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ANNEE 2015

THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1


sous le sceau de l’Université Européenne de Bretagne

pour le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1


Mention : Biologie et Sciences de la Santé

Ecole doctorale Vie-Agro-Santé

présentée par

Anaïs MICHAUT
Préparée dans l’Unité de Recherche INSERM UMR 991
« Foie, Métabolismes et Cancer »
Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques

Thèse soutenue à Rennes


Mise au point d’un le 9 Juillet 2015
modèle cellulaire de devant le jury composé de :
Pr Marie-Anne LORIOT
stéatose hépatique Professeur des Universités
Université Paris-Descartes / rapporteur
liée à l’obésité: Pr Bruno MEGARBANE
Professeur des Universités
Application à l’étude Université de Paris-Diderot / rapporteur
Dr Isabelle DE WAZIERS
de la toxicité du Chargée de recherche
Université de Paris-Descartes / examinateur

paracétamol Dr Dominique LAGADIC-GOSSMANN


Directeur de Recherches INSERM
Université de Rennes-1 / examinateur
Pr André GUILLOUZO
Professeur des Universités
Université de Rennes-1 / examinateur
Dr Bernard FROMENTY
Directeur de Recherches INSERM
Université de Rennes-1 / directeur de thèse
REMERCIEMENTS

Je souhaite tout d’abord remercier Monsieur le Docteur Bernard Fromenty, mon


directeur de thèse, pour ces 3 ans et demi d’accompagnement. Tu as toujours manifesté un
grand intérêt pour mon travail et m’a toujours fait confiance. Merci pour tes
encouragements dans les moments de doutes et ta disponibilité à tout instant.

Je remercie Madame le Professeur Marie-Anne Loriot et Monsieur le Professeur


Bruno Mégarbane d’avoir accepté d’évaluer ma thèse en tant que rapporteur et d’apporter
vos regards d’expert sur ce travail. Merci également à Madame le Docteur Isabelle de
Waziers, Madame Dominique Lagadic-Gossmann et Monsieur le Professeur André Guillouzo
de me faire l’honneur de votre présence au sein de mon jury de thèse.

Merci à Madame le Professeur Odile Sergent et Madame le Professeur Lydie Sparfel,


qui se sont intéressées à mon travail depuis le début, en participant notamment à mes 2
comités de thèse et dont les remarques pertinentes m’ont permis d’avancer. Je remercie
également Madame le Docteur Nathalie Dejucq-Rainsford pour avoir accepté et accompli le
rôle de tuteur de thèse vis-à-vis de l’école doctorale VAS.

Je tiens à remercier Madame le Docteur Caroline Moreau pour ton aide et ta


sympathie. Depuis ton arrivée dans l’unité, tu as toujours été disponible pour moi malgré
ton emploi du temps surchargé. Tu étais à mes côtés lors des difficultés expérimentales et
ensemble, nous avons pu trouver des solutions pour avancer dans les travaux. C’est
également dans ce cadre que je remercie Monsieur le Docteur Claude Bendavid pour votre
aide précieuse.

De même, je tiens également à remercier Madame le Docteur Marie-Anne Robin, qui


était très présente dans l’équipe ainsi que dans mon projet. La maladie t’a emporté voilà
presque un an, et j’admire ton courage. Jusqu’au dernier instant, tu es restée souriante,
confiante et disponible pour ton équipe.
Cette thèse m’a également permis de faire de belles rencontres. Un grand merci à
Karine, j’ai énormément apprécié travailler dans le même laboratoire, nos petites pauses
sur la « terrasse » du bâtiment 8, et il en est né une belle amitié. Merci à Dounia pour ton
aide précieuse, ton soutien moral et ton écoute. Je remercie aussi tous ceux qui ont rendu
ma thèse bien plus agréable, notamment Tatiana et Nicolas qui étaient là dès mon arrivée et
m’ont soutenue dans les difficultés. Simon, j’ai énormément apprécié ta gentillesse, ta
bonne humeur, et ton accent qui me rappelle ma région. Matthew, nous nous sommes
rencontrés en stage au CIT à Evreux et le destin a voulu encore une fois nous réunir à
Rennes. Sans oublier Sophie, Patricia, Sacha, Aude, je n’oublierai pas votre bonne humeur et
nos fous-rire durant la pause déjeuner.

Merci également à l’équipe INSERM UMR991, notamment Ahmad et Houssein, pour


vos disponibilités à chaque instant, Thomas G. et Isabelle Morel, Audrey, Eva, Pascal Loyer,
Anne Corlu, Ghislaine, Denise, Isabelle... J’ai également une pensée pour les anciens
membres de l’équipe, dont Pegah, Camille, Amina, Carine, la petite Florence, et les autres.

