Calificación de

Espectrofotómetro UV-Vis
Espectrofotometría UV-Vis:
Fundamento
• Se basa en que las moléculas absorben las
radiaciones electromagnéticas y a su vez que la
cantidad de luz absorbida depende de forma
lineal de la concentración. La espectroscopia de
absorción UV-Vis involucra la absorción de luz
UV/visible por parte de una molécula
promoviendo el paso de un electrón desde un
orbital molecular fundamental a un orbital
excitado. La separación energética entre estos
orbitales moleculares corresponde a las
longitudes de onda del visible.
Espectrofotómetro UV-Vis:
Instrumentación
• Fuente
▫ Lámpara de deuterio e hidrogeno. (170-375 nm)
▫ Lámpara de filamento de wolframio. (350-2500
nm)
▫ Lámpara de arco de xenón. (200-1000 nm)
• Selectores de longitud de onda
• Recipiente para la muestra
• Detectores de radiación
• Procesadores de señal y dispositivos de lectura
Espectrofotómetro UV-Vis:
Tipos de Instrumentos
Haz Sencillo

Doble Haz en el Espacio

Espectrofotómetro UV-Vis:
Tipos de Instrumentos
Doble Haz en el Tiempo
Calificación de Equipos (EQ)
Actualización Mayor
Cambio de Uso
Selección de
Equipo
Recalificación

