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SECUENCIA
>KU684312.1:6083-7156 Human papillomavirus type 16 isolate IND-JNM434,
complete genome
ATGGATTACAAACAAACACAATTGTGTTTAATTGGTTGCAAACCACCTATAGGGGAACACTGGGGCAAAG
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GGCCAAACCAAAATTTACATTAGGAAAACGAAAAGCTACACCCACCACCTCATCTACCTCTACAACTGCT
AAACGCAAAAAACGTAAGCTGTAA
INTTRRODUCCION
Proteína: Principal proteína de la cápside L1
Gen: L1
Organismo: Virus del papiloma humano tipo 16
Función: Forma una cápside icosaédrica con una simetría T = 7 y un diámetro de 50 nm. La cápside
está compuesta por 72 pentámeros unidos entre sí por enlaces disulfuro y asociados con proteínas
L2. Se une a los proteoglicanos de heparán sulfato en la superficie celular de los queratinocitos de la
capa basal para proporcionar la unión inicial del virión. Esta unión media un cambio conformacional
en la cápside del virus que facilita una infección eficiente. El virión ingresa a la célula huésped a través
de la endocitosis. Durante el tráfico de virus, la proteína L1 se disocia del ADN viral y el ADN genómico
se libera al núcleo del huésped. El ensamblaje del virión se lleva a cabo dentro del núcleo celular.
Encapsula el ADN genómico junto con la proteína L2
Ubicación subcelular: Virion; Núcleo del huésped
PTM: Disulfide bond
Sistema para la expresión de proteínas: Elegimos la Pichia pastoris debido a las técnicas genéticas
disponibles, altos niveles de expresión, tasa de crecimiento rápido en medios relativamente simples
y tecnología de fermentación bien establecida, junto con su economía de uso.
Vector plasmídico: pPICZB
Enzimas de restricción: Sitio 1: EcoRI; Sitio 2: XhoI;
EcoRI XhoI
CUTSITE CUTSITE
G/A A T T C C/T C G A G
C T T A A/G G A G C T/C
OVERHANG OVERHANG
5′ AATT 5′ TCGA
DISEÑO DE PRIMERS
Secuencia: FWD GGC GCG CGA ATT CAT GGA TTA CAA AC
Tm: 61 ºC
Estructuras secundrias:
Secuencia: REV CGC GAT CTC GAG TAG TTA CAG CTT ACG
Tm: 60.1 ºC
Estructuras secundrias:
PCR
vector plasmídico pPICZB / L1 usando ADN polimerasa Pfu.
Configuración de la reacción:Recomendamos ensamblar todos los componentes de la reacción
en hielo y transferir rápidamente las reacciones a un termociclador precalentado a la temperatura
de desnaturalización (98 ° C). Todos los componentes deben mezclarse y centrifugarse antes de
su uso. Es importante agregar Phusion DNA Polymerase al final para evitar cualquier degradación
del cebador causada por la actividad exonucleasa 3´ → 5´. Phusion DNA Polymerase puede
diluirse en 1X HF o GC Buffer justo antes de su uso para reducir los errores de pipeteo. Tenga en
cuenta que los protocolos con Phusion DNA Polymerase pueden diferir de los protocolos con otras
polimerasas estándar. Como tal, las condiciones recomendadas a continuación deben usarse para
un rendimiento óptimo.
Mezcla de reacción
Componente 20 µl de 50 µl de Concentración final
reacción reacción
Notas: Mezcle suavemente la reacción. Recoja todo el líquido en el fondo del tubo mediante un giro
rápido si es necesario. Superponga la muestra con aceite mineral si usa una máquina de PCR sin
una tapa calentada.
Transfiera los tubos de PCR del hielo a una máquina de PCR con el bloque precalentado a 98 ° C
y comience el termociclado:
Condiciones de termociclado para una PCR de rutina:
PASO TEMPERATURA HORA
Sostener 4-10 ° C
ADN CANTIDAD
ADN genómico 1 ng – 1 µg
Plásmido o viral 1 pg – 10 ng
Notas: Mezcle suavemente la reacción. Recoja todo el líquido en el fondo del tubo mediante un
giro rápido si es necesario. Superponga la muestra con aceite mineral si usa una máquina de PCR
sin una tapa calentada.
Transfiera los tubos de PCR del hielo a una máquina de PCR con el bloque precalentado a 95 ° C y
comience el termociclado.
