UNIVERSIDAD ESTATAL PENÍNSULA DE

SANTA ELENA
FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
ESCUELA DE BIOLOGÍA MARINA

ASIGNATURA: Patología

BIOENSAYO

TEMA: Evaluación de las concentraciones toxicológicas del ibuprofeno en tilapia

(Oreochromis sp)

INTEGRANTES

Nicole Naranjo O.
Noha Rivilla M.

CURSO

5/1 BIOMAR

DOCENTE

Acui. Sonnya Mendoza L. PhD.

PERÍODO
2019-II
 Resumen:
El uso de fármacos comerciales es muy común para tratar distintos cuadros de dolencias
leves generales como lo es el ibuprofeno, motivo por el cual es necesario investigar el
impacto ambiental que estos producen cuando son desechados. El objetivo del presente
bioensayo fue determinar el grado mínimo de toxicidad de ibuprofeno en distintas
concentraciones en tilapia (Oreochromis sp) a través de la comparación del nivel de
afectación en órganos diana mediante cultivos microbiológicos. Los ensayos
experimentales se llevaron a cabo exponiendo a los organismos a concentraciones de
ibuprofeno de 1 y 2mg𝐿−1 en tallas pequeñas y medianas respectivamente. Ninguno de
los 2 tratamientos arrojó porcentaje de mortalidad directamente, pero se logró evidenciar
las afectaciones a nivel cutáneo de la concentración más alta y se estableció la diferencia
de efecto del fármaco en ambos tratamientos sobre el órgano más afectado que en ambos
casos fue el hígado.

Abstract:

The use of commercial drugs is very common to treat different general mild medical
conditions such as ibuprofen, which is why it is necessary to investigate the
environmental impact they produce when they are discarded. The objective of this
bioassay was to determine the minimum degree of toxicity of ibuprofen in different
concentrations in tilapia (Oreochromis sp) by comparing the level of involvement in
target organs by microbiological cultures. Experimental tests were carried out exposing
organisms to ibuprofen concentrations of 1 and 2mgL ^ (- 1) in small and medium sizes
respectively. None of the 2 treatments showed a percentage of mortality directly, but it
was possible to show the effects at the cutaneous level of the highest concentration and
the difference in the effect of the drug in both treatments on the most affected organ than
in both cases was the liver.
INTRODUCCIÓN:
La Tilapia (Oreochromis sp) es un pez
teleósteo del orden perciforme,
perteneciente a la familia Cichlidae,
originario de África, habita en la mayor
parte de las regiones tropicales del
mundo, abundante en ríos donde las
condiciones son favorables para su
reproducción y crecimiento. Estos peces
viven en el agua cálida y su óptimo
desarrollo se logra en temperaturas
superiores a los 20° C. La temperatura
critica inferior esta alrededor de los 12 –
13° C. (Castillo Campo, L. 2002) Viven
tanto en aguas dulces como salobres e
incluso pueden acostumbrarse a las
aguas poco oxigenadas. Son por
definición Omnívoros, pero con una
tendencia hacia una dieta vegetariana.
Las adaptaciones estructurales de las
tilapias a esta dieta son principalmente
un largo intestino muy plegado, dientes
bicúspides o tricúspides sobre las
mandíbulas y la presencia de dientes
faríngeos. Los alevines se alimentan de
partículas de fitoplancton y pequeñas
cantidades de zooplancton. Los peces
jóvenes tienen una dieta más variada,
que incluye una gran cantidad de
copépodos, cladóceros, crustáceos y
otros pequeños invertebrados. En
cautiverio suelen aceptar bien como
alimento, a la artemia salina, los adultos
son muy voraces, suelen barrer la
superficie y el fondo de los estanques en
búsqueda de insectos, crustáceos,
ocasionalmente podrían llegar a ingerir
larvas de anfibios pequeñas y peces
pequeños, que captan mediante la
filtración del agua que llega a sus bocas
y es expulsada a través de sus branquias.
( Del Prado, y otros, 2004)
El ibuprofeno es un antiinflamatorio no
esteroideo (AINE), utilizado
frecuentemente como antipirético,
analgésico y antiinflamatorio así como
también para el alivio sintomático de la
fiebre, dolor de cabeza, dolor dental,
dolor muscular o mialgia, molestias de la
menstruación, dolor neurológico de
carácter leve o moderado y dolor
postquirúrgico, o para tratar cuadros
inflamatorios, como los que se presentan
en artritis, artritis reumatoide (AR),
hinchazón muscular, dolor de garganta y
artritis gotosa, incluso es usado en
ocasiones para tratar acné debido a sus
propiedades antiinflamatorias. (Dec de
1984). El organismo es capaz de
metabolizar hasta un 90% del ibuprofeno
ingerido, pero el restante 10% se excreta
a las aguas junto con los otros
metabolitos resultantes de la digestión
del fármaco. Este hecho puede afectar
más de lo que creemos al medio
ambiente, debido al fenómeno de
bioacumulación y toxicidad del fármaco.
Dado que la principal vía por la que el
fármaco puede llegar al medio ambiente
es por medio de las aguas residuales, un
mejor tratamiento de estas aguas
incorporando más filtros o tratamientos
físico-químicos adecuados podría
disminuir la presencia de este fármaco en
el entorno. Se ha logrado la eliminación
de ibuprofeno de las aguas residuales por
ultrasonidos, y mediante la degradación
fotocatalítica del ibuprofeno mediante
dióxido de titanio. (F. Méndez-Arriaga y
otros).
La hematología se utiliza para el
análisis de las alteraciones de los
componentes sanguíneos y sus posibles
alteraciones, en los glóbulos blancos
pueden ser de su forma (tamaño y
forma) o de su funcionamiento, sobre
todo los neutrófilos y los linfocitos. En
muchos casos, se trata de enfermedades
hereditarias que se sospechan en
pacientes con infecciones repetidas.
También se producen en algunas
infecciones, como la mononucleosis
infecciosa, en reacciones ante algunos
medicamentos, y en anemias y
neoplasias.
La alteración por aumento en el número
de leucocitos, se denomina leucocitosis,
y según el tipo que está aumentado, se
habla de neutrofilia, de linfocitosis y de
eosinofilia. Se denomina leucopenia a
la disminución en el recuento de
glóbulos blancos. (Fisterra, 2019)
La tinción de May-Grünwald
Giemsa (MGG) es una técnica
de tinción derivada del método de
Romanowsky que se utiliza
principalmente para el coloreo de
muestras de frotis sanguíneos o observación, patología en fresco: donde
extendidos de médula ósea.
Una cámara de
Neubauer o hemocitómetro es un
instrumento utilizado para realizar el
recuento de esporas y células en un
medio líquido, que puede ser; un cultivo
celular, sangre, orina, líquido
cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc.
En microbiología, un cultivo es un
método para la multiplicación
de microorganismos, tales como lo
son bacterias en el que se prepara
un medio óptimo para favorecer el
proceso de estudio de las bacterias y
otros microorganismos. (Restrepo, 2002)
El agar nutritivo contiene extracto de
carne, peptona y agar, siendo una
formulación suficiente para el desarrollo