Je souhaite également remercier toutes les personnes extérieures avec qui j’ai pu
travailler, Nicolas Mouchet, Medjda et Jacques Le Seyec. Merci à toute l’équipe
d’enseignants, Michelle Lesimple, Céline Raguenes-Nicol, Claire Piquet-Pellorce, Thierry
Guillaudeux, Patricia, Pascale, Colette...

Un merci particulier à ma famille, si importante pour moi. Maman, tu m’as toujours


soutenu dans tous mes projets quels qu’ils soient. Tu es présente à chaque épreuve et
j’espère aujourd’hui que tu es fière de mon parcours. Merci à Rémy et Lylou, votre joie et
votre amour me renforce. Merci à Daniel et Françoise de votre soutien dans mes études,
particulièrement au cours de mon année rouennaise. Merci papa de croire en moi et à ma
réussite.

Mathieu, un grand merci pour ta présence à mes côtés au quotidien et ta ténacité à


me supporter durant ces moments de stress et de découragement. Ton enthousiasme, ta
sérénité et ton amour m’auront permis de tenir bon jusqu’au bout et d’avancer avec
confiance dans mes projets. Que les années à venir nous réservent de belles surprises…
SOMMAIRE

LISTE DES PRINCIPALES ABREVIATIONS ............................................................................. 5

INDEX DES FIGURES ET TABLEAUX ..................................................................................... 7

AVANT-PROPOS ................................................................................................................ 9

INTRODUCTION

I/ Obésité et complications associées .......................................................................... 11

A. Introduction.............................................................................................................. 11

1. L’obésité ................................................................................................................... 11

2. Des chiffres alarmants .............................................................................................. 11

3. Complications associées à l’obésité ......................................................................... 13

B. Stéatoses et stéatohépatites non alcooliques .............................................................. 15

1. Introduction .............................................................................................................. 15

2. Epidémiologie ........................................................................................................... 16

3. Physiopathologie des NAFLD .................................................................................... 17

II/ Les cytochromes P450 2E1 et 3A4 ............................................................................ 21

A. Généralités sur les CYPs ................................................................................................ 21

1. Cycle catalytique ...................................................................................................... 21

2. Nomenclature et classification ................................................................................. 23

3. Rôle physiologique des CYPs .................................................................................... 26

B. Le CYP2E1 ...................................................................................................................... 30

1. Généralités sur le CYP2E1 ........................................................................................ 30


1
2. Les substrats endogènes et exogènes du CYP2E1.................................................... 33

3. Altération de l’expression et/ou de l’activité du CYP2E1 en conditions


physiopathologiques .................................................................................................... 35

C. Le CYP3A4 ..................................................................................................................... 45

1. Généralités sur le CYP3A4 ........................................................................................ 45

2. Les substrats endogènes et exogènes du CYP3A4 .................................................. 47

3. Altération de l’expression et/ou de l’activité du CYP3A4 en conditions


physiopathologiques .................................................................................................... 50

III/ Le paracétamol ...................................................................................................... 56

A. Introduction .................................................................................................................. 56

1. Structure et propriétés chimiques ........................................................................... 56

2. Pharmacologie .......................................................................................................... 57

3. Galénique et posologies ........................................................................................... 57

4. Données pharmacocinétiques.................................................................................. 58

B. Métabolisme ................................................................................................................. 60

1. Les réactions de phase 1 et les cytochromes P450 .................................................. 62

2. Les réactions de conjugaison ................................................................................... 62

3. Le métabolisme de phase 3...................................................................................... 66

C. Toxicité hépatique du paracétamol .............................................................................. 67

1. La phase d’initiation ................................................................................................. 68

2. La phase d’amplification et de propagation des lésions .......................................... 71

3. Régénération et réparation tissulaire ...................................................................... 80

2
D. Prise en charge médicale de l’intoxication au paracétamol ........................................ 83

1. Symptômes ............................................................................................................... 83

2. Traitements .............................................................................................................. 84

3. Diagnostic ................................................................................................................. 85

E. Facteurs de susceptibilité à la toxicité du paracétamol................................................ 87

1. Obésité et pathologies hépatiques associées .......................................................... 89

2. Alcoolisme et maladies hépatiques liées à l’alcool .................................................. 98

3. Jeûne prolongé et dénutrition ................................................................................. 99

4. Autres facteurs de risques...................................................................................... 101

F. Réglementation concernant la délivrance .................................................................. 105

ARTICLE 1 ......................................................................................................................107

