XXXVIII Congresso Brasileiro de Sistemas Particulados

ENEMP 22 a 25 de outubro de 2017

Departamento de Engenharia Química
2017 Universidade Estadual de Maringá
Maringá - Paraná

CARACTERIZAÇÃO DE LIPASES IMOBILIZADAS EM SUPORTES NÃO-

CONVENCIONAIS APÓS A SECAGEM EM LEITO DE JORRO

T. A. COSTA-SILVA; C. R. F. SOUZA; S. SAID; W. P. OLIVEIRA

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo

Av. do Café S/N. – BL. Q, Ribeirão Preto, SP, Brasil, 14040-903
e-mail: costa.silva@usp.br

RESUMO - O objetivo desse trabalho foi avaliar os processos de imobilização e secagem de lipase
produzida pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii através do uso de suportes não convencionais
(subprodutos agroindustriais) e do leito de jorro como equipamento de secagem dos derivados
imobilizados obtidos. Nos ensaios de imobilização o melhor agente ligante foi o glutaraldeído,
sendo os melhores resultados obtidos foram para a celulose microcristalina com retenção da
atividade enzimática de 179,1%, seguido da casca de arroz 173,9% e palha de milho 169,8%.
Alguns parâmetros bioquímicos e cinéticos da lipase na forma livre foram diferentes da lipase
imobilizada. A alteração mais evidente foi a afinidade ao substrato (KM), que para os derivados
imobilizados produzidos apresentou valores menores quando comparados aquele obtido para lipase
livre. Os valores de pH e temperatura ótimos também foram modificados após os processos de
imobilização e secagem, ampliando a faixa de atuação catalítica da enzima. Este trabalho
demonstrou que suportes de baixo custo permitiram a obtenção de derivados imobilizados com
características semelhantes àqueles obtidos com o uso de polímeros sintéticos, e que o leito de jorro
demonstrou viabilidade para a secagem de produtos termo sensíveis, como as enzimas.

meio orgânico, bem como visando à

INTRODUÇÃO
otimização dos bioprocessos através do
desenvolvimento de processos contínuos, o
Apesar das inúmeras vantagens
uso de enzimas imobilizadas tornou-se uma
catalíticas das enzimas, principalmente quando
necessidade. Dentre os benefícios do emprego
comparadas com os catalisadores químicos, a
deste biocatalisador imobilizado estão, a
utilização em processos industriais muitas
redução do potencial de contaminação do
vezes tem sido limitada. Isso acontece
produto com enzima residual; reuso do
principalmente devido a fatores como: à baixa
biocatalisador; melhor controle e qualidade do
estabilidade nas condições de operação,
processo diante de biocatalisadores mais
elevado custo de obtenção (desde o isolamento
estáveis e resistentes; e praticidade na
até a etapa de purificação) e da dificuldade
separação do biocatalisador do sistema
técnica e elevado custo da recuperação e/ou
reacional para posterior reutilização (Malcata
separação do biocatalisador ao término da
et al., 2009).
reação. Isso restringe o uso de enzimas
O conteúdo de água presente no produto
solúveis principalmente em processos de
imobilizado é outro importante parâmetro de
batelada (Cao, 2005). Considerando as
qualidade que deve ser monitorado e mantido
condições adversas para a utilização das
dentro de faixas adequadas. Sabe-se que uma
enzimas livres em algumas reações de
das grandes limitações na produção e
interesse industrial, como as de síntese em

