju- head-groups bind plasmid DNA via electro
(RSH) pueden reaccionar
gated to anespontáneamente quemisorbiendose
AuNP with 2 nm core diameter sobre lainhibit
[13]. Finally, the highly superficie de oroof DNA [25]. The e
the transcription
tunable and multivalent surface structures of AuNPs offer the diversi- and/or the subsequent release of DNA
ty to incorporate multiple therapeutic drugs or biomacromolecules by are improved by the hydrophobicity of th
de las NE formando enlaces con una energía menor a un enlace covalente pero mayor que
covalent or non-covalent conjugation on the surface of a NP [14,15]. AuNPs bind to DNA efficiently and protect i
One important aspect of AuNPs is their ease of functionalization. [26]. These non-covalent DNA-AuNP conju
la de un enlace electrostático (4-7kcal/mol
This ability to tailor the surface hasparamadeenlace
AuNPs electrostático;
effective in both 50-110kcal/mol
fect mammalian 293T para
cells [27]. A series of
the active and passive targeting [16]. Similarly, a variety of functional transfection efficiencies to be dependent o
monolayers can be created to provide [31]
payload release strategies using grupos
substituents in the monolayer (Fig. 3b), and
enlaces covalentes simples; RSH-Au ≈25-45kcal/mol). Otros funcionales
internal or external stimuli such as glutathione, pH, heat, and light surrounding the monolayer (Fig. 3c). Amo
(vide infra). Therefore, the versatility of the AuNP monolayer platform varying cationic monolayer coverage, the
is central to the appeal of using AuNPs as drug and biomolecule deliv- ~8-fold more efficiency 7 than 60 kDa polyet
ery systems. a widely used transfecting agent. Simple
In this review article, we discuss the recent advances in engineer- modified monolayers on AuNPs likewise pro
ing AuNP surfaces that confer the unique physico-chemical properties livery and transfection of plasmid DNA (6.3
required for enhanced delivery of drugs and biomolecules. We have 25 kDa PEI) [28]. Coating of the NPs with
presentes en péptidos como grupos aminos y en menor medida grupos carboxílicos pueden
reaccionar con la superficie de las NE estabilizándolas. Así es posible la conjugación de un
péptido con actividad biológica a una NE mediante la reacción espontánea del grupo tiol
presente en un residuo Cys contenido en la secuencia del péptido con la superficie de oro
generando así una monocapa de péptido sobre la NE (Figura 4).[26, 32] Es por esta razón que
como estrategia se puede agregar una Cys a una secuencia peptídica, en una zona que no
interfiera con la actividad del péptido y permitir así el anclaje del mismo a la superficie de
NE. Pueden mencionarse diferentes ejemplos de funcionalización de NE con péptidos como
la conjugación de NE al péptido CLPFFD, reportada por Kogan y cols.,[33] la conjugación de
NE con el péptido CALNN reportado por Levy y cols.,[13] y recientemente la conjugación con
el péptido THRCLPFFD que favorece la transcitosis a través de la BHE y a su vez reconoce
los AT-Aβ, reportado por nuestro grupo por Prades y cols.[34] Entre los diferentes diseños se
han descrito otras estrategias como el diseño de una molécula con actividad biológica pero
separada de la superficie de la NE mediante un espaciador bifuncional. En esta estrategia
se realiza el recubrimiento de una NE con un espaciador bifuncional (contiendo un grupo
RSH para unirse a la superficie de oro y otro grupo que permite el anclaje a la biomolécula).
El mencionado RSH es inicialmente quemisorbido sobre la superficie de la NE dejando
expuesto el otro grupo (ej. Carboxilo) para la unión a la molécula activa. Un ejemplo de esta
estrategia es la funcionalización de NE con tiopronina, y la conjugación de éste conjugado
con el péptido GRGDSP para terapia de cáncer (Figura 5.A).[35] Otras estrategias descritas
han señalado la utilización de PEG como agente espaciador. Un ejemplo de esto es el uso
de ácido 11-mercaptoundecanóico (AMU) que posee el tiol y el ácido carboxílico terminal de
AMU al cual se unen fragmentos de Aβ31-35 y Aβ32-35 provenientes del péptido Aβ que
presentan afinidad por fibras amiloides (Figura 5.B).[36] Existen muchísimas estrategias
descritas empleando espaciadores que tienen como fin disminuir posibles interferencias en
8
el reconocimiento molecular provocadas por alteraciones en la estructura del péptido que se
una a la NP interfiriendo con la exposición molecular hacia el blanco deseado. Es
importante considerar que al existir un espaciador podrían generarse cambios en la
estructura peptídica que conduzca a una perdida de reconocimiento hacia el blanco lo que
podría reducir la actividad biológica. Para lo cual luego de realizar modificaciones en los
conjugados nanopartícula-péptido deben caracterizarse los nuevos conjugados obtenidos.
Para el caso de las NV, muchas de las estrategias descritas para NE debiesen ser
similares, pero se deben tener ciertas consideraciones, ya que para la síntesis de las NV,
se requiere del uso de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) que actúa como un agente
inductor de la forma y además como agente para la estabilización (Figura 6).[25, 37, 38]

Figura 5. A) Esquema de la funcionalización de una NE con tiopronina como espaciador conjugada al
[35] [36]
péptido GRGDSP. B) NE cubierta con EG3SH y monofuncionalizada con AMU.

Au

Figura 6. Esquema de una NV recubierta con una bicapa de CTAB (las cabezas de grupos amonio
cuaternario del CTAB se representan en círculos negro y las colas en negro representan las cadenas
hidrofóbicas). Esquema extraído de la referencia [39].
9
En el proceso de funcionalización de las NV es muy importante eliminar el CTAB para
así conseguir la biocompatibilización.[40] Liao y cols., desplazaron el CTAB adsorbido sobre
las NV con metoxi-poli(etilenglicol)-tiolado (mPEG-SH). El mPEG-SH, es una molécula que
se comporta como un espaciador bifuncional biocompatible que actúa tanto como
estabilizante y como agente que expone un grupo funcional que puede ser posteriormente
unido a una biomolécula.[41] Otra estrategia descrita es la funcionalización de NV con
fosfatidilcolina, con lo cual se ha visto una reducción de la citotoxicidad sin observar
agregación.[42] Otra forma de funcionalizar NV es mediante la técnica de deposición “capa
por capa”[43] que se basa en el agregado de capas de distintos polielectrolitos sobre la
superficie cargada positivamente debido al CTAB de la NV para generar una carga
superficial apropiada para unir alguna molécula biológica mediante interacciones
electrostáticas.[44] Como ejemplo también se ha descrito la utilización de péptidos
modificados con Cys, como recientemente se ha reportado en nuestro laboratorio por Adura
y cols.,[29] en la que empleando CLPFFD es posible desplazar el CTAB, aumentando la
estabilidad de las NV y disminuyendo considerablemente la toxicidad de las mismas.
1.2.3 Caracterización de NpO y Conjugados: Tamaño y carga, Espectrofotometría
UV-Vis, TEM, DLS, pot-Z.
Una forma de caracterizar las NpO es por espectrofotometría UV visible, puesto que los
coloides de oro se caracterizan por su intenso color rojo, presentando espectros
característicos debido a que absorben a longitudes de onda (λ) en la región verde-azul del
espectro, lo cual permite obtener datos sobre la concentración gracias a la ley de Beer
existiendo una relación lineal entre la concentración y la absorbancia en el pico máximo de
absorción, conocida como resonancia de plasmón superficial (RPS).[16] Es posible tener una
idea de los tamaños de las NE y NV determinando la posición del máximo de absorción que
10
es el RPS ya que la posición del mismo se correlaciona con el tamaño de las AuNP,[45] así
por ejemplo NE de ~12nm poseen un λmax de 520nm. Las NV por su parte poseen una RPS
característica por poseer 2 picos, así NV con una relación de aspecto de 4:1 (40nm largo
por 10nm de ancho), presentan un pico mayor, con una λmax cercana a 800nm, relacionado
directamente con la relación de aspecto de los mismos y otro pico con una λmax cercana a
520nm como se aprecia en la Figura 7.[46, 47] Asimismo el ancho del pico de absorción tiene
relación con la homogeneidad de tamaño de las NpO. Otra técnica de caracterización
ampliamente utilizada es la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la cual permite
obtener principalmente información acerca del tamaño y forma de las NpO, ya que la
muestra es irradiada por un haz de electrones, lo que permite obtener una imagen
aumentada producto del contraste de los electrones retenidos, absorbidos o dispersados
por las NpO.[14, 48]

Nanovarillas de oro
Semillas

Figura 7. A) Síntesis de NV por crecimiento mediado por núcleos. En la síntesis se emplea CTAB como
un agente direccionador de forma. Se muestra una representación de la bicapa final de CTAB. B)
Correlación del espectro UV-Vis según micrografía TEM y fotografías de NV con diferente relación de
aspecto (longitud/ancho). La relación de aspecto se incrementa de izquierda a derecha. Todas las barras
de escala corresponden a 100nm. En el recuadro con sombra amarilla se refleja el área del espectro
conocido como la ventana biológica. Extraído de referencia [47].
11
Otra estrategia estandarizada para la caracterización del tamaño de las NpO, es la
determinación del diámetro hidrodinámico (DLS, del inglés dynamica light scattering), esta
técnica, también es conocida como espectroscopia de correlación fotónica o dispersión de
luz cuasi-elástica (DLS). Esta última técnica se utiliza para medir el tamaño de partículas de
tamaño inferior a micras y se basa en la medición del movimiento browniano que se hace
evidente por fluctuaciones de la dispersión de las luz por las NpO. Así, el tamaño de la
partícula es calculado matemáticamente desde la ecuación Stokes-Einstein, en donde
!"
d(H) = (siendo d(H) diámetro hidrodinámico; D el coeficiente de traslación de difusión,
!"#!
k la constante de Boltzman, T, la temperatura absoluta y η la viscosidad del medio).[49]
El potencial Z (pot-Z), un dato que puede ser obtenido en conjunto al DLS, se relaciona
con las propiedades en solución de las NpO, como la estabilidad coloidal, también
considerado relevante para comprender las interacciones de las NpO con los sistemas
biológicos. Dicho pot-Z es una medida de potencial eléctrico del sistema coloidal, siendo el
valor de la diferencia de potencial entre el medio de dispersión y la capa estacionaria del
mismo fluido que en teoría se encuentra unido a la partícula dispersada. Este valor indica
de alguna forma el grado de repulsión entre partículas adyacentes en una dispersión. Así a
mayor valor absoluto de pot-Z, mayor estabilidad debido a una estabilización por repulsión
eléctrica mientras que al ser un pot-Z con un valor absoluto bajo, los coloides tienden a ser
más inestables apreciándose coagulaciones y floculaciones en el tiempo. Contrariamente
una partícula con mucha carga llevará a una menor biocompatibilidad en sistemas
biológicos, por la gran cantidad de interacciones con biomoléculas influyendo sobre el
comportamiento de la misma en el sistema. En el pot-Z la doble capa eléctrica es
importante y el desarrollo de una carga neta en la superficie de la partícula afecta a la
distribución de los iones en la región interface que la rodea, lo que resulta en un aumento
de la concentración de iones libres, iones de carga opuesta a la de la partícula cerca de la
12
superficie. Así, la capa de líquido que rodea directamente a la partícula existe en dos
partes: una zona interior (capa Stern), donde los iones están fuertemente unidos y una
región externa (difusa) en el que se asocian con menos firmeza. Dentro de la capa difusa
hay un límite teórico dentro de la cual los iones y partículas forman una entidad estable. El
potencial en este límite (superficie de cizallamiento hidrodinámico) es el potencial zeta,
como se aprecia en la Figura 8.A. En un equipo diseñado por Malvern, en donde es posible
medir DLS, el pot-Z es el resultado de una medida electrocinética, en que la existencia de
cargas eléctricas en la superficie de las partículas interactúan con un campo eléctrico
aplicado del tipo electroforesis. En estas condiciones el movimiento de la partícula cargada
está influenciado por el liquido en el cual está suspendida la partícula bajo la influencia de
una carga eléctrica aplicada. Fuerzas de viscosidad actúan sobre la tendencia de las
partículas oponiéndose al movimiento. Cuando se logra el equilibrio entre estas fuerzas
opuestas, la partícula se mueve a una velocidad constante posible de ser detectado bajo
una medida de dispersión estática de luz. En este caso la velocidad depende de la fuerza
del campo eléctrico o del gradiente de voltaje de la constante dieléctrica del medio, de la
viscosidad del medio y del pot-Z. Así la velocidad es una unidad de campo eléctrico referida
como movilidad electroforética y el pot-Z está referido a esta según la ecuación de Henry:
2εzf(κa)
U! =
3η
(en donde U! es la movilidad electroforética; z es el pot-Z; ε es la constante dieléctrica; η
es la viscosidad y f(κa) es la función de Henry. En esta función, la unidad κ se denomina la
longitud de Debye, en que por lo general κ!! es la medida de espesor de la doble capa
eléctrica, y el parámetro a es el radio de la partícula, por lo cual κa mide la relación entre
radio de partícula y el espesor eléctrico de la doble capa. (Figura 8.B))
13
Si todas las partículas en suspensión tienen un gran pot-Z negativo o positivo, entonces
tienden a repelerse entre sí y no habrá tendencia a que las mismas se agreguen. Sin
embargo, si las partículas tienen valores de bajo pot-Z entonces no habrá ninguna fuerza
para evitar que las partículas se adhieran y floculen.[50]

Doble capa
! eléctrica
A! Plano de B!
deslizamiento
Partícula de superficie
con carga negativa
Capa de Stern Capa difusa

Aproximación
Potencial superficial
Smoluchowski
Potencial de Stern Aproximación
Hückel
Potencial Z
Distancia de la superficie de la partícula
Figura 8: Concepto de pot-Z. (A) Representación esquemática del pot-Z (B) Función de Henry,
aproximación Smoluchowski se considera para partículas pequeñas en medios acuosos en
concentración moderada de electrolitos, f(κa)=1,5 y en una aproximación de Hückel, para partículas
pequeñas en un medio con baja constate dieléctrica (no medio acuoso), f(κa)=1
Una manera de aumentar considerablemente la estabilidad de las nanoestructuras
metálicas es la conjugación con moléculas biológicas como péptidos anfipáticos o proteínas
que modifican las propiedades fisicoquímicas de la superficie disminuyendo además su
toxicidad y aumentando el pasaje a través de membranas biológicas para llegar hacia el
objetivo terapéutico deseado. Las NE provenientes de la síntesis son estabilizadas por
aniones de citrato y al ser conjugadas con el péptidos CLPFFD se produce un intercambio
de los citratos por el péptido estabilizando las NpO por efectos estéricos. Por otra parte, el
péptido CALNN es un péptido que confiere gran estabilidad a las NpO y puede actuar como
un espaciador entre la superficie y la molécula activa permitiendo que esta ultima mantenga
su estructura activa facilitando así la interacción con la diana. La estabilidad conferida
14
depende de la longitud de éste y de sus características de polaridad lo cual tiene influencia
sobre la carga superficial.[13]
En esta tesis se emplearán como espaciadores a la molécula de PEG de tres
subunidades (Fmoc-PEG(3)-COOH/ácido 12-(9-Fluorenil-oxicarbonil-amino) y la secuencia
peptídica CALNN de manera de aumentar la estabilidad y reducir las interacciones
especificas. Se ha descrito que el recubrimiento con PEG de alto peso molecular (5kDa)
disminuye el pot-Z de NpO a prácticamente niveles de neutralidad manteniendo la
estabilidad de las partículas por impedimento estérico, esta disminución de carga es
favorable para disminuir las interacciones inespecíficas aumentando así el tiempo de las
NpO en la circulación.[51]
Por su parte las NV obtenidas en una síntesis típica se encuentran estabilizadas por el
detergente CTAB en concentraciones a las cuales se aprecian efectos tóxicos. Así,
estrategias de funcionalización que generen impedimento estérico, permitirá eliminar el
CTAB. Una estrategia para eliminar el detergente es modificar las NV con PEG que
contiene en su extremo un tiol y presenta una gran biocompatibilidad.[51] El PEG que
contiene el tiol desplaza al CTAB de la superficie de la partícula produciéndose una
quemisorción. Otros agentes estabilizantes son de naturaleza polimérica, como PLGA y
quitosano, entre otros.[13] Para esta tesis se empleará el péptido CLPFFD para estabilizar
las NV y poder eliminar el CTAB.
1.3. La enfermedad de Alzheimer (EA) y el uso de NpO.
La enfermedad de Alzheimer (EA) fue descrita inicialmente por Alois Alzheimer en 1907.
Es una enfermedad neurodegenerativa y considerada la base patológica de la demencia
senil común, que se presenta como una degeneración neuronal progresiva generando una
pérdida paulatina de habilidades cognitivas. Es la demencia más común en la tercera edad
15
por lo cual ha tomado protagonismo hoy en día a causa del incremento de las expectativas
de vida en la población.[52, 53] Se estima que actualmente cerca de un 13% de los individuos
de 65 años y cerca de un 45% de aquellos mayores de 85 años padecen la EA.[54, 55] En
Estado Unidos de Norteamerica se estima que cerca de 5.4 millones de personas padecen
de esta enfermedad, y en Chile cerca de 170.000 casos ya han sido reportados.[56]
Es sabido que la EA involucra la formación de placas seniles a nivel extracelular que se
componen en la periferia por prolongaciones neuronales (dendritas y axones) en
degeneración y en la parte central por fibras amiloides. Estas últimas se forman por el
depósito de agregados tóxicos del péptido β-amiloide (AT-Aβ),[52] que puede inducir la
formación de ovillos neurofibrilares tóxicos de la proteína Tau (τ) a nivel intracelular (Figura
9). Tanto la formación de placas seniles a nivel extracelular cono la de ovillos neurofibrilares
a nivel intracelular son los agentes causantes de la EA según se ha propuesto en las dos
ultimas décadas.[57, 58] Actualmente es aceptada la hipótesis del amiloide, que postula que el
elemento principal y primario de la EA es el Aβ, que determina la disfunción sináptica y
celular, el depósito de τ, la inflamación y finalmente la muerte neuronal.[58] Cabe mencionar
que también se ha planteado que el depósito de Aβ tendría un efecto protector, actuando
como biofloculante que atrapa toxinas, especialmente iones metálicos, por lo que la
acumulación de Aβ pudiera ser una respuesta fisiológica a una determinada injuria como
modulador a los procesos inflamatorios, dada la acumulación de Aβ en el traumatismo
craneoencefálico.[58]
Aún cuando Aβ se encuentra fisiológicamente en el cerebro, en condiciones patológicas
se auto agrega formando diferentes especies anómalas representadas en la Figura 10 que
incluyen desde pequeños oligómeros hasta fibras, que finalmente derivan en los depósitos
tóxicos ya mencionados.[16]
16

Vasos(Sanguíneos( Neurona(

Oligómeros( Núcleo(

Moléculas(de(
Protofibrillas( señalización(

Neurita(
Neurona(
Sinapsis(
Placas(Amiloides(
Sinapsis(
dañada(
Ovillos(
neurofibrilares(
Axón(

[57]
Figura 9: Modelo de EA en donde se representan las placas amiloides y los ovillos neurofibrilares.
El Aβ monomérico presente en condiciones fisiológicas consiste en una familia de
péptidos hidrofóbicos de entre 39 a 43 aminoácidos (aa) que es codificado a partir del
cromosoma humano 21, formando parte de una proteína más grande conocida como la
proteína precursora del amiloide (PPA)[54, 58]

la cual es metabolizada por tres enzimas
denominadas α, β, γ secretasas.[59]
[16]
Figura 10: Esquema teórico de la formación de las diferentes especies a partir de monómeros de Aβ.
17
1.3.1. Estrategias para el tratamiento de la EA empleando péptidos.
Las investigaciones sugieren que las placas amiloides tienen un rol protagónico en la
patogénesis de la enfermedad, para lo cual se han propuesto muchas estrategias de
tratamiento basados sobre la inhibición de la cascada amiloidogénica, siendo una de éstas
estrategias terapéuticas la de bloquear los pasos de despliegue y agregación de Aβ. Para
ello se han diseñado péptidos cortos sintéticos capaces de unirse selectivamente a Aβ
evitando la formación de AT-Aβ.[54, 58]
Uno de estos péptidos es el inhibidor de agregación Ac-LPFFD-NH2 (iAβ5p)[30], el cual se
diseñó a partir de la región central de Aβ formada por los aa 17-20 (LVFF) (Figura 11), uno
de los núcleos putativos de agregación de Aβ. Para el diseño de la secuencia aa de iAβ5p
se mantuvieron parte de los aa de la secuencia nativa (LVFF), los aa hidrofóbicos Leu (L) y
Phe (F) que son cruciales para el anclaje permitiendo el reconocimiento de los agregados
de Aβ. Se introdujo también el residuo Asp (D) en el extremo C-terminal que es de
naturaleza hidrofílica y hace al péptido mas soluble entregándole un carácter anfipático.
Además se cambió el aa Val (V) que no es crucial para el reconocimiento por una Pro (P),
un aa reconocido como disruptor de estructuras secundarias. Finalmente se modificó el
extremo carboxilo terminal convirtiéndolo en amida para hacerlo mas estable frente a la
degradación por exopeptidasas.[54, 58, 60]

Sin embargo, el uso de este péptido no ha
prosperado debido a su baja estabilidad in vivo y a la necesidad de emplear dosis muy
elevadas que conducen a efectos tóxicos.
1.3.2 Entrega selectiva de NpO hacia los AT-Aβ mediante el uso de péptidos.
La clave para un tratamiento basado en el uso de NpO es poder dirigirlas selectivamente
hacia la diana terapéutica. En el caso de los AT-Aβ en la EA, las NpO deben atravesar la
BHE y llegar a las placas amiloides presentes en el cerebro. Una estrategia utilizada para
18
ello es unirlas a moléculas como péptidos, proteínas o moléculas orgánicas que faciliten la
llegada al cerebro y que permitan la interacción con los AT-Aβ, como es el caso de
iAβ5p,[30, 50] evitando también fenómenos que puedan dificultar su llegada como la captación
por el Sistema Fagocítico Mononuclear (SFM).
A

B

Figura 11: A) Estructura secundaria del péptido Aβ B) Secuencia de Aβ. En rojo se representan los aa
hidrofóbicos que forman parte del núcleo putativo de agregación. Se muestra la secuencia de iAβ5p
similar al fragmento 17-20 de Aβ, destacándose en azul los aa hidrofóbicos que se mantienen respecto a
[39]
la secuencia original y en amarillo la prolina, un residuo disruptor de estructura secundaria.
Para poder efectuar el anclaje de iAβ5p a la superficie de las NpO, se requirió de una
nueva modificación de la secuencia que consistió en la incorporación del residuo Cys (C)
que contiene un tiol que se quemisorbe a la superficie de las NpO formando una unión
Azufre-Oro estable.[6, 33, 61, 62] Así la funcionalización de las NpO con el péptido CLPFFD
(Figura 12) cambia las propiedades fisicoquímicas de la partícula produciendo una
disminución del valor absoluto de la carga tras reemplazar el citrato (estabilizante de las
NpO proveniente de la síntesis) por el péptido, aumentando la estabilidad del coloide por
efectos estéricos (repulsión) (Figura 12).[61] En conjunto a lo anterior, tras evaluar la
biodistribución de las NpO-CLPFFD se demostró que el porcentaje que llega al cerebro es
muy bajo respecto de la dosis inyectada (DI) por via intraperitoneal (aprox. 0,05%) lo cual
dificulta una posible terapia basada en el uso de las mismas.[50] Por tanto, es necesario
conocer los factores que tienen influencia directa sobre la biodisponibilidad para así poder
19
aumentarla. La llegada de NpO al cerebro y su farmacocinética en general se ven afectadas
por diferentes factores como la interacción con proteínas del plasma, la captación por el
SFM, la estabilidad de los coloides, la captación por otros órganos y la dificultad de
atravesar la BHE.
La conjugación de las NE con el péptido CLPFFD provocó un incremento en la
penetración respecto de las NE sin recubrir.[50] Sin embargo, las causas por las cuales se
incrementa la entrega de NpO recubiertas con CLPFFD hacia el cerebro no están claras.
Un factor clave para explicar este hecho podría ser el rol que juega el recubrimiento con las
proteínas plasmáticas o la unión a receptores de membrana presentes en la BHE que
favorezcan la transitosis mediada por receptores, siendo estos factores claves en el
proceso de biodistribución. En el presente proyecto se estudiará el efecto de la conjugación
de NpO con péptidos sobre la interacción con proteínas plasmáticas, la estabilidad y la
toxicicidad.

= Citrato = CLPFFD

NE NE-‐CLPFFD

Mayor estabilidad por efecto estérico es

Menor carga negativa

Figura 12. La conjugación de NE con el péptido anfipático CLPFFD afecta la carga y estabilidad. Las
moléculas de citrato que recubren y estabilizan a las NE antes de la conjugación (izquierda) y las
moléculas peptídicas después de la conjugación (derecha), se presentan según el modelo de bola y
bastón en donde los átomos de azufre, oxigeno y carbono se representan amarillo, rojo y azul
respectivamente.
20
1.4. Farmacocinética, estabilidad, toxicidad y penetración de las NpO.
Para aplicaciones farmacéuticas de las NpO se deben considerar factores como las vías
de administración, farmacocinética, toxicidad y estabilidad siendo los mismos ampliamente
dependientes de la composición, tamaño, carga superficial y recubrimiento.[51, 61, 63]
En los estudios de biodistribución se deben considerar las variables fisiológicas, como el
flujo sanguíneo, propiedades fisicoquímicas de la sustancia como tamaño, hidrofobicidad,
liofilicidad, además la biocompatibilidad, y también el análisis del transporte a nivel de las
barreras biológicas.[64] Se ha descrito que la distribución de NpO en órganos es dependiente
del tamaño,[51] de la forma y del área superficial relativa al volumen, afectando en conjunto a
la captación y al almacenamiento en tejidos.[65]
Para el pasaje a través de barreras biológicas, el tamaño es un factor importante ya que
la velocidad de penetración de una sustancia está inversamente relacionada con el tamaño
molecular.[14, 66] Por otra parte, los diversos estudios dan cuenta que la distribución de NpO
en el organismo es mayor a medida que disminuye el tamaño. En este contexto Jong y
cols., determinaron que NpO de 10 a 15nm administradas intravenosamente en ratón
presentan una amplia distribución en órganos (hígado, sangre y bazo en elevadas
proporciones, y en pulmón, riñón, corazón y cerebro en bajas proporciones).[63] Por otra
parte, Sonavene y cols. demostraron que NpO de hasta 50nm atraviesan la BHE llegando al
cerebro.[67] En estudios realizados en nuestro laboratorio se observó que NpO de 12,5nm
administradas intraperitonealmente en ratón se distribuyen y acumulan en distintos órganos,
atravesando la BHE y acumulándose así en cerebro no observándose evidencias de
efectos tóxicos.[68] Recientemente, se demostró que al conjugar las NpO al péptido CLPFFD
se incrementan los niveles de oro en cerebro de ratas inyectadas intraperitonealmente en 4
veces con respecto a los encontrados para NpO sin funcionalizar.[50] Asimismo, Niidome y
cols. inyectaron por vía intravenosa NV de una relación aspecto (Largo/ancho) de
21
aproximadamente 6 y modificadas con PEG observando que las mismas permanecen en
circulación más tiempo que las sin modificar por lo cual el PEG disminuye la acumulación
de NV en hígado. Por otra parte, Wang y cols. evaluaron la distribución de NV de una
relación de aspecto ~4,2 sin recubrir y encontrando también que las mismas se acumulan
en hígado llegando también al cerebro.[65]
Una de las razones de la alta acumulación de NpO en hígado y bazo, posiblemente se
deba a la carga superficial de la partícula, referida al potencial Z (pot-Z) que estas poseen,
pues se sabe que el SFM reconoce moléculas con un pot-Z negativo, como el que poseen
las NE. Por esta razón es muy esperable una acumulación de NE en éstos órganos. Así, la
carga superficial de los NM tiene influencia directa sobre la estabilidad, biocompatibilidad y
distribución de estos, afectando directamente sobre la farmacocinética, a la captación y la
viabilidad celular. Según lo cual en una NpO conjugada, la carga superficial puede variar
teniendo diferentes efectos farmacocinéticos como es el caso del clearance sanguíneo.[65] A
raíz de esto resulta importante determinar la carga superficial de NM utilizados para fines
farmacéuticos.
Las NpO en el plasma sanguíneo interaccionan con proteínas cubriéndose con éstas
formando así la denominada CP que puede favorecer procesos de opsonización y llevan a
su captación por el SFM impidiendo que éstas lleguen con niveles adecuados a los órganos
de interés. Así, al momento de diseñar una NpO se debe lograr disminuir el carácter
negativo del pot-Z sin afectar la estabilidad de las NpO lo que puede ser una estrategia
interesante a desarrollar para disminuir su captación por el SFM.[68]
Si la diana se encuentra en el cerebro, las NpO deben atravesar la BHE y además evitar
unirse a moléculas biológicas que favorezcan la captura por otros órganos o sistemas como
el SFM asociado a las células de Küppfer que pueden fagocitar NP cargadas
negativamente, disminuyendo así la biodisponibilidad.[51, 69]

Lo cierto es que las NpO
22
obtenidas en una típica síntesis por reducción de oro con citrato[12] se encuentran cargadas
negativamente, lo que las hace más susceptibles a la captación por el SFM debido al
recubrimiento con opsoninas como inmunoglobulinas, proteínas del complemento,
fibrinógeno, entre otras.[70] Existe una gran cantidad de alternativas a emplear para intentar
mejorar la permeabilidad de las NpO al cerebro, entre estas se incluye la conjugación a
moléculas anfipáticas que actúan como transportadores para mejorar el paso por la BHE,[71]
la conjugación con péptidos que disminuyan su carga negativa (aumentar el valor de pot-
Z)[61] logrando así reducir la captación por el SFM con lo cual puede aumentar la llegada al
cerebro.[51] Asimismo se puede lograr una reducción de la carga negativa de las NpO tras la
funcionalización a moléculas biocompatibles como polietilenglicol, un polímero hidrofílico e
inerte que disminuya la interacción con proteínas como las opsoninas lo que las hace
"parcialmente invisibles" al SFM lo que conlleva a la disminución de su captación por el
SFM aumentado así el tiempo de circulación,[50, 67, 72]

y reduciendo los posibles efectos
inmunogénicos.[73] Cualquier estrategia que permita acercarse a la neutralidad de carga
ayudará a disminuir la captación de las NpO por el SFM.[51] Tal como es el caso de la
disminución de valor absoluto de pot-Z al conjugar las NpO con el péptidos CLPFFD.[34, 50]
No obstante es importante considerar que con la disminución de la carga también puede
disminuir la estabilidad coloidal, lo cual a su vez también podría repercutir negativamente en
la entrega de fármacos.[74]
En resumen, tanto la forma, el tamaño y la carga tienen influencia sobre la
farmacocinética de NpO aunque no se pueden obtener conclusiones generales debido a la
existencia de poca información reportada.[75]
23
1.4.1. Pasaje de NpO a través de la BHE.
Uno de los principales inconvenientes de la administración de fármacos que deben
actuar sobre blancos terapéuticos que se encuentran en el sistema nervioso central (SNC),
como son los AT-Aβ involucrados en la EA, es el pasaje de los mismos a través de la BHE.
Esta barrera protege al SNC de sustancias extrañas, restringiendo también la entrega de
medicamentos y la entrada de muchos potenciales agentes terapéuticos.[76, 77] La BHE es el
mayor obstáculo para el pasaje de moléculas desde la sangre al cerebro. En ella convergen
células endoteliales, pericitos, astrocitos y microglia. En donde a su vez las células
endoteliales de los microvasos cerebrales (CEMC), presentan uniones estrechas, ausencia
de fenestraciones y una baja actividad pinocítica, lo cual ayuda a restringir el paso de
compuestos desde la sangre al cerebro siendo este el mecanismo que impide la
penetración de muchos agentes terapéuticos como oligonucleótidos, anticuerpos, péptidos
y proteínas. Además las CMEC poseen una variedad de enzimas citosólicas sobre la
membrana citoplasmática que también contribuyen a la naturaleza restrictiva. También se
encuentra sobre la membrana plasmática luminal de CMEC la enzima glicoproteína P (gp-
P), siendo esta proteína una bomba extractora dependiente de ATP que impide la
acumulación intracelular de una gran variedad de agentes quimioterapéuticos y compuestos
hidrofóbicos reduciendo así la eficacia de fármacos. Entre las proteínas que se encuentran
en la membrana luminar del CMEC se aprecian proteínas receptoras, que favorecen
procesos de transporte a través de la BHE (ej. transcitosis) como es el caso del receptor de
transferrina y el receptor de Apolipoproteína E (ApoE) (este último mencionado en la Figura
10 en conjunto a la familia de receptores de lipoproteínas de baja densidad-LDLR), entre
otros.[76-79]
24
Recubrir NpO con moléculas que reconozcan dichos receptores o evitar que las
partículas sean reconocidas por la gp-P ayudaría a aumentar el pasaje de las mismas a
través de la BHE.
El tamaño de las sustancias es un factor crítico para el pasaje a través de la BHE, ya
que la rapidez de penetración a través de barreras biológicas está inversamente
relacionada con el mismo.[14, 66]

Aún cuando la BHE es relativamente impermeable a
compuestos sobre una cierta masa o hidrofilicidad, aparenta tener una gran permeabilidad
y una capacidad absortiva suficiente para compuestos con superficie polar mayor a 270Å2,
un peso molecular mayor a 1000Da, una hidrofilicidad menor a −3.5 y una razón de
equilibrio de concentración cerebro a sangre menor a 0,01.[80]
Recientemente se ha propuesto que una de las estrategias para la liberación controlada
de sustancias hacia el SNC es la utilización de nanopartículas de diversa naturaleza, en
donde una forma no invasiva propuesta para la entrega de fármacos es utilizar portadores
coloidales como micelas, emulsiones, liposomas y NP los que pueden incrementar la
llegada de fármacos hacia células o tejidos como el SNC, al protegerlos de enzimas y
mejorar su difusión a través de la BHE. Así se ha conseguido demostrar que NP de hasta
200nm cruzan la BHE de ratas posiblemente por endocitosis o transcitosis sin dañar el
endotelio[80] existiendo evidencias que NpO de 10 a 200nm se distribuyen in vivo
atravesando la BHE y llegando al cerebro.[51, 63, 80]
Tal como se ha descrito anteriormente, el conjugado NpO-CLPFFD pude cruzar la BHE
y llegar al cerebro en mayor proporción que NpO sin recubrir, por esto el péptido es el
responsable de dicho proceso, posiblemente debido a un mecanismo más específico para
favorecer el cruce de la BHE como la endocitosis mediada por receptores.[63, 81] En este
sentido se ha propuesto que el péptido CLPFFD, al ser obtenido a partir de una porción del
péptido β-amiloide, puede mantener la capacidad para ser reconocido por receptores a
25
nivel de BHE, involucrados en el transporte de Aβ desde la circulación al cerebro. Este
péptido puede ingresar al SNC a través de una transcitosis mediada por los receptores para
los compuestos de glicosilación avanzada (RAGE, del inglés), un receptor multiligando para
IgG,[82-85] que tal vez permita el cruce de las NE-CLPFFD a través de la BHE.[9, 30, 50]
1.4.2. Estrategias para aumentar la llegada de las NpO al Cerebro.
Una de las mayores limitaciones para que los fármacos en general y las nanopartículas
lleguen al sistema nervioso central esta dada por la BHE cuya principal función es regular el
paso de especies hacia el cerebro. Actualmente existe gran interés en el desarrollo de
nuevos compuestos para el tratamiento de enfermedades del SNC, sin embargo, se ha
limitado debido a la presencia de la BHE.[86] Se sabe que esta barrera no es impermeable y
permite el paso selectivo de moléculas necesarias para mantener la integridad de las
funciones. En el caso de las NpO-CLPFFD se ha observado que una pequeña porción
respecto de la DI llega al cerebro (aprox. 0.05 %). Analizando en su conjunto los
obstáculos que se pueden presentar para un fármaco antes de llegar al cerebro se puede
mencionar: la interacción con proteínas, la estabilidad, la vía de administración y los
mecanismo de eliminación, entre otros. No obstante es posible modificar la superficie de las
NpO de manera de sortear los diversos obstáculos como ya se ha demostrado previamente
tras modificar ésta con el péptido CLPFFD, con lo cual se ha logrado mejorar la
permeabilidad respecto de las NpO sin funcionalizar. Posiblemente este efecto podría estar
dado por el cambio en el valor de pot-Z (disminuye en valor absoluto acercándose mas a la
neutralidad), la cual puede contribuir a un patrón de interacción diferente de adsorción de
proteínas del plasma específico. El cambio de la carga puede producir diferencia en la
adsorción de proteína modificando el reconocimiento por receptores a nivel de las
membranas de las células endoteliales de la BHE, favoreciendo la transcitosis, y/o
26
7195
disminuyendo la carga evitando R.laPrades et al. / Biomaterials 33 (2012) 7194e7205
interacción con proteínas como opsoninas, minimizando
its integrity and to perform its functions. These basic nutrients are ex vivo and in vivo by our group [7,10]. This limitation could be an
provided by endogenous influx mechanisms present on the capil- inconvenience for therapeutic applications.
[34, 50, 51, 87]
así la that
laries retención por
constitute the el SFM
barrier. y aumentando
These influx la biodisponibilidad
mechanisms can be hacia
With the goal to improve el cerebro.
the delivery of AuNPeCLPFFD to the
used to gain access to the central nervous system for drug delivery. brain, we used a bloodebrain barrier shuttle to increase the
Here we focused our attention, as potential bloodebrain barrier permeability of the conjugate to the central nervous system by
Es posible aumentar los niveles de NpO en el cerebro, mejorando la penetración a través
shuttle, in a peptide that interacts with the transferrin receptor, means of an active transport mechanism. Several large cargos have
which is widely expressed in the brain endothelial cells that been successfully delivered to the brain through this pathway
constitute brain capillaries [3]. The main advantage of using [11e14]. Here we describe the feasibility of THRPPMWSPVWP
de la BHE empleando moléculas lanzadera. Actualmente en el diseño farmacéutico se
a peptide as a shuttle instead of the native substrate of the receptor (THR), a peptide that was found by phage display and that targets
(transferrin) or an antibody against the receptor is that peptides are the transferrin receptor [15], to improve the delivery of the
easier and less expensive to manufacture, show high specificity and AuNPeCLPFFD conjugate to the brain both in vitro and in vivo. For
[88-91]
intenta potenciar este tipo de vías de ingreso para favorecer la llegada al cerebro.
generally produce a very low immunological response [4]. this purpose we formed the new conjugate AuNPeTHReCLPFFD Por
In a previous report, our group showed the feasibility of gold and examined its capacity to cross the bloodebrain barrier and
nanoparticles (AuNPs) conjugated to the b-sheet breaker peptide recognize Ab aggregates (Fig. 1).
lo que se diseñó el péptido THRPPMWSPVWPCLPFFD (THRCLPFFD) que es un
LPFFD, modified with a Cys (C) residue at the N-terminus (CLPFFD)
to promote chemisorption of the peptide onto gold surfaces, to 2. Materials and methods
recognize the b-amyloid toxic protein aggregates (Ab) (i.e. oligo-
constructo bifuncional, que además de poseer2.1.laMaterials
secuencia CLPFFD capaz de reconocer al
mers, protofibrils and fibrils) involved in AD. We showed that, by
means of irradiation with weak microwaves, in vitro Ab aggregates Fmoc-Na-protected amino acids and resins were supplied by Luxembourg
bound to the conjugate AuNPeCLPFFD were destroyed by local
péptido β-amiloide (Enfermedad de Alzheimer), posee la secuencia THRPPMWSPVWP
Industries (Tel-Aviv, Israel), Neosystem (Strasbourg, France), Calbiochem-
(nanometrically) dissipation of the absorbed energy [5,6]. However,
Novabiochem AG (Laüfelfingen, Switzerland), Bachem AG (Bubendorf,
the success of this approach as a type of molecular surgery to Switzerland), or Iris Biotech (Marktredwitz, Germany). PyBOP and RO-20-1724 was
supplied by Calbiochem-Novabiochem AG. DIEA, ninhydrin, and 2-mercaptoethanol
remove the toxic aggregates [92]
present in the brains of AD patients
(THR) (Figura 13), que es una secuencia lanzadera que reconoce el receptor de
and thereby halt or slow down the progression of this disease
were obtained from Fluka Chemika (Buchs, Switzerland). TBTU was purchased from
Albatros Chem Inc. (Montreal, Canada). HOAt was supplied by GL Biochem Shanghai
require that the AuNPeCLPFFD conjugate overcome the Ltd. (Shanghai, China). Gold (III) chloride hydrate, sodium tribasic dihydrate, human
bloodebrain barrier. Our group also recently reported that after serum[34, 93,human
(from 94] male AB plasma), 5(6)-carboxyfluorescein, collagen type IV,
transferrina presente en el endotelio de la BHE.
intraperitoneal injection of AuNPeCLPFFD in rats, some accumu-
Dicha molécula es transportada por
fibronectin, 8-(4-chlorophenylthio)-cAMP, NaHCO3, MEM non-essential amino
acids, Lucifer yellow and HEPES were from SigmaeAldrich (Deisenhofen, Germany).
lation of the conjugate was found in the brain. The amount detected Bovine brain endothelial cells (BBECs) were purchased from Cell Applications Inc.
was low but slightly higher than that found in control animals
transcitosis mediada por el receptor de transferrina presente en las células endoteliales de
injected with citrate AuNP [7]. The conjugation of CLPFFD to AuNPs
(San Diego, USA). Solvents for peptide synthesis and HPLC were obtained from
Scharlau or SDS (Barcelona, Spain). Trifluoroacetic acid was from KaliChemie (Bad
may enhance the penetration of these particles to the brain through Wimpfen, Germany). Ab1e42 was from rPeptide (Bogart, USA). DMEM was from
Biological Industries (Kibbutz Beit-Haemek, Israel), and fetal bovine serum from PAA
the following proposed ways: (a) the adsorption of specific plasma
la microvasculatura de la BHE pudiendo actuar como una lanzadera hacia el sistema
proteins, which could contribute to receptor-mediated trans-
Laboratories GmbH (Pasching, Austria).
cytosis; (b) the enhancement in the amphipathic character of the