Mantenimiento
DQ DQ Uso OQ Uso
Preventivo
IQ PQ

Evaluación OQ
Reparación
Proveedor PQ

Avería
Validación
Traslado
Reubicación
• EQ Es un proceso formal que aporta evidencia
documentada de que un instrumento es
apropiado para un propósito y se mantiene en
un estado de mantenimiento y calibración
consistente con su uso.
• Ciclo de vida de la calificación de equipos.
Calificación de Diseño (DQ)
Característica
Sistema de control y comunicación
Tipo de Fuente
Muestras
Tipo de detector
Precisión de la longitud de onda
Rango de longitud de onda
Rango linear dinámico
Ruido óptico y electrónico
Consideraciones
Parámetros del espectrómetro seleccionado/ controlado/
almacenado/ recuperado ya sea localmente dentro del instrumento
óptico, vía una PC remota o un sistema controlador. Habilidad
para enviar/ aceptar/ almacenar/ recuperar señales y comunicar a
otros equipos.
Vida de lámpara, tiempo de calentamiento, susceptibilidad a la
deriva, longitud de onda.
Tipo de muestra, habilidad para manejar muestra discretas o
continuas, rango de tamaño de muestra, facilidad para controlar la
temperatura de la celda, fácil intercambio a otros tipos de celta.
Habilidad para monitorear longitudes de onda únicas, múltiples o
variables y/o características espectrales totales.
Habilidad para seleccionar una longitud de onda con precisión y
reproducibilidad.
Habilidad para seleccionar y monitorear una longitud de onda con
o sin cambio de fuente, filtro o detector
Habilidad para una cuantificación precisa sobre un amplio rango
de absorbancia.
Bajo ruido mejora la sensibilidad y bajos limites de detección.
 Calificación de Diseño (DQ)
Característica
Deriva de la longitud de onda
Resolución
Precisión fotométrica
Deriva fotométrica
Luz parasita
Recolección de datos
Manipulación de datos
Almacenamiento de datos
Salida de datos
Consideraciones
Baja deriva
Importante para un medida precisa en bandas estrechas
Se requiere una buena precisión para medidas absolutas de
absorbancia.
Estabilidad de la medida en el tiempo, haciendo comparaciones
significativas.
Afecta la precisión y linealidad. Define el método usado.
Expresión de datos en escalas de absorbancia o % T, facilidad para
uno o repetidos barridos, monitores de una o múltiples longitudes de
onda, datos de todo el espectro (ej. Arreglo de diodos)
Sustracción espectral, derivadas espectrales, los datos crudos son
incompatibles, capacidad de back-up y restauración.
No almacenar, memoria incorporada, transmisión de archivos a un
dispositivo externo, salida almacenada por medio magnético u óptico,
sistema de seguridad.
Procesamiento de datos basado en PC, generación de reportes
personalizados.
Calificación de Instalación (IQ)
 ¿el instrumento ha sido entregado como se ordenó, es decir, de
acuerdo a la DQ u orden de compra?
 ¿se ha revisado y verificado que el instrumento no tiene ningún
daño?
 ¿se ha suministrado la documentación apropiada, es la correcta
edición y está identificado de forma única por número de parte,
numero de versión y fecha?
 ¿han proveído todos los detalles requeridos de todos los
servicios y utilidades para operar el instrumento
(preferiblemente antes de la entrega)?
 ¿es claro cuáles son las instrucciones de mantenimiento,
calibración y realización de ensayos que se deben llevar a cabo
para el uso y cuales son responsabilidad del proveedor o sus
agentes?
 ¿se han proveído los detalles de servicios recomendados e
intervalos de calibración (llevados a cabo por el proveedor?
Calificación de Instalación (IQ)
 ¿se han proveído los intervalos, métodos e instrucciones para el
mantenimiento por parte del usuario junto con los puntos de
contacto para el servicio y repuesto?
 ¿se ha proveído el hardware, firmware y software correcto, y es la
edición correcta y está identificada de forma única por número de
parte?
 ¿se ha proveído la información de insumos requeridos durante la
operación normal del instrumento, particularmente durante los
procedimientos de encendido y apagado?
 ¿el ambiente seleccionado es adecuado para el instrumento, como
cuartos adecuado para el desempaque, instalación, operación y
servicio, y se le proporcionan los servicios y recursos apropiados
(electricidad, agua, etc.)?
 ¿se ha proporcionado información ambiental de salud y seguridad
relacionada a la operación del instrumento y es el ambiente de
trabajo propuesto consistente con estos requerimientos?
 ¿la respuesta del instrumento a la aplicación inicial de energía es
como se esperaba y cualquier desviación ha sido registrada?
Calificación Operacional (OQ)
• OQ pruebas deben llevarse a cabo después de la
instalación inicial del instrumento
y luego a intervalos definidos durante toda la vida
del instrumento.
• El propósito de OQ es verificar que aspectos clave
del rendimiento instrumental longitud de onda,
absorbancia, resolución, la luz difusa, el ruido y
desviaciones. Los espectrofotometros uv- visible se
calibran en sus dos escalas fotometrica y de
longitud de onda, con materiales de ref. q deben ser
certificados, adicionalmente hay otras pruebas
instrumentales que se deben evaluar como
Las pruebas de verificación requeridos
por las farmacopeas
La frecuencia o periodo de las pruebas OQ
típicamente dependerá de:

- Recomendaciones del fabricante

- El rendimiento requerido del instrumento
- Grado de utilización de los instrumentos
- Entorno de funcionamiento
- Uso inconsistente con las instrucciones del fabricante.
• Ejemplos de eventos que pueden requerir repetir OQ incluyen:

- Rutina de mantenimiento, revisión y sustitución de piezas

- Movimiento o traslado
- Interrupción de los servicios y / o servicios (otros que por
aceptados cierran procedimientos)
- La modificación o actualización, y
- Como parte de la solución de problemas / fallas encontrando
siguiente fracaso PQ.
Escala longitud de onda (exactitud/)
precisión
• Cálculos
E = λmedida- λref.
• Aceptable: UV ± 1 nm ;Vis ± 3 nm
• 3 repeticiones scans de el mismo pico deberian estar entre +-0.5nm
• Existen muchos estándares que se utilizan comúnmente para verificar la
exactitud de longitud de onda de un espectrofotómetro La desviación de la
longitud de onda puede causar errores en los resultados cuantitativos de la
lectura en el UV-Vis. En este control se verifica el grado de concordancia
entre
• la longitud de onda seleccionada para la máxima absorbancia y la longitud
de onda de referencia. Con una misma cubeta, ajustar el cero (0) del
instrumento
• con la solución de ácido perclórico al 10%. Se recomienda medir según el
rango espectral una longitud de onda para el espectro UV y tres longitudes
de onda para el espectro Vis. Dependiendo del ancho de banda del equipo,
la máxima absorción de la solución de óxido de holmio en ácido perclórico
se detectará a las longitudes de onda indicadas en la tabla 2
Patrón Patrón Ventajas Desventajas
Cristal de Patrón Picos a muchas La posición de los picos
óxido de absorción longitudes de onda de varía de lote a lote
holmio sólidos 280 a 2000 nm
Cristal de Patrón Picos a muchas La posición de los picos
óxido de absorción longitudes de onda de varía de lote a lote
didimio sólidos 400 a 1920 nm No hay picos por debajo
de 400 nm
Líneas de Patrón de Afiladas líneas Limitado a longitudes de
emisión de la emisión espectrales presentes en onda visibles (486,0 y
lámpara de la fuente de luz U 656,1 nm)
deuterio
Líneas de Patrones Afiladas líneas No comúnmente
emisión de la de espectrales Cubre ambas incorporado en el
lámpara de emisión regiones ultravioleta y instrumento
vapor de Hg visible

Oxido de Patron Picos a muchas No hay picos utilizables

holmio en absorcion longitudes de onda por encima de
ácido liquido de 240 a 650 nm 650 nm
perclórico
• Ciertas fuentes de emisión, como las lámparas de
mercurio y deuterio, exhiben líneas agudas a longitudes
de onda específicas que son ideales para los test de
exactitud y precisión de longitud de onda. De hecho, en
muchos espectrofotómetros modernos, se utilizan las
líneas de deuterio a 486.0 y 656.1 nm de la fuente
incorporada, para comprobar y recalibrar la exactitud de
longitud de onda. Sin embargo, las fuentes de emisión
requieren alimentación eléctrica y, si el instrumento ha
sido auto-calibrado utilizando su lámpara de deuterio,
debe utilizarse otro patrón para verificación. Además,
debido a que las fuentes
• de emisión no son muestras típicas, no prueban el
sistema completo.
Escala fotométrica
Exactitud = Am – Aref Exactitud de ± 0,01 AU

6 mediciones de 0,006% w / v de
𝑆𝐷 Dicromato de potasio en 235, 257,
Precisión RSD =
𝑥 313, y 350 nm debe ser inferior a
0,5% RSD.
EXACTITUD fotométrica
Patrón Ventajas Desventajas
Cristal de Perfil de absorbancia No es adecuado para el rango UV
densidad muy llano en elrango No es absolutamente estable; debe
neutra visible de longitud de recalibrarse regularmente
onda
Dicromato Picos anchos a 257 y 350 No absorbancia en el rango visible
potásico en nm y valles Muy sensible al pH y, como agente
ácido anchos a 235 y 313 nm oxidante potente, puede ser inestable
perclórico o
sulfúrico
• La exactitud fotométrica se determina comparando
la
• absorbancia de una solución de referencia (Tabla 3)
con la
• lectura de ésta, obtenida en el espectrofotómetro.
Para
• cubrir satisfactoriamente el rango UV-Vis del
espectro, se
• utilizan dos soluciones diferentes: dicromato de
potasio,
• para el espectro UV y sulfato de cobre, para el
espectro Vis.
Luz dispersa

• Aceptación: la transmitancia de la solución en

una celda de 1-cm debe ser inferior a 0,01, o el
valor de absorbancia debería ser mayor que 2.
• La luz parásita se define como la luz detectada de cualquier
longitud de onda que está fuera del ancho de banda de la
longitud de onda seleccionada
• La luz dispersa es el factor que más afecta a la
relación lineal entre la absorbancia y la
concentración a absorbancias elevadas.
• La luz parásita causa una disminución de la absorbancia y se
reduce el rango lineal del instrumento. Absorbancia de alta
mediciones se ven afectados más severamente por la luz
parásita.
• La luz extraviada causa además importantes desviaciones de
la Ley de Beer-Lambert. Tal como se aprecia en la figura Nº 1,
conforme aumenta la cantidad de luz extraviada que llega al
detector, disminuye la linealidad del método.
Patrón Ventajas Desventajas
Disolución de nitrito sódico Cortes a 390 nm Ninguna
(50 g/l) Usado para medir luz
dispersa a
340 nm o inferior
Disolución de ioduro Cortes a 260 nm Tendencia a
potásico o Usado para medir luz descomponerse
sódico (10 g/l) dispersa a
200 nm o inferior
Disolución de cloruro Cortes a 200 nm Como la medida se realiza
potásico Usado para medir luz en el lateral
(12 g/l) dispersa a de la pendiente de corte,
220 nm o inferior los errores de
exactitud de λ pueden
afectar a la
medida de luz dispersa
Linealidad fotométrica