utilização de enzimas e proteínas para fins
comerciais reside na manutenção de sua
estabilidade física e química quando estas se
encontram em solução. Em termos estruturais,
a estabilidade de uma proteína pode ser
definida como a propriedade de manutenção da
conformação nativa que apresenta atividade
biológica (Costa-Silva, 2014). Além da
influência do conteúdo de água na estabilidade
enzimática, principalmente a longo prazo,
existe outra questão importante que é a
influência da água durante a própria catálise
enzimática. A presença da água durante a
reação enzimática torna-se mais relevante
quando esta ocorre em meios não-
convencionais (meios orgânicos) nos quais
predominam reações de esterificação e
transesterificação (Adlercreutz, 2013). Devido
à esta baixa estabilidade apresentada pelas
formas líquidas, composições sólidas
(desidratadas), são frequentemente
desenvolvidas de forma a proporcionar uma
estabilidade física e química aceitável às
enzimas. Diante disso, a secagem tornou-se
um dos mais efetivos métodos de se preservar
produtos biológicos. Entretanto, a secagem,
independente do equipamento utilizado,
implica em fortes mudanças físico-químicas da
composição líquida em um meio complexo.
Essas transformações do produto não podem
ser descritas de forma simples, e continuam
ocorrendo durante o armazenamento
(Dumoulin; Bimbenet, 1998). Existem
diversos processos que podem ser utilizados na
desidratação de produtos biológicos, como por
exemplo a liofilização, o “spray drying”, a
secagem em leito de jorro, em leito fluidizado
entre outros.
Assim, levando em consideração o papel
do conteúdo de água tanto na questão da
estabilidade enzimática, principalmente a
longo prazo, quanto sua influência nas
propriedades catalíticas das enzimas, este
trabalho tem como um dos objetivos a
avaliação de imobilização covalente e secagem
de lipase produzida pelo fungo endofítico
Cercospora kikuchii utilizando suportes não
convencionais (subprodutos agroindustriais) e
a caracterização do sistema enzima-suporte
produzido.
2
MÉTODOS
Micro-organismo e produção da lipase
O fungo endofítico utilizado neste estudo
foi isolado de Tithonia diversofolia (girassol
mexicano) e identificado como Cercospora
kicuchii (Costa-Silva et al., 2011). A produção
da lipase foi realizada utilizando meio mínimo
Vogel suplementado com 2 % de óleo de soja
como única fonte de carbono (Vogel, 1956). A
cultura foi incubada a 30 ºC sob agitação
constante (120 rpm) durante 6 dias, sendo o
micélio obtido removido por filtração. A
purificação da enzima foi realizada de acordo
com método descrito por Costa-Silva (2010).
Preparo dos suportes
Nesta etapa foi avaliado o potencial de
utilização de subprodutos agroindustriais como
suportes para imobilização da enzima.
Exemplos de subprodutos que foram estudados
para esse fim: bagaço de cana, palha de milho
e casca de arroz. Como material de referência
para os estudos de imobilização foi utilizada a
celulose microcristalina (MC 102 – Microcel,
Blanver Farmoquímica Ltda) na faixa de
tamanho de 150 μm. Os subprodutos
agroindustriais foram ativados com as soluções
dos agentes ligantes na concentração de 1,5%
(v/v): glutaraldeído, epicloridrina e
metaperiodato de sódio. Os suportes foram
colocados em contato com a solução ativadora
por uma hora sob agitação a 230 rpm e, após
esse período foram filtrados a vácuo e lavados
exaustivamente com água destilada. Os
suportes ativados foram desidratados em estufa
de convecção forçada à temperatura de 40ºC
por um período de 24 horas.
Secagem em leito de jorro
Os suportes ativados foram colocados em
contato com a solução enzimática (2 mg de
proteína.g-1 de suporte) durante uma hora sob
agitação constante a 230 rpm. O sistema
enzima-suporte obtido após este período foi
levado para secagem em leito de jorro. O leito
de jorro empregado nesse trabalho consiste de
uma base cônica com ângulo incluso de 40° e
orifício de entrada de ar com diâmetro de 15
mm. Acoplada à base cônica há uma coluna
cilíndrica de 85 mm de diâmetro e 300 mm de