2.2. Synthesis of peptides and chromatography
functionalized particle, which could favor passive diffusion through
nervioso central. En esta tesis se ha logrado aumentar los niveles de NE unidas a
the bloodebrain barrier; or (c) the decrease in the absolute value of
Syntheses were performed on a 200-mmol scale/each, in all cases -amino acids L
zeta potential, which could contribute to a reduction in particle were used. Solid-phase peptide elongation and other solid-phase manipulations
retention by the reticulum endothelial system (RES), thus were done manually in polypropylene syringes, each fitted with a polyethylene
THRCLPFFD respecto de las unidas a CLPFFD aumentándose también el tiempo de
increasing the bioavailability of these particles [8,9]. However, the porous disk. Solvents and soluble reagents were removed by suction. Washings
between synthetic steps were done with dimethylformamide (5 ! 30 s) and
percentage of AuNPeCLPFFD that reaches the brain is still very low dichloromethane (5 ! 30 s) using 5 mL of solvent/g resin each time. During
with respect to the injected dose as was demonstrated recently [34]mixture was allowed to react with intermittent manual stirring.
permanencia de las mismas en cerebro (Figura 13). couplings, the
Sangre' Cerebro'
Núcleo'
Núcleo'
NE'

Núcleo'
Figura 13. Esquema para relacionar el diseño del conjugado NE-THRCLPFFD con su función in vivo. (a)
Fig. 1. Scheme to rationalize the design of the conjugate AuNPeTHReLPFFD. (a) The peptide THReCLPFFD anchored to the AuNP. This peptide contains the THR sequence that
recognizes the transferrin receptor and LPFFD that recognize Ab aggregates; (b) transport of the endocytic vesicle through the endothelial cells of the bloodebrain barrier; and
El péptido THRCLPFFD anclado a la superficie de las NE, le confiere al conjugado la capacidad de ser
(c) recognition and binding of the conjugate to Ab aggregates inside the central nervous system. Transferrin receptor is abbreviated as TfR.
reconocido por el receptor de Transferrina (TfR). (b) Transporte mediado por receptor inducido por TfR, el
cual consiste en una vesícula endocítica que permite el paso a través de las células endoteliales de la
BHE. Y (c) LPFFD le confiere al conjugado la capacidad de reconocer y unirse a los AT-Aβ dentro del
SNC. Figura extraída de la referencia [34].
27
1.5.1. Toxicidad de NpO.
Aun se desconoce el impacto y los riesgos biológicos de las terapias con NP, siendo
latente un eventual almacenamiento de NP no degradables que conduzca a una
acumulación lisosomal que conlleve a la muerte, como es el caso de una sobre exposición
a NpO lo que conduciría a un daño hepático.[65]
La toxicidad de las NpO depende ampliamente de su tamaño habiéndose reportado que
NE de 4 a 100nm no poseen efectos citotóxicos aparentes en contraste a las de 1 a 2nm
cuyos efectos son altamente tóxicos.[95] Recientemente, se ha reportado que la exposición
prolongada a altas concentraciones de NpO de 20nm conlleva a efectos tóxicos al
producirse acumulación en los órganos como el hígado y el bazo, en donde se ha
observado a su vez cambios en los patrones de expresión génica, activándose también
vías tóxicas metabólicas.[96] Asimismo, las NpO de 1,4nm son muy tóxicas al generar altos
niveles de estrés oxidativo y al poder interaccionar con el DNA llevando a efectos
genotóxicos.[97-99]
Los posibles efectos tóxicos de las NP metálicas pueden deberse al estrés oxidativo
producto de los radicales libres propios del sistema celular de degradación y disolución de
estas NPs, al ser posiblemente ionizadas en los distintos ambientes in vivo (jugos gástricos,
lisosomas, etc.). Por su parte, el oro como Au (I), se utiliza como droga antitumoral, tras
inducir apoptosis, al coordinarse con tiorredoxina reductasa en la mitocondria o por daño de
la membrana mitocondrial en su forma lipofílica y catiónica, tras liberar citocromo C. En su
estado Au (III), no es estable y pasa a Au (I) in vivo. Es por esto que los estados de
oxidación del Au son determinantes para los efectos negativos, lo cual puede resultar
crucial para NpO en especial para las NV.[65] Es importante destacar que en la superficie de
las NV y NE se encuentran átomos de Au (I) que pueden dar origen a efectos tóxicos. En el
caso de las NV y ciertas NE que contienen CTAB, su presencia puede ser un factor
28
determinante de toxicidad, tras observarse que en NV al reemplazar el CTAB por PEG se
disminuye considerablemente la toxicidad.[75, 100]
Sin duda, un factor importante es la interacción de las NpO con macromoléculas del
medio biológico que pueden recubrirlas y modificando sus propiedades y dimensiones
originales y modulando la farmacocinetica, estabilidad, penetración y toxicidad.[100]

1.6. Interacción de nanopartículas con proteínas plasmáticas, formación de la CP y
su efecto sobre la farmacocinética, estabilidad y toxicidad.
Sin duda, uno de los factores que tienen influencia sobre la farmacocinética de los NM,
como las NpO, es la interacción con biomoléculas (prioritariamente proteínas) de diferentes
fluidos biológicos, las cuales recubren las NpO y forman la CP. Esta corona proteica que
rodea los NM se forma rápidamente una vez que la partícula interactúa con el plasma u otro
ambiente biológico. Dicha corona es la verdadera superficie interactiva que se une a
biomoléculas, células y otras estructuras biológicas. Este fenómeno ha sido discutido
durante los últimos años concordando en que estos cambios en la superficie de los NM
producen efectos sobre las interacciones biológicas, aunque hasta el presente es poca la
información existente al respecto de modificaciones de NpO con péptidos.[4]
La conformación de la CP se vuelve una caja negra con muchas posibilidades de
modulación de respuestas por lo cual elucidar esta puede ser clave en nuevas aplicaciones
de NM, en pro a una mayor eficiencia en posibles terapias, y en el diseño posterior de
nuevos fármacos derivados de NM. Actualmente las estrategias apuntan a evitar esas
interacciones,[101] pero dada la complejidad del sistema puede resultar más atractivo
apuntar a favorecer ciertas interacciones que mejoren de alguna forma la farmacocinética,
la penetración a dianas terapéuticas, y la posterior eliminación del sistema. Para el estudio
de la formación de esta CP se incuban los NM con plasma por diferentes periodos de
29
tiempo que pueden variar desde segundos hasta días,[102] dependiendo de las futuras
aplicaciones farmacéuticas. Luego de la incubación las proteínas no unidas se separan de
las unidas por centrifugación método que puede producir artefactos debido a que en el
proceso pueden separarse proteínas unidas débilmente. Con el fin de evitar estos
artefactos puede emplearse como alternativa la separación por cromatografía de exclusión
molecular. Luego para la identificación de las proteínas puede emplearse diversos métodos
como LC-MS/MS, geles bidimensionales, así como también Western Blot, entre otros.[74]
Los NM interactúan con proteínas plasmáticas, inmunoglobulinas, albúminas, elementos
del complemento, fibronectinas, entre otros, pudiendo facilitar el reconocimiento por células
fagocíticas, influyendo sobre las respuestas inmune e inflamatoria y/o sobre la captura por
otros órganos o sistemas como el SFM.[51, 69]

Procesos como la opsonización pueden
determinar el destino de las nanopartículas administradas, como por ejemplo en el caso de
NP con superficies hidrofóbicas que se pueden unir eficientemente a componentes del
plasma pudiendo ser removidas de la circulación por macrófagos del hígado y del bazo
(SFM). Contrariamente aquellas NP que son pequeñas y con superficie hidrofílica pueden
escapar al menos parcialmente de este proceso y permanecer en la circulación por más
tiempo.[77, 103]
Debido a esto el recubrimiento superficial es un factor a considerar, pues
según la naturaleza química de las moléculas con las que se conjuguen, será la carga
superficial final y la disposición que adopten las moléculas adsorbidas a las NP, afectando
a la interacción con proteínas y modulando la biodisponibilidad y el reconocimiento del
blanco terapéutico.[51, 61]
La interacción de los NM con las proteínas puede producir plegamientos anómalos y
agregación de proteínas pudiendo producir efectos tanto nocivos como beneficiosos para la
salud. Es fundamental comprender el efecto de los NM sobre los procesos biológicos
esenciales como el plegamiento de proteínas.[104] Algunas proteínas pueden verse afectadas
30
provocando desdoblamiento y perdida de la función.[105] También se ha descrito que
algunas proteínas mejoran su estabilidad aun en condiciones desnaturalizantes.[106] La
Figura 14 esquematiza el posible efecto de la interacción de la superficie de las NpO con la
conformación de las proteínas con las que puede interactuar.
Sin duda no se deben olvidar a su vez las interacciones con aminotioles como el
glutatión, en este contexto se ha determinado que el tiempo de recambio de tioles en
superficie de la NpO es mayor a medida estas son de mayor tamaño, por lo cual esto podría
inducir ciertos fenómenos

Saptarshi et no deseados,
al. Journal of Nanobiotechnology 2013, 11:26 como disminuir la cantidad de GSH presente
http://www.jnanobiotechnology.com/content/11/1/26
Page 4 of 12 en el
plasma, afectando procesos biológicos.[107]

Native protein
Estructura(de(la(
structure
proteína(na0va(
D
Exposición(en(Superficie(
Surfacing of
de(epitopes(críp0cos(
“Cryptic” Epitopes
Immune
Reconocimiento(
recognition
inmune(
C
B Altered protein
Función(de(la(proteína(
Protein un-folding
Proteína(desplegada( function
alterada(

A
Nanoparticle-protein corona
Nanoparticle-protein corona
Formación(de(la(corona(de(proteína(
Formation
sobre(la(Nanopar8cula(

Superficie(de(la(NP(
NP Surface
Figure 1 Schematic representation of NP surface induced unfolding of the interacting protein molecule and consequences. (A) Protein
molecules adsorb on to the NP surface, to form a complex termed as the (B) NP-PC.NP surface may induce conformational change to the native
Figura 14: Representación
structure of the adsorbed proteinesquemática del
molecule, causing it to des
unfold. Suchplegamiento dechangesmay
protein conformational proteínaseither que
(C) alterinteractúan
the function of thecon la
native protein moleculeor even lead to (D) exposure of “cryptic” epitopes which may result in immunological recognition of the complex.
superficie de una NP. (A) Moléculas proteicas adsorbidas sobre la superficie de la NP, complejo llamado
NP@CP. (B) La superficie
formation de lasofNP
[39]. Fibrillation puedeis inducir
proteins cambios
associated in theconformacionales sobrebylaHeLa
case of SWCNT uptake estructura nativa
cells [48], or
de las with diseases adsorbidas,
proteínas such as Parkinson’s and Alzheimer’s.
causando cambiosThe cytoplasm of cellsde
conformacionales as observed for copolymer
estas últimas. NP [49].
Cambios que
fact that NPs can act as platforms to initiate such pro- Cytotoxicity and immune-modulation are the two most
puedentein
alterar la función
structural changesdedemands
la estructura nativa de la proteína
further investigation important (C) o exponer
repercussions regiones
of NP antes
uptake by cells.internas,
This is
of this phenomenon. of particular importance when considering NPs that
que pueden
The en
NP algunos caso
surface can also ser epitopes
introduce ocultos, resultando
thermodynamic en un reconocimiento
have a propensity inmunológico
to dissolve after reaching del
the acidic
instability to the adsorbed protein molecule
complejo (D). Imagen extraída de la referencia [108]. making it lysosomal compartments of the cell, thus contributing
susceptible to chemical denaturation. ZnO NPs induced to cellular toxicity. To understand the fate of NPs in
unfolding of the periplasmic domain of the ToxR protein the biological context it is imperative to systematically
of Vibrio cholera making the protein susceptible to de- analyse the intricate factors involved in uptake of these
1.6.1. naturation
Formación de laagents
by chaotropic CP. [40]. Interestingly, ZnO novel materials.
NPs were able to stabilize the α-helical content of lyso- Protein adsorption, physical characteristics of the NPs
zyme against denaturing agents [41]. The fate of proteins and the properties of interacting cells may influence NP
La CPafteresbinding
la on
consecuencia de un equilibrio y una competencia entre las distintas
the NP surface is thus partially governed uptake. Kinetics of uptake of the same nanomaterial has
by their own chemical properties. A comprehensive list of been shown to differ with different cell types [50,51].
proteínasstructural
que se adsorben
modifications sobre
induced la superficie
by interacting NPs with de los NM.
Adsorption Este onfenómeno
of proteins the NP surfaceescan crucial
take place para
single proteins has been provided in Table 2. almost instantly. Therefore, it can be assumed that inter-
action of the NP with cellular structures is indirect and
Nanoparticle-protein corona: implication on cellular occurs mostly via the NP-PC and not the bare NP sur-
interactions face (Figure 2 i). The NP-PC can thus influence the up-
Given the small size of NPs, it is quite likely that they take of the NP by the cell. The uptake might be either 31
can encounter different types of cells and also translo- inhibited due to loss of protein structure of an adsorbed
cate across membrane barriers in an organism. NPs less protein, or facilitated due to unfolding of the adsorbed
than 100 nm in diameter can enter cells, less than protein to access receptors on the cell surface. This is
40 nm can enter the cell nucleus and below35 nm can particularly important when looking at differential bind-
determinar que superficie es presentada al sistema biológico y a la diana terapéutica. Por lo
cual resulta importante conocer la cinética involucrada en la interacción de nanoestructuras
y proteínas (Figura 15).[2, 109]
Estas proteínas que interactúan pueden ser la clave en los fenómenos de toxicidad,
biodistribución, biodisponibilidad y biocompatibilidad de las mismas. La interacción de
proteínas con NM también podría traer consigo otros problemas asociados al efecto que
estas NM pueden tener sobre la conformación de proteínas, pudiendo afectar su actividad
positiva o negativamente, y en algunos casos podría tener repercusiones negativas por el
efecto de los NM sobre las proteínas con las que interactúan.[110]

Figura 15: Representación de la CP. Procesos de intercambio y constantes de equilibrio de las
[52]
mismos.
Se ha observado que las interacciones pueden ser de baja o de alta afinidad, aquellas
de baja afinidad suelen estar en mayor proporción y se intercambian rápidamente, mientras
que las de alta afinidad permanecen unidas más tiempo. Por lo que en el tiempo la capa de
proteínas cambiará a medida que se distribuyen en los sistemas biológicos. Una manera de
controlar las interacciones de alta o baja afinidad es manipular ciertos parámetros de la
superficie de la nanopartícula como el balance de hidrofobicidad/hidrofilicidad y la carga
determinando la naturaleza y la magnitud de la unión, sin descartar también el efecto que
tiene la forma de las mismas.[111, 112] Es necesario evaluar cada NM individualmente para
32
comprender como las proteínas determinan su destino en el organismo y poder comprender
la respuesta biológica.[105]
Según las características de la superficie de cada NM se espera que distintas proteínas
tengan diferente afinidad por ellos. Esperándose a su vez, encontrar en periodos cortos que
la albúmina y el fibrinógeno, se encuentren predominantemente sobre otras proteínas, por
sus altos niveles en plasma. A su vez, la albúmina presenta una serie de sitios activos que
le permitirían reconocer un mayor número de NM diferentes, con diferentes constantes de
afinidad. Aquellas otras proteínas que presenten constantes de afinidad mayores, pero que
se encuentren en bajas proporciones en plasma, se espera que en el tiempo consigan
dominar sus interacciones por sobre otras proteínas mayoritarias. Conseguir evaluar esto a
la fecha es un gran desafío debido a que la presencia de proteínas mayoritarias dificulta la
detección de otras minoritarias. Lacerda y cols. han observado que NpO interactúan
fuertemente con albúmina, fibrinógeno, γ-globulina, histonas e insulina, existiendo efectos
sobre esta interacción al variar el tamaño de las NpO y el grosor de las capas proteicas que
recubren la partícula.[109] El tamaño es un factor crítico determinante para la interacción con
diferentes proteínas.[113]
Para comprender a fondo como se forma la CP se debe conocer no solo la composición
de las proteínas unidas, sino también la cinética, la afinidad y la estequiometria de las
proteínas asociadas y disociadas con los NM.[114, 115] En este sentido en un área emergente
como la medicina personalizada asociada con la nanomedicina será importante conocer el
comportamiento de cada individuo frente al NM y en este caso la formación de la CP en un
individuo para un NM.[116]
Debido a lo mencionado es necesario evaluar la interacción de las NpO con el plasma
para obtener un perfil proteico que será dependiente de la forma y tamaño de éstas y de su
funcionalización con los péptidos.
33
1.6.2. Efectos de la CP sobre la farmacocinética y la toxicidad.
Para anticiparse a los posibles efectos adversos que pueden generar los NM, es
necesario comprender estos procesos de interacciones de los NM con fluidos biológicos y
fundamentalmente con proteínas. Las NpO interactúan rápidamente con las proteínas
presentes en fluidos biológicos como inmunoglobulinas, lipoproteínas, proteínas de fase
aguda y proteínas involucradas en la vía del complemento y la coagulación. Las proteínas
que son adsorbidas forman una capa dinámica que entra en contacto inmediatamente con
los NM en los sistemas vivos y potencialmente gobiernan la biocinética de los
nanomateriales y su destino in vivo. Estas interacciones contribuyen al tiempo de duración
en la circulación sanguínea, pudiendo tener efectos importantes en la eficacia terapéutica.
En condiciones fisiológicas muchos NM rápidamente se unen a proteínas séricas, por lo
cual las células y tejidos nunca encuentran un NM desnudo. De esta manera algunas
proteínas pueden permanecer asociadas a las NP durante el tiempo de vida de la terapia,
definiendo así la respuesta biológica, influyendo sobre la captación celular, acumulación en
órganos y ruta de clearance.[117]
Recientemente se han identificado proteínas plasmáticas que se unen a la superficie de
NpO estabilizadas con citrato, afectando el tamaño hidrodinámico de éstas, encontrándose
entre ellas elementos de la coagulación, del sistema de complemento y algunas proteínas
que se unen y pueden influir en el reconocimiento por células del sistema inmune y el SFM.
En esta interacción el tamaño también tiene un rol importante, pues NM de igual material
pero distinto tamaño presentan diferentes perfiles de proteínas unidas en dicha corona,
encontrándose diferencias en el rango, naturaleza y cantidad de éstas proteínas. En este
contexto el pot-Z puede entregar mucha información, pues la mayoría de las proteínas
identificadas en diferentes NM son de carácter neutro o parcialmente positivas a pH
34
fisiológico. Estas proteínas que se unen pueden llevar a activación de otras proteínas y
resultar en respuestas como por ejemplo fenómenos inflamatorios.[117]
Estudios realizados sobre NM en base a níquel, diamante y aluminio han identificado 69
proteínas del plasma que se unen a éstas.[118] Otros grupos han detectado proteínas del
complemento, fibrinógenos y otras 68 proteínas sobre NpO sin observar efectos sobre la
agregación plaquetaria, cambios en la coagulación o activación del complemento.[117] Las
opsoninas presentes en la corona pueden crear una señal molecular, reconocida por el
sistema inmune activando la internalización de partículas, pudiendo así ser claves en el
destino de algunos NM.[114] Pese a lo reportado no se debe descartar posibles efectos
trombogénicos que puedan desencadenar ciertos NM con superficie polianiónica, que
pueden activar los factores XII y XI, iniciadores de la cascada intrínseca de coagulación,[74]
por lo que al momento de diseñar un fármaco en base a NM se debe buscar cierta
hemocompatibilidad para evitar estos posibles fenómenos.[117, 119]
También algunas interacciones pueden ser ventajosas, pues la unión de
apolipoproteínas con NpO,[70] en especial ApoE, puede asistir en el traspaso de la BHE por
transcitosis,[105] siendo este factor determinante para terapias dirigidas al SNC.[120, 121]
Asimismo las interacciones con ciertas proteínas del plasma pueden ser ventajosas al
aumentar la estabilidad de ciertos NM, dado por la estabilidad de las mismas proteínas en
los distintos ambientes biológicos.[122-124] Es el conjunto corona proteina-NM el que
realmente determina la distribución dentro del organismo, resultando un nuevo paradigma
en el transporte de fármacos y terapias.[125] Así, la CP se convierte en la verdadera entidad
biológica de las NP, afectando fenómenos de interacción celular, toxicidad, distribución en
el organismos, captación celular y vías transporte a través de membranas y barreras
biológicas (Figura 16). Por lo cual es posible hipotetizar que la NpO-CP, es la determinante
35
de la localización subcelular, así como a las distintas zonas donde puede acceder en el
organismo, siendo un factor clave en el tratamiento y detección de enfermedades.
En la Figura 17 se esquematiza el concepto de cómo es posible modular la distribución
según la naturaleza de la partícula, así una partícula sin mayor modificación superficial,
expone una gran reactividad dependiendo de la naturaleza de la superficie, pudiendo unirse
a muchas moléculas plasmáticas, como las opsoninas, por lo cual su acumulación se verá
mayoritariamente relacionada a órganos vinculados con el SFM, (representado en verde).
Una partícula modificada con PEG en superficie, disminuirá este tipo de interacciones,
esperándose que éstas permanezcan mas tiempo en circulación, aumentando la
disponibilidad para poder entregar fármacos a distintas dianas terapéuticas (representado
en rojo). Finalmente, es posible por medio de modificaciones de la superficie de las NP
modular el tipo de interacción con proteínas del plasma. Como ejemplo puede mencionarse
el recubrimiento con polisorbato, con lo cual se puede inducir la interacción con ApoE y de
esta manera favorecer el paso a órganos como el cerebro que presentan receptores a nivel
de BHE para ApoE, (representado en azul).[115]
Para el caso de NV y NE estabilizadas con el detergente CTAB al interaccionar con
proteínas del plasma se produce una disminución de la toxicidad.[104]
Interacciones con distintas proteínas como transferrina y ApoE, podrían modular el
acceso a células tumorales que sobreexpresan receptores de transferrina y barreras
biológicas como la BHE, donde se expresan receptores para ApoE facilitando asi la
transcitocis. Esto siempre que la interacción NpO proteína permita su reconocimiento por
los distintos receptores para lo cual es necesario que las diferentes proteínas que
conforman la corona proteica conserven su estructura, o parte de su estructura para
favorecer el reconocimiento molecular.
36
Saptarshi et al. Journal of Nanobiotechnology 2013, 11:26 Page 6 of 12
http://www.jnanobiotechnology.com/content/11/1/26
Nanopar'culas,corona-de-proteína-expuestas-a-las-células--
Nanoparticle-protein corona presented to cells
Membrana-plasmá8ca-
Plasma membrane
Dynamin Dynamin
Dinamina)
Dinamina)
Caveolin Clatrina)
Clathrin
Caveolina)
Actin filaments
Filamentos)de)ac5na)
Actin filaments Filamentos)de)ac5na)
Phagosome Vesicle Caveosome Clathrin coated vesicle Vesícula)

Vesicle
Fagosoma) Vesícula)
Endocitosis))
Fagocitosis)
Phagocytosis Macropinocitosis)
Macropinocytosis Endocitosis))caveolina)
Caveolin-dependent Endocitosis))clatrina)
Clathrin-dependent independiente)de)
Clathrin and Caveolin-
dependiente)
endocytois dependiente)
endocytois clatrinas)y)caveolinas)
independent endocytois
Figure 2 Interaction of nanoparticles with the cellular interface. NPs interact with cells via the protein corona. (A) Uptake of large sized
NP-protein complexes, agglomerates of NP may be ingested by specialized cells such as macrophages and neutrophils via phagocytosis. It
involves folding of the plasma membrane over the NP complex to form the phagosome. (B) Non-specific uptake of extracellular fluid containing
aggregates of NP may also be taken up by cells via macropinocytosis which involves ruffling of the plasma membrane to form vesicles which
ultimately fuse to form lysosomes. Endocytosis of NP complexes may also be directed by specific receptors involving formation of (C) caveolae
Figura 16:
that are Interacción
plasma de NP consisting
membrane indentations con la ofsuperficie celular.
cholesterol binding proteinsLas
calledNP interactuan
caveolins con las
or (D) clathrin-coated células
vesicles. (E) Apartpor
frommedio de
these other endocytic mechanisms, independent of clathrin or caveolae may also facilitate uptake of NP.
la CP. (A) Captura de complejos de NP-proteínas de gran tamaño, aglomeraciónes de NP pueden ser
internalizadas por celulas especializadas como macrofagos y neutrófilos por medio de fagocitosis, (B)
characteristics.
Captura The presence
no especifica de orfluidos
enrichment of such to conteniendo
extracelulares NPs incubated inagregados
heat inactivated
de serum
NP, [59].
por While
medio de
opsonising proteins on the NP surface in blood can this study does not state the exact mechanism of up-
macropinocitosis. La endocitosis
lead to immune recognition de los complejos
of the NP-protein com- takedetheNP@CP puede
authors report that ser también
the amount por mediod
of protein and de
plex, otherwise
receptores not intended.
específicos In one study,
involucrados en uptake of alsode
la formación thecaveolas
presence of(C),
heat labile complement
clatrinas (D) o proteins in
por endocitosis
NH2-polystyrene NPs by macrophages in a protein free the non-heat inactivated serum may be responsible for
independiente de clatrinas
medium was shown o caveolinas
to change (E). Imagen the
from clathrin-mediated extraída deenhanced
observed la referencia
uptake.[108].
endocytosis to phagocytosis when incubated in serum Another possible explanation for the enhanced uptake
enriched media [57]. Thus showing that opsonisation is that, cellular interaction of the NP is non-specific;
of the NP surface by serum proteins remarkably influ- depending exclusively on the amount of protein, rather
Las interacciones con opsoninas que pueden conducir a la captación por el SFM, pueden
ences its uptake. Adsorption of complement protein C3 than the presence of certain proteins on the NP surface
and opsonising protein IgG on 50 nm lecithin-coated as discussed above. This was shown by Ehrenberg et al.
[114, 126]
ser determinantes
polystyrene NPs wasdel also tiempo que las
shown to increase NpO
with time sein mantienen
their study where,enNPscirculación. Por su parte
incubated with complete serum
and this directly influenced their uptake by murine or serum depleted of several abundant proteins did not
Kupffer cells [58]. affect the association of NPs with endothelial cells in vitro
las opsoninas sobre NpO pueden tener influencia sobre la captación y el clearance teniendo
The large surface area adsorption of proteins on the NP [16]. While it is interesting to know that protein binding on
surface often leads to an increase in the hydrodynamic the NP surface facilitates its uptake and other interactions,
repercusión en la
size of the latter. Suchdistribución
large NP-protein y llegada
complexes can bea los
thereposibles blancos
have been some reports in the[119]
terapéuticos.
contradictory Asimismo
litera-
taken up by phagocytic cell types and also non-phagocytic ture. Uptake of FePt NPs by HeLa cells was suppressed
cells. Lesniak et al. showed that uptake of polystyrene NP in the presence of the NP-PC [23]. Also, silica NPs dispersed
NpO bydenon-phagocytic
50nm pueden interactuar
lung epithelial cells was con transferrina
significantly y así
in serum free penetrar
medium were takenenupdiferentes
more efficientlycélulas
by por
higher when incubated in non-heated serum compared lung epithelial cells as compared to ones in presence of
endocitosis mediada por clatrinas.[127]

37

Plasma&humano&

Par,cula&sin&recubrir& Muchas&proteínas&unidas&

Plasma&humano&

Par,cula&Pegilada& Pocas&proteínas&unidas&

Plasma&humano&

Par,cula&recubierta&con&polisorbato& ApoE&unido&
[49]
Figura 17: Biodistribución de NP determinada por interacciones con proteínas plasmáticas.
Aunque se han mencionado algunos ejemplos de los efectos de la corona sobre la
farmacocinética, toxicidad y penetración celular, hasta el presente existen pocos estudios
acerca de la composición de las proteínas que interactúan con los NM y su afinidad por los
mismos. Por lo cual, en el presente trabajo se estudió la interacción de proteínas del plasma
con NpO funcionalizadas con péptidos.
Finalmente es importante considerar cual es la conformación de las proteínas que
forman la corona proteica ya que pueden existir cambios en sus actividades proteicas,
debido a que se puede afectar a las estructuras nativas de las mismas (Figura 14), teniendo
impacto biológico. La hemoglobina es un ejemplo, al interaccionar con quantum dots (QD),
afecta su estructura secundaria produciéndose una pérdida de la actividad. Otro ejemplo es
el de la albúmina también sufre cambios conformacionales al ser expuesta a NpO
perdiendo su estructura nativa.[115]
38
1.6.3 Posibles efectos de NM sobre la estructura y función de las proteínas.
En este complejo formado también es importante considerar cual es la conformación de
las proteínas que forman la corona proteica ya que pueden existir cambios en sus
actividades proteicas, debido a que se puede afectar a las estructuras nativas de las
mismas (Figura 14) teniendo impacto biológico. La interacción de los NM con las proteínas
puede producir plegamientos anómalos y agregación de proteínas pudiendo producir
efectos tanto nocivos como beneficiosos para la salud. Es fundamental comprender el
efecto de los NM sobre los procesos biológicos esenciales como el plegamiento de
proteínas que pueden llevar a posibles perdidas de su función.[104, 105]
Existen pocos trabajos en la literatura en los que se estudie el efecto de los NM sobre la
función de las proteínas. Por una parte, se ha descrito como NpO de 20nm pueden
aumentar la actividad y estabilidad de la tripsina, posiblemente debido a que al interactuar
con la superficie de NpO sufre pequeños cambios conformacionales, que conducen a un
aumento de la actividad enzimática afectando en la interacción con inhibidores y a su vez
protegiéndola de la degradación por autolisis.[125, 128]

