Práctica

5
Fragilidad Globular
La osmosis es la difusión de agua de un medio con menor
concentración de solutos hacia medios con mayor
concentración de solutos a través de una membrana
semipermeable, para lograr un equilibrio de concentraciones
a ambos lados de la membrana.

Las propiedades reológicas incluyen la combinación del

Objetivos
 Evaluar el estado de la fragilidad de
los glóbulos rojos frente a
condiciones osmolares y mecánicas.
estado funcional de las células sanguíneas, la viscosidad
sanguínea y la osmolaridad sanguínea. Los eritrocitos o
glóbulos rojos son fundamentales en el establecimiento de
las propiedades reológicas de la sangre ya que sus
membranas constituyen un modelo de la organización
molecular de las membranas plasmáticas.
La Fragilidad Globular es la resistencia globular la que
presentan los glóbulos rojos frente a soluciones hipotónicas
de diferente concentración, además compara la resistencia de
los eritrocitos normales y la de patológicos. Suspendidos en
la solución de NaCl en concentraciones decrecientes.

En condiciones fisiológicas, los eritrocitos se encuentran en

equilibrio osmótico con la sangre que los contiene. La forma
y el volumen de los eritrocitos cambian cuando varía la
cantidad de agua contenida en su interior, pudiendo tomar
una forma irregular al ocurrir pérdida o bien aumentar su
volumen hasta adquirir la forma de una esfera. Cuando la
célula no puede resistir la carga de agua que recibe, la
membrana se rompe

1
Biología Celular. Práctica 5. Fragilidad Globular

Introducción
Las características semipermeables de la membrana del glóbulo rojo normal y su forma de disco
bicóncavo, que le proporciona un área de superficie de 60-70% en exceso del mínimo necesario para
acomodar su contenido, le permiten cambiar de volumen y sufrir deformaciones transitorias, al variar
la presión osmótica del medio que le rodea (Figura 5.1). La cubierta de los hematíes actúa como una
membrana semipermeable que deja pasar con facilidad el agua, pero no la mayoría de las sales
disueltas. Cuando colocamos glóbulos rojos, en una solución hipertónica (Figura 5.1A) estos pierden
agua, para diluir la solución y establecer el equilibrio osmótico; por lo tanto, el glóbulo se deshidrata,
se hace pequeño y se arruga, tomando una forma característica llamada glóbulos rojos crenados.
Cuando colocamos glóbulos rojos en una solución hipotónica (Figura 5.1C), se presenta el fenómeno
contrario al explicado anteriormente. El agua penetra al glóbulo rojo para tratar de diluir su contenido
de sales y así equilibrar su presión osmótica, por lo tanto el glóbulo rojo se embebe de agua, aumenta
su tamaño, pierde la forma de lente bicóncava, aumenta de espesor y adquiere el perfil de un lente
biconvexa o hasta la forma de esfera; en esta etapa no pude resistir la tensión por imbibición y en
consecuencia, se rompe la membrana, se libera la hemoglobina y así tiene lugar la hemólisis.

Figura 5.1. Cambios morfológicos producidos en los eritrocitos, según las condiciones osmóticas del medio en el que se
encuentren. A: glóbulos rojos crenados; B: glóbulos rojos normales; C: glóbulos rojos en lisis.

El glóbulo rojo normal conserva su forma cuando está suspendido en el plasma o en una solución
salina fisiológica (0.85 - 0.90% m/v de NaCl) debido a un intercambio iónico balanceado entre la
célula y el fluido que lo rodea (Figura 5.1B). Si se coloca al glóbulo rojo en agua destilada sufre una
transformación rápida de disco bicóncavo y se rompe. Esto se debe a que la célula toma agua, debido
a la menor concentración osmótica en su interior, y cuando llega al límite de la relación área
superficie/volumen, ocurre la ruptura de la célula y la hemoglobina es liberada en el medio. Si
colocamos glóbulos rojos en soluciones hipotónicas de concentraciones intermedias entre estos dos
puntos extremos (solución de NaCl al 0.9% m/v y agua destilada), sufrirán lisis de acuerdo a la
concentración de la sal y al tiempo a que han sido expuestos a un medio ambiente iónico anormal. Si
fijamos un tiempo, el cual debe ser corto para obviar movimientos significativos de cationes a través
de la membrana, podemos medir la resistencia de los glóbulos rojos a ser lisados frente a soluciones
salinas hipotónicas. Esta es la base en que se fundamentan las pruebas de fragilidad globular osmótica.