altura. A parte superior do equipamento é
constituída por outro cone, com ângulo interno
de 60° onde encontra-se acoplado o sistema de
coleta de pós composto por um ciclone do tipo
Lapple. Como material inerte utilizou-se
partículas côncavo-cilíndricas de
politetrafluoretileno (teflon®), material já
empregado com sucesso na secagem de
produtos biológicos e na produção de extratos
secos de plantas medicinais (Souza, 2007). Os
parâmetros operacionais utilizados estão
apresentados na Tabela 1 (Costa-Silva et al.,
2013.)
Tabela 1: Parâmetros operacionais fixados para a
secagem em leito de jorro.
Parâmetros operacionais do leito de jorro
Temperatura do ar de entrada (Tge), °C 100,0
3
Vazão do ar de jorro (Wg), m /min 0,624
Relação Wg/Wg,jm 1,4
Ângulo da base cônica (y), ° 40
Posição do sistema de alimentação “Top spray”
Altura do leito de partículas (H0), cm 5,5
Massa de partículas inertes (Mpi), g 250,0
Vazão de alimentação (Ws), g/min 5,0
Wg,jm : Vazão de ar correspondente à condição de jorro mínimo
Desempenho do leito de jorro e
caracterização do sistema enzima-suporte
A) Atividade enzimática: a atividade da
lipase foi realizada utilizando ρ-
nitrofenilpalmitato (p-NPP) como substrato
(Mayordomo et al., 2000). Uma unidade (U)
de atividade da lipase foi definida como a
quantidade de enzima que liberou 1 mmol de
p-nitrophenol/min nas condições mencionadas
acima.
B) Eficiência da produção do pó: o
desempenho da secagem foi avaliado através
da determinação da recuperação do produto
(REC) (Costa-Silva et al., 2011).
C) Teor de umidade do produto (Xp): O
teor de umidade do produto foi determinado
pelo método de estufa a 105 oC (Who, 1998).
D) Atividade de água (Aw): A
determinação da atividade de água dos
produtos secos foi realizada utilizando o
medidor de atividade de água Aqua Lab 4Tev
(Decagom).
3
E) Microscopia eletrônica de varredura
(MEV): A forma e características superficiais
dos sistemas suporte:enzima foram analisadas
empregando-se o microscópio eletrônico de
varredura (Zeiss mod. EVO 50) com atmosfera
de vácuo de 10-5 torr.
F) Análise elemental CHN: Para
avaliar a incorporação da enzima na superfície
dos suportes se utilizou a análise elementar
CHN (carbono, hidrogênio e nitrogênio)
utilizando o Analisador Elementar de CHN
Perkin Elmer 2400 (Gomes et al., 2005).
G) Análise de infravermelho: A análise
de Infravermelho por Transformada de Fourier
(Spectrophotometer FTIR BOMEM MB-100)
foi realizada para avaliação do processo de
ativação dos suportes com os agentes ligantes
glutaraldeído, epicloridrina e metaperiodato de
sódio; e para caracterizar o processo de
incorporação da enzima sobre a superfície do
suporte ativado com glutaraldeído, que
apresentaram maiores valores de atividade
enzimática. Os espectros foram obtidos no
comprimento de onda de 400 a 4000-cm
(Gomes et al., 2005).
H) Determinação dos parâmetros
cinéticos e de estabilidade - lipase livre X
lipase imobilizada: Para determinação da
temperatura ótima, a avaliação da atividade
enzimática foi realizada nos intervalos de
temperatura de 20 a 80°C. Para determinação
do pH ótimo da enzima livre e imobilizada a
reação enzimática ocorreu nos seguintes
valores de pHs: citrato-fosfato (2,2 a 7,8) e
Tris-HCl (8,2 a 9,0). Para a determinação das
constantes cinéticas as enzimas livre e
imobilizada foram incubadas com diferentes
concentrações de p-NPP variando entre 0,015
e 0,5 mmol/L, na temperatura e pH ótimo de
atividade. Os valores de KM e VMax foram
determinados plotando-se os resultados
obtidos no programa GraphPad Prism
Software 5.0 (Costa-Silva, 2010).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 1 apresenta os espectros
obtidos dos melhores derivados imobilizados
produzidos. Através da análise desses
espectros pode-se inferir que houve
 4

modificações na estrutura dos suportes após a nos suportes. Por exemplo, o glutraldeído
ativação com os agentes ligantes. O causou modificações visíveis em quase todos
surgimento de novas bandas ou supressão de os suportes ativados. O aparecimento de
bandas originais pode ser atribuído à novas bandas (C=O) pode ser devido a
deformação axial dos grupos carbonilas e formação de grupos aldeídos sobre efetiva
hidroxilas, sugerindo que os grupos funcionais oxidação de grupos diols presentes no suporte
do agente ligante foi efetivamente inseridos puro por esse agente oxidante.