Por otra parte, se han realizado
estudios de interacción entre albúmina sérica humana y NPs poliméricas de gran
hidrofobicidad empleando calorimetría diferencial encontrando que existe interacción entre
las mismas no observándose cambios conformacionales de la proteína.[125] En contraste, en
estudios realizados con quantum dots (QD) y hemoglobina se determinó que existen
cambios conformacionales observándose una disminución de conformaciones α-hélice al
interactuar con la NP produciéndose una pérdida de la actividad.[125] Existen indicios de que
la superficie de las NpO determinada por la funcionalización y la carga, puede afectar a la
estructura de las proteínas con las que interaccionan. Un ejemplo es el caso de la albúmina
que sufre cambios conformacionales al ser expuesta a NpO perdiendo su estructura nativa
y observándose que cuando la partícula es neutra no hay cambios significativos.[115]
39
Finalmente, en este contexto resulta muy interesante conocer el posible efecto que
pueda tener las NpO sobre la estructura del péptido Aβ. Recientemente, se ha determinado
que NP magnéticas (NPM) de Fe2O3 no afectan al crecimiento y formación de las fibras, por
lo que la presencia de las NPM no altera la agregación de Aβ.[129] Así resulta crucial evaluar
los efectos que puedan tener las NpO-péptido sobre la agregación y estructura de Aβ y si la
presencia de un espaciador entre la partícula y el peptido LPFFD afecta a estos
parámetros. Dichos estudios son muy relevantes considerando que las NpO podrían ser
utilizadas para diagnóstico y terapia de la EA.
Actualmente dado los antecedentes que se manejan se puede pensar en realizar
aproximaciones en base a modelos in silico, como el planteado en el trabajo de Dell’Orco y
cols., en el cual se evalúa computacionalmente las posibles cinéticas que tendrían las
interacciones con proteínas, según características de los NM como tamaño, carga,
composición, entre otros, pudiendo así aproximarse a los pseudo estados de equilibrio que
pueden presentar las interacciones entre los NM y las proteínas del plasma.[130] Si bien aun
la composición de la CP se muestra como una caja negra, mientras mayor sea la cantidad
de información que se pueda obtener, modelos de este tipo tomarán mas importancia, para
predecir fenómenos de estabilidad, toxicidad y también el comportamiento in vivo.
En el presente trabajo se estudiará el efecto de los conjugados NpO-péptido sobre la
estructura y la agregación de algunas proteínas de gran relevancia biológica como
albúmina, y la proteína β-amiloide respectivamente.
40
2. HIPÓTESIS.
La funcionalización de Nanoesferas de oro (NE) y Nanovarillas de oro (NV) con
diferentes péptidos (CLPFFD, CALNNLPFFD, CALNN, C-PEG-LPFFD, C-PEG y
THRPPMWSPVWPCLPFFD) reduce los efectos sobre la viabilidad celular, aumenta la
estabilidad coloidal, modifica la estructura secundarias de la albúmina, el patrón de
agregación de Aβ y la composición de la corona de proteínas plasmáticas relacionadas con
el proceso de biodistribución.
La presencia de la secuencia peptídica LPFFD y THRPPMWSPVWP en los conjugados
NpO-péptido aumenta la llegada de las NpO al cerebro in vivo.
3. OBJETIVO GENERAL.
Estudiar el efecto de la funcionalización de NE y NV con los péptidos CLPFFD,
CALNNLPFFD, CALNN, C-PEG-LPFFD, C-PEG y THRPPMWSPVWPCLPFFD sobre la
viabilidad celular, la estabilidad, la interacción con proteínas del plasma y la biodistribución.
Estudiar el efecto de los conjugados péptidos-nanopartículas sobre la estructura y
función de proteínas como la albúmina y Aβ
41
4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
1. Sintetizar y caracterizar CLPFFD, CALNN, CALNNLPFFD, C-PEG-LPFFD, C-PEG,
THRPPMWSPVWPCLPFFD
2. Sintetizar y caracterizar Nanoesferas de oro (NE) de aproximadamente 12nm y
Nanovarillas de oro (NV) con relación de aspecto 4/1
3. Conjugar NE con CLPFFD, CALNN, CALNNLPFFD, C-PEG-LPFFD, C-PEG y
THRPPMWSPVWPCLPFFD, y NV con CLPFFD.
4. Evaluar la estabilidad de NP funcionalizadas en presencia de plasma.
5. Evaluar toxicidad de los conjugados en líneas celulares SH-SY5Y de NM incubados y
sin incubar en plasma.
6. Evaluar efectos sobre la estructura y actividad de proteínas (albúmina y Aβ) debidos
a la interacción de NpO-péptido.
7. Identificar las proteínas del plasma que interactúan con NpO-péptido (corona de
proteínas).
8. Estudiar la biodistribución de NpO-péptido (NE-CLPFFD; NE-THRCLPFFD y NE)
42
5. MATERIALES Y MÉTODOS.
5.1. Síntesis de las secuencias CLPFFD, CALNNLPFFD, CALNN, CpegLPFFD,
Cpeg, THRPPMWSPVWPCLPFFD.
La elongación del péptido en fase sólida fue llevada a cabo en jeringas de polipropileno
equipadas con discos porosos de polietileno. Los solventes y reactivos solubles fueron
removidos por succión utilizando una bomba de vacío. Los péptidos fueron sintetizados en
[131]
fase sólida utilizando la estrategia Fmoc/tBu y obtenidos en su forma amino en el
extremo C-terminal. Todos los aa utilizados fueron Fmoc protegidos y se utilizó como
soporte polimérico la resina MBHA AM Fmoc Rink amida (Iris Biotech GmbH, grado de
funcionalización de 0,72mmoles/g).
Antes de comenzar la síntesis, la resina depositada en la jeringa fue lavada con
diclorometano (DCM; Merck, grado laboratorio, P.M. 84,93) (2 x 1min) para hincharla y
luego con dimetilformamida (DMF; Merck, pro análisis. P.M. 73) (3 x 1min + 1 x 5min). La
remoción del grupo Fmoc se realizó con piperidina (Aldrich, pro análisis P.M. 85,15) al 20%
en DMF (1 vez x 1min, 2 veces x 10min). Finalmente se lavó con DCM (5 x 1min), para
eliminar trazas de piperidina y evitar desprotecciones no deseadas. Posteriormente, se
realizó el ensayo de ninhidrina para confirmar la desprotección del grupo amino de la
resina.
Las reacciones de acoplamiento se llevaron a cabo con Fmoc-aminoácido (Iris Biotech
GmbH) (4 equivalentes) y en el caso de PEG se empleó Fmoc-PEG(3)-COOH (ácido 12-(9-
Fluorenil-oxicarbonil-amino)-4,7,10-trioxa-dodecanoico; Iris Biotech GmbH) (4 equivalentes),
en donde cada residuo se debió emplear con su grupo carboxilo activado mediante
carbodiimidas y un agente acoplante como HOAt (1-Hidroxi-7-Azabenzotriazol; Medalchem
de 99% pureza y de P.M. 136,14) (12 equivalentes) y/o HOBT (hidroxibenzotriazol) según
43
fuera el caso y PyBOP (Iris Biotech GmbH, P.M. 520,30) (4 equivalentes), los cuales fueron
secuencialmente agregados a la resina, y luego disueltos en 1mL de DMF, dejándose la
mezcla reaccionar por 60min. Transcurrido dicho periodo se evaluó la efectividad del paso
de acoplamiento mediante el ensayo de ninhidrina. A partir del resultado se continuó con la
desprotección correspondiente para realizar el siguiente acoplamiento o bien se reacopló el
aminoácido hasta obtener una reacción de ninhidrina negativa. Para realizar el reacople se
repitió el mismo procedimiento. Los lavados entre desprotección, acoplamientos de aa y los
subsecuentes pasos de desprotección, se llevaron a cabo con DMF (3 veces x 1min) y
CH2Cl2 (3 veces x 1min), usando 5mL de solvente cada vez.[132] La desprotección del grupo
amino del aminoácido recién incorporado se realizó mediante la adición de piperidina-DMF
al 20%. Finalmente se agregó la solución de clivaje (TFA 95%:H2O 2,5%:TIS 2,5%; (TFA:
Aldrich. Pureza 99%, P.M. 114,02; TIS: Fluka. Pureza 98%. P.M. 158,36) sobre la resina y
se dejó reaccionar por 60min para producir la escisión del péptido desde la resina. Luego
de evaporar el solvente con un rotavapor, fueron realizadas sucesivas precipitaciones con
tert-butil-metil-eter (Fluka. Pureza 99%. P.M. 88,15) y subsecuentes centrifugaciones. Se
eliminó el éter por evaporación con un flujo de nitrógeno gaseoso (N2). Luego el péptido
obtenido se resuspendió en una mezcla Acetonitrilo:H2O (1:1) (Acetonitrilo (ACN):Merck.
Pureza grado HPLC. P.M. 41,05). Posteriormente se procedió a congelar y a liofilizar.
5.2. Caracterización de los péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD, CpegLPFFD, CALNN,
Cpeg y THRPPMWSPVWPCLPFFD.
5.2.1 Cromatografía líquida de alta eficiencia.
(High-performance liquid chromatography, HPLC). Los crudos obtenidos de la síntesis en
fase sólida se analizaron mediante cromatografía líquida de alta eficiencia para determinar
su pureza. Para esto una pequeña cantidad de péptido (±80mg) se disolvió en 4mL de una
44
mezcla ACN: H2O (1:1). Este se filtró en un filtro de PVDF de 0,4µm y del filtrado se
depositaron 250µL en un vial plástico (diseñado para el carrusel del HPLC). El vial se
colocó en el carrusel del equipo de HPLC/PDA, HPLC analítico Waters 1525 con detección
UV, el cual se configuró luego para tomar solo 10µL y realizar la cromatografía sobre una
columna Waters Sunfire (C18; 3,5µm; 4,6 x 100mm) Con este equipo se obtuvo un
cromatograma dado por la absorbancia a 220nm, en donde absorbe el enlace peptídico. Se
realizó un gradiente de 0 a 100% del eluyente ACN en H2O obteniéndose a partir de éste, el
tiempo de retención de los productos, y la polaridad adecuada del eluyente, puesto que en
algunos péptidos se debió ajustar este parámetro para su mejor separación. Luego el vial
empleado en este HPLC, se colocó en un siguiente HPLC que posee un detector de masa
(HPLC/MS), el cual se configuró para tomar 5µL, con los cual se pudo pre-identificar cada
producto utilizando el detector de masa, que correlacionó cada pico detectado por el
detector UV-VIS. Posteriormente el péptido se purificó por HPLC semi-preparativo
WATERS ALLIANCE, con una columna C18. Finalmente se obtuvieron los cromatogramas
HPLC de los péptidos purificados.[14]
5.2.2 Espectrometría de masas desorción/ionización láser asistida por matriz.
(Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI-TOF). Los péptidos purificados
fueron analizados mediante un equipo de espectrometría de masas desorción/ionización
láser asistida por matriz (MALDI-TOF) Bruker model Biflex III, utilizando una matriz de ácido
2,5-dihidrobenzóico (DHB; Fluka. Ultra Puro. P.M. 154,12) a una concentración de 10mg/mL
en ACN/HCOOH 0,1% v/v (1:2). Para preparar la muestra se mezcló 1µL de la solución de
péptido puro y 1µL de la matriz. Dicha mezcla se dejó secar sobre una placa porta muestra
metálica micro scout que posteriormente fue irradiada dentro del equipo de MALDI-TOF.[14]
45
5.2.3 Análisis de aminoácidos (AAA).
Para obtener la proporción de los aa que conforman el péptido, estos deben ser
separados para analizarlos individualmente. Para esto se realizó una hidrólisis agregando
HCl 6N y un patrón de concentración conocida (ácido aminobutírico) calentándose la
muestra en un tubo cerrado a 110ºC durante 72 horas. Posteriormente, se eliminó el ácido
clorhídrico mediante evaporador rotatorio (hasta sequedad). El sólido obtenido fue
resuspendido en 200µL de HCl 20mM, de los cuales se tomaron 20µL, a los cuales se le
agregaron 60µL de tampón borato (reactivo comercializado junto al AccQ-Tag kit de Waters
como AccQ-Fluor Borate buffer). Posteriormente la muestra se derivatizó agregando 20µL
de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) (reactivo comercializado como
AccQ-Fluor por Waters), el cual se dejó durante 1min a temperatura ambiente y luego
10min a 55ºC, para permitir que reaccione con aminas primarias y secundarias, reacción
que se describe en la Figura 1.25. Una vez realizado este proceso la muestra se inyectó en
un equipo de HPLC-PDA conteniendo una columna AccQ-Tag, (C18; 4µm; 3,9x15mm)
obteniéndose los picos correspondientes a los aa presentes en la muestra, para poder
realizar la comparación se cuenta con un estándar de aa (pico-Tag comercializado junto al
kit AccQ-Tag por Waters). Las áreas de los mismos se compararon frente a la de patrones
de los aa, determinándose así el contenido de estos. Finalmente se determinó la proporción
relativa de cada aminoácido en el péptido, con lo cual se puede corroborar si la secuencia
es la correcta, por medio de estos resultados sumados a los obtenidos por la detección de
masa se pudo corroborar que la secuencia deseada es la correcta y no un producto no
deseado.
46
5.3. Síntesis de NE, NV, obtención de conjugados y caracterización.
5.3.1 Preparación del material.
Previo a la síntesis de nanopartículas, el material utilizado debe estar limpio y libre de
interferentes, para ello se dejó en Extrán al 2% en H20 destilada durante una noche,
posteriormente se enjuagó con agua y se dejó en agua regia (3:1 HCl/HNO3) durante 30
minutos, para finalmente realizar enjuagues sucesivos en agua Milli-Q (18,2MΩcm). A su
vez, todas las soluciones necesarias se prepararon en agua Milli-Q.[16, 133]
5.3.2. Síntesis de NE.
Para la obtención de NE de tamaños cercanos a 12nm, se desarrolló el protocolo
descrito por Levy y cols.[12, 13] Se preparó 100mL de una solución acuosa 1mM de HAuCl4
(Aldrich, pureza 99,9%, P.M. 339,79). Esta solución se colocó en un balón de dos cuellos
de 250mL. Sobre su cuello central se conectó un sistema de reflujo simple y un septum en
el cuello lateral. El balón se dejó sobre un manto de calefacción con agitador magnético
incorporado para lograr una mezcla continua y fue llevado a reflujo constante a ebullición
durante 8min. Posteriormente se agregó rápidamente, por el cuello lateral del balón, 10mL
de una solución acuosa 38,8mM de Na3C6H5O7*2H2O (Fluka, pureza 99,5%, P.M. 294,1) a
60º C (calentado en microondas). Inmediatamente luego de agregada la solución apareció
un color negro intenso en la mezcla, el cual transcurrido 3min pasó a un color rojo borgoña
intenso, indicativo de la formación de las NE. Se dejó el sistema a reflujo por 30 minutos
más y una vez terminado se dejó enfriar el balón a temperatura ambiente. Posteriormente
se filtró la solución mediante un filtro de PVDF de 0,45µm y las NE obtenidas se
almacenaron a 4ºC.[13, 14]
47
5.3.3. Síntesis de NV.
Las NV fueron sintetizadas químicamente mediante el método de crecimiento mediado
por núcleos de oro de un tamaño de 3-5nm.[23] Para obtener NV se comenzó con la
preparación de la solución de núcleos de oro, para lo cual se adicionó 250µL de una
solución de HAuCl4 10mM sobre 9,5mL de una solución 0,1M de surfactante bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB). Como agente reductor se agregó una solución fresca fría de
NaBH4 0,01M, observándose inmediatamente un cambio de coloración de amarillo a pardo.
El sistema se mantuvo bajo agitación vigorosa durante 30min y se dejaron en reposo por
2h. Para utilizar los núcleos obtenidos en una segunda etapa. En esta segunda etapa se
preparó la solución de crecimiento de las NV mezclando en un vial de vidrio 75µL de AgNO3
0,01M y 9,5mL de CTAB 0,1M y en presencia se una agitación suave se agregaron 500µL
de HAuCl4 0,01M. Rápidamente a esta solución se le agregaron 55µL de ácido ascórbico
0,1M como agente reductor, apreciándose una decoloración del amarillo de la solución
quedando transparente, lo que indica que se ha producido la reducción del oro a Au+1.
Posteriormente se agregaron 250µL de HCl 0,1M y luego12µL de la solución de núcleos
preparada en la primera etapa. Se realizó una agitación muy rápida por pocos segundos y
luego esta solución se dejó reaccionar por 10min a 27ºC. Al cabo de los 10min, la solución
fue centrifugada a 7030RCF durante 15min. Finalmente el pellet obtenido fue separado del
sobrenadante y resuspendido en 4mL de una solución de CTAB 0,1M, o directamente en
una solución acuosa conteniendo el péptido deseado para su funcionalización. Después de
72h la solución fue centrifugada a 1520RCF durante 60min y el pellet fue resuspendido en
4mL de CTAB 2,5x10-5 M, obteniéndose así una solución coloidal de NV estabilizadas con
CTAB (NV-CTAB) o con el péptido deseado. [29, 39]
48
5.3.4. Obtención de conjugados de NE con péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD,
CpegLPFFD, CALNN, Cpeg y THRPPMWSPVWPCLPFFD.
Las NE obtenidas fueron conjugadas con los péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD,
CpegLPFFD, CALNN, Cpeg y THRPPMWSPVWPCLPFFD, respectivamente. Se preparó
una solución 1,5mM de cada péptido que se agregó a 20mL de NE (de concentración
aproximada 8nM), previo a esto las NE fueron llevadas a un pH superior al del punto
Isoeléctrico (pI) de cada péptido, con el fin de evitar agregación por carga, para lo cual se
utilizó NaOH 0,1M. La mezcla anterior fue agitada durante la noche a temperatura ambiente
para favorecer la quemisorción, luego se depositó la solución dentro de una membrana de
diálisis (Spectrum Lab de diámetro 32mm, MWCO 6.000-8.000). La muestra fue dializada
durante 3 días frente a 2L de una solución de citrato de sodio 1,2mM. La solución externa
se renovó 1 vez por día en este período. Cada solución de NE-péptido fue conservada a
4ºC hasta su posterior uso.
5.3.5 Obtención de conjugados de NV con el péptido CLPFFD.
Para obtener los conjugados NV-CLPFFD luego de la síntesis antes descrita de NV, una
vez obtenido el pellet, éste fue resuspendido en una solución acuosa de péptido a una
concentración de 0,088mM. Una vez homogeneizada la solución coloidal se dejó
interaccionar durante 72h a 27ºC. El paso final consistió en centrifugar a 1520RCF durante
60min y el pellet fue resuspendido en una solución acuosa de CTAB 2,5x10-5 M.
5.4. Caracterización de las NpO y de los Conjugados NpO-péptidos.
Los conjugados fueron caracterizados por espectrofotometría UV-Vis-NIR, DLS, pot-Z,
XPS, TEM y TEM de alta resolución así como espectroscopia electrónica de perdida de
energía (EELS). Asimismo, la relación de numero de moléculas de péptido/nanopartícula se
49
determinó por activación neutrónica (AAN) o ICP/MS y AAA. Cada análisis realizado se
llevó a cabo para 3 lotes obtenidos en diferente tiempo, de los cuales se informa el
resultado promedio y su correspondiente desviación estándar.
5.4.1. Caracterización por Espectrofotometría de absorción molecular.
Una vez obtenidas las NE fueron caracterizadas mediante espectrofotometría de
absorción molecular utilizando un espectrofotómetro Perkin Elmer modelo Lambda 25 UV,
para observar la banda de resonancia del plasmón. Estas mediciones fueron realizadas en
cubetas plásticas de 1cm de longitud en un rango de 400-800nm empleándose como
blanco citrato de sodio 1,2mM en el espectrofotómetro de doble haz. Por su parte, las NV
obtenidas también fueron caracterizadas mediante espectrofotometría de absorción
molecular, con la finalidad de observar las dos bandas de plasmón características: la
transversal aproximadamente en una λ de 510nm y la longitudinal en una λ que abarca
desde los 600-1000nm, dependiendo de su relación de aspecto.[134] En este caso particular,
al ser las NV de una relación de aspecto ~4, sus bandas características presentan λ cerca
de los 510nm y los 800nm, respectivamente. Por su parte, una vez obtenidos los
conjugados, estos fueron caracterizados mediante esta técnica bajo las mismas
condiciones que NpO sin conjugar con el fin de detectar variaciones en la banda del
plasmón después de la conjugación. Así, el ensayo se realizó en NE, NE-CLPFFD, NE-
CALNNLPFFD, NE-CALNN, NE-CpegLPFFD, NE-Cpeg, NE-THRPPMWSPVWPCLPFFD
así como también en NV y NV-CLPFFD. Es necesario señalar que las NE-CLPFFD(cf) y
NE-THRCLPFFD(cf) (cf corresponde a carboxifluoresceína) fueron caracterizadas además
por fluorescencia, empleando un espectrofluorimetro Perkin Elmer Luminicence
Espectroscope LS50B. Para obtener el espectro de fluorescencia se excitó la muestra con
una λ de 492nm, correspondiente al máximo de excitación de carboxifluoresceína, y se
50
obtuvo el espectro de emisión entre las λ 500-550nm, el máximo de emisión se espera en
una λ de 517nm.
5.4.2. Microscopía electrónica de transmisión.
(Transmission electron microscopy, TEM). Esta técnica se ha descrito para estudiar la
morfología y homogeneidad de tamaño de las NpO. Las imágenes obtenidas de NE y NV
fueron realizadas en un equipo JEOL JEM-1010. Para realizar esta medición se depositó
una gota de 20µL de la muestra sobre una rejilla de cobre de 200mesh recubierta con el
polímero formvar que luego se dejó secar por al menos 1 hora. Finalmente se observó al
microscopio empleando una aceleración de los electrones desde 120keV. En el caso de la
NV, las rejillas fueron pre tratadas para aumentar la adhesión de las mismas por las NV.
Estas fueron cargadas sometiéndolas a una luz ultravioleta durante 15s. Luego de este
tratamiento, se siguió con el procedimiento descrito previamente de depósito de la muestra,
secado y observación de la misma. Así, el ensayo se realizó en NE, NE-CLPFFD, NE-
CALNNLPFFD, NE-CALNN, NE-CpegLPFFD, NE-Cpeg, NE-THRPPMWSPVWPCLPFFD
así como también en NV y NV-CLPFFD
5.4.3. Dispersión dinámica de la luz.
(Dynamic light scattering, DLS). Las NpO, tanto NE como NV también fueron
caracterizadas mediante DLS con el objetivo de determinar sus diámetros hidrodinámicos y
su estabilidad coloidal. Estas mediciones fueron realizadas por triplicado en un equipo
Malvern Instrument Zetasizer Nano ZS en cubetas plásticas de 1cm. Así, el ensayo se
realizó en NE, NE-CLPFFD, NE-CALNNLPFFD, NE-CALNN, NE-CpegLPFFD, NE-Cpeg,
NE-THRPPMWSPVWPCLPFFD así como también en NV y NV-CLPFFD.
51
5.4.4. Potencial Z.
(Z potential, pot-Z). Las NpO, tanto NE como NV también fueron caracterizadas según la
carga aparente superficial, dada por la carga, con el objetivo de determinar posibles
relaciones físicoquímicas que permitan predecir estabilidad así como también su incidencia
biológica. Estas mediciones fueron realizadas por triplicado en un equipo Malvern
Instrument Zetasizer Nano S90 en cubetas plásticas de 1cm.
5.4.5. Espectroscopia fotoelectrónica de rayos X.
(x-ray photoelectron spectrocopy, XPS). Mediante espectroscopia fotoelectrónica de
rayos X (XPS) se observaron las señales de los electrones 4f 7/2 y 4f 5/2 del oro para el caso
de las NE y NV, para el caso de las NV también se observaron los electrones 3d del bromo
proveniente del CTAB, y finalmente los electrones 3d 5/2 y 3d 7/2 de la plata, uno de los
elementos fundamentales en la síntesis para controlar la relación de aspecto. Para el caso
de los conjugados se observaron las señales de los electrones S 2p3/2 y S 2p1/2 del azufre
proveniente de los péptidos para verificar la unión S-Au.
Las mediciones se realizaron en un equipo PHI Multitechnique 5500 con una fuente
monocromática de rayos X (Al KR línea de 1486,6 eV de energía y W 350). La muestra es
pulverizada y puesta en una cámara ultra alto de vacío entre 5x10-9 y 2x10-8Torr.
5.4.6. Estimación del número de moléculas de péptido por NpO (NE y NV).
Los conjugados se dividieron en dos alícuotas. A una de ellas se le determinó el
contenido de aa y a la otra el contenido de oro para obtener la concentración de NpO. Una
alícuota fue de 200µL para cuantificación de oro y otra de 8mL de NE y sus conjugados así
como 15mL de NV y sus conjugados para el AAA. De esta manera se estableció la relación
moléculas de péptido/NpO.
52
5.4.7 Activación neutrónica para la determinación de oro.
En paralelo a lo anterior, alícuotas de 200µL de los conjugados fueron liofilizadas y en el
residuo obtenido se determinaron los niveles de oro por AAN. Estas determinaciones se
realizaron en la Comisión Chilena de energía Nuclear (CChEN). Las muestras fueron
colocadas en un papel de aluminio. Estas se introdujeron en un reactor nuclear RECH-1
con un flujo de electrones de 2-4 x1013n/(cm2xs) por un tiempo de alrededor de 15-25h

197 198
iniciando así la conversión de Au a Au. Luego de 6-9 días de decaimiento, los rayos γ
emitidos por la muestra fueron contados y ordenados por energías usando un detector de
germanio acoplado a un espectrómetro de rayos γ multicanal. Los espectros γ fueron
analizados con el software SAMPO90 Canberra. Una vez obtenida la concentración de oro
presente en la muestra y conociendo el número de átomos por NE y NV así como la
densidad de este elemento en el nanocristal y el tamaño de las mismas mediante
observaciones de TEM (realizando una estadística sobre 100 partículas de NE y NV) se
determinó la concentración teórica molar de las NE y NV.[50, 135] Finalmente conociendo la
concentración de péptido en las NpO y la concentración de estas mismas partículas se
determinó el número de moléculas de péptido por NpO.
5.4.8. Fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo, con detector de masa o
acoplado a un espectrofotómetro de emisión óptica.
(Inductively coupled plasma ICP, mass spectrometry, ICP-MS and optical emission
spectrometry, ICP-OES). En conjunto a la AAN, mediante ICP-OES e ICP-MS se puede
determinar la cantidad de oro total de la muestra. Para tratar las muestras de NpO-péptido
se tomaron 25mL de cada muestra que se depositaron en un reactor de teflón (el cual fue
limpiado previamente con una solución de 3,5mL HNO3+ 0,5mL HCl. Se dejó por 2h a 90ºC)
al que se le agregó 1mL de HNO3 + 0,5mL de H2O2 + 0,5mL HCl. Se cerró el reactor
53
herméticamente y se dejó durante toda la noche a 90ºC. Luego se dejó enfriar y se
trasvasijó toda la mezcla a un matraz aforado el cual se enrasó a 25mL con una solución de
Tiourea (TU: 0,02% Tiuorea en HCl 0,12M) (quedará al 2%de HNO3 en TU).
Posteriormente se inyectó en el equipo ICP-MS empleándose para la cuantificación
soluciones patrón de Au de diferentes concentraciones (0; 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2,5 y 5ppm). El
detector de masa entregó un valor que debe ser integrado en la curva de calibración.
5.4.9. Estimación de la concentración molar de NE y NV.
Una vez obtenidos los datos de oro, se procedió a la estimación de la cantidad en
concentración molar de las NpO, la cual es un valor teórico y sirve como una aproximación.
Para el caso de las NE, el proceso no es complejo y se refiere al uso de la ecuación 2.1
publicada por Liu y cols., que considera los datos de diámetro obtenidos por TEM y así al
conocer la concentración de moles obtenidos de Oro se puede calcular a cuantos moles de
NE equivalen.[136] Donde:
Ecuación 2.1: NNE: Numero de átomos de oro por NE

3
ρ: Densidad de una solución de oro (19,3 g/cm )
πρD! M: Masa molecular del oro (196,97g/mol)
N!" = = 30,89602D!
6MF!
D: Diámetro de NE determinadas por TEM en nm
Fc: Factor de conversión de unidades
Nº Avogadro/nm3 (aprox. 602,2)
Para el caso de las NV, conociendo los datos de las cantidades en moles de oro y
conociendo el largo y el ancho promedio de las NV (determinados ambos por TEM) se
procedió a determinar la concentración (molar) de NV (CNV) siguiendo la ecuación 2.2
publicada por Link y cols.[137]:

Donde:
Ecuación 2.2: CNV: Concentración molar de NV
3
ρ: Densidad de átomos de oro en el bulk (59 átomos/nm )
4C!"
C!" = CAu: Concentración de oro determinado
ρπW ! L
L: Largo de las NV determinadas por TEM
W: Ancho de las NV determinadas por TEM
54
5.4.10. Análisis de aminoácidos (AAA).
Al igual como se procedió con los péptidos puros, es necesario realizar la derivatización
de cada aminoácido para poder identificarlo. Así, para conocer la fracción o porcentaje de
péptido unido a las NpO (NE y NV) se realizaron AAA a los conjugados.
El proceso es muy similar al descrito para los péptidos puros. Para lo cual se liofilizaron
8mL de los conjugados tanto de NE, NE-CLPFFD, NE-CALNNLPFFD, NE-CALNN, NE-
CpegLPFFD, NE-Cpeg, NE-THRPPMWSPVWPCLPFFD así como también 15mL de NV y
NV-CLPFFD. Una vez obtenido el liofilizado, el procedimiento fue tal cual al descrito
previamente en la caracterización de los péptidos. (sección 2.1.2.3)
5.5. Estudio de estabilidad de NpO y sus conjugados en PBS y plasma.
Para estas mediciones se incubaron los pellets resultantes de 10mL de cada solución de
nanopartículas (luego de centrifugar por 16100RCF durante 15min) con 10mL de PBS
0,1M o 10mL de una solución de plasma humano diluido al 30% en agua ultra pura. Los
mencionados pellet se resuspendieron empleando un vortex por 1min. Las muestras se
dividieron en 10 alícuotas de 1mL cada una y se dejaron incubando por diferentes tiempos
a 37ºC. Para el caso de la medición por espectrofotometría UV-vis se midió directamente
utilizando como blanco una solución equivalente de plasma sin NpO conjugadas. Para la
determinación de tamaños por DLS, aquellas muestras incubadas en PBS se midieron sin
problemas, mientras que aquellas incubadas en plasma, se debieron centrifugar pues la
presencia del plasma generó interferencia en la señal. Para ello las muestras se
centrifugaron a 16100RCF por 45min y los pellet obtenidos se resuspendieron en agua ultra
pura. De la misma manera para realizar micrografía TEM se debió eliminar el plasma en
exceso con el fin de intentar observar la posible CP sobre las NpO conjugadas.
55
5.6. Evaluación de efectos de las NpO sobre la estructura y actividad de proteínas
debidos a la interacción de NpO-péptido.
Para evaluar los posibles efectos de las NpO sobre péptidos y proteínas, se propuso
evaluar los efectos sobre la formación de fibras de β-amolide y sobre la estructura
secundaria de la albúmina. Para obtener información acerca de la interacción de las NpO
con las proteínas se puede realizar un espectro de absorción, en el cual se espera un
cambio sobre la RPS de NpO.[109] Los efectos sobre las proteínas pueden evaluarse
determinado cambios en la actividad de las mismas, en cambios estructurales por dicroismo
circular.[109]
5.6.1. Efectos de NpO sobre la estructura secundaria de la albúmina estudiados
por dicroismo circular (CD).
Para este fin se incubó 0,1mM de Albúmina con 0,4nM de conjugados, luego de lo cual,
se colocó la suficiente muestra en una cubeta para CD, y empleando un equipo Jasco 815
de dicroísmo circular, se obtuvo el espectro entre 190 y 250nm, con un tiempo de
respuesta de 2s y una velocidad de barrido de 100nm/min y una resolución de 0,5nm. Cada
espectro es el resultado del promedio de 3 acumulaciones. Los espectros se graficaron
según su elipticidad molar media v/s λ. Empleando estos datos se realizó el análisis
determinándose los contenidos de las siguientes estructuras: % α-hélice, el % de lámina-β y
el % de espirales al alzar. Para el análisis se empleó la base de datos Dichroweb
(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml), con la cual es posible realizar la
comparación para cada espectro, y así obtener el % de estructuras secundarias en cada
caso.[109]
56
5.6.2 Estudio de la formación de fibras del péptido Aβ1-42 en presencia de NpO.
Para estudiar la forma en que se agrega el péptido β-amiloide, se debe obtener una
solución homogénea del mismo libre de agregados. Para lo cual una alícuota de 1mg de
péptido Aβ (comercializado por r-peptide, USA) se suspende en agua (1mL). La solución es
dividida en 10 alícuotas que posteriormente fueron liofilizadas y almacenadas a -20ºC. Así
previo cualquier ensayo con Aβ, una alícuota de 100µg, es disuelta en 200µg de
1,1,1,3,3,3-hexafluoro- 2-propanol (HFIP), condición en la que se mantiene por 30min a
temperatura ambiente. Posteriormente la alícuota es nuevamente liofilizada, y una vez
obtenida la muestra se disuelve en agua para obtener una solución 400µM de. De esta
manera se forman los intermediarios prefibrilares para agregación amiloidogénica. Esta
solución debe ser preparada y utilizada en el momento para comenzar los estudios
posteriores.
Así para evaluar el comportamiento de Aβ en presencia de las NpO (NE; NE-CLPFFD;
NE-THRCLPFFD; NV-CLPFFD y NV-CTAB), se empleó una concentración final de 1nM de
nanopartículas. Así para 200µL se empleó un volumen de 25µL de NE y para el caso de las
NV, la concentración final fue de 0,2nM, para lo cual se empleó 40µL de las NV siendo el
volumen final de 200µL. A estas soluciones se les agregó Aβ (preparado como se indico en
el párrafo anterior), para conseguir una concentración final de 100µM de Aβ. Así la solución
es incubada a 37ºC con agitación de 300rpm, durante el tiempo que tarda el ensayo, en
nuestro caso el estudio se realiza para las primeras estadías del crecimiento, dado durante
24 horas. Durante el tiempo, la formación de fibra es monitoreada por el ensayo de
tioflavina (Th-T) y el producto final se analiza por TEM para confirmar la presencia de las
fibras.
57
5.6.2.1 Estudio de agregación de Aβ en presencia de NpO mediante fluorescencia
de Th-T.
El seguimiento de la formación de fibras de Aβ se realizó por el test de fluorescencia de
Th-T (450nmEx/480nmEm) en presencia de fibras de Aβ. De esta manera se puede detectar
la presencia de fibras como así también evaluar la desaparición o aumento de las
mismas.[138, 139]
Así para llevar a cabo el ensayo, durante la incubación, 10uL de las
muestras se depositaron en pocillos de placas de fondo negro Nunc F96 MicroWell™
Plates Polystyrene Black que contenían 80µL del buffer glicina 0,1M a pH 8,4 y segundos
antes de realizar la medición se agregaron 10µL de Th-T 100µM a cada pocillo. Estos
experimentos fueron realizados en un espectrofluorímetro de placas BioTek, modelo
synergy MX, excitando a 450nm y leyendo la fluorescencia a 480nm. Todos los datos de
fluorescencia de Th-T realizados en la presente tesis se expresaron como la media +/- SD
(desviación estándar).
5.6.2.2. Estudio de agregación de Aβ en presencia de NpO mediante TEM.
Para evaluar la formación de las fibras se empleó TEM, para lo cual, se emplearon
rejillas de Cu (200mesh recubiertas con una película de carbono formvar). Para la carga de
la muestra, se depositan 20µL de muestra sobre una superficie muy limpia, se suele
emplear un trozo de papel transparente parafilm para esto. Sobre esta gota, se deposita
cuidadosamente la rejilla, cuidando de colocar la cara formvar en contacto con la muestra,
el tiempo de contacto es de 2min, luego de los cuales la rejilla es tratada para disminuir el
exceso de muestra. Para esto último se debe depositar la rejilla cargada sobre una gota de
agua Milli-Q de 10µL durante 1min, proceso que debe ser repetido dos veces, se traspasa
la rejilla sobre una gota de 20µL de acetato de uranilo al 2% y se deja durante 2min.
58
Finalmente se eliminó todo el exceso de líquido de la rejilla y se dejó secar durante al
menos 2 horas para luego observar la rejilla por TEM.
5.7. Evaluación de la viabilidad celular en presencia de NpO.
Con el fin de evaluar el efecto de las NpO sobre la viabilidad celular, se realizó el ensayo
de proliferación celular en solución acuosa (CellTiter 96® comercializado por Promega),
conocido como MTS, es un ensayo colorimétrico, que permite determinar el numero de
células viables en ensayos de proliferación y de citotoxicidad. Este metodo está basado en
la reducción de una sal de tetrazolio [3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-
sulfofenil)-2H-tetrazolio, MTS] en presencia del reactivo acoplante electrónico metosulfato
de fenazina; PMS).
El estudio de toxicidad se realizó en líneas celulares SH-SY5Y sembradas sobre placas
de 96 pocillos, con una confluencia de 2500 celulas por pocillo. Una vez pegadas las
células (5000 celulas) lson tratadas con las NpO durante 24 hs. Las mismas fueron
incubadas a 37ºC y con 5% de CO2. Luego de transcurrido el tiempo, se descartó el
sobrenadante y se agregaron 100µL de medio DMEM+10%FBS, sobre los cuales se
agregaron 20µL de la solución MTS/PMS (2mg/mL MTS y 0,046mg/mL PMS). La placa se
incubó a 37ºC y 5% de CO2 por un periodo de tiempo entre 0,5-2 horas. De esta manera se
reduce el del MTS dando un producto detectable por espectrofotometría a una λ de 490nm
en un espectrofluorimetro de placas, empleando también un valor de referencia en los
655nm. El resultado corregido se entrega por la diferencia de la absorbancia medidas
Absλ490nm- Absλ655nm. El ensayo de viabilidad se realizó en un triplicado por placa y un
triplicado de placa, obteniéndose un n=9. Los datos se ajustan al control positivo referido
como 100% de viabilidad. Los datos se entregan según la desviación estándar y se realiza
una comparación según un análisis estadístico de varianza en una vía ANOVA, con una
59
corrección de tukey y un nivel de significancia, α=0.05 (95% intervalo de confianza).
(p>0,05 es ns; p≤0,05 *; P<0,01 ** y p<0,001 ***)
5.8. Identificación de las proteínas de suero y plasma que interactúan con NpO-
péptido (CP).
Se realizó la incubación de las NpO-péptido con plasma, para ello se tomaron 20mL de
cada NpO-péptido y se concentraron utilizando tubos de separación por centrifugación
Amincon con un MWCO de 5000 para lo cual se centrifugaron durante 20min a 16100RCF
(concentración final de las nanopartículas fue de 20nM). A la solución resultante se le
agregaron 4mL de plasma (diluido al medio con PBS), obteniéndose un volumen final de
8mL. La solución resultante se incubó durante 24 horas a 37ºC. Pasado el tiempo de
incubación se procedió a la separación de las proteínas del plasma no unidas a los
conjugados. Dicha separación se realizó en base a métodos no perturbadores para el
complejo NM-proteína. Para ello se realizó una centrifugación a 16100RCF por 45min. El
pellet se resuspendió en PBS 10mM, seguido de una nueva centrifugación bajo las mismas
condiciones. El pellet resultante se resuspendio en H2O nanopura y se volvió a centrifugar
en las mismas condiciones. Para la separación de las proteínas se empleó una solución
desnaturalizante consistente en 8M Urea/2% CHAPS. Para lo cual se agregó 150uL de la
mencionada solución al pellet obtenido en el paso anterior sonicandose luego por 30min.
Posteriormente se dejo incubando la solucion resultante por 2h luego de lo cual se realizó
una centrifugación final, esta vez recuperando el sobrenadante que contenía las proteínas
que interaccionan con las nanopartículas. La identificación de las mismas se realizó de
acuerdo a Lundqvist y cols. empleando geles desnaturalizantes 2D SDS/PAGE.[116] Para
ello en primer lugar se cuantificaron las proteínas obtenidas y luego se sembraron en los
geles exactamente 50mg de las proteínas totales sobre la tira de isoelectroenfóque (tiras
60
marca GE health & care, con un rango de pH de 3-10 no lineal). Así se realizó la corrida en
la 1ª dimensión en un equipo de Isoelectroenfoque Ilphor GE. El programa de corrida se
dividio en 4 pasos: el primero de 16 a 20 horas para el sembrado de la muestra, el segundo
de 30min con una carga total de 500V, el tercero de 30min a 1000V y finalmente el cuarto
de 1h 40min a 5000V hasta conseguir un total de 7500Vha. Posteriormente cada tira con la
primera dimensión realizada se colocó en un gel de poliacrilamida SDS-Page
desnaturalizante preparado al 10%, el cual se corrió a 120V con 20mA por gel. Una vez
obtenido el gel en 2D, se realizó una escisión de los spots seleccionados, una digestión con
tripsina, la muestra obtenida fue concentrada y purificada por medio de una columna C18
en fase reversa y eluida diréctamente sobre la placa de MALDI junto a 1µL de matriz acida
de α-ciano-4-hidroxicinamico (HCCA) (al 99%, Aldrich preparada 10mg/mL en 50%
ACN/H2O (v/v) y 0,1% de TFA), para así realizar el análisis de masas empleando para ello
un espectrometro de masas MALDI-TOF-TOF 4700 proteomics analyzer (Applied
Biosystems). Los datos de espectrometría de masas fueron empleados para identificar las
proteínas de la base de datos NCBI primary sequence, utilizando como buscador el sistema
MASCOT. En donde la identificación se realizó comparando espectros (MS/MS) de cada
fragmento con un parámetro de busqueda con un máximo de 2 fragmentos de corte
perdidos. La tolerancia en el peso molecular fue de 70ppm y 0,25Da, para los espectros de
MS y MS/MS respectivamente. En paralelo a esta estratégia de identificación de spots, se
tomó una cantidad de las proteínas totales y fueron directamente digeridas para luego
realizar LC-MS/MS del crudo de proteínas.[116]
5.9. Distribución de NE-CLPFFD ex vivo.
Para llevar a cabo parte de los primeros estudios de distribución, se concentraron las
soluciones coloidales obtenidas desde aprox. 8nM hasta soluciones 20nM. Las muestras se
61
obtuvieron por centrifugación en tubos de centrífuga Millipore, Amicon a 2800RCF por
15min extrayéndose el pellet y diluyéndolo hasta llegar al volumen deseado.
En el ensayo de distribución, se utilizaron ratas macho de entre 200 a 300g (cepa Sprague
Dawley) suministradas por el bioterio de la Facultad Cs. Químicas y Farmacéuticas de la
Universidad de Chile, A las mismasse les inyectaron las soluciones de nanopartículas a una
proporción de 1mL de conjugado por cada 100g de animal por vía intraperitoneal, para
luego ser sacrificadas a distintos tiempos (1, 2, 4 y 24h) y obtener los órganos de interés.
Los niveles de NE se determinaron a partir de la cuantificación ex vivo de oro en los
órganos estudiados. Estos resultados se complementaron con observaciones por
microscopía de fluorescencia de cortes de tejido. Para poder llevar a cabo la detección se
empleó las NE-CLPFFD(cf). Asimismo, se realizó la evaluación de la integridad de la BHE
luego del tratamiento con NE-CLPFFD.
5.9.1. Detección de NE-CLPFFD por cuantificación de oro.
transcurrido los distintos tiempos de estudio, se sacrificaron los animales tratados para
lo cual se utilizó como sedante isoflurano (Neopharma, 100mL), anestésico por inhalación,
el cual es evaporado con un equipo de anestesia OHIO Ohmeda Modulus II. Para
anestesiar a la rata se colocó en una cámara conectada al flujo de isoflurano por 5min.
Luego el animal sedado se colocó sobre una mesa quirúrgica y se mantuvo con una
máscara con anestésico durante todo el proceso. Así se procedió a realizar una perfusión
suave, utilizando una pequeña cantidad de PBS [NaH2PO4 0,02M, Na2HPO4 0,08M y NaCl
0,15M (pH 7,4)] (1mL) y luego paraformaldehído al 2% en PBS (6mL) a un flujo controlado
de 1mL por 1min con bomba peristáltica. Luego, se extrajo el hígado, riñón y cerebro, los
cuales se colocaron en PBS durante el periodo de experimentación. Una vez obtenidos los
órganos de interés, se congelaron en N2 liquido para luego ser liofilizados a -50º C con una
62
presión de 0,137mBar. Una vez liofilizados, los órganos relativamente secos fueron molidos
en un crisol de porcelana, para así homogeneizar las muestras y una vez molidas se
colocaron en una estufa a 120º C hasta conseguir un peso constante.
Una vez obtenidos los órganos liofilizados y en su peso constante, se analizaron por
AAN. Este análisis se realizó por la Comisión Chilena de Energía Nuclear (CChEN) en la
planta nuclear de la Reina. Los datos obtenidos fueron a partir de 3 y 4 ratas por
tratamiento. Las muestras fueron enviadas luego de una molienda homogenizada de cada
órgano dentro de viales de polietileno libres de elementos. Estas se introdujeron en un
reactor nuclear RECH-1 con un flujo de electrones de 0,25-1,3 x1013 n/cm2s con una fuente
197
de poder de 5mW por un tiempo de alrededor de 17h iniciando así la conversión de Au a
198
Au. Luego de 7-12 días de decaimiento, los rayos γ emitidos por la muestra fueron
contados y ordenados por energías usando un detector de germanio acoplado a un
espectrómetro de rayos γ multicanal. Los espectros γ fueron analizados con el software
SAMPO90 Canberra. Una vez obtenida la concentración de oro presente en la muestra y
conociendo el número de átomos por NE se determinó la cantidad de NE en cada órgano.
Para evaluar los resultados entre los distintos tratamientos, los datos se entregan según la
desviación estándar y se realiza una comparación según un análisis estadístico de varianza
en una vía ANOVA, con una corrección de Tukey-Kramer y un nivel de significancia, α=0.05
(95% intervalo de confianza). (p>0,05 es ns; p≤0,05 *; P<0,01 ** y p<0,001 ***)
5.9.2. Detección de NE-CLPFFD por microscopía de fluorescencia.
A un grupo de ratas tratadas de igual manera que para la detección de oro, se
sacrificaron en los mismos periodos de tiempo, pero esta vez empleando como estrategia
de anestesia, la inyección intraperitoneal de 1mL/kg de Ketamina/Xilacina (2:1; Ketamina,
Ketonal 100. Ruchond vet S.A. 100mg/mL; Xilacina, Xylavet 2%, Agroland 20mg/mL). Una
63
vez anestesiadas las ratas, se les realizó una perfusión transcardial suave por 2 min con
PBS y posteriormente con 4mL (flujo 1mL/1min) de paraformaldehido al 4% en PBS para la
fijación. Luego se extrajeron los órganos de interés (hígado, riñón, cerebro), cuidando de
mantener la integridad de cada órgano. Durante el proceso de extracción los órganos se
mantuvieron en PBS. Posteriormente estos órganos se congelaron por inmersión en iso-
pentano (2-Methylbutano, Sigma-Aldrich, Grado HPLC, P.M. 72,15) en un baño de N2(l). Los
órganos congelados fueron mantenidos a -80ºC hasta la realización de cortes. Para los
cortes, los órganos congelados fueron montados en OCT (embedding medium for frozen
tissue specimens. Tissue-Tek) sobre el ultra-micrótomo MICROM HM500O y así se
procedió a realizar cortes de 20µm de grosor. Los cortes realizados al cerebro fueron del
tipo sagital, coronal y longitudinal, mientras que para el riñón del tipo sagital y para el
hígado del tipo longitudinal, sagital y transversal. Una vez obtenidos los cortes se adhirieron
a un portaobjeto silanizado (superfrost plus. Organosilane coated glass slide for
inmunohistochemistry and in situ hybridization application). Una vez obtenidos los órganos
adheridos, se fijaron en paraformaldehído (Fluka, pureza >95%, P.M. 30,03 como
monómero) al 4% en PBS durante 30 min a 4ºC. Luego se eliminó el exceso con un lavado
de PBS 0,1 M durante 12 min a 4ºC. Posteriormente se secaron y se montaron utilizando
medio de montaje Dako (Dako fluorescent Mounting Médium, DakoCytomation)
colocándose luego el cubreobjetos y finalmente sellándose con esmalte de uña y
guardándose a 4º C hasta su visualización en microscopio. En conjunto se obtuvo a modo
secuencial cortes para tinción, la cual se llevó a cabo en paralelo, para la detección de las
zonas de los tejidos. La tinción en cerebro se realizó posterior al paso de fijación descrito en
el punto anterior. Como los cortes de tejido se encuentran hidratados luego de la fijación,
éstos se tiñeron con el colorante cresil violeta (Merck. Para microscopía Certistain. P.M.
321,33) por 5 a 30min (según preparación de colorante, se realizó una prueba para fijar el
64
tiempo correcto el cual fue de 25min). Luego se les realizó un lavado breve (dipping),
primero 5 veces con H2O destilada, luego 5 en alcohol 70º y finalmente 5 en alcohol 95º.
Solo a aquellos cortes que estuvieron muy teñidos se les realizó una decoloración con
solución diferenciadora [Etanol 95%- Acido acético 0,5%] por un dipping. Posteriormente se
deshidrató el tejido utilizando una batería de alcoholes, primero alcohol 95º por 3min, luego
alcohol 100º por 3min, y alcohol 100º por 3min y finalmente Xilol, 2 veces por 5min.
Finalmente se utilizó como medio de montaje entellan, para así poder visualizar el tejido
utilizando el microscopio.[140] Del mismo modo se procedió con cortes de hígado y riñón,
pero para la tinción se empleó azul de Toluidina (AT. Merck. Para microscopía Certistain.
P.M. 305,83). Para el proceso de hidratación se repitió lo descrito en el párrafo anterior. Así
a cada corte se le agregó AT y se mantuvo por 5min. Se lavó con H2O, luego se deshidrató
y se montó al igual que como se describe para cerebro.[140]
Una vez obtenidos los cortes montados, estos fueron visualizados bajo un microscopio
de fluorescencia Zeiss Axioplan y se recogieron las imágenes con una cámara Nikon
coolpix ES400. Una vez obtenidas las imágenes estas fueron analizadas con programas
como Metamorph e Image J, a partir de los cuales se pudo cuantificar la fluorescencia. Los
datos fueron seleccionados a partir de 5 regiones de cada órgano y a su vez cada región a
partir de 3 ratas por tratamiento. Para evaluar los resultados entre los distintos tratamientos,
se realizó una comparación según un análisis estadístico de varianza en una vía ANOVA,
con una corrección de Tukey-Kramer y un nivel de significancia, α=0.05 (95% intervalo de
confianza). (p>0,05 es ns; p≤0,05 *; P<0,01 ** y p<0,001 ***)
5.9.3. Determinación de integridad de BHE.
Para este estudio nuevamente inyectó un grupo de ratas con los conjugados.
Transcurrido 4h cada rata se sedó inyectando intraperitonealmente ketamina-xilazina (2:1).
65
Luego se inyectó 0,3mL/100g animal de Azul de Evans (The Coleman &Bell CO) al 4% en
solución de NaCl al 0,9% por vía cardiaca y transcurrido 10 min se realizó perfusión
intracardiaca. Para poder analizar los resultados es necesario contar con un control
negativo que consistió en una rata a la cual solo se administró el colorante, y un control
positivo, dado por una rata a la que se le inyectó Manitol (25% en solución de NaCl al
0,9%). Este compuesto en altas dosis es capaz de desunir transitoriamente las uniones
estrechas presentes en el endotelio. Así una vez obtenidos los cerebros, se procedió a la
comparación de la tinción de cada cerebro.
5.10. Distribución de NE-CLPFFD in vivo.
Para llevar a cabo parte de los estudios de distribución in vivo, fue necesario el marcaje
de las NpO, para lo cual se diseñó una estrategia de marcaje de las NE, con el fin de lograr
esto fue necesaria la síntesis y caracterización previa del péptido CK, obtenido de acuerdo
a la síntesis descrita en la sección 2.1.1 de este capítulo. La obtención de las NE-
CK/CLPFFD, fue llevada a cabo de acuerdo a lo descrito en la sección 2.1.2 de este
capítulo. Se conjugaron a las NE bajo una serie de proporciones CK/CLPFFD (4mM/1mM;
2mM/1mM; 1mM/1mM y 1mM/2mM respectivamente), de estas, finalmente la empleada
para los estudios posteriores in vivo fue CK/CLPFFD en la proporción 4mM/1mM.
5.10.1. Marcaje radioactivo de NE para estudios in vivo.
Para el marcaje con N-succinimidil-4-[18F]-fluorobenzoato ([ 18