ARTICLE 2 ......................................................................................................................119

DISCUSSION, CLONCLUSION ET PERSPECTIVES................................................................164

BIBLIOGRAPHIE ..............................................................................................................179

3
4
LISTE DES PRINCIPALES ABREVIATIONS

ACACA Acetyl-CoA Carboxylase α (ACC)


AG Acides Gras
AMPK AMP-activated Protein Kinase
APAP Paracétamol
APO A4 Apolipoprotéine A4
C18:0 acide stéarique
C18:1 acide oléique
ChREBP Carbohydrate Responsive Element-Binding Protein
CMZ Chlorméthiazole
CYPs Cytochromes P450
CZX Chlorzoxazone
DMSO Diméthylsulfoxyde
ERO Espèces Réactives de l’Oxygène
FABP4 Fatty Acid Binding Protein 4
FASN Fatty Acid Synthase
GCLC Glutamate Cysteine Ligase (γGCS)
GSH Glutathion
GSTs Glutathion-S-Transférases
HNF Hepatic Nuclear Factor
HSPs Heat Chock Proteins
HMOX1 Heme Oxygenase 1 (HO-1)
IL Interleukine
IMC Indice de Masse Corporelle
NAC N-Acétylcystéine
NAFLD Nonalcoholic Fatty Liver Diseases
NAPQI N-Acétyl-p-benzoquinone-Imine
NASH Nonalcoholic Steatohepatitis
NRF2 Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2
PDK4 Pyruvate Dehydrogenase Kinase
PLIN1 Perilipine 1
PLIN2 Adipose Differenciation-related Protein (ADFP)
PNPLA3 Patatin-like phospholipase domain-containing 3
PPAR Peroxisome Proliferator-Activated Receptor
PXR Pregnane X receptor
SCD1 Stearoyl-CoA Desaturase 1
SREBF1 Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1c (SREBP1c)

5
SULTs Sulfotransférases
TNFα Tumor Necrosis Factor-α
TRIB3 Tribbles Pseudokinase 3
UGTs UDP-Glucuronosyltransférases

6
INDEX DES FIGURES ET TABLEAUX

Figure 1: Prévalence de l’obésité (IMC>30) dans le monde en 2009. ..................................... 12

Figure 2: Répartition des niveaux d’IMC des personnes de plus de 18 ans en France en 2012
(selon l’étude ObEpi). ............................................................................................................... 13

Figure 3: Physiopathologie de NAFLD : mécanisme impliqué dans le développement d’une


stéatose et dans sa progression en stéatohépatite (NASH).. .................................................. 20

Figure 4: Structure du groupement prosthétique des CYPs .................................................... 21

Figure 5: Représentation shématique du cycle catalytique des CYPs. .................................... 23

Figure 6: Métabolisme d’un xénobiotique au niveau de l’hépatocyte.................................... 27

Figure 7: Les principaux CYPs des familles 1, 2 et 3 impliqués dans le métabolisme des
médicaments utilisés en clinique ainsi que les facteurs influençant la variabilité de ces
enzymes.................................................................................................................................... 28

Figure 8: Les CYPs impliqués dans le métabolisme de molécules endogènes. ....................... 29

Figure 9: structures chimiques de l’acétanilide, du paracétamol et de la phénacétine. ........ 56

Figure 10: Les principales voies métaboliques du paracétamol après administration d’une
dose thérapeutique.. ................................................................................................................ 61

Figure 11: Phase d’initiation de la toxicité du paracétamol : la bioactivation. ....................... 70

Figure 12: Lésions mitochondriales et stress oxydant induits par le NAPQI. .......................... 73

Figure 13: Activation de la voie de la c-jun-N-terminal kinase (JNK) par les ERO suite à une
intoxication au paracétamol. ................................................................................................... 77

Figure 14: Différences morphologiques entre la mort cellulaire par apoptose et par nécrose
observées après coloration à l’hématoxyline-éosine de coupes de foie de souris.. ............... 79

7
Figure 15: Réponse innée au cours de l’intoxication hépatique au paracétamol.. ................. 82

Figure 16: Nomogramme de Rumack et Matthew, représentant la concentration


plasmatique (mg/l) du paracétamol en fonction du temps après ingestion. .......................... 86

Figure 17: Facteurs pouvant moduler le risque et la sévérité de l’hépatotoxicité induite par le
paracétamol dans un contexte d’obésité et de NAFLD. ......................................................... 96