celulose pura.CSV p de arroz.CSV

0,06
pa-ep.CSV
cmc-ep.CSV
pa-ga.CSV
cmc-ga.CSV
pa-mp.CSV
0,05 cmc-mp.CSV 0,1
Absorbância

C=O
0,04

Absorbância
C=O

0,03

0,02

0,0
1800 1750 1700 1650 1600 1550 1500 1500
Número de onda (cm-1) Número de onda (cm-1)

0,2 p de milho.CSV
bagaco puro.CSV
pm-ep.CSV
bc-ep.CSV 0,2 pm-ga.CSV
bc-ga.CSV
pm-mp.CSV
bc-mp.CSV

mais C=O no GA padrao diferente

Absorbância

Absorbância

1713cm-1 para o GA
0,1
0,1

ausência desta banda

no MP
banda um pouco mais intensa no MP
0,0
1500 1500

Número de onda (cm-1) Número de onda (cm-1)

Figura 1: Espectrometria de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) dos suportes puros
e pré-ativados: cmc: celulose microcristalina; pa: casca de arroz; bc: bagaço de cana; pm: palha de
milho; ga: glutaraldeído; mp: metaperiodato de sódio; ep: epicloridrina.

A Tabela 2 apresentam os resultados A Tabela 3 apresenta as condições de

sobre a purificação da lipase presente no secagem em leito de jorro, resultados de
extrato bruto obtido após a fermentação do retenção da atividade enzimática e rendimento
fungo C. kikuchii. A lipase purificada foi usada do processo para os derivados imobilizados em
nos processos de imobilização e secagem. diferentes suportes e agentes ligantes.

Tabela 2: Resumo do processo final de purificação de uma lipase produzida pelo fungo C. kikuchii.
Amostra U/Total Ativ. Específica Proteína Total (mg) Ip Rendimento %
Extrato bruto 360,5 45,1 8,00 1 100,0
Interação
295,0 196,6 1,50 4,4 82,0
Hidrofóbica

Gel Filtração 99,7 398,8 0,25 8,9 27,6

Ip: Índice de purificação
 5

Tabela 3: Desempenho do leito de jorro e caracterização do sistema enzima-suporte.

Tgs Tgi REC RAE
Suporte Agente ligante
(°C) (°C) (%) (%)
Metaperiodato 77,5 61,1 64,6 67,70±0,26
Bagaço de cana Glutaraldeído 84,5 64,1 64,6 156,5±0,67
Epicloridrina 78,5 51,6 45,7 51,00±0,20
Metaperiodato 75,8 61,0 80,6 83,97±0,31
Casca de arroz Glutaraldeído 79,8 61,1 74,6 173,9±0,26
Epicloridrina 77,8 55,0 77,2 73,83±0,60
Metaperiodato 79,1 62,1 81,8 78,17±0,81
Celulose
Glutaraldeído 80,3 60,1 76,8 179,1±0,74
microcristalina
Epicloridrina 81,1 52,3 47,9 68,67±0,35
Metaperiodato 81,2 57,5 72,6 80,70±0,66
Palha de milho Glutaraldeído 76,2 54,5 80,2 169,8±0,57
Epicloridrina 79,2 49,5 69,6 72,73±0,40
Tgs: temperatura de saída; Tgi: temperatura interna; REC: rendimento; RAE: retenção da atividade enzimática; temperatura
de entrada 100°C.