F]-SFB). Para esto fue
necesaria la síntesis de [18F]-SFB, que fue llevada a cabo en un modulo Eckert & Ziegler,
bajo la metodología descrita por Madïng y cols.[141] El [18F] fue obtenido a partir del
bombardeo de [18O]-H2O con protones de alta energía (18 MeV) en el ciclotrón 18/9 IBA
perteneciente al Parc de Recerca Biomédica de Barcelona- Hospital del Mar (PRBB). El
66
radioisótopo [18F] fue enviado al modulo automático donde fue contenido en un cartucho
QMA. El [18F] se extrajo desde el reactor haciendo pasar una mezcla de 2mg de K2CO3 y
1,8mg of Kriptofix 222 in 0.8mL de H2O/CH3CN (1:1) a través del cartucho de QMA. El
reactor fue calentado a 100ºC, luego se aplicó un flujo de He(g) y vacío por 5 min para secar
el [18F]. Para asegurar un secado completo se agregó 1mL de CH3CN anhidro, y se aplicó 5
min vacío. Al [18F], se le agregó 5mg de 4-(tert-butoxicarbonilmetil)- feniltrimetilammonio
trifluorometanosulfonato en 1mL de CH3CN anhidro, se agitó 10min a 90ºC, luego se
agregó HCl 1M. Esta mezcla se calentó a 100 °C por 5 min, se enfrió hasta los 25 °C, para
luego diluirla con 9mL de agua calidad Milli-Q y se pasó por un cartucho HELA C18 para
extracción solida. A los cuales se agregó 3mL of CH3CN a través del cartucho, para que la
solución se enviara a un segundo reactor. El eluato se trató con 20 mL de (CH3)4NOH 25%
en 500mL of CH3CN. La mezcla de reacción se secó a 90 °C por paso continuo de un flujo
de He(g) y vacío. Se agregarón 3mL más de CH3CN anhidro. Luego se agregó una solución
de 15mg of N,N,N’,N’-tetrametil-O-(N-succinimidil) uronio tetrafluoroborato en 500mL de
CH3CN anhidro. Esta nueva mezcla se calentó a 90 °C por 2 min, enfriada luego a 25 °C y
diluida con una solución de acido acético al 5%. El producto crudo se purificó por HLPC
semi preparativo empleando una columna Teknokroma Mediterranean Sea-18 (25 cm × 1
cm, 5 mm) con una fase móvil compuesta de una proporción 42,5/57,5 de CH3CN/formiato
de amonio (3.15 g/1 L H2O, pH = 5) con un flujo de 5mL/min. La pureza se monitoreó por
un detector isotópico y UV-vis a 254nm. La fracción deseada se obtuvo entre 9 y 11min y
fue recogida en 20 mL de solución salina al 0.9%. Esta solución se pasó por un cartucho
C18, lavado con 20mL de agua, y extraido con 3mL de acetona anhidro. La solución se
secó con N2(g). La calidad se probó por HPLC empleando una columna Teknokroma
Mediterranean Sea-18 (25mm × 0,46cm, 5mm) en modo gradiente con flujo de 2mL/min
empleando como fase móvil CH3CN/formiato de amonio (3,15g/1L H2O, pH = 5)
67
comenzando con una proporción 10/90 y alcanzando 40/60 en 10min. El eluyente se
detectó empleando un detector isotópico y UV-vis a 254nm. El compuesto [18F]-SFB
deseado, eluyo a los 10,3min. Obteniéndose un 37% de rendimiento de [18F]-SFB reacción
y con una pureza de >99% y 110 ± 15GBq/µmol de actividad específica.
Para la incubación de NE-CK/CLPFFD, se centrifugaron en tubos de centrífuga Millipore,
Amicon a 2800RCF por 15 min. El pellet se mezcló con 20µL de DMSO y 80µL de citrato de
sodio 1,2mM (pH = 10). A esta solución, se le agregó una cantidad de 4.44 ± 1.11GBq de
[18F]-SFB. Esta mezcla fue agitada a 50 °C durante 1h. Posteriormente se agregaron 900µL
de citrato de sodio 1.2mM (pH = 10), esta solución se centrifugó empleando los tubos
Amicon y el pellet se resuspendió nuevamente en citrato de sodio. Este proceso se repitió 3
veces para conseguir la eliminación de la radioactividad no reaccionante. Para el paso final,
el pellet se disolvión en 2mL de citrato de sodio 1,2mM (pH = 10) y se le agregó 50µL de
Tween-80. Durante el proceso, se obtuvo un rendimiento final de 0.8±0.3% de marcaje. La
caracterización de las NE-CK/CLPFFD*SFB[18F] se llevó a cabo por medio de las técnicas
descritas en la sección 2.1.2 de esta capítulo.
5.10.2. Detección y estudios de distribución in vivo de NE.
En este estudio se emplearon ratas de 571±112g (Sprague Dawley, obtenidas de
Charles River, España, n=3), Cada animal fue anestesiado empleando isoflurano
vaporizado en O2(g) luego de lo cual, se administró por vía intravenosa un bolus de
3.1±2.7kBq de CK/CLPFFD*SFB[18F] (una cantidad similar en concentración molar al
experimento realizado ex vivo, sección 2.5). Rápidamente el animal se dispuso en la unidad
tomográfica específica para el estudio de animales por tomografía de emisión de positrones
(microPET R4; Concorde, Siemens, Knoxville, TN, USA) para así comenzar con la
adquisión dinámica de imágenes de todo el cuerpo del animal. Se obtuvieron imágenes
68
durante 120min, tiempo durante el cual el animal se mantuvo anestesiado por una mascara
facial entregando 2.5% de isoflurano vaporizado en O2(g).
Las imágenes fueron reconstruidas con un tamaño de matriz de 128×128×63mm y un
tamaño de voxel de 0,85 × 0,85 × 1,21mm 3 con un algoritmo de retroproyección filtrada
(FBP). Luego de la reconstrucción, los volúmenes de interés (VOI) fueron dibujados de
forma manual en los diferentes órganos, para luego calcular las curvas de tiempo-actividad.
La medida representativa de radiactividad en sangre se obtuvo por la disposición de uno de
los VOI en la región del corazón. La concentración de radioactividad obtenida al final de la
adquisición se empleó para calcular el porcentaje de la DI por cada gramo de tejido, basado
en la información de PET. Los gráficos de actividad promedio de los 3 animales se calculó
para cada órgano.
5.11. Mejora de la llegada al cerebro de NE empleando THRCLPFFD, Distribución
de NE-THRCLPFFD ex vivo.
Para llevar a cabo este estudio, se empleó una estrategia de estudio muy similar a la
descrita en la sección 2.5. Se emplearon ratas de características similares (Sprague Dawley
de 180-200g, machos, obtenidas desde el centro experimental animal de la Universidad de
Chile), se separaron en grupos de 4 ratas considerando un grupo control (tratas con citrato
de sodio, vehículo de las NE). Las NE-THRCLPFFD se inyectaron por vía intraperitoneal, y
las ratas fueron sacrificadas según lo descrito en la sección 2.4, a los tiempos de 0,5, 1, 2, 4
y 24h. Esta vez se administró 1mL de conjugado por 200g de peso de rata. Luego de
transcurrido los tiempos, se les realizó una perfusión transcardial de forma suave (2mL de
PBS 0,1M a un flujo de 1mL/min) con la intención de eliminar el exceso de sangre. Se
obtuvieron los órganos de interés, que fueron puestos en PBS, luego lavados, congelados
69
en N2(l), liofilizados, molidos, homogenizados, y llevados a peso constante para así
determinar los niveles de oro, en cerebro, hígado, bazo, por AAN, en la CChEN.
De igual manera como se describe en la sección 2.4 de este capítulo, se evaluó la
fluorescencia en cortes de cerebro de ratas tratadas con NE-THRCLPFFD(cf) (n=3),
siguiendo las mismas consideraciones de tratamiento de animales, y de obtención de cortes
de tejido de 20µm de grosor. Los cortes se realizaron en secuencia, realizando una tinción
con Nissl a cortes para poder determinar las zonas del tejido cerebral.
5.11.1 Detección de NE-THCLPFFD en cerebro por TEM.
Esta vez se empleó TEM para confirmar la presencia de NE en el cerebro. Para este fin,
cerebros de ratas tratadas se fijaron en paraformaldehido al 2% con 2,5% de glutaraldehido
en PBS 0,1M, en dichas condiciones se mantuvo por 24h a 4ºC. Luego se lavó la muestra
con PBS, se fijaron con 1% de tetróxido de osmio con 0,8% de ferrocianuro de potasio en
PBS a 4ºC, Luego la muestra se deshidrató en acetona, para luego infiltrarla con resina de
Epon por 2 días, embebida en la misma resina, se polimerizó a 60ºC por 48h, cortes ultra
delgados se obtuvieron empleando un ultra-micrótomo Leica Ultracut UCT, y luego fueron
montados en rejillas de Cu cubiertas con formvar. Finalmente las muestras fueron teñidas
con acetato de uranilo al 2% en agua y citrato de plomo. Así las secciones fueron
observadas por TEM para así obtener micrografías de los cortes.
5.12. Evaluación de la potencialidad de la incubación de NE-péptido con ApoE,
posible estrategia para mejorar la llegada al cerebro.
Para llevar a cabo este estudio, se empleó una estrategia de estudio muy similar a la
descrita en las secciones 2.5 y 2.7 de este capítulo. Se emplearon ratas (Sprague Dawley
de 250-300g, machos, obtenidas desde el centro experimental animal de la Universidad de
70
Chile), se separaron en grupos de 3 ratas considerando un grupo control (tratas con citrato
de sodio, vehículo de las NE-peptido). Para este ensayo, las NE-CLPFFD y NE-
THRCLPFFD fueron determinadas en el organismo por AAN en la CChEN y por
fluorescencia.
Para realizar los estudios de fluorescencia, las NE-CLPFFD y NE-THRCLPFFD se
concentraron las NE empleando centrifugación llevándose a 40nM. Se tomaron 24mL de
conjugados a 8nM que se centrifugaron a 16100RCF por 15min. El sobrenadante se
descartó y el pellet (1mL) se incubó junto al fluoróforo AlexaFluor-750 (NHS-Esther,
Invitrogen). Para lo cual se tomó una alícuota de fluoróforo de 100µg y se diluyó en 200µL
DMF, la cual rápidamente se agregó sobre el pellet de NpO. Se incubó durante 2 horas bajo
agitación constante y luego se llevó a un volumen de 6mL con citrato de sodio 1,2mM.
Posteriormente se centrifugó a 16100RCF por 15 minutos y se llevó nuevamente a 6mL con
citrato de sodio 1,2mM, este proceso se repitió 2 veces para eliminar el fluoróforo no unido.
(Se espera que la unión del fluoroforo sea por los grupos aminos libres de los péptidos
unidos a las NE, puesto que el fluoróforo tiene un grupo carboxilo unido a un grupo
succinimidil, formando un succinimidil ester, un grupo altamente reactivo, y el grupo saliente
en presencia de grupos aminos libre, por lo cual se espera la formación de un enlace amida
por sustitución nucleofílica). Obtenidos los 6mL de conjugados marcados (NE-péptido-
Alexa750), se dividió en 2 fracciones de 3mL, una de ellas fue incubada con 50µg
Apolipoproteína E (ApoE3-human, expressed in E. coli, SIGMA) por 1mL de conjugado por
24 horas, para luego ser inyectada a cada animal como 1mL de (NE-péptido-Alexa750) o
1mL (NE-péptido-Alexa750@ApoE) para así poder realizar comparaciones respectivas. Una
vez inyectadas en cada animal, estos fueron monitoreados por medio del equipo In vivo FX
pro (Carestream/Bruker). Dada la baja fluorescencia, se procedió a la extracción de los
órganos a los tiempos 2 y 24 horas (tiempos definidos por estudios anteriores) y se
71
determinó la señal de fluorescencia por medio del equipo In vivo FX pro
(Carestream/Bruker) de cada órgano completo. Se determinó una región de interés (ROI) a
la cual se midió la fluorescencia, obteniéndose la intensidad de fluorescencia. Los datos
analizados corresponden a la intensidad promedio de las 3 ratas por ensayo, valor que es
entregado como la intensidad promedio de la región de interés en comparación con la
fluorescencia del control. Los datos son graficados como promedio de cada punto, con
desviación estándar muestra, comparados según un análisis estadístico de varianza en una
vía ANOVA, con una corrección de Tukey-Kramer y un nivel de significancia, α=0.05 (95%
intervalo de confianza). (p>0,05 es ns; p≤0,05 *; P<0,01 ** y p<0,001 ***)
Para confirmar los valores de fluorescencia, estos cerebros obtenidos, fueron tratados
según se describe en la sección 2.5 y 2.7 para poder ser evaluados por AAN, en la CChEN
y así obtener los niveles de oro en cada cerebro. Los datos de oro obtenidos, se muestran
en un gráfico como promedio de cantidad de oro en cada tratamiento, mostrando la
desviación estándar de la muestra (n=3), y se realiza una comparación según un análisis
estadístico de varianza en una vía ANOVA, con una corrección de Tukey-Kramer y un nivel
de significancia, α=0.05 (95% intervalo de confianza) (p>0,05 es ns; p≤0,05 *; P<0,01 ** y
p<0,001 ***).
72
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
6.1. Objetivo específico 1.
Sintetizar y caracterizar Nanoesferas de oro (NE) de aproximadamente 12nm y
Nanovarillas de oro (NV) con relación de aspecto 4/1.
6.1.1 Caracterización de NE y NV por espectrofotometría de absorción molecular.
Las NE obtenidas presentaron un máximo de absorción cercano a los 520nm
correspondiente a la banda del plasmón de resonancia característico para NE de tamaños
de entre 10 y 20nm (Figura 18).

1,4
1,2
1,0
A b s o rb a n c ia (u .a .)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
λ(nm)
Figura 18. Espectro de absorción UV-Vis de NE. Se aprecia la absorbancia característica de las NE de
un tamaño cercano a 12nm (concentración 4nM) debido al fenómeno RPS.
Para el caso de las NV, el espectro posee dos bandas dadas por los plasmones
transversal y longitudinal, respectivamente. La banda correspondiente al plasmón
longitudinal se encuentra en el infrarrojo cercano observándose un máximo a 800nm lo que
se condice con una relación de aspecto largo/ancho de alrededor de 4, mientras que la
banda correspondiente al plasmón transversal se centra en los 520nm (Figura 21 ).
73
0,8 1,8
A) B) 1,6
0,6
1,4
1,2

Absorbancia (u.a.)
Absorbancia (u.a.)
1,0
0,4
0,8
0,6
0,2
0,4
0,2
0,0 0,0
400 600 800 1000 400 500 600 700 800 900 1000 1100
λ(nm) λ(n m )
Figura 19: Espectro de absorción Vis-NIR de NV-CTAB. (A) Espectro obtenido de las Semillas previo
crecimiento de NV. (B) Espectro de NV-CTAB luego del crecimiento cristalino
6.1.2. Caracterización de NE y NV por microscopia electrónica de trasmisión.
Para determinar el tamaño de las NP, se realizaron observaciones por TEM. Como se
aprecia en la Figura 22.A, se pueden distinguir NE, y a partir de un estudio poblacional de
300 partículas, se determinó que las mismas poseen un tamaño promedio de 12±1nm (ver
la distribución de tamaños en el inserto de la imagen). Como se observa en la Figura 22.A
las NE obtenidas por este método son homogéneas en tamaño y forma.
50 A 20
B
40 15
%NV
30
%3NE
10
20
5
10
0
0 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Diametro3(nm) Relación2de2aspecto2(largo/ancho)
200nm
200nm
Figura 20 (A) Microfotografía de TEM de NE. En el inserto se muestra la distribución de tamaños de

una población de 300 partículas obteniéndose un tamaño próximo a 12nm. (B) Microfotografía de TEM
de NV-CTAB. El inserto muestra la relación de aspecto obtenida luego de analizar la morfología de un
Nº de 200 NV, obteniéndose una relación de 3,9±0,2.
74
Al igual que las NE, las NV fueron observadas por TEM (Figura 22.B) con el fin de
obtener información acerca de la morfología de las especies. Las partículas obtenidas
presentaron forma de Nanovarillas con longitudes promedio de 45,8nm y anchos promedio
de 11,8nm, dando así una relación de aspecto promedio de 3,9, valores obtenidos luego de
analizar la morfología de 200 NV.
6.1.3 Caracterización de NE y NV por dispersión dinámica de la luz y potencial zeta.
Para evaluar características de las NP en solución, se empleó la técnica de DLS,
determinándose el diámetro hidrodinámico de las partículas en suspensión, mediante la
cual se espera un resultado coherente en relación a los tamaños obtenidos por TEM. En la
Figura 23 se aprecian los resultados entregados por DLS de intensidad para diferentes
muestras obtenidas de NE y NV.

15
NE
18,8 NV
10
% Intensidad
2,78
59,13
5
0
0,1 1 10 100 1000
Dimetro (nm)
Figura 21. Distribución de tamaños en diámetro según % de intensidad determinado mediante DLS para
NE (azul) y NV (verde). En cada máximo se indica el valores correspondiente de tamaño.
En la Figura 23 se aprecia más de una señal sobre el resultado entregado de DLS para
NV en solución, posiblemente debido a la presencia de CTAB,[29] que forma pequeñas
micelas que interfieren en los datos por DLS,[142] y según lo descrito en el capítulo 1 al
75
analizar el valor de % de intensidad los resultados obtenidos son consecuentes con la
longitud de las NV. Este diámetro hidrodinámico es mayor que el obtenido por TEM debido
a que las NV en solución se mantienen rotando y el equipo de DLS ajusta los valores de
diámetro a los de esferas equivalentes aunque la forma de la partícula sea la de una barra.
A este análisis se debe agregar la propuesta de Liu y cols.,[143] quienes en su trabajo
indican que esa señal observada entre 1 y 10nm no es solo dada por el CTAB, si no que
también puede atribuirse a la difusión rotacional de las NV en lugar de una dimensión real
de las mismas, indicando que dicho valor puede ir desde 3-7nm par NV de relación de
aspecto que van desde 2,5 a 4.
El pot-Z es un dato que puede ser obtenido en el mismo equipo DLS y está muy
relacionado a las propiedades en solución de las NP. El valor de pot-Z obtenido para las NE
es de -46mV, un valor negativo debido posiblemente a que la partícula se encuentra
recubierta por citrato adsorbido sobre la superficie de oro y que proveniente de la síntesis.
La estabilidad del coloide esta dada por repulsión electrostática. Contrariamente las NV
poseen un pot-Z positivo de +52mV ya que se encuentran recubiertas con moléculas del
surfactante catiónico CTAB.
6.1.4. Determinación de la concentración de NpO.
Para determinar la concentración de nanopartículas se realizó una cuantificación de oro
en las muestras por AAN. Considerando la concentración de oro en conjunto con los
tamaños obtenidos por TEM y aplicando las ecuaciones descritas en el capítulo 2
(ecuaciones 2.1 y 2.2), se determinaron las concentraciones de NE y NV, datos entregados
en la Tabla 1
76
Tabla 1 Cuantificación de oro en NE y NV.
Oro NP
(µg/g) ±SD µmol ±SD nmol ±SD nM ±SD
NE 117,8 (±15,4) 0,6 (±0,08) 1,1×10!! (±1,5×10!! ) 11,4 (±1,5)
NV-CTAB 38,9 (±2,6) 0,2 (±0,01) 4×10!! (±2×10!! ) 0,4 (±0,02)
9. En cada caso los datos fueron obtenidos a partir de 3 lotes de NpO independientes.
6.2 Objetivo específico 2.
Sintetizar y caracterizar CLPFFD, CALNN, CALNNLPFFD, C-PEG-LPFFD.
6.2.1. Caracterizaci8ón de los péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD, CALNN,
CpegLPFFD, Cpeg, THRPPMWSPCLPFFD.
Una vez obtenidos los péptidos según el protocolo experimental estos fueron analizados
mediante cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) para determinar el grado de
pureza de los mismos. En los cromatogramas HPLC de los tres péptidos purificados, en los
cuales se observa el tiempo de retención en la columna cromatográfica de todos los
componentes de la muestra, en donde para todos los casos la pureza fue superior al 90%.
(Anexo Figura A1).
Asimismo, los péptidos obtenidos se caracterizaron por espectrometría de masa MALDI-
TOF corroborándose la presencia de los correspondientes iones cuasi moleculares [M+H+]+;
[M+Na+]+ y [M+K+]+ y por ES-MS HPLC, las correspondientes masas según la carga M+1/Z;
M+2/2Z; M+3/3Z. La Tabla2 resume las señales correspondientes a las másas obtenidas
desde los corresponde espectros de masa de CLPFFD (Figura Anexo 2), de
CALNNLPFFD(Anexo Figura A3), de CpegLPFFD (Anexo Figura A4), de CALNN (Anexo
Figura A5), de Cpeg (Anexo Figura A6) y de THRPPMWSPVWPCLPFFD (Anexo Figura
A7).
77
Tabla 2: Caracterización de péptidos por Espectrometría de masa, HPLC-MS y MALDI-TOF/MS
MALDI-‐TOF/MS HPLC-‐MS
Masa teórica
Ion cuasi
(g/mol) (g/mol) Masa/Carga (g/mol)
molecular
+ +
[M+Na ] 762,248 M+1/Z 740,4
CLPFFD 739,9 + +
[M+K ] 778,2223 M+2/2Z 371,2
+ +
[M+Na ] 1174,497 M+1/Z 1152,5
CALNNLPFFD 1152,34 + +
[M+K ] 1190,4796 M+2/2Z 576,8
+ +
[M+H ] 1042,5735
+ + M+1/Z 1042,5
CpegLPFFD 1041,8 [M+K ] 1080,5157
+ + M+2/2Z 522
[M+Na ] 1064,5360
+ +
M+H ] 533,2823
+ +
CALNN 532,62 [M+K ] 571,2569 M+1/Z 533,2
+ +
[M+Na ] 555,2576
+ + M+1/Z 423,2
[M+H ] 423,249
+ + M+2/2Z 212,2
Cpeg 422,1 [M+K ] 463,241
+ + M+3/3Z 142,1
[M+Na ] 445,2362
2M+1/Z 845,4
+ +
[M+H ] 2212,264 M+1/Z 2213,5
+ +
THRPPMWSPVWPCLPFFD 2212,63 [M+K ] 2250,2456 M+2/2Z 1107,3
+ +
[M+Na ] 2235,2764 M+3/3Z 738,7
Conjugar NE con CLPFFD, CALNN, CALNNLPFFD, C-PEG-LPFFD y
THRPPMWSPVWPCLPFFD, y NV con CLPFFD.
6.3.1 Caracterización de los conjugados NpO-Péptidos por Espectrofotometría UV-
Vis-NIR.
En la Figura 24.A. se muestran los espectros de absorción de los conjugados
observándose las bandas correspondientes al plasmón de resonancia de NE en
comparación con NE-CLPFFD, NE-CALNNLPFFD,NE-CpegLPFFD, NE-CALNN, NE-Cpeg
y NE-THRPPMWSPVWPCLPFFD, todas centradas en alrededor de los 520nm.
78
1,4
2,8 NE NV-‐CTAB
A) NE-‐CLPFFD
NE-‐CpegLPFFD
B) 1,2
NV-‐CLPFFD
2,4
NE-‐Cpeg
NE-‐CALNNLPFFD 1,0
2,0
NE-‐CALNN
Absorbancia (u.a.)
Absorbancia (u.a.)
NE-‐THRCLPFFD
1,6 0,8
1,2 0,6
0,8
0,4
0,4
0,2
0,0
0,0
400 450 500 550 600 650 700 750 400 500 600 700 800 900 1000
λ(nm)
λ(nm)
Figura 24. A) Espectro de absorción de conjugados a NE B) espectro de absorción de NV.

Luego de la conjugación con los péptidos se produce un desplazamiento batocrómico de
la banda de la RPS debido a una modificación de la superficie metálica en la que se
reemplazan las moléculas de citrato (estabilizante) por moléculas de péptido (Figura 24).
Dicho desplazamiento se relaciona con un cambio en el índice de refracción en la
nanopartícula.[144] Para el caso de las NV también se produce un desplazamiento
batocrómico debido a la quemisorción de las moléculas de péptido que desplazan a las
moléculas de CTAB (Figura 24.B). La banda correspondiente al plasmón longitudinal de las
NV-CTAB se encuentra entre los 750 y 790nm y al ser funcionalizadas se desplaza hacia
el infrarrojo cercano, entre 800-815nm.
6.3.2. Caracterización de los conjugados NpO-Péptidos por TEM.
Al igual que para las NP sin funcionalizar, una vez obtenidos los espectros de absorción
y corroborada la conjugación se realizaron micrografías TEM con el fin de evaluar que el
corrimiento de la banda plasmónica no se relaciona con un crecimiento de las NP debido a
posibles fenómenos de agregación. En las Figuras 25 se observa que las NP y NV se
mantienen con un bajo grado de agregación. Asimismo, se puede observar que las NE
79
conjugadas a los péptidos mantienen su forma, tamaño y dispersión de tamaño respecto de
las NE sin conjugar, al igual que lo que sucede con las NV que mantienen
A"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""B"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" C su relación de
aspecto.
A B C
A"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""B"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" C
D""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""E""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" F

50
40
D E FF
% of AuNP
D""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""E"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
30
20
10
Diameter (nm)
50
G H40 I
% of AuNP
30
20
10
Diameter (nm)
Figura 25. Imágenes obtenidas por TEM de conjugados: A) NE; B) NE-CLPFFD; C) NE-CALNNLPFFD;
D) NE-CpegLPFFD; E) NE-CALNN; F) NE-Cpeg; G) NE-THRCLPFFD; H) NV-CTAB; I) NV-CLPFFD.

6.3.3 Caracterización de los conjugados NpO-Péptidos por DLS y pot-Z.
En la Tabla 3 se resumen los valores obtenidos observados en los espectros de DLS y
así como también los valores de pot-z.
Los diámetros hidrodinámicos de las NE conjugadas aumentan respecto al de las NE
recubiertas con citrato. Esto se correlaciona con que en todos los casos las moléculas de
péptido se encuentran recubriendo la partícula incrementando así el tamaño de las
mismas.[61, 145] Así mismo se observa un cambio en las NV-CLPFFD, esta vez el valor de
DLS fue menor que para NV-CTAB, posiblemente esto se deba al desplazamiento del
CTAB que se podría encontrar formando multicapas por el péptido quemisorbido formando
80
una monocapa. Es necesario considerar que el CTAB funciona como un agente caotrópico
y posiblemente en la superficie de las NV se deposite en más de una capa como da cuenta
Nikoobaskht y El-Sayed.[146] Al estar presente el péptido tiolado luego de la quemisorción se
desplaza el CTAB desde la superficie de las NV, así como se describe el desplazamiento
de citrato desde la superficie de las NE,[6, 9, 29, 33, 61] dada la unión muy favorable oro-tiol.[147]
En el caso del Pot-Z se aprecia un cambio en la carga dado por el desplazamiento de
citrato en el caso de las NE por moléculas de péptido ya que al reemplazar una molécula de
citrato que posee tres cargas negativas por una molécula de péptidos (posee una carga
negativa neta a pH=7,4) se produce una reducción del valor absoluto de pot-Z (desde
aprox. -46mV a aprox. -36mV), dicho efecto puede tener repercusión sobre las
interacciones con los sistemas biológicos, pues es sabido que a mayor carga negativa, es
mayor el reconocimiento por el SFM.[108, 109, 114]
Tabla 3: Datos obtenidos de DLS y pot-Z para las NE y NV y sus conjugados.
DLS (nm (PDI)) Pot-‐Z (mV (± SD))

NE 18,8 (0,2) -‐46,5 (±1,3)

NE-‐CLPFFD 21,8 (0,3) -‐36,5 (±1,6)

NE-‐CALNNLPFFD 21,5 (0,3) -‐35,4 (±2,3)

NE-‐CpegLPFFD 20,2 (0,3) -‐36,8 (±1,9)

NE-‐CALNN 22,1 (0,3) -‐32,5 (±2,1)

NE-‐Cpeg 21,1 (0,3) -‐35,4 (±2,8)

NE-‐THRCLPFFD 44,6 (0,3) -‐42,2 (±1,4)

NV-‐CTAB 56,6 (0,3) +52,9 (±5,6)

NV-‐CLPFFD 45,6 (0,4) +55,5 (±2,7)

* En cada caso los datos fueron obtenidos a partir de 3 lotes de NpO independientes; el Pot-Z se entrega
como promedio de 15 medidas para cada lote, con su correspondiente SD; en el caso del DLS, se
entrega el valor dado por triplicado para cada lote, con un ajuste matemático entre los lotes para luego
obtener el valor de la tabla junto al índice de Polidispersidad (PDI) dado para el total de las muestras.
81
6.3.4 Determinación de la relación de moléculas de péptido/nanopartícula.
El conocer el número de moléculas que se disponen sobre la superficie de una
nanopartícula es crucial ya que este número se relaciona con la disposición de las
moléculas sobre la superficie de la nanopartícula.[9, 61, 148]

Para determinar la relación
moléculas de péptido por nanopartícula se realizaron dos análisis por separado y en
paralelo. En primer lugar se sintetizó una cantidad de NP-péptido y sobre una alícuota
(centrifugada) se realizó un AAA al pellet de las mismas y por otra parte, a otra alícuota de
la misma preparación de conjugado se le realizó un análisis de oro, por ICP-MS o AAN. Con
esto se obtuvo la concentración molar de péptido y de la NpO, respectivamente.
Finalmente, la razón entre ambas indica el número de moléculas de péptido/NpO. Las
concentraciones de NpO, péptido y el número de moléculas de péptido se muestran en la
Tabla 4.
En base a todos los análisis realizados se puede concluir que en presencia de los
diferentes péptidos, es posible detectar una gran cantidad de estos recubriendo a las NpO.
En el caso de las NE-péptido el grado de funcionalización en presencia del espaciador
Cpeg en la secuencia CpegLPFFD es el mayor respecto de los otros péptidos, lo cual
podría relacionarse con que la presencia de Cpeg permite un mayor empaquetamiento
hidrofóbico sobre la superficie metálica lo cual haría suponer que la disposición de
moléculas de péptido es ortogonal respecto de la superficie. Por otra parte en presencia del
espaciador CALNN se disminuye el grado de funcionalización disponiéndose posiblemente
de un modo en que las moléculas se encuentran de forma horizontal sobre la superficie, lo
cual posiblemente también se relacione con el grado determinado en aquellas NE-CALNN
Figura 26.
82
Tabla 4: Determinación del Nº de moléculas de péptido unidas a cada NE determinado a partir de
Análisis de Aminoácidos y concentración de NE y NV (ND es no determinado)
Moléculas péptido x
NP (±SD)
NE ND
NE-CLPFFD 927 (±197)
NE-CALNNLPFFD 633 (±156)
NE-CpegLPFFD 1158 (±235)
NE-CALNN 512 (±119)
NE-Cpeg ND
NE-THRCLPFFD 337 (±178)
NV-CTAB ND
NV-CLPFFD 3025 (±359)
* En cada caso los datos fueron obtenidos a partir de 3 lotes de NpO independientes, entregándose el
valor promedio en cada caso y su correspondiente desviación estándar (±SD).
En el caso de THRCLPFFD el grado de funcionalización es mas bajo respecto a lo que
sucede con CLPFFD lo cual puede atribuirse a que el péptido se quemisorbe disponiéndose
sobre la superficie con un forma posiblemente de “Y”. (Figura 26)
Para el caso de las NV-CLPFFD, el grado de funcionalización es mayor, lo cual se debe
a la mayor área que estas presentan.
Desde el punto de la posible aplicación de los conjugados, es interesante destacar que
un mayor grado de funcionalización podría permitir una mayor interacción con los
agregados de β-amiloide debido a la presencia de una mayor zona para el posible contacto.
83
NE#
CLPFFD#
CpegLPFFD#
CALNNLPFFD#
CALNN#
THRCLPFFD#
Figura 26. Esquema de funcionalización de NE con los péptidos CLPFFD, CpegLPFFD, CALNNLPFFD,
CALNN y THRCLPFFD.