Condiciones de termociclado para una PCR de rutina:
PASO TEMPERATURA HORA
Sostener 4-10 ° C
ADN Cantidad
genómico 1 ng – 1 μg
plásmido o viral 1 pg – 10 ng
DIGESTIÓN
Enzimas
EcoRI; XhoI
Mezcla
Componentes:
50% (v / v) de glicerol
Condiciones de reacción
1. Diluya el fragmento grande de ADN polimerasa I a 0.5 U / µl con Klenow Tampón de dilución.
0.5 mM dTTP....................................................................................1 µl
DNA...........................................................................................0.5-1 µg
3. Mezcle suavemente y centrifugue brevemente para llevar el contenido al fondo del el tubo.
4. Incubar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos o 20 minutos en hielo.
LIGACIÓN
El gen L1 se ligó al vector de expresión pPICHOLI (Mobitech) después de la digestión
con SalI, rellenando los extremos de cadena sencilla usando polimerasa Klenow
(Invitrogen) y dNTP, y digestión por EcoRI. El vector de expresión resultante se
denominó pPICHOLI / L1.
Enzimas
SalI EcoRI.
Mezcla
Condiciones de reacción
TRANSFORMACIÓN
Introducción:
El kit Pichia EasyComp ™ produce células Pichia químicamente competentes y es
incluido para proporcionar una alternativa a la electroporación y un rápido y conveniente
método para la transformación. Sin embargo, debido a la baja eficienicia de transformación
(3 μg de ADN plasmídico produce alrededor de 50 colonias), es muy difícil
aislar integrantes de copias mútliples. En casos donde los integrantes de copias múltiples
son deseados, se utiliza la electroporación para obtener mejores resultados.
Tenga en cuenta que las celdas son preparadas de manera diferente para la
electroporación.
No utilice celdas preparadas utilizando el Protocolo EasyComp ™ para electroporación.
Se requiere:
Reactivos y Equipo
• Incubadora rotatoria de 30 ° C
• Medio YPD (extracto de levadura peptona dextrosa) (ver Recetas, página 55)
• 50 ml, tubos cónicos estériles
• Centrífuga adecuada para tubos cónicos de 50 ml (piso o sobremesa)
• Tubos de microcentrífuga estéril de rosca de 1,5 ml.
• –80 ° C congelador
• Caja de espuma de poliestireno o toallas de papel.
Antes de comenzar:
• Colocar una placa de YPD con su cepa de Pichia de forma aislada.
Las colonias crecerán. Incubar la placa a 28-30 ° C durante 2 días.
• Equilibre la solución I a la temperatura ambiente.
Preparado:
Células competentes
1. Inocular 10 ml de YPD con una sola colonia de su cepa Pichia. Dejar crecer
durante la noche a 28–30 ° C en una incubadora con agitación (250–300 rpm).
2. Diluya las células del cultivo nocturno a un OD600 de 0.1–0.2 en 10 ml de YPD.
Crecer las células a 28-30 ° C en una incubadora de agitación hasta que el OD600 es 0.6-1.0.
Esto tomará aproximadamente 4 a 6 horas.
3. Formar Pellet de las células por centrifugación a 500 × g durante 5 minutos a temperatura
ambiente.
Desechar el sobrenadante.
4. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de Solución I. No se requiere tiempo de
incubación.
5.Formar Pellet de las células por centrifugación a 500 × g durante 5 minutos a temperatura
ambiente.
Desechar el sobrenadante.
6. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de Solución I. Las células ahora son
competentes.
7. Alícuota de 50 a 200 μl de células competentes en tubos con tapones roscados estériles
de 1,5 ml etiquetados de microcentrífuga.
Nota: Usar 50 μl de celdas para cada transformación. Puedes descongelar las células y volver
a congelar varias veces sin pérdida significativa en la eficiencia de transformación.
8. En este punto, las células pueden mantenerse a temperatura ambiente y usarse
directamente para la transformación o congelado para uso futuro. Para congelar las células,
coloque los tubos en una Caja o envoltura de espuma de poliestireno en varias capas de
toallas de papel y colóquela a –80 ° C en congelador. Es importante que congele las células
lentamente. No congelar las células en nitrógeno líquido.
9. Continúe con el procedimiento de transformación.
Necesario:
Reactivos y Equipo
• incubadora a 30 ° C
• Baños de agua o bloques de calor a 30 ° C y 42 ° C.
• Microcentrífuga a temperatura ambiente.
• YPDS con placas Zeocin ™ de 100 μg / ml (consulte Recetas, página 56)
Antes de comenzar:
• El PEG en la Solución II puede precipitar a temperaturas inferiores a 27 ° C. En caso de
observar un precipitado, calentar la solución a 37 ° C, girando ocasionalmente, hasta que
el precipitado se disuelva. Para evitar la formación de un precipitado, almacene la Solución
II a temperatura ambiente.
• Equilibre la Solución III a la temperatura ambiente.
• Equilibre el número y tipo de placas apropiados a la temperatura ambiente.