Las pruebas que se emplean para evaluar la fragilidad osmótica miden la resistencia de los glóbulos
rojos a la hemólisis por estrés osmótico. A su vez, esta resistencia depende, en mayor parte, de la forma

2
Biología Celular. Práctica 5. Fragilidad Globular

del glóbulo rojo y su relación entre el área de superficie y el volumen. Una fragilidad globular
aumentada (o resistencia globular disminuida), se observa en:
• Condiciones asociadas con esferocitosis. Esto se debe a que los esferocitos tienen un área
de superficie reducida en relación a su volumen, por lo que, necesitan absorber muy poca
cantidad de líquido para llegar al punto en el cual la membrana no resiste el estiramiento y
se rompe. Por lo tanto, hay aumento de la fragilidad globular en la esferocitosis hereditaria,
donde la hemólisis puede iniciarse a concentraciones tan altas como la 0.60% m/v de NaCl
y se completa a 0.40% m/v de NaCl.
• Anemias hemolíticas autoinmunes con presencia de esferocitos.
• Estados de hipercolesterolemia.
• Talasemias. En ellas se explica por la presencia de células en diana (leptocitos) que tiene
un área de superficie aumentada en relación a su volumen. En esta enfermedad esta tan
marcada dicha resistencia, que se pueden encontrar glóbulos rojos intactos en
concentraciones tan bajas como 0.30% de NaCl y aún en agua destilada.
• Drepanocitosis y otros desórdenes donde existan leptocitos, tal es el caso, de enfermedades
del hígado, después de la esplenectomía, enfermedades por Hb C.
• Casos de hipocromía, ya que los glóbulos rojos hipocrómicos debido a su menor contenido
de hemoglobina, tienen capacidad para absorber mayor cantidad de agua que los normales.
• Se observa después de hemorragias, debido al paso a la sangre de células jóvenes.

Los hematíes, como todas las células animales, son susceptibles al trauma mecánico y pueden
hemolizarse incluso in vitro, agitándolos con perlas de vidrio. La prueba de fragilidad mecánica estudia
la cantidad de lisis de la sangre en presencia de soluciones de distinta composición, y se compara con
la cantidad de lisis de la sangre que ha sido sometida a trauma mecánico, en presencia de las mismas
soluciones. Esta prueba permite evaluar el papel de la membrana plasmática en la regulación de las
condiciones internas de las células.

Actividades previas que debe realizar el estudiante

El estudiante debe familiarizarse con los siguientes tópicos: resistencia globular osmótica, resistencia
globular mínima, resistencia globular máxima, prueba de fragilidad globular de parpart, hemólisis
total, hemólisis inicial, fragilidad globular media, composición de la membrana eritrocitaria y
acuaporinas.

Materiales y Métodos
Material disponible en el laboratorio
• Pipetas Pasteur • Tubos de centrífuga de 15 mL, de poliestireno
• Bulbos para pipetas Pasteur y fondo cónico.
• Centrífuga. • Tubos de colorimetría.
• Espectrofotómetro. • Tubos de ensayo.
• Gradillas para tubos. • NaCl 0,9% p/v.
• Pipetas automáticas de 2-20, 20-200 y 100- • Agua amoniacal.
1000 µL. • Papel Parafilm.
• Puntas para pipetas automáticas de 2- 20, 20-
200 y 100-1000 µL.

Material que debe traer el estudiante

• Cámara fotográfica
• 1 Jeringa de 5 mL por equipo.
• Muestra fresca de sangre (que le será tomada en el laboratorio a los voluntarios).