Os melhores valores de retenção de lipase no suporte ativado também foi avaliada

atividade enzimática foram obtidos para a
celulose microcristalina com o uso do ligante
glutaraldeído, com retenção da atividade
enzimática de 179,1%, seguido da casca de
arroz e da palha de milho com 173,9% e
169,8%, respectivamente. Os derivados
imobilizados apresentaram resultados
adequados para o conteúdo de água, umidade
abaixo de 6% e atividade de água inferior a
0,3. Um dos motivos que justifica a secagem
do extrato enzimático é a diminuição da Aw, e
assim diminuir a possibilidade de
contaminação microbiológica do mesmo
(Beauchat, 1981). Considerando a maior
retenção de atividade enzimática observada
para os derivados imobilizados obtidos com o
ligante glutaraldeído, os mesmos foram
submetidos à avaliação da eficiência do
processo de imobilização, à análise elementar
(CHN) e determinação dos valores ótimos de
temperatura e pH.
A eficiência do método de
imobilização em relação à incorporação de
por Espectroscopia de Infravermelho por
Transformada de Fourier (FTIR). A Figura 1
mostra um exemplo do conjunto de espectros
da lipase livre, suporte pré-ativado e derivado
imobilizado produzido. A banda característica
da lipase livre claramente apareceu no número
de onda de 1341 cm-1 o que é observado
também para o derivado imobilizado (suporte
+ lipase), sugerindo a fixação da enzima no
suporte após o processo de imobilização.
A Tabela 4 apresenta o teor de carbono,
hidrogênio e nitrogênio (CHN) dos derivados
imobilizados, onde se observa um aumento no
teor dos elementos. O nitrogênio foi o
elemento que apresentou maior elevação após
a imobilização da enzima, com uma média de
aumento de 50,2%. Esses resultados reforçam
as evidências da incorporação da enzima na
superfície dos suportes.
A Tabela 5 mostra os resultados para a
determinação da temperatura e pH ótimos,
valores de KM e VMax e termo-estabilidade dos
melhores derivados imobilizados produzidos.
 6

Celulose M. Cristalina Ativada

Lipase
Celulose M. Cristalina Ativada + Lipase
0,15
0,14
1341
0,13
0,12
0,11
0,10

Absorbância
0,09
0,08
1359 1318
0,07
0,06
1372
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
1400 1380 1360 1340 1320 1300
-1
Numero de onda (cm )

Figura 2: FTIR para lipase livre, suporte pré-tivado com glutaraldeído e derivado imobilizado
obtido: celulose microcristalina.

Tabela 4: Resultado da análise elemental realizada para os suportes puros, suportes ativados com
glutaraldeído e derivados imobilizados obtidos.
Carbono Hidrogênio Nitrogênio
Amostra
(% m/m) (% m/m) (% m/m)
puro 45,4 ± 0,1 5,6 ± 0,1 0,3 ± 0,1
Bagaço de cana ativado 46,4 ± 0,1 5,8 ± 0,3 0,3 ± 0,1
+ lipase 47,0 ± 0,3 6,1 ± 0,2 0,5 ± 0,2
puro 32,3 ± 0,2 4,4 ± 0,1 0,5 ± 0,2
Casca de arroz ativado 33,4 ± 0,1 4,9 ± 0,2 0,5 ± 0,1
+ lipase 35,7 ± 0,3 5,3 ± 0,2 0,8 ± 0,1
puro 41,9 ± 0,1 6,3 ± 0,1 0,5 ± 0,2
Celulose Microcristalina ativado 42,5 ± 0,1 6,9 ± 0,1 0,5 ± 0,1
+ lipase 43,0 ± 0,2 7,4 ± 0,2 0,8 ± 0,2
puro 43,8 ± 0,1 5,4 ± 0,2 0,5 ± 0,1
Palha de milho ativado 45,9 ± 0,2 7,4 ± 0,1 0,8 ± 0,1
+ lipase 46,1 ± 0,1 7,9 ± 0,2 1,3 ± 0,1

Tabela 5: Parâmetros bioquímicos e cinéticos da lipase livre e imobilizada.

Temperatura ótima pH KM VMax Termoestabilidade
Suporte
(°C) ótimo (Mm) (µmol/min/mg) (RAE %)*
Lipase livre 60,0 6,5 0,212 160,3 50,0 ± 1,23
Casca de arroz 70,0 8,5 0,121 275,4 83,6 ± 0,80
Palha de milho 70,0 8,5 0,162 293,1 81,2 ± 0,76
CMC 70,0 8,5 0,102 269,2 83,2 ± 0,63
*RAE: Retenção da atividade enzimática após duas horas de incubação a 80 °C. CMC: Celulose Microcristalina.