Tableau 1: Classification des CYPs en fonction de leur classe de substrat majoritaire ........... 26

Tableau 2: Altération de l’expression et/ou de l’activité du CYP2E1 lors de la stéatose et de la


NASH dans des foies humains : Investigations Ex vivo et mesure In vivo de l’activité du
CYP2E1. ..................................................................................................................................... 38

Tableau 3: Régulation du CYP2E1 par les AG dans des hépatocytes humains in vitro............ 39

Tableau 4: Médicaments substrats du CYP3A4 (stéroïdes inclus) ........................................... 49

Tableau 5: Altération de l’expression et/ou de l’activité du CYP3A4 lors de la stéatose et de


la NASH dans des foies humains. ............................................................................................. 51

Tableau 6: Régulation du CYP2E1 par les AG dans des hépatocytes humains in vitro............ 53

Tableau 7: Posologies du paracétamol recommandées en France, d’après le dictionnaire


VIDAL. ....................................................................................................................................... 58

8
AVANT-PROPOS

L’obésité et ses maladies dysmétaboliques associées telles que le diabète de type 2 et


les maladies hépatiques stéatosiques constituent un problème croissant et préoccupant
dans nos sociétés modernes. En effet, ces pathologies réduisent significativement
l’espérance de vie des patients et augmentent considérablement les dépenses de santé.
Concernant les maladies hépatiques stéatosiques liées au surpoids et à l’obésité
(Nonalcoholic Fatty Liver Diseases ou NAFLD pour les anglo-saxons), il est maintenant
reconnu qu’elles peuvent être à l’origine de cirrhoses et de carcinomes hépatocellulaires
chez des individus qui ne consomment pas (ou peu) d’alcool. Un aspect moins connu du
problème de la présence d’une NAFLD chez les sujets obèses est la susceptibilité accrue de
leur foie à certains xénobiotiques et en particulier à des médicaments. Cela semble être le
cas du paracétamol, un antalgique et antipyrétique consommé chaque jour par des millions
de personnes. Dans ce contexte, mes travaux de Thèse ont eu pour but de mettre au point
un modèle cellulaire pertinent de NAFLD et d’utiliser dans un deuxième temps ce modèle
expérimental pour mieux comprendre pourquoi le paracétamol pourrait être plus toxique
sur un foie stéatosique.

9
10
I/ Obésité et complications associées

A. Introduction

1. L’obésité

Selon l’OMS, le surpoids et l’obésité se définissent comme une accumulation


anormale et excessive de graisses corporelles qui peut nuire à la santé des individus. Chez
l’adulte, une estimation simple d’une éventuelle surcharge lipidique peut être réalisée grâce
à l’indice de masse corporelle (IMC, ou BMI en anglais pour « Body Mass Index ») qui
correspond au poids divisé par le carré de la taille. Un IMC normal est inférieur à 25 kg/m2.
Le surpoids est défini par un IMC compris entre 25 et 30, l’obésité par un IMC supérieur à 30
et l’obésité morbide (ou de classe III) par un IMC supérieur à 40. L’IMC permet une
estimation facile du surpoids et de l’obésité chez l’adulte car l’échelle de mesures est la
même quel que soit le sexe ou l’âge du sujet. Cet indice donne toutefois une indication
approximative car il ne correspond pas nécessairement au degré d’adiposité d’un individu à
l’autre (Flegal et al., 2009; Romero-Corral et al., 2008). De plus, l’IMC ne donne aucune
indication concernant la proportion de graisses sous-cutanées et viscérales qui présentent
des propriétés métaboliques et hormonales distinctes (Booth et al., 2014).

2. Des chiffres alarmants

Le surpoids et l’obésité constituent un problème majeur de santé publique en France