6.3.5. Evaluación superficial de las NpO por XPS.
En este trabajo de tesis se realizaron espectros XPS de las diversas NpO. Por medio de
la técnica de XPS, se puede obtener información de los átomos presentes en la superficie
de las NpO, pudiendo evaluarse cambios luego de la funcionalización.
Modificaciones en las señales entregadas por los electrones Au4f del Au y los electrones
S2p del S, podrían indicar la existencia del enlace Au0-S correspondiente a la posterior
unión del péptido a la superficie de oro. En una primera etapa se realizaron los espectros
generales para detectar los átomos presentes en la superficie de las NE y las NV (Figura
27).
En los espectros presentados en la Figura 27 se observa un grupo de señales
característico de las NE y que se diferencia de las NV en que esta última muestra, posee
señales que corresponden a Ag y Br. Luego de realizar el barrido general que va desde 0 a
550eV, se realizaron espectros a mayor resolución en las zonas de interés donde es posible
analizar en detalle cada señal. De esta manera es posible asociarlas a tipos de electrones
específicos y además atribuirlas a determinados grupos funcionales.
84
gn01.spe: AuNP Company Name CTABgn01.spe: 1 Company Name

08 Aug 19 Al mono 350.0 W 0.0 0.0° 187.85 eV 8.0979e+004 max 9.63 min 10 Feb 25 Al mono 350.0 W 0.0 0.0° 187.85 eV 6.5819e+004 max 4.54 min
Sur1/Full/1 A) Sur1/Full/1 B)
4 4
x 10 gn01.spe x 10 CTABgn01.spe
9 8

-O1s
8
7
-C1s

-Au4f7 -Au4f5 -Au4f

7
6
-Au4p3
-C1s
-Au4d3

6
-Au4p1
5
-Au4d5
5
-Ag3d5 -Ag3d3 -Ag3d

4
c/s
c/s
-N KLL
-O KLL
-N1s
4
-Br3p
-Au4d5
3
-Au4d3
-Au4f5 -Au4f
-Na KLL1

3
-Br3p1
-Na KLL
-S2p
-S2s
2
-Br3p3
2
-Au4f7
-Br3s
-Br3d
-Ag4s
1
1
-Ag4d
-O2s
0 0
1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
Binding Energy (eV) Binding Energy (eV)
Figura 27. Espectro generales de XPS para NE (A) y NV (B)
El primer elemento analizado es el oro. En la Figura 28 se observa el espectro de alta
resolución para este elemento en NE-Citrato y NV-CTAB, respectivamente observándose
que la señal de oro en ambas NpO poseen dos picos, en el caso de NE uno a 83,8eV y otro
a 87,5eV y para el caso de NV-CTAB uno a 83,3eV y otro a 87,1eV. En ambos casos estos
están asociados a los electrones del oro Au4f7/2 y Au4f5/2, respectivamente.[149, 150]
Al
funcionalizar, se espera que estas señales tengan pequeñas variaciones, correspondientes
a la formación de enlaces entre el oro y las moléculas que se emplearán para la
funcionalización.
El siguiente elemento analizado fue el Azufre y al no estar funcionalizadas las NpO se
esperaría no estuviese presente. En la Figura 29 se observa la zona del azufre en NE y NV-
CTAB, las cuales se utilizaron como un control para descartar la presencia de tioles u otras
especies azufradas provenientes de otra fuente que no fueran los péptidos. En ambos
espectros no se observa ninguna señal dada por el S, con lo cual se puede concluir que la
aparición de señal en esta zona, se puede relacionar con una posible conjugación.
85
mn01.spe: AuNP mk56mn01NR-CTAB.spe:
Company Name NR Company Name
08 Aug 19 Al mono 350.0 W 0.0 0.0° 23.50 eV 1.4510e+004 max 20.00 11
s May 18 Al mono 350.0 W 0.0 0.0° 23.50 eV 3.4249e+004 max 7.00 min
Au4f/Full/1 Au4f/Full/1 (Shft)
4
mn01.spe x 10 mk56mn01NR-CTAB.spe
15000 3.5
A) NE B) NV
3
2.5
10000
c/s
c/s
1.5
5000
1
0.5
0 0
98 96 94 92 90 88 86 84 82 80 78 98 96 94 92 90 88 86 84 82 80 78
Figura 28. Espectros XPS de alta resolución para energías de unión de los electrones 4f del oro en
mn01.spe: AuNP sg05mn02.spe:
Company Name NRCTAB Company Name
08 Aug 19 Al mono 350.0 W 0.0 0.0° 23.50 eV 1.67 min11 Dec 15 Al mono 350.0 W 0.0 45.0° 23.50 eV 2.6755e+003 max 14.67 min
(A)NE y (B)NV-CTAB. En rojo se muestra el espectro
2.3300e+003 max
S2p/Full/1 S2p/Full/1original, en azul el ajuste del mismo.
mn01.spe sg05mn02.spe
2350 2680
2300 2660

2640
2250
2200 A) NE
2620
B) NV
2600

c/s
2150
c/s
2580
2100
2560
2050
2540
2000 2520
1950 2500
176 174 172 170 168 166 164 162 160 158 156 154 174 172 170 168 166 164 162 160 158 156 154
Figura 29. Espectros XPS de alta resolución para energías de unión de los electrones 2p del azufre en
(A) NE y (B) NV-CTAB.

La aparición de energía correspondientes al S proviene del residuo de Cys quemisorbida
sobre la superficie de oro y se puede tener información acerca de la interacción del péptido
con la superficie de oro. Así, para confirmar la presencia de S, se debe evaluar la energía
asociada a los electrones S2p.[151-153]
En sí la interacción oro-tiol presente en las NpO, ha sido de gran interés en los últimos
tiempos y aún no existe certeza de la reacción que ocurre cuando un átomo de S se enlaza
a una superficie de Au0. Se estima que la reacción que toma lugar es la siguiente:[152, 154]
RSH + Au0= RS-Au0 + ½ H2
86
Como se ha descrito en cálculos teóricos de teoría funcional de la densidad DFT
(Density functional theory) la energía de este enlace estaría alrededor de las 50kcal/mol,
estudios experimentales han demostrado que la energía es cercana a -25kcal/mol,[31, 155] lo
cual hace considerar este enlace casi como del tipo covalente.[156]
Así, para el análisis de esta posible interacción, los espectros de XPS pueden resultar
determinantes, así los valores analizados son los entregados por cambios en los electrones
Au4f y los electrones S2p, esperándose señales doblete en el caso de Au4f, como se
muestra en la Tabla 5. Eventualmente estos valores permiten un análisis más profundo de
cómo estos elementos se pueden encontrar. Análisis mas exhaustivos pueden indicar la
presencia de tioles no unidos a la superficie de oro lo cual podría deberse a que puede
existir una interacción de los aminos libres de los péptidos.[157] Sin embargo, aun cuando las
energías indican una interacción de carácter covalente, no se debe descartar la posibilidad
de fenómenos dinámicos que puedan en cierto momento exponer los tioles con lo cual se
pueda generar una posible oxidación. A partir de los resultados de XPS, se observan picos
cercanos a 162,7eV, que pueden relacionarse con la interacción Au-S.
Como parte de la caracterización de las NV-CTAB por XPS es necesario detectar la
presencia de Ag, Br que se encuentran presentes en las muestras. Asimismo, es importante
evaluar la presencia de CTAB que es una de las impurezas presentes provenientes de la
síntesis. Así, en las Figuras 37.A se observa el espectro de alta resolución para Ag
presente en las NV-CTAB, apreciándose dos picos de energía a 373,3eV y 367,3eV
concordantes con los electrones Ag3d5/2 y Ag3d3/2, respectivamente. Estos electrones no
juegan un papel en la conjugación posterior, como lo demuestra C. Adura en su tesis de
doctorado,[39] en donde los mismos electrones se observan para NV-péptidos, entre los que
se encuentra las NV-CLPFFD de nuestro interés, con energías de 376,6eV y 367,4eV,
respectivamente asociados a Ag+, por lo cual en un análisis para evaluar la funcionalización
87
estos electrones no permiten distinguir diferencias. Otra zona ampliada es la
correspondiente al Bromo. En la síntesis de NV el surfactante catiónico CTAB es utilizado
como templado para inducir la forma de varilla en el nanomaterial. Este surfactante está
compuesto por una cadena de 16 carbonos, con una cabeza hidrofílica de un amonio
cuaternario y como contra ión posee un Br-.[39] Es entonces, por este motivo que es
esperable encontrar trazas de bromo en las muestras de NV-CTAB y también un cierto
efecto en aquellas NV conjugadas. En la Figura 30.B se observan los espectros XPS de alta
resolución en la zona del Br. Según lo descrito por C. Adura, la energía cercana a 67eV se
relaciona a la señal de Br- libre, mientras que una energía cercana a 68eV se espera para
Br- unido a las NV.[39] Al Analizar el espectro de NV-CTAB en la Figura 30.B se encontró la
señal correspondiente a Br unido a la superficie de Au de 67,8 eV. Así se concluye que para
el caso de NV-CTAB se encuentra el Br- unido a la superficie del Au.
Tabla 5: Datos obtenidos por XPS para la energía de los electrones Au4f7/2, Au4f5/2, esperándose la
aparición de doblete en estas regiones de energía y también se espera la aparición de la señal
correspondiente a los electrones de azufre, S2p
Au4f7/2 (eV) Au4f5/2 (eV) S2p (eV)
NE 83,46 87,17 ND
NE-‐CLPFFD 82,49-‐83,68 85,51-‐86,89 163, 3
NE-‐CALNNLPFFD 82,9-‐84,04 85,28-‐86,83 162,11
NE-‐CpegLPFFD 82,78-‐83,46 86,48-‐87,53 162,58
NE-‐CALNN 82,96-‐83,1 86,54-‐87,01 162,97
NE-‐Cpeg 83,11-‐83,96 86,26-‐87,51 161,83
NE-‐THRCLPFFD 82,87-‐83,11 86,6-‐88,18 163,11
NV-‐CTAB 83,3-‐83,59 86,33-‐87,3 ND
NV-‐CLPFFD 83,42 87,23 161,75
88
mk56mn01NR-CTAB.spe: NR Company Name
mk56mn01NR-CTAB.spe: NR Company Name
11 May 18 Al mono 350.0 W 0.0 0.0° 1.7259e+004 max 14.00 min
11 May 18 Al mono 350.0 W 0.0 0.0° 23.50 eV 4.3433e+003 max 7.00 min
Ag3d/Full/1 (Shft)
Br3d/Full/1
4
x 10 mk56mn01NR-CTAB.spe
mk56mn01NR-CTAB.spe
1.8
4500
1.7
4000
1.6
3500
1.5
3000
1.4
c/s
2500
c/s
1.3 2000
1.2 1500
1.1 1000
-
1 500
382 380 378 376 374 372 370 368 366 364 362 80 78 76 74 72 70 68 66 64 62 60
Figura 30. Espectros XPS de alta resolución de NV-CTAB. A) espectro para energías de unión de los
electrones 3d de Ag en NV-CTAB. En rojo se muestra el espectro original, en azul el ajuste del mismo. B)
espectro para energías de unión de los electrones 3d del Br en NV-CTAB. En rojo se muestra el espectro
original, en azul el ajuste del mismo.
6.3.6. Obtención, caracterización de CK y funcionalización de NE.
Con el fin de poder marcar radioactivamente las NE, para emplear estas en el
seguimiento in vivo, se diseñó un dipéptido, que pueda ser unido a las NE y luego facilite la
unión de un marcador. El dipéptido empleado, fue CK, de manera de obtener NE
multifuncionalizadas con este péptido y CLPFFD. De esta manera se aumentarán los
grupos amino disponibles para una posterior interacción con el marcador. En el Anexo
Figura A8 se muestra el cromatograma de HPLC obtenido para CK.
El dipéptido CK fue caracterizado por medio de MALDI-TOF (Anexo Figura A9),
observándose el ion cuasi molecular esperado de [M+H] 249,143g/mol, equivalente a la
masa teórica para dicha secuencia de 248,331g/mol.. Obtenido y caracterizado, CK se
empleó en conjunto a CLPFFD para funcionalizar NE obteniéndose la forma NE-
CK/CLPFFD. En la Figura 31 se muestran los espectros UV-Vis de NE-CK/CLPFFD
empleando para la conjugación diferentes proporciones de los péptidos CK y CLPFFD. La
imagen TEM, corresponde a la proporción finalmente empleada, que equivale a 4mM de CK
y 1mM de CLPFFD incubados con las NE. Dicha proporción por AAA dio cuenta de una
89
cantidad real cercana 1,6 moléculas de CK por 1 de CLPFFD en la superficie de las NE.
(aproximadamente 624 moléculas de CK por 416 de CLPFFD). Estas NE-CK/CLPFFD (4:1)
presentan un diámetro hidrodinámico de 21,3nm con un índice de poli-dispersión de 0,295,
y un pot-Z de -40,3mV, lo cual da cuenta de que son adecuadas para los estudios de
biodistribución, y están bajo parámetros similares a las NE y NE-CLPFFD.
Figura 31. A) Espectro de absorción de conjugados de NE-CK/CLPFFD en diferentes proporciones B)

micrografía TEM de NE-CK/CLPFFD (proporción 4:1)
Una vez obtenida la forma NE-CK/CLPFFD, y gracias a los grupos amino aportados por
K, es posible la formación de un enlace amida empleando para estos ésteres de
succinimidas, permitiendo el anclaje de una serie de marcadores, algunos de tipo
fluorescentes, actualmente en el mercado, otros como succinimil-4-fluorobenzoato (SFB), el
cual puede marcarse con un isótopo radioactivo del Flúor, 18F. Siendo posible así el marcaje
radioactivo, obteniéndose NE- CK/CLPFFD*SFB-[18F].
En la Figura 32 se muestra un espectro realizado con la molécula apreciándose una
banda plasmónica desplazada de 524 a 525nm dando cuenta de la unión de SFB. Al
evaluar estos últimos por DLS se observó un diámetro hidrodinámico de 33,7nm con un
índice de poli-dispersión de 0,398, dando cuenta de un cambio respecto de la NE inicial.
90
Así es posible por medio de la misma forma obtener las NE marcadas radioactivamente,
dando cuenta de una señal equivalente a una marca por NE cercana a un 0,8 ± 0,3% de las
18
posibles interacciones teóricas, lo que corresponde a un valor de 27 átomos de F por NpO
marcados. El rendimiento del radiomarcaje fue corregido y calculado durante todo el
proceso desde el contenido del [18F]-SFB puro que se agregó a la reacción.
1,8
NE-‐CK/CLPFFD
NE-‐CK/CLPFFD*SFB

1,2
Absorbancia (u.a.)

0,6

0,0
400 500 600 700 800
λ(nm)

Figura 32. A) Espectro de absorción de conjugados de NE-CK/CLPFFD (proporción 4:1) antes y después
de la unión a N-succinimidil-4-fluorobenzoato (SFB).

A partir de la información obtenida por medio de las diferentes técnicas empleadas en este
capítulo es posible dar cuenta que las NpO obtenidas, en presencia de péptidos tiolados,
interactúan funcionalizándose debido la unión muy favorable oro-tiol, descrita hoy en día
como una clásica vía de funcionalización de NpO.[147] Así estas NpO probablemente
funcionalizadas, pueden ser empleadas en los experimentos siguientes.[29, 34, 50, 158]
91
Evaluar la estabilidad de NP funcionalizadas en presencia de plasma.
6.4.1 Estudio de estabilidad de NpO.
Se evaluó la estabilidad de diferentes NpO obtenidas en tampón PBS 10mM y en medio
de cultivo celular DMEM suplementado con suero fetal bovino (Figura 33). Para evaluar la
estabilidad se midió la absorbancia de la banda plasmónica de las muestras incubadas por
diferentes tiempos observándose que no hay variaciones que puedan correlacionarse con
perdida de la estabilidad dando origen dando origen a agregados que produzcan efectos
sobre la intensidad de la banda plasmónica.
Estabilidad de NpO en PBS 10mM Estabilidad de NpO en DMEM+10%SFB
NE
NE NE-‐CLPFFD
800 800
NE-‐CLPFFD NE-‐CALNNLPFFD
NE-‐CALNNLPFFD
NE-‐CpegLPFFD
NE-‐CpegLPFFD
NE-‐CALNN
NE-‐CALNN
NE-‐Cpeh NE-‐Cpeg
NE-‐THRCLPFFD NE-‐THRCLPFFD
700 NV-‐CTAB 700 NV-‐CTAB
NV-‐CLPFFD NV-‐CLPFFD
λ(nm)
λ(nm)

600
600
500
0 5 10 15 20 25 500
0 5 10 15 20 25
Tiempo (h) (h)
Tiempo

Figura 33. Estabilidad de NpO en PBS y medio de cultivo celular DMEM suplementado con 10% de
suero fetal bovino (SFB), seguimiento por espectrofotometría UV-Vis. Se grafica la absorbancia a la
longitud de onda en nm de la banda plasmónica en función del tiempo de incubación.
En la Figura 34.A se aprecian los resultados obtenidos para la estabilidad de las
nanopartículas en plasma humano evaluado por espectrofotometría UV-vis. En los
espectros presentados en la Figura 34.B se aprecia un perfil de absorbancia característico
de cada NpO, pero sin embargo, al comparar estos espectros con los de la misma muestra,
92
sin incubarse en plasma, se aprecia que hay un leve corrimiento de la banda RPS (Figura
34.B), corrimiento que se aprecia desde que se comienza el estudio y se mantiene
constante. Estos desplazamientos batocrómicos podrían atribuirse al recubrimiento de las

B" 1,6 NE 1,6 NE0CLPFFD 1,6
NE;CALNNLPFFD
NE# NE$CLPFFD# NE$CALNNLPFFD#

partículas por proteínas del plasma.[61]
!Control!sin!plasma !Control!sin!plasma
!Control!sin!plasma
!Incubado!con!plasma!t0h !Incubado!con!plasma!t0h
Absorbancia#(u.a.)#
!Incubado!con!plasma!t0h
Absorbancia#(u.a.)#
Absorbancia#(u.a.)#
!Incubado!con!plasma!t24h !Incubado!con!plasma!t24h # !Incubado!con!plasma!t24h
1,2 1,2 1,2
Absorbancia6(u.a)
B"
Absorbancia6(u.a)
Absorbancia>(u.a)
A" B"
B" 0,8
B"
En7plasma724h
0,8 0,8
!
! A" 1,6 1,6 NE
1,2
NE 1,6 1,6
!NV<CLPFFD7
!NV<CTAB NE0CLPFFD NE0CLPFFD 1,6 1,6
NE;CALNNLPFFD
NE;CALNNLPFFD
NE# NE# NE$CLPFFD#

NE$CLPFFD# NE$CALNNLPFFD#
NE$CALNNLPFFD#
!Control!sin!plasma !Control!sin!plasma !Control!sin!plasma
!Control!sin!plasma
0,4 0,4 0,4 !Control!sin!plasma
!Control!sin!plasma
!Incubado!con!plasma!t0h !Incubado!con!plasma!t0h !Incubado!con!plasma!t0h
Absorbancia#(u.a.)#
Absorbancia#(u.a.)#
Absorbancia#(u.a.)#
Absorbancia#(u.a.)#
!Incubado!con!plasma!t24h !Incubado!con!plasma!t24h
!NE #
Absorbancia#(u.a.)#
Absorbancia#(u.a.)#
!Incubado!con!plasma!t24h !Incubado!con!plasma!t24h # !Incubado!con!plasma!t24h
1,2 1,2 1,2 !Incubado!con!plasma!t24h
1,2 1,2 1,2
!NE$CLPFFD
!
Absorbancia6(u.a)
0,8
Absorbancia6(u.a)
800
Absorbancia6(u.a)
Absorbancia>(u.a)
En7plasma724h
Absorbancia7(u.a)
0,0 0,0 0,0
!NE$CALNNLPFFD
Absorbancia6(u.a)
Absorbancia>(u.a)
400 500 600 700 800 400 500 600 700 800 400 500 600 700 800
!NV<CLPFFD7 1,6!NE$CpegLPFFD !
1,2 0,8
λ(nm)#
λ(nm)
En7plasma724h En6Plasma624h
0,8
λ(nm)#
λ(nm) 0,8
λ(nm)#
λ(nm)
!NE$CALNN
B"
!
!
!
!NV<CTAB0,8 0,8 0,8
A"
En7plasma724h
B"
!NV<CLPFFD7
!
1,2
!NE$Cpeg 6NE
!
!
A"
0,4 !NV<CLPFFD7 !NV<CTAB
1,2 6NE;CLPFFD
NE;CpegLPFFD
0,4!NE$THRCLPFFD
1,6 1,6 1,6
!NV<CTAB 0,4 0,4 NE;Cpeg
NE$CpegLPFFD# 6NE;CALNNLPFFD
NE$CALNN# NE$Cpeg#
!Control!sin!plasma
!NV$CTAB NE;CALNN
Absorbancia#(u.a.)#
!Incubado!con!plasma!t0h !Control!sin!plasma
!NE
0,4
1,2
0,4 6NE;CpegLPFFD 0,4
!Control!sin!plasma
Absorbancia#(u.a.)#
!NV$CLPFFD !Incubado!con!plasma!t24h
Absorbancia#(u.a.)#
700 6NE;CALNN
# #
!NE !NE$CLPFFD !Incubado!con!plasma!t24h
Absorbancia6(u.a)
0,8 1,2 1,2 1,2

800 En7plasma724h 0,0 6NE;Cpeg
Absorbancia7(u.a)
0,0 0,0
!NE$CALNNLPFFD 0,0
Absorbancia6(u.a)
0,8
Absorbancia6(u.a)
!NE$CLPFFD 400 500 600
400 700
500 600 800 700 400 800 500 900 600 700 800 400 500 600 700 800
Absorbancia7(u.a)
6NE;THRCLPFFD
Absorbancia6(u.a)
0,8
!NE$CpegLPFFD
800 En7plasma724h !NV<CLPFFD7 1,6 ! !
Absorbancia7(u.a)
1,2 !NE$CALNNLPFFD
0,0
700 λ(nm) λ(nm)# En6Plasma624h
0,0 λ(nm)
λ(nm)# λ(nm)
0,0
λ(nm)#
λ(nm)
λ(nm)
400 500 600 800 400 500 600 700 800

!NE$CALNN 400 500 600 700 800
!
!NV<CTAB 0,8 0,8 0,8

!NV<CLPFFD7 !NE$CpegLPFFD
1,6 !NE$Cpeg 0,8 ! 6NE
λ(nm)# En6Plasma624h λ(nm)# λ(nm)#
!
1,2 0,4 λ(nm) 1,6 λ(nm) λ(nm)
!NE$CALNN 6NE;CLPFFD En6Plasma624h
!
!NE$THRCLPFFD NE;CpegLPFFD
!
!NV<CTAB 1,6 1,6 1,6

NE;Cpeg
NE$CpegLPFFD# 6NE;CALNNLPFFD
NE$CALNN# NE$Cpeg#
!Control!sin!plasma
!NE$Cpeg !NV$CTAB 6NE 6NE NE;CALNN
Absorbancia#(u.a.)#
0,4 !Incubado!con!plasma!t0h 0,4 0,4 !Control!sin!plasma
0,4 6NE;CpegLPFFD 6NE;CLPFFD
600 1,2 6NE;CLPFFD !Incubado!con!plasma!t24h !Control!sin!plasma
Absorbancia#(u.a.)#
0,4 !NE$THRCLPFFD !NV$CLPFFD
1,6 NE;CpegLPFFD 1,6 6NE;CALNNLPFFD 1,6
Absorbancia#(u.a.)#
700 6NE;CALNN
# #
!Incubado!con!plasma!t0h NE;Cpeg
NE$CpegLPFFD# NE$CALNN# NE$Cpeg#

6NE;CpegLPFFD !Incubado!con!plasma!t24h
6NE;CALNNLPFFD
!Control!sin!plasma
1,2
Absorbancia6(u.a)
1,2 1,2 1,2

!NV$CTAB 0,4 6NE;Cpeg 6NE;CALNNNE;CALNN !Incubado!con!plasma!t24h
Absorbancia#(u.a.)#
0,0 !Control!sin!plasma
Absorbancia6(u.a)
0,8
Absorbancia6(u.a)
Absorbancia6(u.a)
1,2 400 500 6NE;CpegLPFFD

600 700 800 900 6NE;Cpeg!Control!sin!plasma
Absorbancia#(u.a.)#
Absorbancia7(u.a)
6NE;THRCLPFFD
Absorbancia6(u.a)
!NV$CLPFFD 0,0
!Incubado!con!plasma!t24h 6NE;THRCLPFFD
0,0 0,0
700 6NE;CALNN Absorbancia#(u.a.)# # #

!
400λ(nm) 500 600 700 400
800 !Incubado!con!plasma!t0h 500 600 700 800 400 500 600 700 800
λ(nm)
Absorbancia6(u.a)
1,2 1,2 !Incubado!con!plasma!t24h ! 1,2

0,0 0,8 6NE;Cpeg 0,8 0,8
Absorbancia6(u.a)
0,8 0,8
Absorbancia6(u.a)
λ(nm) λ(nm)
0,8 400 500 600 700 800 900 λ(nm)#
λ(nm)
λ(nm)# λ(nm)#
!
6NE;THRCLPFFD
Absorbancia6(u.a)
1,6 En6Plasma624h NV<CLPFFD

!
!
0,0 0,0
400
λ(nm)
5001,6 600 # NE;THRCLPFFD
700 800
# !Control!sin!plasma
500
400 500 600 700 800 0,8 900
6NE 1,2 1,2 NV<CTAB
NE$THRLPFFD#
0,8 0,8
NV$CLPFFD# NV$CTAB#
0,4 6NE;CLPFFD!Control!sin!plasma
0,4 !Incubado!con!plasma!t0h 0,4
600 0 5 10 0,8 15 20 25
##
0,4 !control!sin!plasma
0,4
!
! λ(nm) 6NE;CALNNLPFFD !Incubado!con!plasma!t24h
λ(nm) 1,6 6NE;CpegLPFFD
Absorbancia#(u.a.)#
1,2 En6Plasma624h !Incubado!con!plasma!t24h
0,4
Tiempo1(h)
Absorbancia#(u.a.)#
Absorbancia#(u.a.)#
6NE;CALNN
Absorbancia6(u.a)
1,2 6NE 6NE;Cpeg

0,0 0,0 0,0
Absorbancia7(u.a)
0,4 6NE;THRCLPFFD
0,4 0,4
Absorbancia6(u.a)
6NE;CLPFFD 400 500 0,8 600 700 800 400 500 0,8 600 700 800
600
0,0
!
400 500 600 700 800
Absorbancia7(u.a)
0,4 400 6NE;CALNNLPFFD
500 600 700 800
!
0,8 6NE;CpegLPFFD λ(nm) λ(nm)
0,4
1,2
λ(nm)#
λ(nm)
0,8 6NE;CALNN
λ(nm)
λ(nm)# λ(nm)#
Absorbancia6(u.a)
6NE;Cpeg NV<CLPFFD
!
!
0,0 NV@CTAB
0,0
0,0
400 5001,6NV@CLPFFD 600 700 # NE;THRCLPFFD
6NE;THRCLPFFD
700
0,0
800
#NE !Control!sin!plasma
0,0
500 NV<CTAB800
C" 10λ(nm)
400 1,2500 600 700 800 400 1,2 500 600 700
!
400 500 600 700 800 900 400 500 600 800
NE$THRLPFFD#
1,5 1,5 1,5
NV$CLPFFD# NV$CTAB#
!Control!sin!plasma 0,4
!Incubado!con!plasma!t0h 0,4
0 5 15 20
4En4plasma424h 25
##
0,4(En(plasma(24h !control!sin!plasma
!Incubado!con!plasma!t0h 3En3plasma324h!
λ(nm) λ(nm)
0,4 !Incubado!con!plasma!t24h
! 4Sin4plasma 0,8 (Sin(plasma λ(nm) λ(nm)
λ(nm)#
λ(nm)# λ(nm)#
Absorbancia#(u.a.)#
!Incubado!con!plasma!t24h 3Sin3plasma
Tiempo1(h)
Absorbancia#(u.a.)#
Absorbancia#(u.a.)#
1,2 NV<CLPFFD
0,0
# 800
Absorbancia7(u.a)
0,0
Absorbancia6(u.a)
NE;THRCLPFFD
Absorbancia((u.a)
!
0,0 #
!
!Control!sin!plasma
Absorbancia3(u.a)
500 400 5001,6 600 700 800 0,8 0,8

Absorbancia7(u.a)
1,0 1,0 0,01,0 NV<CTAB

Absorbancia4(u.a)
400 500 600 700 800 900 400 500 600 700 1,2 0,0 1,2 0,0
NE$THRLPFFD# NV$CLPFFD# NV$CTAB#

!Control!sin!plasma 400 !Incubado!con!plasma!t0h
##
500 600 700 800 400 500 600 700 800 900 400 500 600 700 800 900
0 5 10 15 20 25 0,4
λ(nm)0,8 !Incubado!con!plasma!t0h λ(nm) ! !Incubado!con!plasma!t24h !
!control!sin!plasma
!
λ(nm)
!
λ(nm) λ(nm)#
λ(nm)
λ(nm)#
λ(nm)#
Absorbancia#(u.a.)#
!Incubado!con!plasma!t24h λ(nm)
!
!
Tiempo1(h)
!
Absorbancia#(u.a.)#
Absorbancia#(u.a.)#
NV@CTAB NV@CLPFFD NE
C" ! !
1,2
1,5 0,5 1,5 0,5 1,5 0,5 0,4 0,4
Absorbancia7(u.a)
4En4plasma424h (En(plasma(24h
Absorbancia6(u.a)
0,0 3En3plasma324h
!
0,8 0,8
Absorbancia7(u.a)
0,4
4Sin4plasma (Sin(plasma
400 500 600 700 800
3Sin3plasma
λ(nm)
0,8
!
Absorbancia((u.a)
!
Absorbancia3(u.a)
1,0 1,0 0,01,0

Absorbancia4(u.a)
!
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
NV@CTAB 600 650 700 750 800 NV@CLPFFD700
850 750 800 850400 900500 600450
NE
700 500 800 550 400 500 600 600 700 800 900 400 500 600 700 800 900
1,5
C" 4En4plasma424h
1,5
λ(nm) (En(plasma(24h
0,4
1,5 !
λ(nm)
λ(nm)#
!
3En3plasma324h
λ(nm)
0,4
λ(nm) ! !
λ(nm)
λ(nm)#
0,4 λ!(nm)
λ(nm)#
!
4Sin4plasma (Sin(plasma 3Sin3plasma

0,5
NE=CALNNLPFFD
0,5
!NE=CpegLPFFD
NE=CLPFFD ! 0,5
1,5 1,5
Absorbancia((u.a)
Figura 34. Estabilidad de NpO en plasma humano, ! seguimiento por espectrofotometría Uv-Vis. A)
0En0plasma024h 0En0plasma024h 0En0plasma024h
Absorbancia3(u.a)
1,0 1,5 1,0 0,01,0 0,0 0,0

0Sin0plasma 400 500 0Sin0plasma
600 700 800 400 500 0Sin0plasma
600 700 800 900 400 500 600 700 800 900
0,0
600 650 700 750 800 850 λ(nm)#
0,0
700 ! λ(nm)# ! 750λ(nm)# 800 850 900
0,0 !
450λ(nm) 500 550 600
!
λ(nm) λ!(nm)
Absorbancia0(u.a)
Absorbancia0(u.a)
Absorbancia0(u.a)
Máximo de absorbancia vs tiempo para cada λ(nm) NpO evaluada; B) perfil de absorbancia de las NpO en
!
!1,0 1,0
1,0
λ(nm) λ(nm)
0,5 0,5
! 0,5
presencia
NE=CLPFFD
de plasma humano, comparación de los NE=CpegLPFFD
NE=CALNNLPFFD
máximos de! absorbancia de cada muestra incubada
0,5 1,5 0,5 1,5 0,5
0En0plasma024h 0En0plasma024h 0En0plasma024h
1,5
! el máximo
0Sin0plasma 0Sin0plasma 0Sin0plasma
0,0 0,0 0,0
600 650 700 750 800 850 700con y sin plasma humano. Se aprecia un cambio en
750
!
! 800 de absorbancia en cada muestra 850 900 450 500 550 600
Absorbancia0(u.a)
Absorbancia0(u.a)
Absorbancia0(u.a)
λ(nm) 0,0 λ(nm) 1,0 0,0 1,0 λ(nm) 0,0

1,0 450 500 550 600 450 500 550 600 450 500 550 600
estudiada.
λ(nm) En negro NpO sin λincubar
!
(nm) en plasma, en azul
λ(nm) incubado a tiempo 0 y en rojo incubado a 24
!
! !
NE=CLPFFD NE=CALNNLPFFD NE=CpegLPFFD

1,5 0,5 1,5 0,5
horas.
0,5 0En0plasma024h 0En0plasma024h 0En0plasma024h
1,5 NE=THRCLPFFD
NE=CALNN NE=Cpeg 1,5
0Sin0plasma 0Sin0plasma
1,5 0Sin0plasma 0En0plasma024h
0En0plasma024h 0En0plasma024h
!
1,5 0Sin0plasma
0,0 0,0 0,0
Absorbancia0(u.a)
Absorbancia0(u.a)
450 500 1,0 550 600 450 500 550 1,0 600 450 500 550 600
Absorbancia0(u.a)
1,0 1,0
Absorbancia0(u.a)
Absorbancia0(u.a)
! ! !
λ(nm) λ(nm)
1,0 λ(nm)
1,0
Con el fin de determinar si el corrimiento del plasmón superficial podría atribuirse a un NE=THRCLPFFD
0,5 0,5 NE=CALNN NE=Cpeg
0,5 1,5 0,5
0,5 1,5 0,5 0En0plasma024h
1,5 0Sin0plasma
crecimiento de la partículas por la formación de la CP se evaluó el efecto por DLS (Tabla 6).
Absorbancia0(u.a)
1,0 0,0
Absorbancia0(u.a)
Absorbancia0(u.a)
0,0 0,0 0,0 1,0 0,0 0,0 450 500 550 600
450 500 1,0
550 600 450 450 500 500 550 550 600 600
450 500450 550 500 600 550 600
!
! ! ! ! ! λ(nm)
λ(nm) λ(nm) λ(nm) λ(nm) λ(nm)
0,5 A partir de estos datos se aprecia un crecimiento del diámetro hidrodinámico considerable 0,5
0,5
NE=THRCLPFFD
NE=CALNN NE=Cpeg 1,5
1,5 0En0plasma024h
1,5 0,0 0Sin0plasma
0,0 0Sin0plasma 0,0 0Sin0plasma
en todas las NpO. Este cambio podría ser causado por un efecto de agregación de
450 500 550 600
450 500 550 600 450 500 550 600 !
! ! λ(nm)
λ(nm) λ(nm)
Absorbancia0(u.a)
1,0
Absorbancia0(u.a)
1,0
1,0
nanopartículas, o por alteración de la superficie producida por ejemplo par la formación de

0,5
0,5
0,5
0,0 la CP.[125, 0,0

159, 160]
Para determinar si se trata de agregación de nanopartículas o de la 0,0
450 500 550 600
450 500 550 600 450 500 550 600 !
! ! λ(nm)
λ(nm) λ(nm)
93
formación de la CP. Se estudió la morfología de las nanopartículas por TEM realizándose
una tinción negativa lo que permite visualizar la presencia de la CP (Figura 35). Las
partículas aparentemente mantienen su morfología y al ser observadas empleando tinción
negativa con acetato de uranilo se detecta la presencia de un halo que podría ser atribuible
a la presencia de la CP sobre las NpO.[160]
Tabla 6: Evaluación de la formación de la CP por cambios en los valores de del diámetro hidrodinámico
de las NpO.
DLS DLS Incubado en plasma
(nm (Pdi)) 24h (nm (Pdi))
NE 18,8 (0,151) 41,25 (0,466)
NE-‐CLPFFD 21,75 (0,341) 57,57 (0,523)
NE-‐CALNNLPFFD 21,52 (0,271) 58,72 (0,475)
NE-‐CpegLPFFD 20,24 (0,259) 59,51 (0,487)
NE-‐CALNN 22,09 (0,282) 53,91 (0,614)
NE-‐Cpeg 21,09 (0,264) 51,05 (0,489)

NE-‐THRCLPFFD 44,62 (0,293 110,26 (0,559)

NV-‐CTAB 56,59 (0,330) 108,9 (0,823)

NV-‐CLPFFD 45,56 (0,359) 80,63 (0,981)

* En cada caso los datos fueron obtenidos a partir de 3 lotes de NpO independientes. Se entrega el valor
dado por triplicado para cada lote, con un ajuste matemático entre los lotes para luego obtener el valor de
la tabla junto al índice de Polidispersidad (PDI) dado para el total de las muestras.

6.4.2 Formación de la CP.
Para corroborar que la naturaleza del recubrimiento de las nanopartículas incubadas con
plasma es proteica, se realizó un tratamiento desnaturalizante al pellet resultante luego de
realizada la incubación y el posterior lavado con PBS para separar las proteínas que se
encontraban formando la denominada CP.
94
NE# ###NE$CLPFFD# ###NE$CALNNLPFFD#
###NE$CpegLPFFD# ###NE$CALNN# ###NE$Cpeg#
###NE$THRCLPFFD# NV$CTAB# NV$CLPFFD#
Figura 35. Imágenes obtenidas por TEM luego de la incubación de las NpO-péptido con plasma. Luego
de una incubación por 24h a 37ºC, la escala equivale a 200nm en NE y 500nm en NV.
Al realizar la posterior cuantificación de proteínas se apreció una cantidad muy similar de
proteínas adheridas para todas las nanopartículas (Tabla 7). No obstante es interesante
destacar que el conjugado NE-THRCLPFFD así como NV-CLPFFD y NV-CTAB
interacciona con una mayor cantidad de proteínas, posiblemente debido a la naturaleza del
péptido en el caso de THRCLPFFD que tiene una forma de “Y” con lo cual tendría una
mayor interacción y al mayor tamaño en el caso de las NV. Para caracterizar el perfil
proteico correspondiente a las proteínas presentes en la CP las mismas se cargaron en un
gel en 1D SDS-Page (Anexo Figura A10). Para el caso de NE-CLPFFD; NE-CALNNLPFFD
y NE-CpegLPFFD se observaron patrones similares, posiblemente debido a que exponen
95
una región similar del péptido LPFFD. Sin embargo, dada la gran complejidad que presenta
este tipo de muestras, las posibles diferencias sutiles detectadas son solo predictivas y
requieren de ensayos mas selectivos como los que se discutirán en el desarrollo del
objetivo específico 7, entre las diferencia sutiles es posible decir que las NE aparentemente
no se comportan de igual manera determinándose una sutil mayor diversidad de proteínas
que se adhieren a la superficie, posiblemente debido a que las mismas son mas reactivas
que las nanopartículas funcionalizadas con péptido. Por otra parte, NE-CALNN y NE-Cpeg
se comportan de una manera algo diferente, pero también adhieren proteínas.
Tabla 7: Cuantificación de proteínas obtenidas de las NpO-conjugadas luego de ser incubadas por 24h,
datos ajustado de acuerdo a la concentración en nmol de NpO.