Necesitará una placa para cada transformación.
• Es posible que desee incluir controles para verificar la contaminación.
Se recomienda un control sin ADN y solo con plásmido.
Protocolo:
1. Para cada transformación, descongelar un tubo de células competentes en la sala a
temperatura ambiente y alícuotar 50 μl en un tubo de microcentrífuga estéril. Si se busca
transformar células nuevas, use 50 μl de células competentes,
Paso 7, página 29.
2. Agregue 3 μg de ADN de vector de expresión de Pichia linealizado a las células
competentes.
Nota: El uso de más de 3 μg de ADN puede aumentar la eficiencia de transformación en
algunos casos. El volumen de ADN no debe exceder los 5 μl. Se puede usar ADN linealizado
directamente de una reacción de digestión de restricción sin afectar la eficiencia de la
transformación.
La extracción con cloroformo de fenol y la precipitación con etanol no son necesarias.
3. Agregue 1 ml de Solución II a la mezcla de ADN / célula y mezcle sacudiendo el tubo.
4. Incubar las reacciones de transformación durante 1 hora a 30 ° C en un baño de agua o
incubadora. Mezcle la reacción de transformación cada 15 minutos mediante agitación
vorticial o sacudiendo el tubo. No mezclar la reacción de transformación cada 15 minutos.
Pues dará como resultado una disminución de la eficiencia de transformación.
5. Chocar con calor las células en un bloque de calor de 42 ° C o baño de agua durante 10
minutos.
6. Divida las células en 2 tubos de microcentrífuga (aproximadamente 525 μl por tubo)
y agregue 1 ml de medio YPD a cada tubo.
7. Incubar las células a 30 ° C durante 1 hora para permitir la expresión de la resistencia
Zeocin ™.
8. Formar Pellet de las células por centrifugación a 3.000 × g durante 5 minutos a
temperatura ambiente.
Desechar el sobrenadante.
9. Resuspenda cada tubo de células en 500 μl de Solución III y combine las células
en un tubo.
10. Formar Pellet de las células por centrifugación a 3.000 × g durante 5 minutos a
temperatura ambiente.
Desechar el sobrenadante.
11. Resuspender el sedimento celular en 100 a 150 μl de Solución III.
12. Platee toda la transformación en placas de selección apropiadas usando un
esparcidor estéril. Incubar las placas durante 3 a 10 días a 30 ° C. Cada transformación
debería producir aproximadamente 50 colonias.
Analizando transformaciones en Pichia
Seleccione 6–10 de sus transformantes de Pichia resistentes a Zeocin ™ y confirme el Mut
fenotipo. También es posible que desee analizar la presencia de inserto mediante PCR
Nota: Al seleccionar transformantes de Pichia resistentes a Zeocin ™, es normal observar
una baja cantidad de fondo (~ 10-30%).
SCREENING
X-GAL
PCR
Seuenciación
PURIFICACIÓN
En esta sección, crecerá e inducirá un cultivo de 10–200 ml de su transformante Pichia para la
purificación de prueba en una resina quelante de metales como ProBond ™.
Puede recolectar las células y almacenarlas a –80 ° C hasta que esté listo para purificar su proteína
de fusión, o puede proceder directamente con la purificación de proteínas.
Recomendamos que utilice el Sistema de purificación ProBond ™ (Cat. No. K850-01) para purificar
proteínas de fusión expresadas. Tenga en cuenta que las instrucciones para el equilibrio y la
cromatografía en resina ProBond ™ son contenido en el sistema de purificación ProBond ™.
Si está utilizando una resina quelante de metales que no sea ProBond ™, siga las recomendaciones
del fabricante para las proteínas de fusión expresadas en bacterias o levaduras.
REFERENCIAS
https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/pcr-protocol-m0530
http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0012033_Pfu_DNAPolymerase_UG.pdf
https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/taq-dna-polymerase-with-thermopol-buffer-m0267
https://assets.thermofisher.com/TFS-
Assets/LSG/manuals/MAN0012026_TaqDNAPolymerase_recombinant_5_UuL_100U_UG.pdfhttp://tools.the
rmofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0012033_Pfu_DNAPolymerase_UG.pdf
https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/taq-dna-polymerase-with-thermopol-buffer-m0267
https://assets.thermofisher.com/TFS-
Assets/LSG/manuals/MAN0012026_TaqDNAPolymerase_recombinant_5_UuL_100U_UG.pdf
https://enzymefinder.neb.com/#!/name/XhoI
https://enzymefinder.neb.com/#!/name/EcoRI
http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/easyselect_man.pdf
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3507537/
GGG CGG TCG GAA TTC ATG GAT TAC AAA C