et dans de nombreux pays industrialisés (Fig. 1). Le surpoids concerne aujourd’hui 1,4
milliards de personnes de plus de 20 ans, parmi lesquelles 35% sont obèses. En 2008, une
méta-analyse effectuée sur 49 articles publiés entre 1990 et 2008 révèle le doublement de la
prévalence de l’obésité en Europe, passant ainsi de 15% à 30% en une vingtaine d’années
(Berghöfer et al., 2008). Dans notre pays, l’enquête épidémiologique ObEpi, réalisée tous les
3 ans depuis 1997, permet de suivre l’évolution du surpoids et de l’obésité dans la
population adulte. En 2012, 32% de la population française de plus de 18 ans était en
surpoids et 15% présentaient une obésité (Fig. 2).
11
L’obésité est malheureusement un problème qui touche également une forte
proportion d’enfants et d’adolescents. D’après l’OMS, il y a eu dans le monde une
augmentation spectaculaire entre 1990 et 2013 du nombre d’enfants obèses de moins 5 ans,
passant de 32 millions à 42 millions, ce qui représente aujourd’hui 7% de cette population.
Cependant, Ogden et coll. (2014) n’ont pas constaté cette augmentation aux États-Unis en
2011-2012 par rapport à 2004, mais au contraire une diminution de 5,5% du nombre
d’enfants obèses de moins de 5 ans (Ogden et al., 2014). Aux Etats-Unis, 17% des 2-19ans
sont obèses (Ogden et al., 2014), tandis que ce chiffre est de 3% en France pour les 3-17ans
(enquête INCA2 2006/2007 de l’ANSES). En ce qui concerne les pays émergents, les chiffres
récents sont également alarmants. Ainsi, la prévalence de l’obésité chez les jeunes âgés de 5
à 19 ans est de 19,3% en Argentine, 22% en Inde, 22,1% au Brésil et 11,7% en Inde et allant
jusqu’à 41,8% au Mexique (Gupta et al., 2012).

L’incidence de l’obésité est en constante progression au niveau mondial, même si


cette augmentation semble s’infléchir ces dernières années dans certains pays. Cette
« épidémie » d’obésité est liée à l’évolution des habitudes en matière d’alimentation et
d’exercice physique, conduisant à une consommation plus importante d’aliments très
caloriques (notamment riches en graisses et en sucres) et à une diminution d’activité
physique en raison de la nature de plus en plus sédentaire du travail, des transports et de
l’urbanisation.

% d’adultes

Figure 1: Prévalence de l’obésité (IMC>30) dans le monde en 2009 (cartographie de l’OMS).

12
Figure 2: Répartition des niveaux d’IMC des personnes de plus de 18 ans en France en 2012
(selon l’étude ObEpi).

3. Complications associées à l’obésité

Le surpoids et l’obésité ne sont pas uniquement un problème esthétique pour ceux


qui en souffrent. En effet, l’obésité est responsable de diverses pathologies qui peuvent être
graves et entraîner le décès prématuré du patient. Plusieurs études estiment que l’obésité
diminue l’espérance de vie de 1 à 7 ans (Anstey et al., 2014; Peeters et al., 2003), tandis que
cette diminution peut atteindre 7 à 13 ans en cas d’obésité morbide via l’augmentation du
nombre de décès secondaires aux maladies cardio-vasculaires, aux cancers et au diabète
(Kitahara et al., 2014). En effet, l’un des principaux risques de l’obésité est le développement
d’un syndrome d’insulinorésistance conduisant au diabète de type 2 (Meisinger et al., 2006).
Ainsi, 80% des cas de diabète de type 2 peuvent être attribués à l’obésité, le risque
augmentant proportionnellement à l’augmentation de l’IMC (Colditz et al., 1995). De plus,
l’augmentation de l’IMC chez les patients diabétiques est associée à une élévation à long
terme du risque de mortalité cardiovasculaire (Bodegard et al., 2013).

Outre les troubles du métabolisme des glucides (insulinorésistance et diabète de type


2), l’obésité s’accompagne très fréquemment de troubles du métabolisme des lipides, en
particulier au niveau hépatique. Cela se traduit notamment par le développement d’une

13
stéatose qui correspond à une accumulation de lipides dans le foie. Bien que bénigne à court
terme, la stéatose peut cependant évoluer à long terme en stéatohépatite ou en cirrhose,
voire en carcinome hépatocellulaire chez certains patients (Farrell and Larter, 2006; Larter et
al., 2010; McPherson et al., 2014; Starley et al., 2010). La physiopathologie de la stéatose et
de la stéatohépatite sera développée plus en détail dans la section suivante.

L’obésité augmente aussi très fortement le risque d’accidents cardiovasculaires, en


particulier coronaropathies et infarctus du myocarde (Galinier et al., 2005). Ce risque
cardiovasculaire accru est lié en grande partie à l’hypertension artérielle, au diabète de type
2 et à l’hyperlipidémie. L’augmentation chronique du travail cardiaque due à l’excès de
masse corporelle accentue de plus le risque d’insuffisance cardiaque (Alpert and Hashimi,
1993).