Concentración Concentración
μg de proteína/uL (±SD) μg de proteina/nmol de NpO (±SD)
NE 0,68 (±0,115) 34 (±5,7)
NE-‐CLPFFD 0,84 (±0,246) 42 (±12,3)
NE-‐CALNNLPFFD 0,99 (±0,105) 49,5 (±5,25)

NE-‐CpegLPFFD 0,78 (±0,219) 39 (±10,95)

NE-‐CALNN 0,67 (±0,078) 33,5 (±3,9)

NE-‐Cpeg 0,83 (±0,197) 41,5 (±9,85)

NE-‐THRCLPFFD 1,32 (±0,214) 66 (±10,7)

NV-‐CTAB 0,54 (±0,307) 108 (±23,35)

NV-‐CLPFFD 0,72 (±0,234) 144 (±15,35)
* En cada caso los datos fueron obtenidos a partir de 3 lotes de NpO independientes. Resultados
corresponden al promedio de cada lote evaluado, junto a la desviación estándar (±SD) en cada caso.
96
Evaluar toxicidad de los conjugados NpO-péptido en líneas celulares SH-SY5Y de NM
incubados y sin incubar en plasma.
6.5.1. Efectos de las NpO sobre la viabilidad celular.
Para emplear NM in vivo, es necesario evaluar en primer lugar los posibles efectos sobre
la viabilidad in vitro. En la Figura 36 se muestran los resultados obtenidos en los ensayos
de MTS realizados luego de incubar NE con células de neuroblastoma SH-SY5Y. Tal como
puede apreciarse no se observan efectos significativos en los rangos de concentraciones de
nanopartículas probadas.
En el caso de las NV, se ha descrito que la presencia de CTAB, es un factor
determinante que puede inducir toxicidad. Para eliminar la mayor cantidad posible de CTAB
del medio se realizó una centrifugación y reconstitución del pellet en diferentes soluciones:
CTAB a una baja concentración (2,5mM), plasma y DMEM. Es importante destacar que en
las NV-CTAB no se puede eliminar completamente el CTAB debido a la inestabilidad
coloidal que da origen a la agregación de las nanopartículas.
En la Figura 37 se observan los resultados de toxicidad evaluados en cada NV luego de
realizar centrifugaciones y resuspensiones en los diferentes medios. Lo mismo se realizó
con el conjugado NV-CLPFFD. Al analizar el perfil de viabilidad se aprecia que las NV-
CLPFFD producen un efecto menor sobre la viabilidad celular en comparación con lo
observado para NV-CTAB. Posiblemente esto se deba a que las NV-CTAB de por sí llevan
una mayor cantidad de CTAB. C. Adura y cols., reportaron que al cuantificar los niveles de
CTAB remanente luego de una primera centrifugación, en las muestras NV-CTAB el CTAB
cuantificado corresponde a 0,5mM y en las NV-CLPFFD corresponde a 50µM,[29] por lo cual
la mayor toxicidad de las primeras respecto de las últimas puede ser atribuida al CTAB
97
remanente, que se liberaría tras reconstituir estas en medio de cultivo, lo cual previamente
Ensayo
también ha sido reportado por Alkilany de [29,
y cols. MTS 161]
150
Control +
125 Control -‐
NE
% Viabilidad NE-‐CLPFFD
100 NE-‐CALNLPFFD
NE-‐CpegLPFFD
NE-‐CALNN
NE-‐Cpeg
75 NE-‐THRCLPFFD
50
25
0
+ -‐ 5 2,5 1
Concentración nM
Figura 36. Ensayo de viabilidad en células SH-SY5Y tratadas con NE, se realizó un análisis de varianza
ANOVA-tukey, al comparar el control positivo(C+) y los diferentes ensayos empleando NE, se aprecia
que no hay diferencias significativas. Los resultados fueron expresados en porcentaje de viabilidad
respecto al control, representados como el promedio junto a su desviación estándar de 3 experimentos
independientes de 6 repeticiones (n=18). Se compararon contra las células no tratadas.
La CP se ha descrito que también influye sobre la toxicidad de los NM aumentando o
disminuyendo los efectos.[117] Para estudiar el posible efecto de la mencionada corona se
incubaron las NV en plasma humano, y DMEM+10%SFB, luego se centrifugaron y se
resuspendieron en medio DMEM (Figura 37). Al existir proteínas en el medio fue posible
realizar dos centrifugaciones sucesivas ya que la CP estabiliza las nanopartículas
permitiendo así la eliminación de mayores cantidades de CTAB. Empleando una doble
centrifugación, se pudo disminuir el efecto sobre la viabilidad de las NV siendo mas notorio
el efecto en aquellas NV-CLPFFD (como se observa en la Figura 37). Si bien aquellas NV-
CTAB presentan aun toxicidad, que posiblemente se atribuya a la liberación de CTAB, es
bastante menor a la observada empleando una sola centrifugación (Figura 37). La
formación de una CP aumenta la estabilidad de las NV permitiendo realizar una mayor
cantidad de centrifugaciones, reduciéndose los niveles de CTAB y concomitantemente la
toxicidad.[29]
98
NV#CTAB
NV#CTAB 1º*centrifugación ********NV#CLPFFD 1º*centrifugación
1º*centrifugación
1º*centrifugación ********NV#CLPFFD
NV#CTAB
120
1º*centrifugación
2º*centrifugación
2º*centrifugación 2º*centrifugación
2º*centrifugación
120 2º*centrifugación
120 120120
100
100
100 100100
***
%)Viabilidad
80
***
%)Viabilidad
80
***
%"Viabilidad
%)Viabilidad
%)Viabilidad
80 80 80
*** ******
*** ***
60
60
60 *** *** 60 60
40
40
*** ******
40 40 40
20
20
20 ***
*** *** 20 20
0 ***
0 *** ***
0 0 0
E E M MM
M
CT CTC M MEM
+
as asla M M M
C# C# C
C+ C+C
Pl Pl P 5 µ5 µ5 µ
*2 *2B*2 EMEMME
DMDMD MEMEME
EMEME
M MM
E E M
*2 *2B*2
CT MEM
MM
MM
AB 25 µ /DMEM
C+
AB ATBA DMD/MD
C#
Pl sm 25 µM
CT AB* M
EM
D D/D
/D /D/D
DMDMD
CT M M/ EM
*2 M EM
C+
DM #
as a/ M
C
Pl AB*25 µ
D E
/D E
DM a/DME
CT CTC M/ ME/M
a/ a/a
M MM
AB ATBA
M DM
m msm
5 µ5 µ5 µ
EM D
m D
M
5µ /
E
a
D
CT B*
A
Muestra
Muestra
Muestra Muestra
Figura 37: Ensayo de viabilidad en células SH-SY5Y tratadas con NV, Los resultados fueron expresados
en porcentaje respecto del control de vida (+), representados como el promedio junto a su desviación
estándar de 3 experimentos independientes de 6 repeticiones (n=18). Se compararon contra las células
no tratadas. Se realizó un análisis de varianza ANOVA-Tukey (*** P < 0.001). SDS se empleó como C-, y
DMEM como C+. En el eje x, DMEM y CTAB 25µM se refieren a las muestra centrifugada y redisuelta en
dichos medios; por su parte Plasma/DMEM, DMEM/DMEM y CTAB 25µM/DMEM, se refiere a las
muestras que pasaron por una segunda centrifugación. Luego de la primera centrifugación se incuban en
plasma, DMEM o CTAB 25µM, respectivamente, y luego de la segunda centrifugación se redisuelve en
DMEM.
Evaluar efectos sobre la estructura y actividad de proteínas (albúmina y Aβ) debidos a la
interacción de NpO-péptido.
6.6.1 Estudio de interacción de NpO con proteínas, efectos sobre la agregación de
Aβ.
Para evaluar el efecto de las NpO sobre el crecimiento de las fibras amiloides se realizó
el ensayo de fluorescencia de tioflavina (Th-T) que es un compuesto que se une a las fibras
incrementando la señal de fluorescencia. Así en la Figura 38 se representa la señal de
intensidad de fluorescencia de Th-T debido a la formación de fibras amiloides.
99
Al evaluar los resultados se observa una tendencia de las NE y NE-CLPFFD de inducir
un mayor crecimiento de las fibras, posiblemente debido a la capacidad que tienen las
superficies de las NpO para aumentar el crecimiento de las fibras favoreciendo las
interacciones de las mismas. Por el contrario, las NE-THRCLPFFD generan una tendencia
a un crecimiento menor, posiblemente esto se deba a la presencia de la secuencia THR, la
cual en su estructura presenta una gran cantidad de Pro (P), lo que podría afectar a la
estructura secundaria y reducir el crecimiento de las fibras. Para el caso de las NV-
CLPFFD, posiblemente
!
la disminución en el crecimiento de las fibras se deba a la presencia
de CTAB, similar a lo observado por C. Adura en su tesis doctoral.[39] Aun cuando en el

12000
caso de las NE-CLPFFD exista una tendencia a un mayor crecimiento de fibras, al efectuar
se destruyen las fibras y estas no vuelven a crecer.[33]

la irradiación de este sistema,10000
!Citrato!de!sodio
!CTAB
8000 !NE
!NE0CLPFFD
!NE0THRCLPFFD
!NV0CLPFFD
6000
!
Fluorescencia4(u.a)
4000
2000
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo4(h) !
Figura 38: Intensidad de Fluorescencia de Tioflavina-T para el seguimiento del crecimiento de fibras de
!
Aβ en 24h incubadas con NpO. Resultado mostrado como el promedio y graficado según su desviación
estándar. (n=3)
Este hecho da cuenta que las NpO si pueden interferir con propiedades de agregación
de las proteínas y sus reconocimiento,[108, 162] en este caso con Aβ.[163] existe una serie de
100
evidencias que NP pueden acelerar procesos de formación de fibras al favorecer el proceso
de nucleación y en contraparte se ha descrito que modificando la superficie de estas es
posible disminuir la formación de fibras de algún tipo de proteínas.[104]
Para evaluar la formación de las fibras, se tomó una serie de micrografías por TEM,
como se aprecia en la Figura 39, lo que da cuenta de la formación de las fibras al cabo de
24 horas.
Considerando los posibles efectos de las NpO sobre otras proteínas se han realizado
algunos ensayos sobre el efecto en la albúmina, proteína mayoritaria del plasma. Se tiene
referencia que las NpO al interaccionar con proteínas del plasma pueden modificar su
actividad, como es el caso de la quimiotripsina que aumenta su actividad enzimática.[108, 125]

Control'Aβ'
Control Aβ" Aβ'+'NE'
Aβ+ ΝΕ" Aβ'+'NE-CLPFFD'
Aβ+ NE*CLPFFD/

200nm 200nm 200nm
Aβ'+'NE-CALNNLPFFD'
Aβ+ NE*CALNNLPFFD/ Aβ'+'NE-CpegLPFFD'
Aβ+ NE*CALNNLPFFD/ Aβ'+'NE-CALNN'
Aβ+ NE*CALNN/

ACS Applied Materials & Interfaces Research Article
200nm 200nm 200nm
Aβ'+'NE-Cpeg'
Aβ+ NE*Cpeg/ Aβ'+'NE-THRCLPFFD'
Aβ+ NE*THRCLPFFD/ Aβ'+'NV-CLPFFD'
Aβ+ NV*CLPFFD/
200nm 200nm 500nm
Figura 39: Imágenes obtenidas por microscopía electrónica de transmisión luego de la incubación de las
NpO (4nM de NE y 1nM de NV) junto con Aβ (12,5µM), también se muestra una imagen solo de Aβ,
correspondiente al control. La escala equivale a 200nm en NE y 500nm en NV.
Figure 5. TEM image of Aβ fibrils and GNR-CLPFFD (A) and GNR-CTAB (B) that were incubated for 5 days. In panels A it is possible to see the
attachment of the nanorods to the amyloid fibrils.
101
Effects of Irradiation on the Amyloidogenic Process.
We prepared Aβ PIAA with high amyloidogenic capacity
according to Bieschke et al.35 The Aβ PIAA were incubated
with GNR-CLPFFD, forming the complex Aβ PIAA/GNR-
CLPFFD (Supporting Information, Figure S7), and a control
6.6.2 Efectos de las NpO sobre la estructura secundaria de la albúmina.
Para evaluar el efecto de las NpO sobre la albúmina se llevó a cabo un estudio de
dicroísmo circular de la albúmina incubada con NpO. Como se aprecia en la Tabla 8 y en la
Figura 40, existen ciertos cambios conformacionales en presencia de las NpO, lo cual indica
que hay una cierta interacción de BSA con las NpO, llevando a cambios conformacionales
de la proteína. Se observa que las NE y las NV no recubiertas con péptido disminuye el %
de α-hélice, indicando un posible efecto sobre las estructuras α-hélice. En relación a estos
realizados por Shang y cols., que dan cuenta que luego de conjugar BSA a NE (desnudas),
se aprecia una disminución del % de α-hélice y un aumento del % de lámina-β.[164] Así de
acuerdo a lo observado en los resultados evaluados para NE se estarían conjugando con
BSA, posiblemente por el único tiol libre presente en BSA en el residuo Cys34, presente en
una hendidura de 6Å, siendo este residuo el responsable de la agregación de BSA bajo
condiciones experimentales de estrés.[165] Para el caso de las NV-CTAB, que puede ser
funcionalizada, también se aprecia una disminución del % de α-hélice, pero no un aumento
del % de lámina-β. Posiblemente este tipo de NpO también esté funcionalizándose, pero
dada la presencia de CTAB un surfactante iónico que se ha descrito interacciona con BSA
por medio de interacciones electrostáticas y también en regiones hidrofóbicas presentes en
la superficie de BSA. Así la presencia de CTAB sobre las NV podría generar otro tipo de
modificaciones de BSA que interfiera en las observaciones, dificultando predecir una
posible funcionalización.[166]
Por su parte los datos obtenidos de la incubación con BSA con NE-CLPFFD y NV-
CLPFFD tienen poco efecto sobre las estructuras de tipo lámina-β y un marcado efecto
hacia las conformaciones α-hélice. Por su parte las NE-THRCLPFFD, aparentemente
aumentan las conformaciones de tipo lámina-β y α-hélice, lo que revelaría que
posiblemente el péptido afecta dichas estructuras. Posiblemente estas últimas interaccionen
102
mejor con BSA por la presencia del péptido THRCLPFFD. Sin embargo, es complejo dar
cuenta de esto, puesto que BSA es una proteína con múltiples dominios los cuales
mayoritariamente están conformados por estructuras tipo α-hélice, las cuales pueden
interactuar con diferentes estructuras moleculares. Es sabido que BSA interactúa con alta
afinidad con estructuras hidrofóbicas, y moléculas cargadas negativamente, por lo cual la
alteración en el % de α-hélice, puede dar cuenta de posibles interacciones a este nivel. Se
debe tener en cuenta también que dada la alta cantidad de Lys (K) expuestas en la
superficie de BSA (60 residuos), también pueden esperarse interacciones de tipo
electrostática con motivos cargados negativamente presentes en moléculas como las NE.
Si bien, posiblemente este tipo de interacciones no afecte las estructuras secundarias de
BSA, si puede favorecer al reconocimiento y luego favorecer la interacción con otras
moléculas en el plasma.[167]
Tabla 8: Estructura secundaria, (α-hélice, lámina-β y espiral al alzar (RC)), análisis para BSA en
ausencia y presencia de NpO. Obtenidos a partir del análisis de la elipticidad residual media por el
programa dichroweb
% α-‐hélice lámina-‐β % RC
BSA 55,4 (±1,1) 10,4(±1) 34,2(±1,2)

BSA+NE 50,6 (±2,4) 11,1 (±0,3) 38,3 (±2,1)
BSA+NE-‐CLPFFD 57,5 (±0,6) 7,4 (±2,7) 35,1 (±3,4)
BSA+NE-‐THRCLPFFD 56,9 (±0,7) 15,5 (±1,5) 27,6 (±1,8)
BSA+NV CTAB 52,1 (±0,2) 8,9 (±0,4) 39 (±1,3)
BSA+NV-‐CLPFFD 60,7 (±2,2) 6,4 (±2,8) 32,9 (±2,9)
* En cada caso los datos fueron obtenidos a partir de 3 lotes de NpO independientes.

103
BSA
8000 BSA+NE
BSA+NE-‐CLPFFD
BSA+NE-‐THRCLPFFD
Elipticidad Residual Media (deg cm dmol )

-‐1
BSA-‐NV-‐CTAB
4000
BSA-‐Nv-‐CLPFFD
2
0

-‐4000

-‐8000

-‐12000
200 205 210 215 220 225 230 235 240 245
λ(nm)

Figura 40: Elipticidad residual media de BSA en presencia de NpO.
Identificar las proteínas del plasma que interactúan con NpO-péptido (corona de
proteínas).
6.7.1 Identificación de las proteínas del plasma que se unen a los conjugados NpO-
péptido por electroforesis en 2-D y LC-MS/MS.
Se procedió a identificar que tipos de proteínas conforman la CP luego de la incubación
de las mismas con plasma humano. Luego de la incubación se separaron las proteínas
unidas a las NpO según se describe en el capítulo 2, y se procedió a su identificación, para
lo cual se realizaron geles de poliacrilamida bidimensionales. En la Figuras 51 y 52 se
muestran los geles en 2-D obtenidos a partir de las proteínas separadas para cada NpO
incubada con plasma. Dada la gran complejidad de las muestras, se empleó como
referencia desde la base de datos ExPASy, la información de proteómica que se tiene del
plasma humano, (Figura 41). Esto con el fin de pre identificar una serie de spots, para así
centrar el interés en ciertas proteínas que podrían estar relacionadas con el cruce a través
de la BHE y con la captación por el SFM. Seleccionado los spots, se extrajeron y se
104
analizaron por LC-MS/MS, a partir de lo cual se identificaron las proteínas (Tabla 9). Dada
la gran cantidad de proteínas en el plasma y la complejidad de los geles obtenidos, también
se realizó la identificación de proteínas totales a partir del crudo de proteínas obtenido
(Anexo Tabla A1).
Para complementar los datos se realizó una identificación de las proteínas totales a partir
del pull de proteínas unidas y posteriormente separadas desde la superficie de las NpO.
Como se esperaba se identificaron las proteínas ya detectadas por la identificación de las
manchas en los geles bidimensionales y se observaron muchas otras proteínas que
también están presentes en la CP, dando cuenta de la complejidad de la CP. En la Tabla
A1 del anexo se detallan la proteína totales identificadas de las CP de las muestras de
NpO.
Estos resultados pretenden servir a modo de observación general, a partir del cual es
necesario plantear la posibilidad de conseguir favorecer ciertas interacciones, y disminuir
otras para mejorar la entrega de las NpO, este principio es el que se aborda en la ultima
parte de esta tesis. Algunas observaciones generales luego de identificadas las proteínas
pueden destacarse de los geles obtenidos. Interesantemente, en que aquellas proteínas
mayoritarias del plasma (ver Figura 41, Tabla 9) están presentes en todas las muestras
tales como inmunoglobulinas, albúmina, fibrinógeno, proteínas del complemento entre
otras. Pero una observación no menor se relaciona con la albúmina, pues pese a que es la
proteína mayoritaria del plasma, no es la que se encuentra mas abundante en las muestras.
Es interesante destacar que gran numero de opsoninas (proteínas como Ig, proteínas del
complemento, fibrinógeno, etc) se unen indiscriminadamente a las NpO, dato que
posiblemente se relacione con lo observado in vivo para las NE, NE-CLPFFD y NE-
THRCLPFFD, en los cuales puede relacionarse con la acumulación mayoritaria observada
en órganos no deseados como hígado y bazo, tal como se demostró por nuestro grupo en
105
estudios previos in vivo,[4,5] (capítulo 5). Si bien existen diferencias en la funcionalización
entre las diferentes NE, al realizar su caracterización presentan ciertas similitudes, como
tamaño y pot-Z. No obstante, aunque cambia el recubrimiento las interacciones con las
denominadas opsoninas no son dependientes de la estructura de los péptidos que se
encuentran recubriendo las NpO. Asimismo, los cambios de forma y de carga tampoco
tienen una gran influencia en la interacción con las opsoninas.

Albumina'
Ferro'oxidasa'
Plasminógeno'
An:'plasminaJαJ2'
An:'tripsinaJαJ1'
Serotransferrina'
Factor'del'complemento'B'
An:'quimiotripsinaJαJ1'
Trans:re:na/prealbumina'
Haptoglobulina'

AngiotensinaJ1'
An:trombina'III'
Macro'globulinaJαJ1'
Micro'globulinaJαJ1'
Protrombina'
Fibrinógeno,'cadena'A,'B'y'G'respec:vam
Complemento'C1s,C3'y'C4'respec:vame
Albumina'
Glicoproteínas'(αJ1JB;'αJ1Jacida;'αJ2'rica
Cadenas'de'inmunoglobulina,'IgLC,'IgHC;
Ferro'oxidasa'

Apolipoproteínas'(ApoA1;'ApoA2;'ApoA4
'Clusterina'(ApoJ))'
Plasminógeno'
An:'plasminaJαJ2'
An:'tripsinaJαJ1'
Serotransferrina'
Trans:re:na/prealbumina'
Haptoglobulina'
Albumina' AngiotensinaJ1'
Ferro'oxidasa' An:trombina'III'
Plasminógeno'
Micro'globulinaJαJ1'
An:'plasminaJαJ2'
Protrombina'
An:'tripsinaJαJ1'
Fibrinógeno,'cadena'A,'B'y'G'respec:vamente'
Serotransferrina'
Complemento'C1s,C3'y'C4'respec:vamente'
Glicoproteínas'(αJ1JB;'αJ1Jacida;'αJ2'rica'en'leucina;'αJ2JHS)'
Cadenas'de'inmunoglobulina,'IgLC,'IgHC;'IgHA;IgSG;'IgSA'respec:vamente''
Trans:re:na/prealbumina' Apolipoproteínas'(ApoA1;'ApoA2;'ApoA4;'ApoC;'ApoD;'ApoE;'posible'Apo'(NA3);'
Haptoglobulina' 'Clusterina'(ApoJ))'
AngiotensinaJ1'
An:trombina'III'
Figura 41 : Gel Micro'globulinaJαJ1'
en 2-D de una muestra de plasma humano, obtenido a partir de la base de datos de
Protrombina'
Expasy http://swissmodel.expasy.org, se indican las proteínas presentes en el gel.
Fibrinógeno,'cadena'A,'B'y'G'respec:vamente'
Complemento'C1s,C3'y'C4'respec:vamente'
Glicoproteínas'(αJ1JB;'αJ1Jacida;'αJ2'rica'en'leucina;'αJ2JHS)'
Cadenas'de'inmunoglobulina,'IgLC,'IgHC;'IgHA;IgSG;'IgSA'respec:vamente''
106
Apolipoproteínas'(ApoA1;'ApoA2;'ApoA4;'ApoC;'ApoD;'ApoE;'posible'Apo'(NA3);'
'Clusterina'(ApoJ))'
NE# NE$CLPFFD# NE$THRCLPFFD#
NE$CALNN# NE$CALNNLPFFD# NV$CLPFFD#
NE$Cpeg# NE$CpegLPFFD#
Albumina' NV$CTAB#
Plasminógeno'
Serotransferrina'
Fibrinógeno.'
Albumina' Complemento'C3'y'C4'respecEvamente'
Plasminógeno' Cadenas'de'inmunoglobulina,'IgLC,'IgHC;''
Serotransferrina' Apolipoproteínas'(ApoA'ApoE;''
Fibrinógeno.'
Complemento'C3'y'C4'respecEvamente'
Cadenas'de'inmunoglobulina,'IgLC,'IgHC;''
Apolipoproteínas'(ApoA'ApoE;''
Figura 42 : Geles 2D de Separación de proteínas presentes en la CP de los conjugados NpO.

Comparativa de geles en 2D a partir de Np conjugadas por 24h. Se aprecia el patrón proteico según su
punto isoeléctrico y tamaño de las proteínas. Se representan algunas de las proteínas identificadas y
relacionadas con la distribución in vivo.

107
Tabla 9: Resumen de las proteínas mas relevantes en cada CP unida a los diferentes conjugado
identificadas desde los geles bidimensionales por medio de LC/MC/MC:
NE-‐CALNNLPFFD
NE-‐THRCLPFFD
NE-‐CpegLPFFD
NV-‐CLPFFD
NE-‐CLPFFD
NE-‐CALNN
NV-‐CTAB
NE-‐Cpeg
NE
inmunoglobulinas ** ** ** ** *** ** ** *** **
Fibrinógeno *** ** * * * * ** *** **
CO3 ** * * * * * *** * *
Albúmina * * * * * * *** * *
Serotransferrina *** * * ** * * *** ** *
Plasminógeno ** * * * * ** ** *** *
ApoE ** * * * * *** * ***
NA3(posible APO) * * * *
CO4 ** * ** ** ** * ** * **
ApoA4 ** ** * * ** ** *** * *
ApoA1 ** * * * ** ** ** ** **
Alfa-‐Globulinas ** ** ** * * * ** * *
(A2MG/A1G/A2AP/ANGT)
protrombina * * * * * **
Antitrombina III * ** * * * * *
Los valores *;**;*** solo son de carácter cualitativo y reflejan las cantidades relativas de dichas
proteínas en las muestras evaluadas según la intensidad de las bandas de los geles. 2D.
En la Figura 42 y en la Tabla 9, es posible apreciar ciertos patrones similares entre las
diferentes muestras, en donde se marcan algunas de las proteínas relacionadas con la
distribución a modo de comparación. Así al comparar los geles obtenidos de aquellas NE
con la secuencia CLPFFD (NE-CLPFFD; NE-CALNNLPFFD; NE-CpegLPFFD), se presenta
un patrón proteico que posee cierta similitud, mayor que la determinada por otras NpO.
Siguiendo con las observaciones generales de los geles la ausencia de CLPFFD (NE; NE-
CALNN; NE-Cpeh) produce cambios en los patrones proteicos de las CP de las NE. Así,
espaciadores CALNN y Cpeg (NE-CALNNLPFFD; NE-CpegLPFFD) aparentemente no son
determinantes en el patrón proteico en presencia de CLPFFD, pero si generan diferencias
108
al estar expuestos en ausencia de este péptido. Por otra parte para el caso de las NV-
CLPFFD se obtiene un patrón con una serie de similitudes respecto de NE-CLPFFD. Y
puede mencionarse que las muestras como NE; NE-CALNN; NE-Cpeg; NV-CTAB y NE-
THRCLPFFD que sin tener un factor común en superficie, tienden a unir otras proteínas y a
tener patrones de unión a proteínas diferenciales. Estas observaciones solo son
comparativas y no permiten determinar diferencias reales, dada la gran cantidad de
posibles isoformas que pueden tener las proteínas. Dado lo cual solo da cuenta de
parámetros a ser considerados para los estudios posteriores.
Las NE-THRCLPFFD, NV-CTAB y NV-CLPFFD a diferencia de los otros conjugados
unen una mayor cantidad de proteínas por nmol de NpO (capítulo 4). Entre las proteínas
mayoritarias observadas en el gel de NE-THRCLPFFD (Figura 42) y luego detectadas por
LC-MS/MS (Tabla 9) se encuentran la albúmina y las proteínas del complemento. Además
se observa una alta densidad de proteínas en la región de las apolipoproteínas
(Apolipoproteína A y E). Tanto la presencia de albúmina como de apolipoproteínas podrían
ser factores que favorezcan el paso a través de la BHE por transcitosis absortiva o mediada
por receptores, respectivamente. La albúmina podría estar promoviendo una transcitosis
absortiva y la ApoE podría promover el paso a través del receptor LRP1.[76-79, 105, 115, 120, 121]
La presencia de elevados niveles de proteínas de la CP sobre conjugados como NE-
THRCLPFFD y dada la gran cantidad de proteínas detectadas (objetivo 4), puede ejercer
efectos sobre el reconocimiento por los receptores para THR, ya que podría darse un
ocultamiento del péptido lanzadera por la mencionada corona. Al analizar en conjunto a los
resultados del último objetivo (objetivo 8), los resultados in vivo, se aprecia durante periodos
cortos de tiempo 0 a 1h que NE-THRCLPFFD logra aumentos notorios en los niveles
cerebrales respecto de NE-CLPFFD, sin embargo, a las 2 horas, no es tan considerable la
mejora respecto a los conjugados NE-CLPFFD. Posiblemente la llegada mas temprana del
109
primero al cerebro se deba a la interacción con los receptores de transferrina que favorecen
la transcitosis. Si bien NE-CLPFFD se unen en menor medida a albúmina y ApoE,
posiblemente este factor sea la causa mas relevante del paso a través de la BHE,
dejándose en segundo plano el cruce de la BHE por medio del receptor de Transferrina
para el caso de las NE-THRCLPFFD, que posiblemente esté restringido dada la gran
cantidad de proteínas que pueden estar conformando la CP. Por último se tiene que las NE
unen una menor cantidad aparente de albúmina respecto de otras proteínas, y
posiblemente esto sea causa de que se observen ciertos niveles de NE-citrato (desnudas)
en el cerebro.
Estudiar la biodistribución de NpO-péptido (NE-CLPFFD; NE-THRCLPFFD y NE)
6.8.1. Determinación de niveles de oro en cerebros de rata en función del tiempo
luego de la administración intraperitoneal (experimentos ex vivo).
Luego de inyectar las NE a una rata se determinaron los niveles de oro a diferentes
tiempos post administración en cerebro, resultados que se muestran en la Figura 43 y en la
Tabla 10.
De los resultados se pudo apreciar que los niveles de oro determinados en aquellas
ratas tratadas con NE-CLPFFD fueron mayores a los de las ratas tratadas con NE (sin
funcionalizar). A partir de los resultados observados se determinó que a las 2 horas post
inyección se detectaron los mayores niveles de oro observándose luego una disminución
de los mismos hasta llegar a los niveles basales luego de 24h post administración. Esto da
cuenta de una posible remoción de las NE desde el cerebro al menos durante las 24 horas
post inyección, disminuyendo así posibles efectos no deseados, en el sistema nervioso
central. Si bien los niveles de oro son muy bajos respecto de la DI (Tabla 10) se aprecia
110
que aquellas NE-CLPFFD, llegan en una mayor proporción respecto de las NE (sin
funcionalizar).[50]
*
*** ***
*** ***
Concentración de oro (mg Au 0 /g de tejido)

0.06 ***
Cerebro
Control
NE-CLPFFD
NE
0.04
*
**
0.02

0.00
0 1 2 4 24
Tiempo (h)
Figura 43. Perfil de acumulación en el tiempo de oro en cerebro de rata luego de una administración
intraperitoneal de NE y NE-CLPFFD. El experimento se realizó por cuadruplicado. *p<0,05; **p<0,001;
***p<0,0001.
6.8.2 Determinación y comparación relativa de los niveles de oro encontrados en
hígado, bazo y riñón respecto a los encontrados en cerebro.
La funcionalización de NE con CLPFFD conlleva a cambios en las interacciones con
biomoléculas respecto de las NE sin funcionalizar tal como se demostró tras realizar el
objetivo 7. Es por eso que se espera un efecto sobre la distribución diferencial entre NE-
CLPFFD y NE (sin funcionalizar) al igual que lo observado en cerebro. Para esto se
determinaron los niveles de oro en órganos como el hígado, el bazo y los riñones (Figura 44
y Tabla 10). Los elevados niveles de oro detectados en los órganos estudiados, indican
que las NE llegaron a la circulación y se distribuyeron en el organismo. Luego de 24 horas
las NE-CLPFFD se encontraron mayoritariamente a nivel de hígado y bazo (52% y 2%
respectivamente de las DI) y en un menor nivel en los riñones (0,2% de la DI). Los niveles
de NE fueron mas variables, encontrándose 29%, 0,7% y 0,1% en hígado, bazo y riñones,
respectivamente (Tabla 10). Asimismo, se determinó que el contenido de oro en cerebro
111
fue 10 veces menor al detectado en riñones. Luego de 24 horas los mayores niveles se
detectaron a nivel del hígado. Interesantemente el recubrimiento con CLPFFD disminuyó la
captación de NE a nivel del bazo durante las primeras 2 horas respecto a lo observado en
las NE estabilizadas con citrato.[50]
NE
A NE-‐CLPFFD B
100 100
Cerebro Cerebro
80 Hígado 80 Hígado
% Auº en tejidos
% Au en tejidos

Bazo Bazo
60 Riñón 60 Riñón
40 40
0
20 20
0 0
1h 2h 4h 24h 1h 2h 4h 24h
Control
Control
C D
*** **
*** ***
Concentración de oro ( µg Au /g de tejido)
**
*
* Riñón ***
0.8 **
**
Control Bazo
100 *** *
*** NE-‐CLPFFD ** Control
0
0.6 **
*** **
NE-‐CLPFFD
NE 80
0
*** *** NE
60
0.4
*** **
40
0.2
20
0.0 0
0 1 2 4 24 0 1 2 4 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

E F
***
** *
*** *** *** ***
Hígado
*** ***
40 ***
*** Control Cerebro
0.06 ***
*** Control
NE-‐CLPFFD
0
30 NE-‐CLPFFD
NE
0
**
0.04 NE
** **
20
* *
* **
** 0.02
10
0 0.00
0 1 2 4 24 0 1 2 4 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
Figura 44. Perfil de distribución de NE y NE-CLPFFD en bazo, hígado, riñón y cerebro luego de una
administración intraperitoneal en ratas. (A-B) porcentaje de oro determinado en cada órgano respecto
de la DI. (C-F) Perfil de concentración de oro en los diferentes órganos estudiados. El experimento se
realizó por cuadruplicado. *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.

112
Tabla 10. Contenido de oro en los órganos de ratas, obtención de la DI
Tiempo NE-‐CLPFFD NE
Órgano horas %
µg/g µg µg/g µg %
+ + + + + +
( SD) ( SD) ( SD) ( SD) ( SD) ( SD)
0.5 0,012 0,023 0,003 0,007 0,013 0,002
+ + + + + +
( 0,01) ( 0,019) ( 0,003) ( 0,01) ( 0,011) ( 0,002)
1 0,017 0,034 0,005 0,009 0,02 0,002
+ + + + + +
( 0,002) ( 0,003) ( 0,0004) ( 0,002) ( 0,004) ( 0,0006)
2 0,045 0,09 0,012 0,009 0,018 0,002
Cerebro + + + + + +
( 0,011) ( 0,02) ( 0,003) ( 0,003) ( 0,006) ( 0,0008)
4 0,012 0,024 0,003 0,005 0,0102 0,001
+ + + + + +
( 0,001) ( 0,002) ( 0,0003) ( 0,001) ( 0,002) ( 0,0003)
24 0,015 0,03 0,003 0,02 0,034 0,004
+ + + + + +
( 0,008) ( 0,015) ( 0,002) ( 0,01) ( 0,023) ( 0,003)
1 6,81 102,15 13,68 6,5 97,5 13,06
+ + + + + +
( 0,67) ( 9,98) ( 1,33) ( 1,48) ( 22,2) ( 2,98)
2 6,45 96,75 10,41 4,7 70,5 9,45
+ + + + + +
( 1,27) ( 19,05) ( 2,55) ( 2,13) ( 31,95) ( 5,18)
Hígado
4 15,7 235,5 31,55 8,3 124,5 16,68
+ + + + +
( 2,72) ( 40,8) ( 5,46) ( 3,88) 58,28) ( 7,8)
24 25,88 388,2 51,98 14,39 215,95 28,92
+ + + + + +
( 7,69) ( 115,4) ( 15,45) ( 10,43) ( 156,6) ( 20,97)
1 0,227 0,795 0,106 0,067 0,24 0,03
+ + + + + +
( 0,036) ( 0,13) ( 0,02) ( 0,03) ( 0,086) ( 0,012)
2 0,341 1,194 0,159 0,12 0,42 0,05
+ + + + + +
( 0,084) ( 0,3) ( 0,04) ( 0,05) ( 0,18) ( 0,024)
Riñón
4 0,2 0,7 0,09 0,12 0,42 0,05
+ + + + + +
( 0,087) ( 0,31) ( 0,09) ( 0,09) ( 0,32) ( 0,041)
24 0,40 1,41 0,19 0,36 0,84 0,112
+ + + + + +
( 0,12) ( 0,40) ( 0,05) ( 0,35) ( 1,13) ( 0,15)
1 12,46 3,99 0,53 57,33 18,35 2,46
+ + + + + +
( ) ( ) ( ) ( 24,09) ( 7,71) ( 1,03)
2 12,68 4,06 0,54 63,5 20,32 2,72
+ + + + + +
( 4,96) ( 1,59) ( 0,21) ( 13,44) ( 4,3) ( 0,558)
Bazo
4 43,73 13,99 1,88 68,4 21,9 2,93
+ + + + + +
( 12,75) ( 4,08) ( 0,55) ( 13,43) ( 4,29) ( 0,58)
24 48,01 15,36 2,05 16,29 5,21 0,7
+ + + + + +
( 25,96) ( 8,31) ( 1,11) ( 7,51) ( 2,41) ( 0,321)
* Solo el cerebro se analizó por AAN a las 0,5 horas
** A partir de los órganos extraídos, peso cerebro seco promedio fue de 0,35g, hígado 1,8g, riñón 0,5g y
bazo 0,085g. Se empleó una cantidad de 3 animales por tiempo analizado (n=3)
En las Figura 43 y 54 y en la Tabla 10 se aprecia como es posible aumentar en 4 veces
la cantidad de NE en el cerebro modificando la superficie de las nanopartículas reduciendo
la carga y aumentando el carácter lipofílico de éstas. También queda claro que esta
modificación lleva a una reducción de la retención de NE por el bazo a 1 y 2 horas luego de
la inyección. Transcurridas las 24 horas, se aprecia que los conjugados han sido
parcialmente extraídos del cerebro y otros órganos para acumularse mayoritariamente en
hígado. La acumulación en hígado, es similar a la observada en un trabajo previo, en que el
113
grupo de Semmler-Behnke y cols., inyectaron NpO intravenosamente en ratas y al cabo de
24h se encontraron mayoritariamente en hígado.[50, 98] En este sentido se ha encontrado que
las NE (sin funcionalizar) presentan un pot-Z con mayor valor absoluto negativo que las NE-
CLPFFD, y con la funcionalización con el péptido anfipático CLPFFD se incrementa la
penetración de las NE posiblemente debido a la reducción de la carga negativa que
reduciría la interacción con opsoninas y la consecuente captación por el SFM como también
por un aumento del carácter hidrofóbico que contribuye a un aumento de la penetración a
través de membranas.[34, 72, 77, 114]
A partir de la información de las NE y su comportamiento, seria posible dar cuenta de
que la carga negativa de las mismas conlleva a procesos de opsonización, no deseados,
que inducen a la retención de las NE por el SFM, disminuyéndose así su llegada al
cerebro.[50, 72, 77, 109] Según esto, el desafío es lograr aumentar aun más los niveles de NE en
el cerebro. Para ello podrían considerarse diferentes parámetros como la vía de
administración intravenosa y/o una modificación de la superficie de las NpO en el orden de
incrementar su lipofilicidad y reducir su carga negativa.
Aun cuando en este trabajo no se estudió el clearence de NE, se podría especular que
por el tamaño de las NE se vea dificultada su excreción a través de los riñones, ya que se
ha descrito que el tamaño de corte de excreción por riñón es cercano a los 5,5nm, lo cual
se observado para QD.[168] Por lo cual el mecanismo presumible para las NE estudiadas en
este trabajo seria la excreción por vía hepatobiliar, como lo ha propuesto Sonavane y cols.,
y Semmler-Behnke y cols., en un estudio realizado para NE de tamaño similar.[50, 67, 98]
En cuanto a la llegada de NE al cerebro otros autores también demostraron que las
mismas cruzan la BHE luego de la administración intraperitoneal de NE de 12-13nm. Esto
da cuenta que las NE pueden sortear numerosas barreras y el efecto de primer paso para
114
conseguir llegar al cerebro tal como lo describieron, previamente Hillyer y Albertch,
empleando otras NE.[50, 169, 170]
El paso al cerebro de las NE-CLPFFD, posiblemente esté relacionado con algún tipo de
receptor que pueda reconocer CLPFFD a nivel de BHE, como el receptor RAGE e inducir la
transcitosis de las NpO desde la sangre al cerebro al igual que ocurre con Aβ.[82-85] Otra
posibilidad demostrada en el capítulo 4, es la capacidad de interactuar con proteínas, entre
las que pueden estar Albúmina, que favorecería la transcitosis, mediada por la interacción
de la membrana. Asimismo la unión a otra proteína como la ApoE, una proteína que es
reconocida por los receptores de LDL, podría favorecer la transcitosis. La naturaleza
anfipática de CLPFFD, posiblemente también ayude al anclaje de la membrana de las NpO,
lo cual facilitaría las posibilidades de reconocimiento.
6.8.3 Localización de NpO en el cerebro.
En relación a los niveles de NE y NE-CLPFFD detectados en el cerebro, se intentó
localizar en que región se acumulan las diferentes NE. Con el fin de detectar los conjugados
se empleó marcaje con carboxifluoresceína, con la cual por medio de microscopia de
fluorescencia podría ser detectada siempre que los niveles de señal observada en el
parénquima cerebral fuesen mayores a los niveles de fluorescencia de los controles. Para
este fin, el cerebro fue dividido en cortes de 20µm y las áreas del cerebro se detectaron por
tinción de Nissl de regiones paralelas a las analizadas, como muestra la Figura 55. En una
condición similar a la cuantificación de oro, luego de 2 horas se observó una mayor
acumulación en la zona del hipocampo La señal de fluorescencia decayó al cabo de 4h
como se aprecia en la Figura 45. Estos resultados se correlacionan con el perfil dado por
los niveles de oro obtenidos a las 2h post inyección, a partir de lo cual se puede inferir que
el péptido se mantuvo unido a la superficie de la NE, sin embargo, no se descarta una
115
hidrólisis parcial del péptido in vivo. Pero a través de estos estudios no es posible descartar
una eventual hidrólisis del péptido pues el marcaje se ubicó en extremo N-terminal del
péptido, justamente más cercano a la superficie de la NE. A las 4h post inyección los
niveles de fluorescencia decayeron en conjunto a los niveles de oro, lo cual da cuenta de un
eventual clearence desde el cerebro, correlacionado con un aumento en los niveles en
hígado. En estos experimentos no se evaluaron mecanismos de clearence, pero se
propone que posiblemente las NE-CLPFFD fueron extraídas desde el cerebro tras pasar
desde del parénquima cerebral al líquido cefalorraquídeo (LCR), para ser luego exportadas
desde el SNC a la circulación venosa. Posiblemente las NE podrían ser exportadas en el
LCR por el transporte de fluidos y otros elementos mediados por vacuolas de fluidos a
través de la vellosidad de las células (mecanismo empleado por ejemplo por bacterias y
células de la sangre). El LCR se mueve a lo largo de un gradiente de presión desde un
punto de alta presión (espacio subaracnóideo) a un punto de menor presión (senos
venosos), pudiendo así transportar las NE hacia la circulación a través de las estructuras de
las vellosidades aracnoides, adaptadas para el transporte de LCR desde el espacio
subaracnóideo a la circulación venosa. [34, 50, 171, 172]
6.8.4 Evaluación de la integridad de la BHE.
Para descartar que la presencia de las NE en la circulación no tiene un efecto negativo
en la integridad de la BHE y que los niveles detectados en el cerebro no se deban a un
daño en la BHE se empleó azul de Evans (AE) inyectado por vía intravenosa, el cual se une
a la albúmina y se convierte en un marcador de extravasación.[173] Si existiese daño a nivel
de la BHE se espera que el cerebro se tiña de color azul fenómeno que se observa en un
control positivo empleando manitol en concentraciones hiperosmolares (al 25% en solución
salina al 0,9%) que produce disrupción en la BHE observándose permeabilidad de albúmina
116
marcada con AE (Figura 46). En el caso de las ratas tratadas con NE-CLPFFD, no se
observó tinción con AE en el cerebro (Figura 46)
6.8.5 Estudios in vivo de distribución de NE-CLPFFD.
Según se demostró en el objetivo 3, el diseño experimental involucra el marcaje de NE