• Graficar Am Absorbancia medida vs Aref Absorbancia de referencia .

• A de la serie de soluciones de dicromato de
potasio (0,02; 0,04; 0,06; 0,08 y 0,1 g L-1), en Sl de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1 235, 257,
313, y 350 nm
r ≥0,999 Aceptable
• El estudio de la linealidad fotométrica permite establecer el rango de absorbancia en el que
el instrumento tiene respuesta proporcional a los cambios de concentración. Para ello se
determina la respuesta del espectrofotómetro a diferentes concentraciones de una
sustancia que cumpla con la ley de Lambert-Beer. Se evalúa la linealidad fotométrica
realizando lecturas de absorbancia de la serie de soluciones de dicromato de potasio (0,02;
0,04; 0,06; 0,08 y 0,1 g L-1), utilizando la solución de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1 para
realizar el ajuste a 0 de absorbancia del equipo. Las longitudes de onda a que se realizan las
lecturas serán: 235, 257, 313 y 350 nm. Calcular con una regresión lineal el coeficiente de
regresión (r). Linealidad El rango lineal dinámico de la medición está limitada por la luz
parásita en alta absorbancia y por el ruido en absorbancia baja. Para mediciones de rutina
con muestras y los estándares de referencia químicas relacionadas, la exactitud de la
cuantificación de la muestra depende de la precisión y linealidad de las mediciones.
• Tests. Una serie de soluciones de dicromato de potasio de concentración 20, 40, 60, 80, y
100 mg / L en 0,005 M de ácido sulfúrico se puede utilizar para comprobar la linealidad del
sistema. En primer lugar, 0,005 M de ácido sulfúrico como referencia se escanea y después
las soluciones de dicromato de potasio en 235, 257, 313, y 350 nm. Los valores de
absorbancia a la longitud de onda diferentes se representan frente a la concentración de las
soluciones y los coeficientes de correlación se calculan. Aceptación. Coeficiente de
correlación r ≥ 0,999.
Ruido
Se origina principalmente a partir de la fuente de luz y componentes
electrónicos. El ruido en la medición afecta a la precisión en ambos
extremos de la escala de absorbancia

• El aire es escaneado en el modo de absorbancia para 10 min. pico a pico el ruido