Par ailleurs, l’insuffisance respiratoire, l’apnée du sommeil, les troubles musculo-


squelettiques, l’arthrose et des troubles psychologiques (e.g. dépression et stress) sont aussi
plus fréquents chez les sujets obèses (Muzumdar and Rao, 2006; Opel et al., 2014; Pelajo et
al., 2012). Le surpoids et l’obésité augmentent également le risque de développer un certain
nombre de cancers hormono-dépendants (sein, ovaires, prostate) et gastro-intestinaux
(œsophage, côlon, rectum) ainsi que des cancers du pancréas, des reins et du foie, comme
précédemment mentionné (Song et al., 2015; Calle et al., 2003; Cheskin and Prosser, 2007;
Gallagher and LeRoith, 2013; Renehan et al., 2008; Wolin et al., 2010).

Enfin, il est important de souligner que les sujets obèses consomment en moyenne
plus de médicaments par rapport aux sujets non obèses, notamment pour le traitement de
leur obésité et des pathologies associées telles que les dyslipidémies et le diabète de type 2
(Finkelstein et al., 2009; Stuart et al., 2008; Trasande and Chatterjee, 2009). Plusieurs études
rapportent également chez les sujets obèses une consommation importante d’anti-
inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et d’analgésiques incluant le paracétamol, en
particulier pour le traitement des maladies ostéoarticulaires (Amundsen et al., 2010; Kit et
al., 2012; Narbro et al., 2002).

14
B. Stéatoses et stéatohépatites non alcooliques

1. Introduction

Décrites pour la première fois chez les sujets obèses par Ludwig en 1980, les maladies
hépatiques stéatosiques non-alcooliques (Nonalcoholic Fatty Liver Diseases ou NAFLD pour
les anglo-saxons) couvrent un large spectre de lésions hépatiques incluant la simple
stéatose, la stéatohépatite non alcoolique (Nonalcoholic Steatohepatitis ou NASH) et la
cirrhose (Ludwig et al., 1980). Ces lésions surviennent en dehors de toute consommation
excessive d’alcool et peuvent évoluer chez certains patients en carcinome hépatocellulaire
(Jiang et al., 2014). La présence de NAFLD est également associée à un risque accru de
développer un diabète de type 2, une dyslipidémie et une hypertension artérielle (Adams et
al., 2009).

La stéatose correspond à une accumulation de lipides stockés sous forme de vacuoles


dans les hépatocytes. Il est classiquement considéré que la simple stéatose est bénigne,
même si cette lésion peut être accompagnée d’une petite élévation des transaminases
(ALAT, ASAT) au niveau plasmatique, reflétant la cytolyse de quelques hépatocytes
(Loguercio et al., 2004). Cependant, la stéatose peut évoluer à long terme en NASH chez 10 à
20% des patients. La NASH se distingue de la stéatose par la présence d’une nécro-
inflammation, d’une augmentation de la taille des hépatocytes (« hepatocyte ballooning »)
et d’un dépôt de collagène plus ou moins important reflétant la présence d’une fibrose (Yeh
and Brunt, 2014).

Au cours de la NAFLD, la stéatose est principalement macrovacuolaire avec la


présence d’une volumineuse vacuole intracytoplasmique repoussant le noyau vers la
périphérie de la cellule. Cependant, une stéatose microvésiculaire peut être parfois observée
concomitamment à la stéatose macrovacuolaire. Cette stéatose est caractérisée par la
présence de petites gouttelettes lipidiques laissant le noyau en position centrale. La

15
présence d’une stéatose microvésiculaire au cours de la NAFLD pourrait refléter une maladie
hépatique plus sévère (Söderberg et al., 2011; Tandra et al., 2011).
Les lipides hépatiques stockés dans les vacuoles sont principalement des
triglycérides, espèces lipidiques étant considérées comme non délétères pour les
hépatocytes (Puri et al., 2007). Cependant, d’autres types de lipides peuvent s’accumuler au
cours de la NAFLD, tels que les diacylglycérols (DAG, ou diglycérides) qui pourraient avoir un
rôle pathogénique important (Magkos et al., 2012; Puri et al., 2007). En effet, les DAG sont
impliqués dans la physiopathologie de l’insulinorésistance, non seulement dans le foie mais
aussi dans d’autres tissus comme le muscle et le tissu adipeux (Byrne and Targher, 2014;
Perry et al., 2014). Enfin, il est important de noter que les vacuoles lipidiques sont
recouvertes à leur surface de protéines qui semblent jouer un rôle important dans leur
maturation et leur métabolisme. Les plus abondantes de ces protéines sont la périlipine
(codée par le gène PLIN1), l’adipophiline (codée par le gène PLIN2) et TIP47 (Tail Interacting
Protein of 47 kDa, codée par le gène PLIN3) (Fujii et al., 2009; Pawella et al., 2014).