18
con F, para así tener una marca que puede ser detectada por PET con una alta
sensibilidad. Para lograr esta marca, se multifuncionalizaron NE con dos péptidos el
péptidos CK y el CLPFFD. De esta forma se aumentaron los grupos aminos disponibles,
esperándose que al reaccionar de manera de favorecer la reacción con la sonda SFB-[18F]
y formar las nanopartículas multifuncionalizadas NE-CK/CLPFFD*SFB[18F] con un porcentaje
de marcación adecuado para realizar los estudios in vivo por PET en una rata viva. Las NE-
CLPFFD/CK y NE-CK/CLPFFD*SFB-[18F] fueron obtenidas y caracterizadas de acuerdo a los
objetivos 1, 2 y 3.[145]
En estos estudios se emplearon ratas macho Sprague Dawley tratadas con un bolus
intravenoso de partículas radiomarcadas (con un nivel de 3.1±2,7kBq relacionado con los
niveles de oro inyectados en los trabajos anteriores). Luego de lo cual se comenzó con la
adquisición de imágenes tomográficas por un periodo de 120min. En el capítulo 2 se detalla
en mayor profundidad la metodología empleada.[145]
117
A!
Tinción&de&Nissl Fluorescencia
Control 1 2 4
Zona%Pre%frontal
Zona%Cuerpo%Estriado
Zona%Hipocampo
!!
B! Cerebro
Zona Pre-Frontal
Zona Cuerpo Estriado
200 ***
*** Zona Hipocampo
*
Intensidad Relativa (u.a.)
150
100 ns
ns ns
ns ns
ns
50
0
1 2 4
Tiempo (h)
Figura 45. Distribución en el tiempo de NE-CLPFFD-carboxifluoresceína. (A)Imágenes de microscopía

óptica (izquierda) y Microscopía de fluorescencia (centro y derecha) de cortes a distintos niveles del
cerebro de forma secuencial desde la zona pre-frontal, cuerpo estriado e hipocampo. (B) Perfil en el
tiempo de la señal de fluorescencia en las diferentes regiones del cerebro estudiadas. Las imágenes son
representativas a un promedio de una serie de 3 cortes de la misma región, los datos graficados fueron
obtenidos de la serie de cortes y el experimento fue repetido empleando 4 animales. *p<0,05; **p<0,001;
***p<0,0001; ns sigla de no significativo. El microscopio fue calibrado a la fluorescencia basal, la cual fue
considerada como la fluorescencia de las muestras control.
118

C+ C- NE-CLPFFD

Figura 46. Análisis de la integridad de la BHE luego de tratar ratas con NE-CLPFFD. 5min previo a la
administración de las NE-CLPFFD, se administró a cada rata por vía intravenosa Azul de Evans. Se
esperaron 30 minutos y transcurrido ese tiempo, las ratas se sacrificaron y perfundieron, para luego
remover el cerebro, y continuar con los análisis posteriores. En la imagen se muestran 3 cerebros:
control positivo (izquierda, C+), una rata tratada con una solución hiperosmolar de manitol, para generar
daño en la BHE, control negativo (centro, C-), ratas que fueron tratadas con una solución de citrato de
sodio 1,2mM (solución en que se encuentran inmersas las NE) y cerebro de una rata tratada con NE-
CLPFFD.
6.8.6 Estudio de distribución in vivo de NE-CK/CLPFFD.
La distribución de las NE-CK/CLPFFD*SFB-[18F] se monitoreó por PET a diferentes tiempos
luego de la administración intravenosa. La Figura 47 da cuenta de las imágenes obtenidas
por PET luego de 120 minutos de la inyección, mostrando que existe una elevada
concentración de radiactividad en torno a los riñones, hígado, bazo e intestino.[158]
El bazo, uno de los órganos mas visibles en las imágenes de todos los animales, da
cuenta de la captura de las NE por el SFM, resultado consistente con lo evaluado
previamente ex vivo en este capítulo. Este estudio permitió también determinar que órganos
como el pulmón muestran alto nivel de retención de radiactividad, lo que posiblemente
pueda estar relacionado con una acumulación de NE-péptidos en el lecho vascular de este
órgano. Notablemente en el mencionado lecho podrían acumularse especies de gran
tamaño cercanos a 500nm, por lo cual posiblemente se deba a posibles interacciones de
las NE interactuando con estructuras mayores como células o macromoléculas. Este
119
re carried out in sediment after centrifugation. As was mentioned previously,
te was incubated nanoparticles in plasma are in a different aggregation state.
In Figure 3, one Notably, it is necessary to consider for in vivo experiments that
nged, allowing us from the beginning of the incubation there is a free labeled
the two tested species that could be filtered by the kidney and consequently
excreted by a renal mechanism. Remarkably, it is important to
rticles in plasma, estudiomention that the
también permite radioactivity
apreciar que vasoscontent in plasma
de gran tamaño was constant
son visibles en las diferentes
es the in vivo with time, which was not compatible with the detachment of
imágenes, lo cual puede indicar una cierta unión de los compuestos marcados al endotelio
in the plasmon the radiolabel from the AuNPs after incubation. Rather, a time-
incubation with vascular.dependent increasepodrían
Aquellas imágenes in therepresentar
radioactivity of elthe
también supernatant
volumen de sangre de los
which could be would be expected as a consequence of the detachment of the
vasos producido por la permanencia de las NE en la sangre durante el intervalo de tiempo
with proteins to radiolabel, which does not occur in this case.
18
tion, Figure S6), en que seIn Vivoel Distribution
realizó experimento. Losof C(AuNP)LPFFD-C(AuNP)K([
vasos supra aórticos fueron visibles en lasF]-imágenes
carried out DLS indicandoSFB). The biodistribution of the newly synthesized conjugate
nce of different waslamonitored
presencia del marcador en el endotelio vascular. Otros órganos incluyendo el
by PET imaging at various time points following
ated for 1 h, two cerebrointravenous
presentaron injection into
bajos niveles de rats. Figure 4lo shows
radiactividad, PETserimages
cual podría atribuidoof a la baja
ed where one is penetración de las nanopartículas al cerebro.[158]
which could be
r to aggregation
%ID/gr!
%DI/gr'
the sizes of the
to aggregation
ut zeta potential
amatic variations
ncubation time

(AuNP)LPFFD-
h Tween-80 to
itions. After the
a, the aforemen- Figure
Figura 4. Representative
47. Imágenes representativas deimage
escáner of
PETaa los
120120min
mintranscurrida
PET scan una after anen ratas
inyección
e the desorption intravenously
por vía intravenosa deinjection of dea 5.2
una solución nM solution
NE-CK/CLPFFD*
SFB[18F]
of(5,2nM).
C(AuNP)LPFFD−
Se muestra una serie de
st the conjugate imágenes tomográficas18F]-SBF)
C(AuNP)K([ obtenidas ain rats.de Coronal
partir sections Las
secciones coronales. of the animal
imágenes from
indican diferentes
cal scenario, we dorsal

zonas, (A)
en A se to ventral
muestra (F).
un animal Organs
desde el ladothat
dorsalpresented
hasta F queelevated uptakeSeofpudo
es el lado ventral. theapreciar
gate capped with radiolabeled
acumulación compound
de fluorescencia, areel clearly
en hígado, cual está seen.
presenteLiver appears
en todas in de
las secciones all imágenes,
the las
s against PBS for images,
flechas 1 y 2 daarrows 1 laand
cuenta de 2. Lungs
posición canLosbepulmones
del hígado. visualized in visualizarse
pueden images A−E en las (5).
imágenes A-
UV−vis spectra Kidneys

E, indicando su and spleen
posición con lacan be5.visualized
flecha Los riñones yinel images B and
bazo pueden C, arrows
visualizarse en las3imágenes
and B y
4. Bladder
C, indicados andflechas
con las intestines
3 y 4 are clearly visible
respectivamente. in images
La vejiga E and
se aprecia F, tomografías
en la arrows 8 E y F,
mes, and it was and 6.conInterestingly,
señaladas la flecha 8 y lasupraortic vessels can
flecha 6 corresponde be appreciated
al intestino. in image
Interesantemente, E, supra
los vasos
occurred within arrow
aórticos 7. ser visualizados en la imagen E, denotado como flecha 7.
pueden
ensity band was
Al analizar las curvas del gráfico de la Figura 48, las cuales muestran los valores de
404 dx.doi.org/10.1021/bc200362a | Bioconjugate Chem. 2012, 23, 399−408
radiactividad obtenidos por PET en el tiempo, indican que la mayor concentración
encontrada fue en la vejiga, lo cual da cuenta de una excreción urinaria del marcaje que
120
puede ser atribuido a las NE. En el intestino también se acumuló radiactividad de forma
progresiva, compatible con una posible excreción biliar de los conjugados. A nivel del bazo,
la evaluación de la radiactividad en el tiempo señala que los niveles fueron altos al
comienzo del estudio y se incrementaron ligeramente con el tiempo. Esto da cuenta de un
posible patrón compatible con la fagocitosis en éste órgano de las NE que circulan junto a
componentes del SFM, posiblemente ya opsonizados. Al observar los datos se puede
apreciar que existe también una fuerte correlación entre la rápida disminución de la marca
desde la sangre con el incremento de la marca en la orina, reflejando la rapidez con la cual
posiblemente se excretan estas NE, luego de esta rápida disminución inicial, la disminución
es mas lenta, al igual que la señal en hígado, pulmones y riñones. En el estudio, los niveles
en cerebro siempre se mantuvieron con una baja señal. Todos los niveles fueron
disminuyendo con el tiempo lo cual da cuenta del clearence del compuesto desde el
compartimento vascular.[158]
Bioconjugate Chemistry Article
Hígado'
Pulmón'
Bazo'
Riñón'
Intes?no'
Cerebro'
Vejiga'
Sangre'

%DI/gr'

Tiempo'(s)'
Figure 5. Mean time−activity curves of the levels of radioactivity in the different organs obtained from the PET images. The bars represent the
Figura
standard 48.The
deviation. Gráfico de curvas
radioactivity del in%thedebladder
accumulated la dosis inyectada
and intestine, (DI)the
reflecting normalizado
dual excretory en gramos
mechanisms of de
the tejido (%DI/gr)
nanoparticle.
en el tiempo para los diferentes órganos analizados y evaluados por PET. Las barras representan la
desviación estándar. La radiactividad acumulada en vejiga e intestinos, reflejan un mecanismo de
excreción dual de NE.
121
Figure 5. Mean time−activity curves of the levels of radioactivity in the different organs obtained from the PET images. The bars represent the
standard deviation. The radioactivity accumulated in the bladder and intestine, reflecting the dual excretory mechanisms of the nanoparticle.

Corte&y&conteo& PET&&&&
A B

%DI/gr'
%DI/gr'

'
n'
'
'
'
o'
'
'
ón
a'
'
o'
'
do
In na'
re
n'
Hí n'
Ce o'
as
no
'
zo
re
do
zo
ñó
br
jig
br
ñó
ó
ng
re
lm
Ba
ng
ga
s7
Ba
i
ga

lm
s7
re
Ri
or
Ve
re
nc
Ri
Sa
Pu
Hí
Sa
te
te
Ce
Pu
Pá
In
Figure 6. Graphs showing the %ID/gr in each tissue calculated from the cut and count study or the PET scans.
FIGURA 49. Grafico mostrando el % de dosis inyectada (DI) normalizado en gramos de tejido (%DI/gr)
the labeled AuNPs,
calculado demonstrating
a partir de corte ythat elevated
conteo (A)concentrations compoundPET
y también por escáner to (B).
the vascular endothelium. Other tissues,
of radioactivity could be observed in the kidneys, liver, bladder, including the brain, displayed low levels of radioactivity,
and intestine 120 min after injection. The spleen was clearly which could be related to the rapid washout of the conjugate
visible in the images of all the animals, indicating considerable from the blood (see Figure 4).
Con el
trapping finNPs
of the debyevaluar los niveles
the reticuloendothelial systemde radiactividad
(RES), a acumulada
The time−activity curvesaobtained
los 120min
from the obtenido
PET images por
finding that is consistent with our previous ex vivo results in showed that the highest concentration of the compound was
rats.8 Moreover, the lungs showed high levels of radioactivity,
PET, determinados como porcentaje de DI por present
thereby suggesting the trapping of the conjugate in the vascular
cadaingramothe bladder, indicative of the urinary excretion of the
de tejido por PET en un animal
NPs (Figure 5). The intestine also progressively accumulated
bed of this organ which could be attributed to the presence of radioactivity, which is compatible with the biliary excretion of
in species
vivo, ofy high
porsize
la(approximately
detección500 exnm).
vivoThedel
greatporcentaje
vessels thede la DI por
conjugate. gramo obtenido
A time−activity por el corte
curve of radioactivity in the de
were visible in the images, which could indicate the binding of spleen showed that the accumulation of the conjugate was high
the labeled compound to the vascular endothelium. Alter- at the beginning of the scan and increased only slightly with
cada tejido
natively, these y conteo
images (Figurathe49).
could represent blood Nuevamente
volume of the estos
time, datos compatible
a pattern revelaron withque la orina mantenía
the phagocytosis of the
vessels produced by the nanoparticles that remained in the circulating NPs by the RES components of this organ. The
blood until the end of the experiment. The supraortic vessels concentration of radioactivity in the blood decreased quickly
una gran concentración de los compuestos radiomarcados
were visible in the images, indicating the binding of the labeled
(considerar que se grafica % DI
during the first minutes of the study in parallel with an increase
por gr de órgano, en el caso de la orina, de405ésta). Por lo dx.doi.org/10.1021/bc200362a

cual surgió la| Bioconjugateinterrogante si esto
Chem. 2012, 23, 399−408
correspondía a la excreción de NpO o a metabolitos radiactivos, producidos por un eventual
intercambio superficial sobre las NpO de los péptidos radiactivos anclados por otras
moléculas presentes en el organismo que son tioladas como péptidos y proteínas. Para
resolver esta duda se inyectaron 2 animales recogiéndose su orina luego de 1 hora post
inyección. Estas muestras fueron centrifugadas y se evaluó el nivel de radiactividad del
sobrenadante resultando en un 0,02% de radiactividad (Tabla 11) permaneciendo
prácticamente el total de la radiactividad en el pellet, lo cual da una posible cuenta de que la
señal corresponde a la NE-CK/CLPFFD*SFB[18F] y no a un ligando desorbido de las
nanopartículas ya que las NE sedimentan en el pellet. Pero este no es un resultado
122
absoluto, pues el riñón puede eliminar los metabolitos libres, los cual llevó a realizar
estudios in vitro de estabilidad en plasma. Estos estudios se llevaron a cabo a 37ºC en que
se incubándose las NE-CK/CLPFFD*SFB[18F] con plasma de rata y tomándose muestras
durante 3 horas. Estas se centrifugaron para separar posibles productos de degradación
presentes en sobrendantes del plasma luego de la centrifugación. Entonces se realizó un
conteo de radioactividad del sobrenadante y del pellet, como se muestra en la Figura 50. La
fracción de radiactividad detectada en el sobrenadante podría corresponder a metabolitos
libres o a una fracción de NE-CK/CLPFFD*SFB[18F] que no sedimentó luego de la
centrifugación. Esto debido a que las NE en plasma podrían encontrarse en diferentes
estados de agregación. En base a los resultados obtenidos puede suponerse que existe un
cierto % de remoción del péptido marcado desde la superficie que podría ser excretados
por vía renal. Por lo cual una fracción de la marca radioactiva observada en la orina podría
corresponder al péptido libre que se desorbió de la superficie por intercambio con otras
moléculas biológicas presentes en el medio.[158]
Tabla 11. Radiactividad obtenida en sobrenadante y pellet de una muestra de orina recogida luego de
SFB[18F]
1h de la inyección de NE-CK/CLPFFD* , la cual se centrifugó a 16200RCF durante 10 minutos.
Sobrenadante de orina Pellet de Orina %Cpm sobrenadante de

Animal
(Cpm) (Cpm) orina
1 33559 2774246,4 0,01195
2 47841,7 2822304,5 0,01667
Estos resultados dan cuenta de una posible remoción de NE por clearence renal. Y si
bien se ha descrito que este proceso es eficiente para aquellas NE con diámetros menores
a 5,5nm,[174] también hay evidencia de NP de mayor tamaño que pueden ser eliminadas por
riñón, como nanopartículas de diamante o nanotubos de carbono, lo cual da cuenta que la
eliminación de NE como las estudiadas, de un diámetro promedio de 12nm también pueden
123
ser eliminadas por esta vía.[175, 176] La marca detectada en el intestino da cuenta de una
doble eliminación, no solo renal si no también por vía biliar. Existen evidencias que la vía
hepática es también una ruta de excreción de NE, la cual ocurre por medio del paso de NE
a través de los hepatocitos hacia la vía de producción biliar. En este sentido se ha descrito
que los hepatocitos también pueden fagocitar las NE en conjunto a las células de Kupffer,
indicando que la eliminación de NE se puede dar por más de una vía.[177-179]
40
supernatant
%"de"radioac*vidad"en"sobrenadante""""
35
30
plasma
ininthe
25

% radioactivity
20
% of radioactivity
15
10
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tiempo"(min)"
Time (min)
Time (min)
Figura 50. Proporción de radioactividad en sobrenadante ( respecto de la suma total de la señal del
SFB[18F]
pellet + sobrenadante) de una muestra de NE-CK/CLPFFD* . Muestra incubada con plasma a
37ºC.
Figure S8. Proportion of radioactivity in supernatant (with respect to the total sum of the signal
pellet + supernatant) of a sample of C(AuNP)LPFFD−C(AuNP)K([18F]-SBF) incubated with
plasma at 37ºC.
De lo observado en las Figuras 5.6 y 5.7, el hígado, el bazo y los pulmones, son los
órganos con mayores niveles de radioactividad por gr de tejido. Niveles menores de
radioactividad se encuentran en la vejiga, intestino, riñón y sangre siendo los órganos de
menor acumulación de marcaje radioactivo el páncreas, y el cerebro. De los datos
obtenidos se puede señalar que los conjugados se acumulan en hígado y bazo, como se ha
observado en los experimentos ex vivo, (sección 5.1 y Figura 49) y como otros autores lo
han indicado.[63, 67, 68, 98, 169]

Lo cual se ha relacionado a la carga superficial negativa
expuesta por los conjugados que favorecen el reconocimiento de éstas por el SFM. Al
ingresar las NE-CK/CLPFFD*SFB[18F], las NE-CLPFFD, y posiblemente alguna otra NE-
péptido con características similares, se unirán rápidamente a proteínas del plasma que las
124
recubrirán dándole una nueva identidad, definida por las proteínas que estarán unidas en la
superficie de las NpO conformando la CP. Esta CP puede influir en la biodistribución así
como en el reconocimiento por la superficie celular entre las cuales se espera algunas sean
opsoninas llevando a procesos de retención por el SFM que conducen a una acumulación
en hígado y bazo consiguiendo una disminución significativa de los niveles de NE en
circulación.[50, 158]
Potenciar el uso de imagenologia in vivo por PET, puede ayudar a comprender los
fenómenos in vivo de las NpO así como otros NM de una forma bastante poco invasiva y
muy sensible, permitiendo a su vez emplear menos animales necesarios que para los
estudios ex vivo
6.8.7 Determinación de la capacidad de las NE-THRCLPFFD de cruzar la NHE.
Para este estudio se administró intraperitonealmente en diferentes ratas los conjugados
NE-THR-CLPFFD, NE-CLPFFD, NE-THR y NE y transcurridos diferentes tiempos post
inyección se sacrificaron los animales y se extrajeron los cerebros y otros órganos, como
hígado, bazo, riñón, para así por AAN determinar los niveles de oro.[180]
De los resultados analizados, la incorporación de THR a CLPFFD y la posterior
conjugación a las NE conlleva a un cambio en el perfil de los niveles de oro en el cerebro,
observándose un incremento en la concentración de oro al cabo de 1h de la administración
de NE-THRCLPFFD, niveles que se mantuvieron en cerebro por al menos un intervalo de
1h (entre 1h y 2h post inyección, ver Figura 51). Este intervalo de tiempo podría ser
adecuado para una posible terapia de irradiación con microondas o radiación laser para
propósitos terapéuticos. Continuando con el análisis de los niveles de oro, se aprecia que al
cabo de 4 horas post inyección de NE-THRCLPFFD, los niveles de oro disminuyeron desde
aproximadamente 0,3µg en cerebro de rata a 0,11µg en cerebro de rata, y transcurrido 24
125
horas los niveles son aún menores, 0,07µg en cerebro de rata, ver Tabla 12.

***
Concentración de oro (µg Au0/g e tejido)

***
***
0.25 ***
***
*** ***
*** ***
0.20 *** Control
*
NE
0.15 *** ** NE-CLPFFD
NE-THR
0.10
NE-THR-CLPFFD

0.05
0.00
0 0.5 1 2
tiempo (h)
Figura 51. Perfil de contenido de oro en el tiempo determinado en cerebros de ratas tratadas con NE;
NE-CLPFFD; NE-THR; NE-THRCLPFFD. *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.
Comparando la penetración al cerebro in vivo de NE-THR respecto de NE-THRCLPFFD,
esta fue menor inclusive respecto de la observada para NE-CLPFFD, la razón de esto
podría deberse a la disposición del péptido lanzadera THR sobre la superficie de la NE que
al estar colocada en forma adyacente a la superficie de oro con lo que se impide el
reconocimiento por el receptor de transferrina disminuyéndose la internalización al sistema
nervioso central.[34]
Por otra parte es importante mencionar que las NpO se depuran del cerebro por lo cual
puede plantearse un mecanismo clearence de NE, en donde la disminución de los niveles
de oro desde el cerebro se deba a que las NE pasan desde el parénquima cerebral hacia el
LCR, exportándose así desde el SNC hacia la circulación tal como se describió en la
sección 5.1.[34, 50, 171, 172]
126
Tabla 12. Contenido de oro en cerebro, determinación del porcentaje de oro respecto de la dosis
inyectada luego de una administración intraperitoneal en ratas.
Tiempo Contenido de oro

Muestra
(h) μg (SEM) μg/g de tejido (SEM) % DI
+ + +
0.5 0.038 ( 0.01) 0.02 ( 0.007) 0,009 ( 0,004)
+ + +
1 0.117 ( 0.05) 0.062 ( 0.03) 0,029 ( 0,013)
+ + +
NE 2 0.049 ( 0.02) 0.026 ( 0.01) 0,021 ( 0,004)
+ + +
4 0.023 ( 0.002) 0.012 ( 0.001) 0,006 ( 0,001)
+ + +
24 0.028 ( 0.015) 0.015 ( 0.008) 0,007 ( 0,026)
+ + +
0.5 0.124 ( 0.015) 0.065 ( 0.009) 0,031 ( 0,004)
+ + +
1 0.11 ( 0.07) 0.058 ( 0.037) 0,028 ( 0,017)
+ + +
NE-‐CLPFFD 2 0.232 ( 0.013) 0.122 ( 0.007) 0,058 ( 0,003)
+ + +
4 0.01 ( 0.002) 0.005 ( 0.01) 0,003 ( 0,001)
+ + +
24 0.033 ( 0.022) 0.017 ( 0.011) 0,008 ( 0,005)
+ + +
0.5 0.067 ( 0.023) 0.035 ( 0.012) 0,017 ( 0,006)
+ + +
NE-‐THR* 1 0.083 ( 0.038) 0.044 ( 0.02) 0,021 ( 0,01)
+ + +
2 0.084 ( 0.031) 0.044 ( 0.02) 0,021 ( 0,008)
+ + +
0.5 0.081 ( 0.006) 0.043 ( 0.003) 0,02 ( 0,004)
+ + +
1 0.298 ( 0.079) 0.157 ( 0.042) 0,075 ( 0,02)
+ + +
NE-‐THRCLPFFD 2 0.306 ( 0.21) 0.161 ( 0.11) 0,077 ( 0,05)
+ + +
4 0.113 ( 0.10) 0.059 ( 0.054) 0,028 ( 0,026)
+ + +
24 0.067 ( 0.02) 0.04 ( 0.01) 0.017 ( 0,005)
*NE-THR solo se estudió a los tiempos 0,5, 1 y 2 horas. Se empleó un total de 3 animales por tiempo y
muestra
6.8.8 Localización de las NE-THRCLPFFD en cerebro.
Una de las interrogantes al estudiar si las NE llegan al cerebro es la de determinar si las
mismas se encuentran en el parénquima cerebral o en el endotelio de la BHE. Con el fin de
identificar la zona en donde se encuentran las NE-THRCLPFFD en el cerebro, los
conjugados fueron marcados con carboxifluoresceína (NE-THRCLPFFD(cf)) y se inyectaron
en ratas con el fin de localizar éstas en los tejidos por medio de microscopía de
fluorescencia. Luego de 2 horas de la inyección, las ratas fueron sacrificadas, perfundidas
intracardialmente con PBS, fijadas con paraformaldehido y sacrificadas para luego extraer
127
sus cerebros. Una vez extraídos los mismos fueron divididos en cortes de 20µm que fueron
realizados en serie, separándose intercaladamente cortes para evaluar fluorescencia y
cortes para hacer tinción de Nissl con el fin de identificar regiones en el cerebro. En la
Figura A11 (anexo) se observa la fluorescencia en varias regiones del cerebro siendo la
señal en aquellos cortes de cerebros de ratas tratadas, mayor a la fluorescencia basal
detectada en ratas control, con lo cual esta fluorescencia puede atribuirse a las NpO. De
esta manera puede corroborarse que las mismas atraviesan la BHE. Además por medio de
estos estudios se descarta que pueda haber una acumulación en capilares pertenecientes a
la BHE que puedan alterar los resultados posteriores de cuantificación.[34] En conjunto a lo
observado en la Figura A11(Anexo) la fluorescencia se observa difusa no ajustándose del
todo a lo esperado para las nanopartículas marcadas (fluorescencia localizada en puntos
específicos de la célula debido a procesos de endocitosis). No pudiendo descartarse que
exista una posible separación del marcaje de cf desde la superficie de NE en las células
endoteliales del cerebro y luego ser expulsado al tejido cerebral.[34]
6.8.9 Distribución de las NE-THRCLPFFD.
La evaluación de los niveles de oro en otros órganos de las ratas tratadas con NE-
THRCLPFFD relacionados con el SFM, como el hígado y el bazo, permite determinar el
comportamiento de las mismas in vivo. Debido a eso también se cuantificaron los niveles de
oro en hígado (Tabla 13). A las 0,5h post inyección se observó una acumulación del 38% de
la DI en hígado y un 18% en bazo. Estos altos niveles se relacionan directamente con la
carga negativa y el tamaño de la partícula, que favorecen a la captación por esos órganos,
como da cuenta Levchenko y cols.[181] Estos resultados concuerdan con los altos niveles
observados en las ratas tratadas con NE-CLPFFD y NE que también presentan carga
negativa. [34, 50]
128
7204 R. Prades et al. / Biomaterials 33 (2012) 7194e7205
Hipocampo(
Sinapsis( Corteza(

Fig. 7. Localization of AuNPeTHReCLPFFD
Figura 52. Micrografíasin the hippocampus
obtenidasandpor cortex
TEM regions
deascortes
shown bydeTEM after intraperitoneal
cerebro injection ofde
en las regiones thehipocampo
conjugate. (A) Hippocampus,
y corteza (B) cortex
regions, where preS is the presynaptic compartment, postS is the postsynaptic compartment, N is the nucleus, ne is the nuclear envelope, np is the nuclear pore, C is the cytoplasm,
para la erdetección
ga is the Golgi apparatus, de NE-THRCLPFFD.
is the endoplasmic preS indica
reticulum, mit is the mitochondria, el microtubule
mt is the compartimentoand arrowspre sináptico;
are the postS da cuenta del
gold nanoparticles.
compartimento post sináptico, N es el núcleo celular, ne demarca el recubrimiento nuclear, np

brains was low (approximately
corresponde a los0.07%
poroswith respect toCthe
nucleares, esinjected Acknowledgment
el citoplasma, ga el aparato de Golgi, er se refiere al retículo
doses), it was possible to visualize isolated particles in various
sections of the endoplásmico, mit a la
parenchyma tissue. mitocondria,
According mt gold
with the corresponde
levels losWe
microtubulos
thank Prof. M. y las
Garcia flechas danUniversity
from the cuenta de las NE and I.
of Barcelona
present in the brain (Fig. 6) it was expected to find low density of
identificadas. Martín from the Institute for Research in Biomedicine (IRB Barce-
nanoparticles in the tissue. Single AuNPs were located in synapses lona) for performing the zeta potential measurements, J. Calderón
and also in the cytoplasm (Fig. 7). from the Agència de Salut Pública de Barcelona for technical support
in the ICP-MS measurements, and S. Madurga from the University
Tabla 13. Perfil de acumulación de oro en hígado y bazo después
of Barcelona for de
thela in administración intraperitoneal
silico calculations. This study wasdesupported
4. Conclusions
NE-THRCLPFFD a ratas. by AECID, Fondecyt 1090143, ANILLO ACT-95, CONSOLIDER-
INGENIO 2010, the Generalitat de Catalunya (XRB and 2009SGR-
Nanoparticle application for the treatment of neurodegenera-
Órgano
tive disorders is a promising therapeutic field. However, issues such
Tiempo % DI
1005), MECESUP-UCH-0811 and BFU 2009-07186.
as the transport mechanism across the bloodebrain barrier, (h)

neurotoxic effects, and the reduction of RES interactions remain to Appendix A. Supplementary material
0,5 38,5
be addressed. Here we have demonstrated that the incorporation of
Hígado
the THR sequence to AuNPeCLPFFD increased the delivery of the
1 Supplementary 17,3
material associated with this article can be
conjugate into the central nervous system. We postulate a mecha- 2 found, in the 40,2 online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.
nism whereby the conformation and charge of 0,5 the biomaterials.2012.06.063.
18,0
AuNPeTHReCLPFFD conjugate allows interaction Bazo with the cell
1 2,7
membrane. The hydrophobicity of the recognition portion of the References
peptide (LPFFD) may allow bringing the conjugate to the cell
2 3,5
membrane, thus closer to the transferrin receptor. An active [1] Kessler RC, Chiu WT, Demler O, Merikangas KR, Walters EE. Prevalence,
transport mechanism (probably receptor-mediated transcytosis) is severity, and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National
Comorbidity Survey Replication. Arch Gen Psychiatry 2005;6:617e27.
then triggered by the directing portion of the peptide (THR) [2] Pardridge WM. Bloodebrain barrier delivery. Drug Discov Today 2007;(1,
interacting with the receptor.
6.8.10. Mejora An en
additional mechanism
la llegada where the de NpO-péptido
al cerebro 2):54e61.
pre-incubados con ApoE.
conjugate interacts with plasma proteins, as a result of the presence [3] Ponka P, Lok CN. The transferrin receptor: role in health and disease. Int J
Biochem Cell Biol 1999;10:1111e37.
of LPFFD portion, cannot be excluded. Given that a particle may [4] Lo SL, Wang S. An endosomolytic Tat peptide produced by incorporation of
Segúntolas
have the capacity proteínas
carry identificadas,
several molecules of a drug,posiblemente
an histidinesea ApoEresidues
and cysteine unaasde las vector
a nonviral proteínas que
for DNA transfection.
improvement in AuNP delivery to the central nervous system Biomaterials 2008;15:2408e14.
[5] Kogan MJ, Bastus NG, Amigo R, Grillo-Bosch D, Araya E, Turiel A, et al.
would contribute to more
contribuyan efficient delivery
a aumentar of pharmaceutical
la llegada al cerebro (objetivo 7). Asílocal
Nanoparticle-mediated para demostrar
and remote manipulationesta nueva
of protein aggregation.
agents to the brain. In addition, the conjugation approach may also Nano Lett 2006;1:110e5.
enhance the number of AuNPs delivered selectively to toxic Ab [6] Araya E, Bastus NG, Guerrero S, Puntes VF, Giralt E, Kogan MJ. Gold nano-
particles and microwave irradiation inhibit beta-amyloid amyloidogenesis.
aggregates, a crucial factor for the early diagnosis and therapy of
Nanoscale Res Lett 2008;3:461e7. 129
neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease. In this [7] Guerrero S, Araya E, Fiedler JL, Arias JI, Adura C, Albericio F, et al. Improving
regard, here we developed a tool that could potentially contribute the brain delivery of gold nanoparticles by conjugation with an amphipathic
to a therapeutic application. However, in a clinical scenario, the peptide. Nanomedicine (Lond) 2010;6:897e913.
[8] Giljohann DA, Seferos DS, Patel PC, Millstone JE, Rosi NL, Mirkin CA. Oligo-
critical dose and the time required for treatment based on the use nucleotide loading determines cellular uptake of DNA-modified gold nano-
hipótesis, se administraron intraperitonealmente a ratas AuNP-CLPFFD y AuNP-
THRCLPFFD marcados con AlexaFluo 750 con y sin incubar con ApoE. Posteriormente, se
determinó la florescencia ex vivo en cada caso y se cuantificó el oro en las muestras
obtenidas (metodología detallada en el capítulo 3). En la Figura 53 se aprecian imágenes
obtenidas ex vivo de los cerebros obtenidos a partir de las ratas según los diferentes
tratamientos, a tiempos de 2 y 24 horas. En las fotografías pueden apreciarse cambios en
los niveles de fluorescencia en los diferentes tratamientos con respecto a los controles en
los cuales solamente se inyectó el vehículo de las nanopartículas (solución de citrato), la
Figura 54 da cuenta de los niveles de fluorescencia.
Complementariamente a los resultados de fluorescencia, se determinaron los niveles de
oro en el cerebro de ratas tratadas con NE-CLPFFD y NE-THRCLPFFD con y sin incubar
con ApoE por AAN, los cuales se visualizan en la Figura 55.

2horas' 24horas'

AuNP.CLPFFD' AuNP.THRCLPFFD'
!6,6$x10!2$
AuNP1CLPFFD' AuNP1THRCLPFFD' !6,6$x10!2$ !8,02&x10!2&

!8,02&x10
!5,3x10 !2&
!2&
!6,2x10!2$

!6,2x10!2$ !7,1x10!2&
!7,1x10
!6,2x10 !2&
!2&
!5,8x10!2$
!5,8x10!2$
AuNP.CLPFFD' AuNP.THRCLPFFD'
!6,2x10!2&
!6,2x10
!7,1x10 !2&
!2&
!5,4x10!2$ @ApoE' @ApoE'

Control'
Citrato'
AuNP1CLPFFD'
AuNP1THRCLPFFD'
@ApoE' !5,4x10!2$ !5,3x10!2&
@ApoE' !5,3x10
!8,02&x10 !2& &
!2
Control'
Citrato' !8,02&x10!2&
Figura 53. Imágenes de Fluorescencia de cerebros extraídos a 2 y 24 horas post inyección !7,1x10!2&
intraperitoneal de NE-CLPFFD; NE-THRCLPFFD y de NE-CLPFFD@ApoE; NE-THRCLPFFD@ApoE.

Las muestras fueron marcadas con el fluoróforo comercial Alexa fluor 750. !6,2x10!2&
Como se aprecia en los resultados en las Figuras 65 y 66 existe una diferencia!5,3x10

al !2&
emplear ApoE sobre las NE estudiadas. Es posible indicar que el hecho de emplear ApoE
contribuye a mejorar la llegada de NE al cerebro, indicando a su vez que es posible
130
modificar la CP. A partir de estos datos se puede indicar que es posible la capacidad de
poder modular la distribución modificando la CP. Así la CP es relevante y debe
considerarse al momento de diseñar nuevos fármacos basados en NM.
Cerebro 24h
Cerebro 2h ns ns
***
*
*** ns
Intensidad promedio Δ% de referencia

***
Intensidad promedio Δ% de referencia
*
25 ***
** 40
20 30
ns
15
* 20
10
5
10
0 0
l
oE
oE
D
oE
oE
D
D
tro
tro
FF
FF
FF
FF
Ap
Ap
Ap
on
Ap
on
LP
LP
LP
LP

@
@
C
@
C
C
C
D
C
D
D
E-
R
FF
FF
E-
R
FF
FF
TH
N
TH
N
LP
LP
LP
LP
E-
E-
C
C
N
C

E-
N
E-
R
TH
N
TH
N
E-
E-
N
N
Figura 54. Determinación de fluorescencia ex vivo. Comparativa de fluorescencia entre cerebros de ratas
con diferentes tratamientos y ratas control inyectadass con citrato. Intensidades obtenidas a las 2h y a
las 24h luego de la administración (A y B, respectivamente). Numero de animales por experimento=3, se
grafica la desviación estandar muestral, *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.