de los microorganismos. El extracto de
carne proporciona al medio fuente de
carbohidratos, de nitrógeno y vitaminas.
(DIBICO, 2017) El empleo de este
medio es de acuerdo al tipo de estudio
por realizar. Las unidades formadoras
de colonias (UFC) es una unidad de
medida que se emplea para la
cuantificación de microorganismos, es
decir, para contabilizar el número
de bacterias o
células fúngicas (levaduras)1 viables en
una muestra líquida o sólida. La
viabilidad se define como la habilidad de
multiplicarse por fisión binaria en
condiciones controladas.
(Benington,1999)
El presente trabajo determinara el grado
mínimo de toxicidad de ibuprofeno en
distintas concentraciones en tilapia
(Oreochromis sp) y realizara una
comparación de afectación en órganos
diana mediante diagnóstico de
se demostró el estado fisiológico de los
organismos, cultivos microbiológicos:
en el cual se demostró los
microrganismos presentes en los órganos
diana, y hematología: se realizó el conteo
de células para la identificación del
efecto de los tratamientos a nivel
sistémico, obtenido de cada una de las
peceras control, tratamientos y replicas,
para la comprobación del objetivo
planteado mediante los resultados
obtenidos.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Tipo y lugar de estudio:
El estudio fue de tipo observacional.
Los organismos de estudio fueron
capturados de un cultivo extensivo tipo
estanque en la comuna de Olón en la
villa San Vicente de Loja, provincia de
Santa Elena, se recolectaron un total de
70 organismos aparentemente en buen
estado y fueron trasladados hacia el
laboratorio de prácticas experimentales
de la Universidad Estatal Península de
Santa Elena en bolsas plásticas del
mismo lugar con suficiente oxígeno, el
tiempo de transportación fue de 2 horas
y media.
Al llegar fueron trasladados a un tanque
de 500L con agua previamente
declorada y fueron liberados
paulatinamente, se encontraron 3
organismos muertos producto del estrés
generado por el viaje, se les suministró
oxígeno de la toma de aire proveniente
del blower y se les alimentó
provisionalmente con una mezcla de
harina de avena y arroz.
Por último, fueron trasladados posterior
al período de aclimatación a peceras con
capacidad de 10L siendo separados por
tamaños, se les suministró oxígeno y
alimento balanceado para tilapia según
el factor de conversión alimenticio a
partir de un promedio la biomasa
obtenida por pecera respecto a la
siguiente tabla:
tabla 1 TCA en estanques. FAO
Simple inspección
Se evaluó a cada uno de los organismos
por observación básica donde
constatamos el estado fisiológico de
ojos, branquias, aletas, escamas,
mucosidad, tamaño, peso, y conducta de
estos estando en cautiverio, así como
también se examinó a los organismos
durante y después de aplicado el
tratamiento.
Patología en fresco
Se realizó un corte en la parte superior de
la cabeza de pez para evitarles el dolor y
sufrimiento, se hizo un pequeño corte a
la altura del ano, con una tijera se cortó
hasta las branquias en forma redonda,
luego se realizó otro corte en línea recta
del ano hacia la parte inferior del
opérculo y otro alrededor de las
branquias, esto ayudó a la óptima
observación de los órganos, se realizó un
corte en los órganos diana, se colocó en
el portaobjetos y con el cubreobjetos se
hizo el squash, para proceder a la
observación en el microscopio.( OIE,
2012)
Análisis hematológico por tinción de
GIEMSA
Se realizó la extracción de una muestra
de sangre de la vena caudal del
organismo, se añadió solución
anicoagulante y se hizo un frotis en la
placa arrastrando la gota de muestra
para esparcirla uniformemente. Se secó
la muestra en una lámpara de alcohol
hasta que se adhiera totalmente a la
placa y se procedió a la aplicación de
los colorantes HE, se retiró el exceso,
se secó nuevamente y se llevó la
muestra al microscopio para la
observación.
Análisis hematológico por conteo de
hemocitos
Se observó la línea lateral como guía, se
introdujo la aguja de una jeringa de
insulina con anticoagulante previamente
introducido, hasta sentir las vértebras en
dirección perpendicular, una vez dentro
de forma paralela se introdujo a la vena
caudal y extrajo la sangre (OIE, 2012)
Se colocó una gota de sangre con
anticoagulante en el hemocitómetro, se
tratamiento incluyendo la pecera de
control, se realizó la técnica de squash
para cada placa y se observó en el
microscopio, se tomaron registros
fotográficos de cada uno para
posteriormente realizar una
comparación por observación entre cada
placa resultante.
Análisis Microbiológico
Se tomó parte de los órganos diana se
pesó y se introdujo en un tobo eppendorf,
contabilizó 3 celdas al azar y se sacó un
promedio de la cantidad de celdas por
cuadrante.
Análisis de órganos diana
Algunos órganos son muy susceptibles
a cambios inducidos por factores
abióticos como la temperatura y las
condiciones del medio. Se recolectaron
muestras de hígado, branquias e
intestino de un pez de cada
se coloca agua destilada con una
micropipeta donde se procedió a macerar
el órgano elegido, pera sembrar se
realizó una disolución de diez a la menos
dos, mientras que el agar nutritivo se
elaboró con un día de anticipación, ya
listo, con un aza estéril se tomó la
disolución y se sembró sobre el agar
cerca de un mechero para evitar la
contaminación, se tapó y se selló con
papel parafilm, acto seguido se dejó
incubar para el crecimiento de
microrganismos. (OIE, 2012)
RESULTADOS