2. Epidémiologie

Dans certains pays occidentaux tels que les Etats-Unis, on estime que la prévalence
des NAFLD dans la population générale est comprise entre 20% à 30% chez les adultes et
10% chez les enfants et adolescents (Berardis and Sokal, 2014; Lazo et al., 2013; Smith and
Adams, 2011). La plupart des études épidémiologiques réalisées pour estimer la prévalence
des NAFLD utilise l’échographie hépatique pour le diagnostic. Cependant, cette technique
semble sous-estimer les chiffres et de plus, elle ne permet pas de faire la distinction entre la
simple stéatose et la NASH. En réalité, cette distinction ne peut se faire que grâce à l’analyse
anatomopathologique d’une biopsie hépatique (Brunt et al., 2011; Brunt and Tiniakos,
2010). L’étude de Minervini en 2009 sur des ponctions-biopsies hépatiques réalisées chez
des patients apparemment sains révèle que plus de 50% des sujets présentent une NAFLD,
et parmi eux 1/3 sont au stade de NASH (Minervini et al., 2009).

En ce qui concerne les populations à risque, les études épidémiologiques bénéficient


des analyses anatomopathologiques des biopsies hépatiques. Ainsi, ces études démontrent
16
que la majorité des personnes en surpoids ou obèses développe des NAFLD, et que dans un
contexte d’obésité morbide, les NAFLD sont rapportées chez 93% des sujets, dont 26%
présentent une NASH (Clark, 2006; Ong et al., 2005).

Concernant la distribution par sexe, les études montrent que les NAFLD seraient
légèrement plus fréquentes chez les hommes. La moindre prévalence chez les femmes
pourrait être due, au moins en partie, à l’action protectrice des hormones féminines telles
que les œstrogènes. Les NAFLD sont décrites à tout âge mais la prévalence augmente au
cours de la vie et en particulier après la ménopause chez les femmes (Clark, 2006). Enfin, des
différences ethniques sont rapportées. Ainsi, aux Etats-Unis, les personnes d’origine
hispanique sont plus prédisposées à développer une NAFLD que celles d’origine caucasienne
ou afro-américaine (45%, 33% et 24% de NAFLD respectivement parmi ces trois populations)
(Browning et al., 2004).

3. Physiopathologie des NAFLD

En ce qui concerne la physiopathologie des NAFLD, il faut distinguer d’une part


l’apparition de la stéatose hépatique, et d’autre part la progression de la stéatose en NASH.

• Développement de la stéatose hépatique

Les deux principaux mécanismes de l’accumulation des lipides hépatiques chez les
sujets obèses sont l’augmentation de la lipogenèse de novo et l’entrée accrue des acides
gras libres dans le foie. Ces deux évènements sont en fait intimement liés à la présence
d’une insulinorésistance qui s’établit usuellement chez les sujets obèses dans différents
tissus, principalement tissu adipeux, muscles et foie (Begriche et al., 2013; Postic and Girard,
2008; Tamura et al., 2005; Wieckowska et al., 2007).

En effet, la présence de l’insulinorésistance au niveau du tissu adipeux favorise


l’hydrolyse des triglycérides en glycérol et acides gras libres (AGL) du fait de la moindre
inhibition par l’insuline des lipases hormono-sensibles ATGL (Adipose Triglyceride Lipase) et

17
HSL (Hormone Sensitive Lipase) (Hsiao et al., 2013; Jocken et al., 2007). Ainsi, la libération
des AGL dans la circulation aboutit à une redistribution de ces dérivés entre le tissu adipeux
et le foie. Les AGL pénètrent en effet librement dans les hépatocytes grâce à différents
transporteurs membranaires « non saturables » tels que les FATPs (Fatty Acid Transport
Proteins) et la FAT/CD36 (Fatty Acid Translocase). Après estérification (conversion des AGL
en triglycérides), les triglycérides sont stockés sous forme de gouttelettes lipidiques dans les
hépatocytes ou sécrétés dans le sang sous forme de VLDL (Very Low Density Lipoprotein).