Concentración de oro (µg Au /g de tejido)
Cerebro
Control Citrato
0.5
*** NE-‐CLPFFD
NE-‐CLPFFD ApoE
0.4
0
NE-‐THRCLPFFD

0.3 NE-‐THRCLPFFD ApoE
***
0.2 ***
***
*
**
0.1

0.0
0 2 24

Tiempo (h)

Figura 55. Determinación de oro por activación neutrónica ex vivo. Comparativa de niveles de oro entre
cerebros de ratas con diferentes tratamientos. A 2h y 24h luego de la administración. Numero de
animales por experimento=3, se grafica la desviación estandar muestral, *p<0,05; **p<0,001;
***p<0,0001.
131
Al considerar este último punto, sobre los resultados obtenidos in vivo posiblemente sea
una interacción diferencial con proteínas presentes en el plasma las responsables de
facilitar el transporte a través de la BHE determinado en ciertas NpO, lo cual da cuenta que
posiblemente la CP pueda estar implicada en nuevas vías de transporte a través de la BHE
mediada por receptores que inducen transcitosis para alguna de estas proteínas, como por
ejemplo receptores de LDL. Así estos últimos resultados permiten apoyar la hipótesis de
que el cruce de la BHE por las NpO-péptido está mediado por la interacción con proteínas
del plasma como se planteó inicialmente.[34, 50, 158]
132
7. DISCUSIÓN GENERAL Y PERSPECTIVAS.
La obtención adecuada de NpO-péptidos conlleva a considerar la caracterización con
gran relevancia, así, la síntesis de NpO, de péptidos y la posterior funcionalización se hace
crucial. Así considerando los resultados obtenidos, se observa que los péptidos obtenidos
presentan una pureza superior al 95% y según su masa corresponden al péptido deseado,
dicha pureza resulta adecuada para su posterior utilización en aplicaciones biológicas. Las
NpO obtenidas en paralelo se observaron por TEM, DLS y según su RSP poseen una
dispersión de tamaño, carga y homogeneidad adecuada para los estudios posteriores. La
posterior conjugación NpO-Péptidos fue demostrada bajo una serie de experimentos como
XPS, AAA, DLS, TEM, UV-vis, pot-Z, resultados que confirman la obtención de estos
últimos, los cuales presentan características aptas para los ensayos biológicos. De estos
conjugados, a excepción de NE-THRCLPFFD presentan diámetros hidrodinámicos muy
similares. Mientras que las NV-CLPFFD por su parte presentan un DLS asociado a su
componente longitudinal. A su vez se aprecia que los valores de pot-Z para los conjugados
de NE son muy similares y diferentes a los obtenidos por NV.
Para el caso de las NE, posiblemente el recubrimiento de péptidos se da por el grado de
empaquetamiento que los péptidos puedan tener en la superficie. Aparentemente el
espaciador PEG favorecería este empaquetamiento para la secuencia CLPFFD. Mientras
que el constructo de THRCLPFFD al disponerse en forma de Y, disminuye el grado de
funcionalización de la partícula. Por su parte los datos de XPS indicarían que la
funcionalización es adecuada y el tipo de interacción entre la superficie del oro y los
péptidos se debe posiblemente una reacción con el grupo Tiol.
Empleando estos conjugados, in vitro se aprecia que las NpO se mantienen estables
luego de incubarlas en plasma observándose un desplazamiento del máximo de
absorbancia dado por la RSP en los espectros UV-vis así como las imágenes TEM y los
133
datos obtenidos por DLS indicarían un efecto sobre la superficie de las NpO, no atribuible a
agregaciones y posiblemente dados por la formación de la CP.
Las NE funcionalizadas son compuestos que presentan un comportamiento adecuado in
vitro en células, no muestran toxicidad aparente en los ensayos de toxicidad llevados a
cabo, dando cuenta que dichas NE no son toxicas en el rango de concentraciones
ensayadas. En el caso de las NV estudiadas, es posible disminuir la toxicidad, la cual está
relacionada con la presencia de CTAB. El CTAB puede eliminarse luego funcionalizar las
NV con péptidos sin que se pierda estabilidad coloidal.
Entre los ensayos in vitro, aquellos ensayos preliminares de incubación de NpO con
proteínas como Aβ y albúminaa, dan cuenta de efectos de las mismas, en interacciones,
actividad y también en conformación, dando cuenta de cambios que pueden tener
repercusión y que deben ser considerados junto a muchos otros cambios que pueden
presentar las proteínas que interactúen con las NpO en el organismo. Se hace importante
considerar dichos cambios que pueden tener repercusiones a largo plazo por el empleo de
NpO.
Si bien las NpO estudiadas en el desarrollo de esta tesis, se obtuvieron sin observarse
efectos no deseados a nivel celular no deben descartarse otros efectos a nivel molecular,
como por ejemplo a nivel de la actividad de proteínas o enzimas, por cambios
conformacionales que puedan tener repercusión en la actividad proteica.
Dado que la hipótesis plantea que modificaciones sobre la superficie de las NpO puede
llevar a patrones diferenciales de la CP que afecten a la distribución, al analizar los
resultados, es interesante destacar que al evaluar los geles bidimensionales, la primera
observación es que la totalidad de los conjugados se unieron a las proteínas mayoritarias
del plasma, obteniéndose un patrón de bandeo muy robusto entre los mismos, por lo cual
posiblemente estas interacciones solo son inespecíficas y no se dan según las propiedades
134
de las NpO y claramente muchas de estas interacciones inespecíficas sobre las NE
empleadas in vivo, dan cuenta de la explicación de la gran acumulación de las mismas en
órganos como el hígado y el bazo, así proteínas como opsoninas (Ig, proteínas del
complemento, fibrinógeno) se relacionan con la acumulación observada en órganos no
deseados como hígado y bazo. Sin embargo, se debe considerar otras interacciones con
proteínas como las ApoE, que interesantemente se detectan en las muestras de NE-
THRCLPFFD, NV-CLPFFD y en una menor proporción en NE-CLPFFD, posiblemente sean
candidatos para conseguir que estas NpO penetren la BHE por receptores como LRP1
favorecidas por la ApoE. Otra proteína interesante es la albúminaa, si bien la cantidad de
dicha proteína unida a los conjugados es muy baja, no lo es en aquellas NE-THRCLPFFD.
Así, posiblemente la mayor penetración al cerebro observada en los estudios de
biodistribución se deba también al recubrimiento con esta proteína.
Dados los estudios in vivo considerados en el objetivo 8, es destacable considerar como
es posible lograr que las NE lleguen al cerebro al modificar su superficie. De los resultados
expuestos, las modificaciones como CLPFFD, permiten mejoras respecto de las NE para
llegar al cerebro. Asimismo, la incorporación de la secuencia THR, permite aumentar los
niveles de NE en cerebro, dando cuenta de las posibilidades que las mismas presentan.
Los estudios con NE-CK/CLPFFD*SFB[18F] permiten dar cuenta de las potencialidades de
las NE para ser multifuncionalizadas, la capacidad que estas poseen para estudios in vivo
en diagnóstico. En este contexto también es importante mencionar que las NE se pueden
excretar tanto por vía renal como biliar. Sin embargo, hay que considerar que la señal del
marcador radiactivo (SFB[18F]) que una cierta cantidad de marcaje puede ser removida
desde la superficie de las NE, indicando que pueden existir cinéticas de intercambio de
moléculas en la superficie de las NE
Al analizar los datos de las interacciones con proteínas del plasma del objetivo 7 es
135
posible dar cuenta de lo evaluado anteriormente in vivo, indicando los efectos de las
interacciones sobre el destino que las NpO pueden tener en el organismo. Por medio de
este tipo de estudios es posible predecir el destino de aquellas NpO con similitudes. Así, al
realizar una comparación de los geles en 2D se pudo apreciar un bandeo similar de
proteínas totales para aquellos conjugados que presentan la secuencia LPFFD, lo cual
puede indicar que esta secuencia podría estar relacionada con determinadas interacciones
que pueden predecir el destino in vivo.
En relación a la hipótesis, la ultima parte del desarrollo del objetivo 8 se centró en
demostrar como es posible modificar la CP, y de esta manera afectar la distribución
mejorando considerablemente los niveles de NpO en cerebro. De esta manera se demostró
que pequeños cambios sobre la CP conducen a cambios importantes en la distribución de
las NpO, lo cual abre las puertas a nuevos estudios que permitan modular la CP
considerando nuevas aplicaciones farmacéuticas. Esto ultimo también se complementa con
el efecto que tiene ApoE de mejorar la llegada de las NpO al cerebro. Dado dichos
resultados, el plantear la posibilidad de conseguir favorecer ciertas interacciones, y
disminuir otras para mejorar la entrega de las NE al cerebro puede ser una estrategia
interesante para mejorar la llegada de NM al cerebro.
Entre las diferentes consideraciones que se deben tener en cuenta al momento del
diseño de una molécula con aplicación biomédica, es necesario conocer las limitaciones de
las mismas. Una consideración es la limitación de concentración a la cual se puede trabajar
con las NE. Existen concentraciones críticas a las cuales las NE podrían agregarse, por
pérdida de estabilidad. Se debe considerar que la carga que de alguna forma mantiene a
las NE estables en solución lo que puede llevar consigo a cambios no esperados in vivo, en
donde las interacciones con biomoléculas se vuelven mas complejas. En este sentido el
recubrimiento de NpO con péptidos como CLPFFD, cf-CLPFFD, THR-CLPFFD, llevan
136
consigo cambios en las propiedades fisicoquímicas de las mismas como por ejemplo un
cambios en los valores de pot-Z.[61] Es sabido que las NE (funcionalizadas o sin
funcionalizar) forman complejos con proteínas y moléculas biológicas, permaneciendo
estables en medios biológicos como por ejemplo en plasma, pero esto lleva consigo a una
nueva entidad que no se sabe cual será su comportamiento o su efecto sobre la
biodistribución. En gran parte la CP es la responsable de la distribución, como por ejemplo
en el caso de las opsoninas que llevan a una acumulación en hígado y bazo y eso puede
ser atribuido al recubrimiento con las mencionadas opsoninas que reconocen cargas
negativas, como es el caso de las NE. Asimismo, otras proteínas que puedan interaccionar
con NE pueden favorecer la entrega de estas a otros órganos como es el caso de las
interacciones con especies anfipáticas como las apolipoproteínas, como por ejemplo ApoB
y ApoE presentes en la sangre, mediando así el reconocimiento de receptores de
lipoproteínas, lo cual puede favorecer mecanismos de transcitosis a través de barreras
como la BHE. Considerando que CLPFFD es anfipático, puede favorecer este tipo de
interacciones que pueden llevar a mejorar el paso de la BHE respecto de las NE. Otras
proteínas que pueden ser reconocidas por receptores que median la transcitosis mediada
por receptores son la transferrina, la insulina, y también otras proteínas como albúmina que
pueden inducir otro tipo de transcitosis. Saber que las NE interaccionan con proteínas del
plasma abre muchas posibilidades para comprender la distribución de las mismas.[109, 182]
Si bien CLPFFD se menciona que puede ser reconocido por el receptor RAGE, tal vez
esté involucrado en permitir que NE-CLPFFD cruce la BHE en mayor proporción respecto a
las NE,[82-85] lo cual debe ser probado en futuros trabajos. Sin embargo, dados los resultados
obtenidos, es más probable que sea la interacción con proteínas del plasma las que
contribuyan en gran medida a cruzar la BHE.
Otra consideración no menor, es el efecto de eflujo de la BHE, dado principalmente por
137
el transporte relacionado al transportador de glicoproteína-P (P-gp), el cual está
constantemente previniendo la acumulación significativa de sustancias ajenas al cerebro.
Por lo cual es valido considerar para estudios posteriores, el emplear estrategias
quimioterapéuticas para prevenir el reconocimiento de las NpO por P-gp, posiblemente los
péptidos evaluados en estos estudios actúen evitando el efecto eflujo que si puede
presentar la NE sin funcionalizar. O quizá dicho eflujo sea inducido y esa sea una de las
razones por la cual no hubo mayor acumulación en cerebro. A futuro será necesario evaluar
este tipo de interacciones y proponer estrategias como emplear polisorbato 80, que
permitan evitar estos posibles eflujos no deseados.[124, 183-186]
Si bien los resultados expuestos dan un indicio de que una pequeña cantidad de NpO a
nivel del cerebro, enfermedades como la EA en estadios mas avanzados presentan
comportamientos inflamatorios, lo que lleva a una vascularización del cerebro algo mas
permisiva, contexto en donde posiblemente exista un mayor ingreso de NpO al cerebro lo
que posiblemente permitirá un mejor acceso para una posible terapia empleando NM.[187]
Se espera a futuro poder predecir el comportamiento in vivo que puedan tener los
diferentes NM, en este caso NpO con diferentes moléculas en superficie y así según el tipo
de interacción con las proteínas plasmáticas explicar su farmacocinética. Asimismo, se
propone como una posibilidad para nuevos estudios desarrollar estrategias para controlar
estas interacciones según el blanco terapéutico deseado. Para lo cual es necesario plantear
la posibilidad de favorecer ciertas interacciones, y disminuir otras para mejorar la entrega de
las nanopartículas selectivamente hacia el blanco terapéutico deseado. A estos estudios
resultarán complementarios otros estudios biofísicos que se lleven a cabo con modelos de
membrana y paralelamente con la evaluación de la interacción con la CP lo que
paralelamente contribuirá a explicar el comportamiento de las NpO in vivo.
138
A partir de los datos obtenidos la interacción inespecífica con ApoE puede mejorar la
penetración al cerebro y posiblemente otras proteínas como albúminaa, estén implicadas en
otras vías para mejorar su llegada al cerebro. Por lo mismo resultará interesante evaluar el
comportamiento de las NpO incubada con esta u otras proteínas in vivo, para determinar
otras interacciones que pueden favorecer la llegada al cerebro.
A su vez resultará interesante analizar si existe alguna estrategia que permita disminuir
las interacciones que pueden traer consigo repercusiones negativas, como por ejemplo el
recubrimiento con PEG de alto peso molecular.
8. CONCLUSIONES GENERALES.
Los péptidos obtenidos presentan una pureza superior al 95% tal como se determinó por
HPLC confirmadose su identidad por Espectrometría de Masas MALDI-TOF/MS y ES-
MS/HPLC
-Se obtuvieron NE y NV con un tamaño y relación de aspecto deseados, como se
aprecia al evaluar la señal dada por la resonancia de plasmón superficial, las imágenes
TEM y los datos de DLS.
-Las NE y NV funcionalizadas con los péptidos son estables en diferentes medios.
-Para todas las NpO estudiadas se forma la corona de proteínas que contribuye a
estabilizar las NpO.
-Para las NE no se observan efectos sobre la viabilidad celular a las dosis ensayadas.
-La funcionalización de NV con péptidos aumenta la estabilidad de las mismas
reduciendo los niveles de CTAB y los efectos sobre la viabilidad celular.
-Se observan pocos efectos sobre la estructura secundaria de la Albumina en presencia
de NpO-péptido, Sin embargo, el cambio en la elipticidad observado en la albúmina en
139
presencia de NE y NV podría atribuirse a la quemisorción de la Cys34 presente en la
Albumina sobre la superficie de las NpO. Por lo cual el recubrimiento con péptidos podría
estar disminuyendo los efectos sobre la estructura de las proteínas.
-Existe una alta acumulación en hígado y bazo, lo cual se debe al Sistema fagocitico
mononuclear debido al recubrimiento con proteínas como Inmunoglobulinas y proteínas del
complemento.
-Las NE-CLPFFD llegan al cerebro, lo que puede deberse a receptores que median la
transcitosis a través de la BHE como el receptor RAGE o al recubrimiento con proteínas
como ApoE, Albúmina, transferrina que favorecen la transcitosis a través de la BHE.
-La incorporación de la secuencia THR a LPFFD permite una mayor permanencia de las
NE en cerebro lo cual puede representar una ventaja para una aplicación terapéutica.
-Es posible mejorar la llegada de NE al cerebro luego de incubar estas con ApoE. Por lo
que se demostró que es posible modificar dicha corona de proteínas y así modificar la
distribución de NpO
-En relación a lo determinado en los estudios llevados a cabo en el desarrollo de esta
tesis, el recubrimiento de las NpO con péptidos, conduce a cambios que permiten una
mayor estabilidad, disminuir potenciales efectos citotóxicos y mejorar la biocompatibilización
de los mismos.
-La composición de la corona de proteínas está ligada al comportamiento de las NpO in
vivo, promoviendo la acumulación en hígado, bazo y otros órganos como cerebro, lo que
permitiría el diseño de nuevas estrategias para modular su distribución.
-La modificación de la corona de NpO con proteínas como ApoE conduce a un aumento
de la llegada de las NpO al cerebro lo que representa una herramienta para posibles
aplicaciones farmacéuticas.
140
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150
10. ANEXOS:
Figura A1. Cromatograma HPLC para los péptidos CLPFFD; CALNNLPFFD; CpegLPFFD; CALNN;
Cpeg; THRPPMWSPVWPCLPFFD. Realizado en un gradiente 5% a 100% de B en A donde B: ACN con
0,036% de TFA y A: agua con 0,045% de TFA. Tiempo del gradiente: 8 minutos, flujo: 1,2 ml/minuto,
columna C18 a temperatura ambiente, inyección 4 µL. λ de detección 220nm.
151
CLPFFD
5100
SG clpffd 70 (5.992) Cm (6:128) 1: Scan ES+
100
101.10 2.34e4
A
740.32
%
741.34
142.07
742.35
143.04
299.78 471.90 753.29 825.20 1480.71
150.88 259.74 391.71 552.10 574.40 653.40 876.43 1045.92 1110.73 1232.47 1261.73 1376.82
0
m/z
SG clpffd 72 (6.165) 1: Scan ES+
100
740.38 1.95e5
B
741.40
%
742.41
101.04
142.21 770.17 965.59 1174.93

284.92 371.17 670.59 844.15 1364.37
238.48 485.45 540.35 611.16 995.84 1068.94 1233.21 1415.66 1457.01
0 m/z
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
Figura A2. Caracterización por masa de CLPFFD, peso molecular teórico 739,873g/mol A) Espectro
MALDI-TOF del péptido CLPFFD. Matriz de ácido 2,5-dihidrobenzóico (DHB) a una concentración de
+ + + +
10mg/mL en ACN/ácido fórmico 0,1% v/v (1:2); [M+Na ] 762,2479 y [M+K ] 778,2223 B) Espectro ES-
MS del péptido CLPFFD; M+1/Z 740,4 y M+2/2Z 371,2
152
5100
CALNNLPPFFD
A
SG-CALNNLPFFD V 71 (6.117) 3: Scan ES+
100
142.00 2.34e6
5100
SG-CALNNLPFFD V 71 (6.117)
5100 3: Scan ES+
100
142.00 2.34e6
100
142.00 2.34e6
5100
m/z
5100
B
142.00
SG-CALNNLPFFD V 71 (6.117) 2.34e6
3: Scan ES+
%
100
100
142.00 2.34e6
1152.53
1153.55
5100
% %
100
142.00 2.34e6
1154.49
1152.53
1152.53
143.02 1153.55
524.24 576.77 1155.51

1153.55
201.04 507.18 629.30
220.88 1156.59
280.11 402.18 637.29 741.26 769.49 873.40 907.38 1020.61 1077.88
1302.58 1333.71 1442.12
% %
0 m/z
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
1154.49
1154.49
1152.53
Figura
143.02
A3. Caracterización por masa de CALNNLPFFD, peso molecular teórico 1152.318g/mol A) 1152.53
143.02 524.24 576.77 1155.51
1153.55
Espectro
201.04
MALDI-TOF
220.88
280.11 402.18
del péptido
507.18
524.24 576.77 CALNNLPFFD.
629.30
637.29 741.26 769.49 Matriz
873.40 907.38 de ácido 2,5-dihidrobenzóico
1020.61
(DHB) a una
1302.58 1333.71 1442.12
1153.55
1155.51
1077.88 1156.59
0 201.04 507.18 629.30 m/z
220.88
280.11 637.29 741.26 769.49 873.40 907.38 1077.88 1156.59 + + 1333.71 + +
concentración
100 200 300
de 10mg/mL
400
402.18 500
en 600
ACN/ácido
700
fórmico
800 900
0,1%1000
v/v (1:2);
1020.61 1100
[M+Na
1200
] 1174,497
1300
1302.58 14001442.12
y
m/z [M+K ]
%
0
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
1190,4796 B) Espectro ES-MS del péptido CALNNLPFFD. M+1/Z 1152,5 y M+2/2Z 576,8
1154.49
1154.49

1152.53
143.02
143.02 1153.55
1155.51
524.24 576.77
524.24 576.77 629.30

201.04 507.18 1155.51
1156.59
220.88 769.49
201.04 280.11 402.18 507.18 629.30637.29 741.26 873.40 907.38 1020.61 1077.88
1302.58 1333.71 1442.12
0 220.88 1156.59 m/z
280.11 402.18 637.29 741.26 769.49 873.40 907.38 1020.61 1077.88
1302.58
1333.71
0100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 14001442.12 m/z

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
1154.49
143.02
524.24 576.77 1155.51
201.04
220.88
280.11 402.18
507.18 629.30
637.29 741.26 769.49 873.40 907.38 1020.61
1077.88 1156.59
1302.58
1333.71
1442.12
0 m/z
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

153

CpegLPPFFD

A
5100
SG-C-PEG-LPFFDV
100
71 (6.117)
1042.48
3: Scan ES+
9.16e6

5100
5100
SG-C-PEG-LPFFDV 71 (6.117)
100
1042.48
3: Scan ES+
9.16e6
SG-C-PEG-LPFFDV 71 (6.117) 3: Scan ES+
100
1042.48 9.16e6
1043.49
m/z
5100
SG-C-PEG-LPFFDV 71 (6.117) 3: Scan ES+
100
1042.48 9.16e6
%
B 1043.49
1043.49
%
1044.51
%
1043.49
142.00
522.00
1045.46
513.54
524.24 1046.47
1044.51
143.02
263.05 280.11 406.17 455.86 763.33 811.39 910.49 939.53 1203.09
%
526.47 637.22 741.33 1165.52 1314.76 1391.10 1458.91

0 m/z
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
1044.51 1200 1300 1400
Figura
142.00 A4. Caracterización522.00
por masa de CpegLPFFD, peso molecular teórico 1041.973g/mol A) Espectro
1045.46
MALDI-TOF
142.00 del péptido CpegLPFFD.
513.54
522.00
Matriz de ácido 2,5-dihidrobenzóico (DHB) a una concentración de
524.24 1046.47
1045.46
143.02 406.17 763.33 811.39 +939.53
+ + + + +
0 10mg/mL263.05
en280.11
ACN/ácido
455.86
fórmico
513.54 526.47 0,1% v/v (1:2); [M+H
637.22 741.33
910.49
] 1042,5735,
1044.51
[M+Na
1165.52
1203.09
]1314.76
1064,5360
1391.10 1458.91 y [M+K ]
m/z
100 200
143.02 300 400 500 524.24 600 700 800 900 1000 1046.47
1100 1200 1300 1400
406.17 455.86 763.33 811.39 910.49 939.53 1203.09
0 1080,5157 B) Espectro ES-MS del péptido CpegLPFFD. M+1/Z 1042,51165.52
263.05 280.11
y M+2/2Z1314.76
526.47 637.22 741.33 522 1391.10 1458.91 m/z
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
142.00
522.00
1045.46
513.54
524.24 1046.47
143.02 406.17 763.33 811.39
263.05 280.11 455.86 910.49 939.53 1203.09
526.47 637.22 741.33 1165.52 1314.76 1391.10 1458.91
0
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
m/z

154

5100
100 CALNN
SG-CALNN V 22 (1.323) Cm (14:32)
83.06
141.99
3: Scan ES+
7.58e5
A
101.02
533.15
%
534.17
118.98 545.19
516.17
142.98 546.17
220.94 499.15
187.96 246.04 258.12 359.17 402.15 414.10 898.15 990.32
548.09 636.19647.11 685.28 788.61 800.06 811.14 916.27 932.41
0 m/z
SG-CALNN V 22 (1.323) 3: Scan ES+
100
533.15 2.85e6
B
%
534.17
142.00 545.15
83.06 516.13
546.17
499.11
119.01 143.01 246.03 402.14 547.19
229.01 288.14298.45 359.14 414.07 587.33 696.23732.30 799.97 819.50 898.15
917.41 969.68
0 m/z
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
Figura A5. Caracterización por masa de CALNN, peso molecular teórico 532.603g/mol A) Espectro
MALDI-TOF del péptido CALNN. Matriz de ácido 2,5-dihidrobenzóico (DHB) a una concentración de
+ + + + + +
10mg/mL en ACN/ácido fórmico 0,1% v/v (1:2); [M+H ] 533,2823 [M+Na ] 555,2576 y [M+K ]
571,2569 B) Espectro ES-MS del péptido CALNN. M+1/Z 533,2

155
Cpeg
A
SG-Cpegconh fr10 43 (2.585) Cm (23:60) 1: Scan ES+
100
423.22 1.47e5

100
423.22 1.47e5
100
423.22 1.47e5
83.15
m/z
%
B
100
423.22 1.47e5
83.15
83.15
845.39
101.08
%
%
424.27
845.39
846.39
425.28
101.08 847.45
83.15 845.39
101.08 142.10
150.69 212.22 240.78 303.21 321.20 366.93 426.28 466.04
424.27 568.09 844.41 848.49 892.58 945.02 986.05
585.90 624.08 672.98 688.86 779.59
0 m/z
50 100 150 200 250 300 350 400 424.27
450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
%
%
846.39
Figura A6. Caracterización por masa de425.28
Cpeg, peso molecular teórico 422,157g/mol A) Espectro MALDI-
847.45
846.39
TOF del péptido
142.10 Cpeg. Matriz de ácido 2,5-dihidrobenzóico
425.28
(DHB) a una concentración
847.45
848.49
de 10mg/mL en
150.69 212.22 240.78 303.21 321.20 366.93 426.28 466.04 568.09 844.41 892.58 945.02 986.05
+ + + +
585.90 624.08 672.98 688.86 779.59 +845.39
+
ACN/ácido
0
50 100
101.08
fórmico
142.10
150150.69 200
0,1%
240.78 v/v
212.22 250
(1:2);
300 321.20
[M+H
350 366.93
]450423,249
400 426.28 466.04
500
[M+Na
550
568.09 600
] 650
445,2362
700
y [M+K
750
] 848.49
800844.41850
463,241
900
B) Espectro
892.58 950
m/z
1000
945.02 986.05
303.21 585.90 624.08 672.98 688.86 779.59
0 m/z
ES-MS
50 100del 150
péptido
200 Cpeg.
250 M+1/Z
300 350 423,2,
400 M+2/2Z
450 500 212,2,
550 600 M+3/3Z
650 142,1
700 750 y 800
posiblemente
850 900 un 1000
950 dímero
424.27
2M+1/Z 845,4
846.39
425.28
847.45
142.10
150.69 212.22 240.78 303.21 321.20 366.93 426.28 466.04 568.09 844.41 848.49 892.58 945.02 986.05
585.90 624.08 672.98 688.86 779.59
0 m/z
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
156
500 2500

THRPPMWSPVWPCLPFFD
SG-THR B 5100 de 500-2500 66 (6.067) Cm (57:80) 3: Scan ES+
100
738.67 1.03e6
A
%
757.40 1107.37
732.96
688.88
1155.29
524.49 845.65 1106.71 1155.94 m/z
595.96 885.80 967.51 1325.59
1218.34 1476.54 1613.01 1818.13 2212.82 2394.14
0
SG-THR B 5100 de 500-2500 66 (6.067) 3: Scan ES+

100
738.65 1.13e7
B
%
1107.34
732.98
1108.31
694.58
524.39 845.53 885.75 1136.01 1258.55 1715.91 1926.10 2476.54
1041.80
596.30 1389.191476.54 1654.30 1992.11 2182.77 2213.47 2390.21
0 m/z
500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400
Figura A7. Caracterización por masa de THRPPMWSPVWPCLPFFD, peso molecular teórico 2212,603g/mol
A) Espectro MALDI-TOF del péptido Cpeg. Matriz de ácido 2,5-dihidrobenzóico (DHB) a una concentración
+ + + + + +
de 10mg/mL en ACN/ácido fórmico 0,1% v/v (1:2); [M+H ] 2212,264 [M+Na ] 2235,2764 y [M+K ]
2250,2456 B) Espectro ES-MS del péptido Cpeg. M+1/Z 2213,5, M+2/2Z 1107,3 y M+3/3Z 738,7
157

Figura A8. Cromatograma HPLC para el péptido CK. Realizado en un gradiente 0% a 100% de B en A
donde B: ACN con 0,036% de TFA y A: agua con 0,045% de TFA. Tiempo del gradiente: 8 minutos, flujo:
1,2 ml/minuto, columna C18 a temperatura ambiente, inyección 4 µL. λ de detección 220nm.

Figura A9. Caracterización por masa de CK, masa molecular teórica 248.331g/mol. Matriz de ácido 2,5-
dihidrobenzóico (DHB) a una concentración de 10mg/mL en ACN/ácido fórmico 0,1% v/v (1:2); [M+H]
249,143.
158
D)
)
D)
PFF
FD
PFF
LPF
D)
NL
D)
N)
)
PFF
e gL
PFF
AB
eg)
LN
LN
RC
#C A
#C A
#C T
# TH
#C p
#Cp
#C L
#C L
)
NV
NV
NE
NE
NE
NE
NE
NE
NE
#250kD)
#150)
#100)
#75)
#50)
#37)
#25)
#20)
#15)
Figura A10: Proteínas separadas de la superficie de las NpO-péptido vistas por Geles en 1D SDS-
Page. Gel de poliacrilamida al 10% y marcado con plata, las muestras corresponden a las proteínas
cuantificadas y cargadas a 20µg por muestra.
Tinción&de&Nissl& Control& 2&horas&post&inyección&

NE6THR6CLPFFD(cf)&
Zona%pre%frontal%
Zona%Cuerpo%Estriado%
Zona%Hipocampo%
Figura A11. Localización de NE-THRCLPFFD(cf) en cortes de cerebros de ratas tratadas

intraperitonealmente con NpO-péptido. El cerebro fue seccionado en cortes de 20mm, las áreas del
cerebro fueron identificadas por tinción de Nissl.
159
Tabla A1: Proteínas y subunidades proteicas identificadas a partir de una muestra de proteínas
totales desde las proteínas separadas de la CP por LC-MS/MS, los valores corresponden al
entregado por el programa MASCOT, correspondientes en cada caso a la mayor probabilidad
obtenida a partir de los fragmentos que pudieron ser identificados para dicha proteína.
Descripción NE NE-CLPFFD NE-THRCLPFF NV-CLPFFD NV-CTAB
Alcohol dehydrogenase 1B 52,59
Alpha-1-acid glycoprotein 71,05
Alpha-1-antitrypsin 232,72 85,62 200,95
Alpha-actinin-1 95,12 70,06
Apolipoprotein A-I 197,85 391,58 236,6 1124,17
Apolipoprotein A-II 210,22 72,7 88,92 410,04
Apolipoprotein A-IV 256,45
Apolipoprotein B-100 316,28 72,55 1309,12
Apolipoprotein C-I 48,22
Apolipoprotein C-II 31,43 358,88
Apolipoprotein C-III 63,28 51,19 1174,79
Apolipoprotein D 52,11
Apolipoprotein E 656,91 445,12 681,25 931,34
Apolipoprotein F 124,21
Apolipoprotein M 90,45
Beta-2-glycoprotein 1 24,89 58,39 70,54 40,44
Beta-parvin 125,05
C4b-binding protein alpha chain 366,42 114,67 131,65
Ceruloplasmin 94,4 29
Clusterin 147,42 187,13 149,3 402,4
Coagulation factor V 120,55 370,13
Coagulation factor XI 152,21
Complement C1q subcomponent subunit A 33,92
Complement C1q subcomponent subunit B 186,6
Complement C1q subcomponent subunit C 51,77 72,87
Complement C1r subcomponent 102,02 137,44
Complement C1s subcomponent 169,89 90,49 232,96
Complement C3 133,5 107,73 389,47 98,09 326,56
Complement C4-A 1011,73 381,65 372,11 299,57 476,43
Complement C4-B 373,55 421,23 1104,84
Complement factor H 135,31 222,38 511,85 340,37
Complement factor H-related protein 1 60,92 147,08
160
Erythrocyte band 7 integral membrane protein 36,52 51,26
Fibrinogen alpha chain 108,14 89,48 59,78 120,74
Fibrinogen beta chain 45,98 156,3 124,49 111,96
Fibrinogen gamma chain 154,41 229,4 77,75 35,67 98,55
Fibulin-1 117,18 79,37
Filamin-A 30,49
Galectin-3-binding protein 125,54
Gelsolin 53,75
Haptoglobin 139,96
Hemopexin 80,72
Histidine-rich glycoprotein 140,99 420,02 1075,81 111,01
HLA class I histocompatibility antigen, B-58 alpha chain 98,34 109,21
Hyaluronan-binding protein 2 30,73
Ig alpha-1 chain C region 86,6 51,32 266,02
Ig gamma-1 chain C region 104,05 207,61 239,13 63,91 383,53
Ig gamma-2 chain C region 108,4
Ig gamma-3 chain C region 174,95 145 104,99 278,02
Ig gamma-4 chain C region 221,35
Ig heavy chain V-III region BRO 147,5
Ig kappa chain C region 196,25 216,26 482,43 78,39 717,18
Ig kappa chain V-III region B6 80,64
Ig kappa chain V-III region HAH 77,97
Ig kappa chain V-III region SIE 122,9
Ig lambda-1 chain C regions 46,05 194,31 138,91
Ig lambda-2 chain C regions 101,19 199,01 462,99
Ig lambda-6 chain C region 127,56 223,39
Ig mu chain C region 338,1 273,31 93,6
Ig mu heavy chain disease protein 78,01 47,47

Insulin-like growth factor-binding protein complex acid
98,2 79,35
labile subunit
Integrin alpha-IIb 119,41 365,13 386,41 139,98
Integrin beta-3 47,76 45,53
Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 48,12
Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 80,67 120,31
Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 199,65 466,92 393,75
Keratin, type I cytoskeletal 10 94,76
Keratin, type I cytoskeletal 9 78,77 38,87
Keratin, type II cytoskeletal 1 90,24 61,84 84,65 113,58 144,05
Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal 75,82
Keratin, type II cytoskeletal 75 122,39
Kininogen-1 96,61
161
Lipopolysaccharide-binding protein 73,22
Lumican 76,55
Multimerin-1 22,7 38,89
Myosin-9 199,13 104,94 113,68
Plasma kallikrein 52,72
Plasma protease C1 inhibitor 74,13
Plasminogen 40,15 183,71 319,1
Platelet basic protein 22,1
Platelet factor 4 70,77 36,59
Platelet glycoprotein 4 60,83
POTE ankyrin domain family member E 80,52 93,31
POTE ankyrin domain family member F 119,91
POTE ankyrin domain family member J 29,66
Prothrombin 33,39
Ras-related protein Rap-1b-like protein 63,22 88,77 93,45
Retinol-binding protein 4 45,15 127,74
Serotransferrin 607,8 304,56 508,94

134,56 456,89
Serum albúmina 298,05 922,04 733,6 803,46 2159,5
Talin-1 79 113,6 72,82
Thrombospondin-1 54,98 61,6
Transthyretin 38,62 75,93 493,67
Tubulin alpha-1C chain 83,15
Tubulin beta-1 chain 51,23
Tubulin beta-2A chain 48,92 41,69
Vitamin K-dependent protein S 130,62 56,94 117,13
Vitronectin 137,56 86,53 502,26 120,62 249,87
von Willebrand factor 51,77
162

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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

“Implicancias Farmacéuticas de la Conjugación de

Tesis presentada a la Universidad de Chile

SIMÓN JUAN GUERRERO RIVERA

Dr. Marcelo Javier Kogan (Director)

Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y

SIMÓN JUAN GUERRERO RIVERA

Dr. Marcelo Javier Kogan ___________________________

Dr. Fernando Albericio ___________________________

Comisión Informante de Tesis:

Dr. Guillermo Díaz A. (Presidente) ___________________________

Dra. Mª Antonieta Valenzuela P. ___________________________

Dr. Carlos Díaz V. ___________________________

Dr. Michael Seeger P. ___________________________

Dr. Roberto Ebensperger G. ___________________________

Me gustaría comenzar agradeciendo a mis Padres y mi hermana, a los

A todos mis compañeros de laboratorio con los cuales he compartido estos

Quiero agradecer a la comisión por todo el apoyo dado en estos años,

A todos ustedes muchas gracias.

Este trabajo contó con el apoyo y financiamiento de los siguientes proyectos:

Beca CONICYT 2009-2012 (Simón Guerrero)

Beca apoyo tesis Doctoral CONICYT 24110109/2011 (Simón Guerrero)

Proyecto FONDECYT 113045 (Marcelo Kogan)

Proyecto AECI (Fernando Albericio-Marcelo Kogan)

(2010) “Improving the brain delivery of gold nanoparticles by conjugation with an

(2012) “Synthesis and in vivo evaluation of the biodistribution of a 18F-labeled conjugate

Índice de Tablas XII

1.2 Nanomateriales y fototermia, posibles aplicaciones en salud. 2

1.2.1 Obtención de NE y NV para fines biológicos. 4

1.2.2 Funcionalización y estabilización de NpO para usos farmacéuticos. 6

1.2.3 Caracterización de NpO y Conjugados: Tamaño y carga,

1.3 La enfermedad de Alzheimer (EA) y el uso de NpO. 15

1.3.1 Estrategias para el tratamiento de la EA empleando péptidos 18

1.4 Farmacocinética, estabilidad, toxicidad y penetración celular de las NpO. 21

1.4.1 Pasaje de NpO a través de la BHE. 24

1.4.3 Estrategias para aumentar la llegada de las NpO al Cerebro. 26

1.5 Toxicidad de NpO. 28

1.6 Interacción de nanopartículas con proteínas plasmáticas, formación de la

1.6.1 Formación de la CP. 31

1.6.2 Efectos de la CP sobre la farmacocinética y la toxicidad 34

1.6.3 Posibles efectos de NM sobre la estructura y función de las proteínas. 39

5.1 Síntesis de las secuencias CLPFFD, CALNNLPFFD, CALNN, 43

5.2 Caracterización de los péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD, CpegLPFFD,

5.2.1 Cromatografía líquida de alta eficiencia. 44

5.2.2 Espectrometría de masas desorción/ionización láser asistida por matriz. 45

5.2.3 Análisis de aminoácidos. 46

5.3 Síntesis de NE, NV, obtención de conjugados y caracterización. 47

5.3.1 Preparación del material 47

5.3.4 Obtención de conjugados de NE con péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD,

5.3.5 Obtención de conjugados de NV con el péptido CLPFFD. 49

5.4 Caracterización de las NpO y de los Conjugados NpO-péptidos 49

5.4.1 Caracterización por Espectrofotometría de absorción molecular. 50

5.4.2 Microscopía electrónica de transmisión. 51

5.4.3 Dispersión dinámica de la luz. 51

5.4.5 Espectroscopia fotoelectrónica de rayos X. 52

5.4.7 Activación neutrónica para la determinación de oro. 53

5.4.8 Fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo, con detector de masa o

5.4.9 Estimación de la concentración molar de NE y NV. 54

5.4.10 Análisis de aminoácidos. 55

5.5 Estudio de estabilidad de NpO y sus conjugados en PBS y plasma. 55

5.6 Evaluación de efectos de las NpO sobre la estructura y actividad de

5.6.1 Efectos de NpO sobre la estructura secundaria de la albumina