Conteo de hemocitos

Fig. 1: hematología de la pecera de control Fig. 2: hematología en la pecera T1 se contó un

donde se contó un total de 7,240,000 total de 8,080,000 eritrocitos/ mm3, se asume el
eritrocitos/ mm3, se asume la interacción aumento de linfocitos por la intervención del
normal del sistema inmunológico de los sistema inmune para la protección del organismo
organismos en condiciones normales. en proceso de enfermedad.

Fig. 4: hematología en la pecera T 2 se contó un

Fig.3: hematología en la pecera T1´ se contó total de 14,582,000 eritrocitos/mm3 células se
un total de 11,290,000 eritrocitos/mm3 notó que en este caso el sistema inmunológico se
células, se asume que el sistema inmune disparó con el motivo de sanar al organismo por
activó linfocitos al igual que en el anterior el cual se evidenció tal acumulación de células.
tratamiento, pero al ser más grandes en
tamaño y estadio son más propensos a
enfermarse.
 Fig 5: hematología en la pecera T2´ se contó un
total de 16,255,000 eritrocitos/mm3,lo que
sugiere que este organismos al igual que el
segundo y el tercero logro controlar la
inserción del tratamiento por medio de su
sistema inmune.

Técnica HE

Fig. 6: Tinción HE organismo de Fig. 7: Tinción HE organismo de

pecera de control. 10x pecera de tratamiento 1 . 10x

Fig. 8: Tinción HE organismo de

Fig. 9: Tinción HE organismo de
pecera de tratamiento 1’ . 10x
pecera de tratamiento 2 . 10x
Fig. 10: Tinción HE organismo de
pecera de tratamiento 2’ . 10x

Análisis de órganos diana:

Hígado:

Fig. 11. A) Hígado de tilapia aparentemente normal, nótese las

células con un citoplasma homogéneo, eosinófilo y núcleo central Fig. 12 Muestra de hígado de
(asterisco) (40X). B) acercamiento de los hepatocitos normales del organismo de pecera de control.
hígado de tilapia (100X). (Triana, 2013) Presenta coloración pálida 10x

Fig. 12 Muestra de hígado de Fig. 13 Muestra de hígado de

organismo de pecera T1. Presenta organismo de pecera T1’. Presenta
coloración normal 10x coloración normal 10x
 Fig. 14 Muestra de hígado de Fig. 14 Muestra de hígado de
organismo de pecera T2. Presenta organismo de pecera T2’. Presenta
coloración pálida 40x coloración muy enrojecida 10x

Intestino:

Fig. 15. Fotomicrografía de un corte histológico del intestino Fig. 16 Muestra de intestino de
de C. ensiferus. Se observa un tejido normal, compuesto por organismo de pecera control. Presencia
Branquias
las células caliciformes (CG), los enterocitos (ENT), vasos de microplásticos 10x
capilares (CAP) la capa muscularis (M), la mucosa (MC) y
la submucosa (SM). HE, 40x. (Bautista, 2014)
 Fig. 17 Muestra de intestino de Fig. 18 Muestra de intestino de
organismo de pecera T1 . 10x organismo de pecera T1’ . 10x

Fig. 19 Muestra de intestino de Fig. 20 Muestra de intestino de

organismo de pecera T2 . 10x organismo de pecera T2’ . 10x

Branquias

Fig.20 branquia de R. quelen. En condiciones

Fig. 21 Muestra de branquia de
normales (A) Visión general del arco en la base
(rastrillos) y láminas. (4X) (B) Ápice de las organismo de pecera de control
láminas evidenciando aspecto terminal del Coloración normal.. 4x
cartílago hialino de su eje. 4x (C) Lamela
secundaria (respiratoria). 100x (D) Presentación
de las láminas primarias (40x) (Ribeiro, 2018)
Fig. 22 Muestra de branquia de Fig. 23 Muestra de branquia de
organismo de pecera T1 Coloración organismo de pecera T1’ Coloración
normal.. 4x ligeramente enrojecida. 4x