3
Biología Celular. Práctica 5. Fragilidad Globular

Fragilidad Globular Osmótica

- Mida 5 mL de cada una de las soluciones de trabajo de NaCl 0.90, 0.80, 0.70, 0.60, 0.55, 0.50,
0.45, 0.40, 0.35, 0.30, 0.20 y 0.10% p/v, y coloque cada una en un tubo de centrífuga de 15 mL
perfectamente limpios, secos y debidamente rotulados.
- Agregue 20 μL de sangre a cada una de las soluciones medidas anteriormente, enjuagando la
pipeta 3 veces en la solución. Esta operación debe realizarse siempre igual en cada uno de los tubos.
- Selle el tubo con papel parafilm y mézclelo por inversión varias veces. Deje en reposo a
temperatura ambiente por 30 minutos.
- Al culminar el tiempo, mezcle de nuevo los tubos y centrifúguelos de 3000 a 3500 rpm
durante 5 minutos, a fin de sedimentar las células no lisadas.
- Tome el sobrenadante de cada tubo y colóquelo en tubos de colorimetría, teniendo la
precaución de no resuspender el fondo de hematíes. El sobrenadante del tubo que contiene la solución
de NaCl al 0,10% m/v debe mostrar completa hemólisis; el sedimento debe ser muy escaso y de color
blanco o ligeramente rosado. Si se observan en él glóbulos rojos intactos, debe resuspenderse el
contenido del tubo para lograr la lisis completa de los glóbulos rojos y luego centrifugarlos
nuevamente. Este tubo representa el 100% de hemólisis.
- Utilizando una longitud de onda de 540 nm (filtro verde), ajuste el cero de densidad óptica o el
100% de transmitancia, utilizando como blanco el sobrenadante del tubo que contiene la solución de
NaCl al 0,90% m/v, ya que en él no debería haber hemólisis. Luego proceda a la lectura de cada uno
de los sobrenadantes de los otros tubos.

Fragilidad Globular Mecánica

- Coloque 1 mL de sangre en un homogenizador y se le aplican 20 toques. Transvase el
homogenizado a un tubo de ensayo.
- Haga diluciones 1:100 (para un volumen total de 2 mL), de la sangre homogeneizada con
solución salina (NaCl 0,9 % p/v) y con agua amoniacal (NH4OH N/150). Repita el mismo
procedimiento pero empleando sangre sin homogeneizar.
- Centrifugue los tubos y mida la absorbancia del sobrenadante a 540 nm. Emplee como blancos
la solución salina y el agua amoniacal, según sea el caso.

Resultados
Fragilidad Globular Osmótica
Absorbancia
[NaCL] (% m/v)
(540 nm)
0.90
0.80
0.70
0.60
0.55
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.20
0.10

4
Biología Celular. Práctica 5. Fragilidad Globular

Fragilidad Globular Mecánica

Absorbancia (540 nm)
Compuesto
Homogeneizado Sin homogeneizar
NaCl 0,9% p/v
Agua amoniacal

Puntos para discutir en el informe

El porcentaje de hemólisis en cada uno de los tubos se deduce comparándolo con el que representa el
100% de hemólisis. Calcule el % de hemólisis en cada uno de los tubos con la fórmula:

𝐷𝑂𝑥
%𝐻𝑒𝑚𝑜𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 = 𝑥100
𝐷𝑂0.1

Donde, x = concentración en % m/v de NaCl del sobrenadante del tubo

DO (Densidad Óptica) =Absorbancia medida a 540 nm
Grafique el % de hemólisis a medida que disminuye la concentración de NaCl.

Con ayuda del gráfico determine lo siguiente:

• La Hemólisis Inicial (Resistencia Globular Mínima): es la más alta concentración de
solución salina donde comienza a observarse la hemólisis (valores normales: 0.45- 0.50
%m/v NaCl).
• La Hemólisis Total (Resistencia Globular Máxima): es la concentración más alta de
solución salina en la cual aparece hemólisis completa (valores normales: 0 – 30 % m/v
NaCl).
• Fragilidad Globular Media (FGM): la concentración de solución salina que produce el 50%
de lisis.

Evalúe los resultados obtenidos para la prueba de fragilidad globular mecánica, comparando el
comportamiento de la sangre homogeneizada y no homogeneizada en cada una de las soluciones, y los
resultados obtenidos para los dos tipos de soluciones (las cuales constituyen dos tipos de medio al que
están siendo sometidos los eritrocitos).

Referencias Bibliográficas
Alberts A., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & P. Walter (2006). Molecular Biology of the
Cell. 4th ed. Garland Science. USA.

Cátedra de Hematología (2003). Guía de Trabajos Prácticos. Parte I. Escuela de Bioanálisis. Facultad
de Ciencias de la Salud. Universidad de Carabobo. Venezuela.

Cuéllar, F. & F. Falabella (2004). Hematología. 6ª ed. Corporación para Investigaciones

Biológicas. Colombia.

Lodish H., A Berk, P. Matsudaira, C. Kaiser, M. Krieger, M. Scott, S. Zipursky & J. Darnell (2005).
Molecular Cell Biology. 5th ed. W. H. Freeman & Co. USA.

Rodak, B. (2005). Hematología, Fundamentos y Aplicaciones Clínicas. Editorial Médica

Panamericana. España.