se registra a 500 nm. La raíz cuadrada media (RMS) de ruido se calcula. La
medición del ruido RMS es una medida de la desviación estándar de las señales
de fondo
• Aceptación. El ruido RMS normalmente debe ser inferior a 0,001 UA.
• Un espectrofotómetro, típicamente, tiene dos factores de ruido. El primero (ruido fotónico o Schott)
resulta de la distribución estadística de los fotones emitidos por una fuente de luz. Es proporcional a la
raiz cuadrada de la intensidad de luz. Cuando se miden muestras de baja concentración con bajas
absorbancias, este factor puede evitar una medida exacta de la pequeña diferencia entre dos niveles de
luz. El segundo factor es inherente a la
• electrónica del instrumento (amplificador del detector, convertidor analógico-digital, etc.) y es
independiente de la intensidad medida. Este factor se convierte en significativo a altos niveles de
absorbancia, donde la señal de muestra es muy pequeña. Puede minimizarse mediante un buen diseño.
• El ruido afecta negativamente a la precisión de las medidas y, para una medida sola, puede introducir
también errores en la exactitud. Sin embargo, el ruido puede reducirse aumentando el tiempo de medida
(vea “Promedio de tiempo” en la página 67). uido
• El ruido en la medición de UV-Vis se origina principalmente a partir de la fuente de luz y componentes
electrónicos. El ruido en la medición afecta a la precisión en ambos extremos de la escala de absorbancia.
Photon ruido de la fuente de luz afecta a la precisión de las mediciones de absorbancia baja. El ruido
electrónico de los componentes electrónicos afecta a la precisión de las mediciones de absorbancia alta
[8]. Un alto nivel de ruido afecta a la precisión de las mediciones y reduce el límite de detección, haciendo
así que el instrumento menos sensible ruido
• El ruido en la medición de UV-Vis se origina principalmente a partir de la fuente de luz y componentes
electrónicos. El ruido en la medición afecta a la precisión en ambos extremos de la escala de absorbancia.
Photon ruido de la fuente de luz afecta a la precisión de las mediciones de absorbancia baja. El ruido
electrónico de los componentes electrónicos afecta a la precisión de las mediciones de absorbancia alta
[8]. Un alto nivel de ruido afecta a la precisión de las mediciones y reduce el límite de detección, haciendo
así que el instrumento menos sensible.
• Tests. El aire es escaneado en el modo de absorbancia para 10 min. pico a pico el ruido se registra a 500
nm. La raíz cuadrada media (RMS) de ruido se calcula. La medición del ruido RMS es una medida de la
desviación estándar de las señales de fondo. Espectrofotómetros modernos suelen estar equipados con la
función de estimación de ruido. Para espectrofotómetros viejos , el ruido RMS puede estimarse
multiplicando el más alto pico a pico de nivel de ruido en un factor de 0,7 (Figura 10,8). Aceptación. El
ruido RMS normalmente debe ser inferior a 0,001 UA
Resolución

Aceptación. Sln tolueno 0.02% v/v en hexano La relación de la

absorbancia a λ (269 nm) y la absorbancia a (266 nm) debe ser
mayor que 1,5.
• Resolución espectral La resolución espectral es una medida de la
capacidad de un instrumento para diferenciar entre dos longitudes de
• onda adyacentes. Dos λ se consideran resueltas, normalmente, si el mínimo
entre los dos picos de la señal de salida del detector es menor que el 80 %
del máximo. Esto se La resolución está muy relacionada con la anchura de
banda espectral instrumental (SBW). La SBW se define como la anchura, a
la mitad de su intensidad máxima, de la banda de luz que sale del
monocromador La exactitud de cualquier absorbancia medida depende de
la relación de la SBW a la anchura de banda natural (NBW) de la sustancia
absorbente. La NBW es la anchura de la banda de absorción de la muestra a
la mitad de su máximo
• de absorción Una relación SBW/NBW de 0.1 o menos, dará lugar a una
medida de absorbancia con una exactitud del 99.5 % o mejor.8,9 A una
relación SBW/NBW mayor de 0.1, el espectro medido se distorsiona
progresivamente, como se muestra en la Figura 32. Las bandas no pueden
resolverse
• correctamente y ocurrirán errores significativos en los valores de
absorbancia, a la mayoría de las longitudes de onda. SBW es principalmente
una función de las anchuras de las rendijas de entrada y salida del
monocromador y de la dispersión generada por la red de difracción. No son
inusuales resoluciones de 0.5, 0.2 y 0.1 nm, pero mayores resoluciones
pueden causar un considerable deterioro de la relación S/N
Calificación de Desempeño (PQ)
Bibliografía
• Principios de análisis instrumental 5ª edición. Pág.
348
• D.G. Holcombre, M.C. Boardman. Guidance on
equipment qualification of analytical instruments:
UV-visible spectro (photo)meters (UV-Vis),
September 2000
• Chow C. Analitical method validation and
instrumental performance verification.Jhon Willey
& son. New Jersey. 2004
• Clare J.L. (2005) Calibration of UV-vis
spectrophotometers for chemical analysis.
Accreditation and Quality Assurance 10: 283-288