Nota-se que a atividade máxima da
lipase livre ocorreu a 60°C, enquanto que a
lipase imobilizada apresentou uma atividade
máxima a 70°C. Esses resultados sugerem que
o processo de imobilização atuou no sentido de
aumentar a temperatura ótima da enzima, o
que é muito favorável, pois permite operações
de trabalho em uma faixa maior de
temperatura. Observa-se também que o
processo de imobilização deslocou o pH ótimo
da enzima livre (pH= 6,5), para um valor de
pH mais básico (pH= 8,5). Após duas horas de
incubação a 80°C, 50,0% da atividade da
enzima livre foi perdida enquanto que para os
derivados obtidos com o uso de glutaraldeído
encontrou-se em média valores de retenção de
atividade de 82,6%. Os parâmetros cinéticos
Figura 2: Fotomicrografias dos derivados imobilizados: (A) casca de arroz; (B) palha de milho; (C)
celulose microcristalina.
Houve uma predominância de
partículas com superfícies irregulares e de
formas cilíndricas, como é o caso da casca de
arroz e da celulose microcristalina. No caso
das partículas de palha de milho notam-se
estruturas mais porosas e possivelmente
7
KM e VMax, determinados para a lipase livre
foram 0,212 mM e 160,3 μmol/min/mg,
respectivamente (Tabela 5). Com a utilização
do glutaraldeído como agente ligante, houve
uma diminuição do valor do KM com um valor
médio de 0,129 mM. Esse aumento da
afinidade da lipase imobilizada pelo substrato
pode explicar o aumento na taxa de reação
comparado com a enzima na forma livre, ou
seja, obtenção de valores de atividade
enzimática superiores a 100%. Esse aumento
na taxa de reação também foi observado em
vários trabalhos sobre imobilização de enzimas
(Hara et al., 2008; Kim et al., 2006). Pode-se
constatar através da Figura 2 que os sistemas
enzima-suporte ativados com glutaraldeído
apresentaram morfologias distintas.
flexíveis. Essas diferenças nas morfologias
externas das partículas podem ser atribuídas à
composição química de cada subproduto
agroindustrial e, também, influência do agente
ativador (glutaraldeído). Outro fator com
potencial para influenciar na superfície das

partículas é o comportamento das gotículas
líquidas, que durante a secagem em leito de
jorro, estão sujeitas às turbulências,
movimentações internas e forças de atrito
inter-partículas (Maa; Hsu, 1997).
É importante compreender as alterações
nas propriedades físicas e químicas de uma
enzima, quando submetidas ao processo de
imobilização e consequentemente de
insolubilização. As principais alterações são
observadas na estabilidade das enzimas e nas
suas propriedades cinéticas causadas pelo novo
microambiente imposto sobre elas, seja pela
matriz do suporte ou pelos produtos da sua
própria ação.
Diversos tipos de materiais podem ser
empregados como suportes, como por
exemplo, produtos naturais e até mesmo
subprodutos agroindustriais. A possibilidade
do uso destes materiais como suporte constitui
uma alternativa versátil e economicamente
favorável aos suportes poliméricos de origem
sintética. Neste trabalho investigou-se a
viabilidade do emprego de vários produtos,
incluindo-se subprodutos agroindustriais,
como por exemplo, casca de arroz, palha e
sabugo de milho, bagaço de cana, casca de
coco verde entre outros. Assim, além dos
benefícios obtidos pela imobilização da
enzima, ter-se-ia vantagens ambientais e
econômicas, já que o emprego destes materiais
poderia reduzir o custo de produção.
CONCLUSÕES
O desenvolvimento deste trabalho
levou à obtenção de informações relevantes
sobre a tecnologia de imobilização de enzimas.
Somado à essa relevante área da tecnologia
enzimática, inseriu-se a tecnologia de secagem
nas operações de imobilização. Assim, como
conclusão geral do trabalho tem-se que a
imobilização das lipases produzidas por C.
kikuchii mostrou-se bastante relevante do
ponto de vista do baixo custo dos suportes
utilizados, bem como em função dos altos
valores de retenção da atividade enzimática
tanto após a secagem quanto para o período de
armazenamento.
8
AGRADECIMENTOS
A Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo – FAPESP (Processo:
2011/00743-8).
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