Fig. 24 Muestra de branquia de Fig. 25 Muestra de branquia de

organismo de pecera T2 Coloración organismo de pecera T2’ Coloración
enrojecida. Lamelas fusionadas 4x enrojecida. Lamelas fusionadas 4x
Cultivos microbiológicos

Contenido estomacal

Fig. 27 Cultivo de contenido estomacal de

Fig. 26 Cultivo de contenido estomacal de organismo de pecera T1 UFC= 5
organismo de pecera de control UFC= 22

Fig. 28 Cultivo de contenido estomacal de Fig. 29 Cultivo de contenido estomacal de

organismo de pecera T1’ UFC= 8 organismo de pecera T2 UFC= 15

Fig. 30 Cultivo de contenido estomacal de

organismo de pecera T2’ UFC= 12
Contenido del Hígado

Fig. 32 Cultivo de contenido del hígado de

Fig. 31 Cultivo de contenido del hígado de
organismo de pecera T1 UFC= 13
organismo de pecera de control UFC= 12

Fig. 33 Cultivo de contenido del hígado de Fig. 34 Cultivo de contenido del hígado de
organismo de pecera T1’ UFC= 10 organismo de pecera T2 UFC= 28

Fig. 35 Cultivo de contenido del hígado de

organismo de pecera T2’ UFC= 16
Contenido intestinal

Fig. 36 Cultivo de contenido intestinal de Fig. 37 Cultivo de contenido intestinal de

organismo de pecera de control UFC= 3 organismo de pecera T1 UFC= 8

Fig. 38 Cultivo de contenido intestinal de Fig. 39 Cultivo de contenido intestinal de

organismo de pecera T1’ UFC= 6 organismo de pecera T2 UFC= 11

Fig. 40 Cultivo de contenido intestinal de

organismo de pecera T2 UFC= 60
 CONCLUSIONES

• En análisis hematológico el conteo de células es uno de los diagnósticos más

precisos ya que como mediante la identificación de un incremento se puede
evidenciar la presencia de antígenos y la reacción que tiene ante esto el sistema
inmune y la adaptación de los organismos a los parámetros de estrés en cada
tratamiento de Ibuprofeno.

• En el ejemplar tomado del tratamiento 2 se evidenció el mayor incremento de la

cantidad de células sanguíneas.

• La variabilidad del contenido intestinal no fue en gran escala

• Las coloraciones del hígado presentaron particularidades en cada uno de los

organismos

• El análisis de branquias presentó resultados uniformes para todos los ejemplares

exceptuando el del T2’

• Los cultivos microbiológicos variaron en UFC según el organismo del que se

tomó la muestra, arrojando resultados de diferencias significativas entre los
organismos del T1 y su réplica con los del T2 y su réplica.

• Los cultivos con menor incidencia de bacterias fueron siempre los del ejemplar
tomado de la pecera de control

ANEXOS

Fig. 41 aclimatación de los organismos Fig. 42 alimentación de los

organismos Fig. 43 limpieza por sifoneo
Fig. 44 Determinación de TCA

Fig. 45 Preparación del agar

Fig. 46 Análisis Hematológico

Fig. 47 Cultivo microbiológico
Cronograma de actividades

día mes año actividad observaciones

implementación de peceras,
aireación, colocación de los
peces en el tanque para
aclimatación, inserción de
vitamina C para disminuir el
estrés
25 11 2019
comprobación del estado de los un pez muerto por
organismos y alimentación canibalismo

26 11 2019

alimentación
27 11 2019

alimentación
28 11 2019

alimentación y limpieza de
tanque
29 11 2019

alimentación
30 11 2019

alimentación y se dejó agua en peces muertos por

reposo para recambio de agua canibalismo
1 12 2019

alimentación y recambio de agua

2 12 2019
alimentación y aplicación de
3 12 2019 Ibuprofeno
alimentación y toma de dos peces muertos por
4 12 2019 parámetros canibalismo

alimentación y limpieza
5 12 2019
alimentación, limpieza y toma de se tomó un pez de cada
6 12 2019 muestras diagnósticos pecera

alimentación
7 12 2019

alimentación y limpieza dos peces muertos por

8 12 2019 canibalismo
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