De plus, l’hyperinsulinémie associée à l’insulinorésistance stimule la lipogenèse de


novo au sein des hépatocytes, c’est-à-dire la conversion des glucides simples (e.g. glucose,
fructose) en lipides. En effet, l’augmentation de l’insulinémie active dans le foie le facteur de
transcription SREBP1c (Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1c) qui gouverne
l’expression de nombreuses enzymes impliquées dans la glycolyse et la synthèse des lipides
telles que la glucokinase (GK), la fatty acid synthase (FASN), l’acetyl-CoA carboxylase (ACC)
ou encore la stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1) (Postic and Girard, 2008). Lorsqu’un diabète
de type 2 est installé, l’hyperglycémie contribue également à la stimulation de la lipogenèse
par l’intermédiaire de l’activation du facteur de transcription ChREBP (Carbohydrate
Responsive Element-Binding Protein) (Denechaud et al., 2008).

La présence d’une stéatose est un marqueur important d’une résistance à l’insuline


multi-tissulaire, et ce indépendamment de l’IMC (Bugianesi et al., 2005; Fabbrini et al., 2009;
Korenblat et al., 2008; Seppälä-Lindroos et al., 2002; Vega et al., 2007). Cependant, il n’est
pas clairement établi actuellement si la stéatose liée à l’obésité est une cause ou une
conséquence de l’insulinorésistance.

• Transition stéatose/NASH

Comme il a été mentionné plus haut, la stéatose peut progresser à long terme en
NASH chez environ 10 à 20% des patients. De très nombreuses investigations expérimentales
et cliniques ont été réalisées afin de connaître les mécanismes de cette transition. Même si
de nombreux facteurs ont pu être identifiés, les principaux mécanismes impliqués dans la

18
physiopathologie de la NASH semblent être le stress oxydant et la peroxydation lipidique
(générant des aldéhydes toxiques tels que le malondialdéhyde et le 4-hydroxynonénal), les
dysfonctions mitochondriales ainsi que la surproduction de cytokines proinflammatoires et
profibrotiques comme TNFα (Tumor Necrosis Factor-α), IL6 (Interleukine-6) et TGFβ
(Transforming Growth Factor-β) (Begriche et al., 2013; Fabbrini et al., 2010; Tilg and
Moschen, 2010). La présence de prédispositions génétiques explique aussi probablement
pourquoi certains sujets ont plus de risques de développer une NASH. Parmi les nombreux
gènes de susceptibilité étudiés, PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase domain-containing 3) est
le plus fréquemment retrouvé dans plusieurs études indépendantes avec notamment la
présence d’un polymorphisme particulier (rs738409/I148M) qui augmente le risque de
survenue de la NASH (Anstee and Day, 2013; Cohen et al., 2011; Verrijken et al., 2013). De
façon intéressante, ce polymorphisme semble favoriser non seulement l’accumulation des
triglycérides mais également le stress oxydant (Min et al., 2014; Smagris et al., 2015). Il est à
noter aussi qu’un polymorphisme particulier dans le gène CYP2E1 (« allèle c2 ») a été associé
à un risque accru de NASH dans une étude effectuée chez des femmes obèses (Varela et al.,
2008).

Concernant le stress oxydant, plusieurs mécanismes sont simultanément impliqués.


Premièrement, il y a une surproduction des espèces réactives de l’oxygène (ERO) par la
chaîne respiratoire qui est défectueuse, mais également par le cytochrome P450 2E1
(CYP2E1), une enzyme du métabolisme de phase I, dont l’activité est augmentée au cours de
la NAFLD (Aubert et al., 2011; Begriche et al., 2011; Butura et al., 2009; Dey and Kumar,
2011). Deuxièmement, une réduction des défenses antioxydantes peut être observée avec
par exemple une diminution des concentrations intra-hépatiques de glutathion et de
l’activité de la glutathion peroxydase (GPx) (Begriche et al., 2013; Kathirvel et al., 2010;
Videla et al., 2004).

L’induction du CYP2E1 dans le contexte des NAFLD a été documentée dans de


nombreuses investigations réalisées chez l’Homme ou l’animal (Abdelmegeed et al., 2012;
Aubert et al., 2011; Leung and Nieto, 2013). Or, le CYP2E1 est capable de produire des ERO

19
au cours de son cycle catalytique. Cette surproduction d’ERO par le CYP2E1 semble non
seulement être impliquée dans la progression de la stéatose en NASH mais également dans
le développement de l’insulinorésistance. En effet, la surexpression hépatocytaire du CYP2E1
perturbe la signalisation insulinique avec notamment une diminution de la phosphorylation
des IRS (Insulin Receptor Substrates) 1 et 2 et de la protéine kinase B (PKB/Akt) (Kathirvel et
al., 2010; Kathirvel et al., 2009; Schattenberg et al., 2005). Inversement, les souris KO
(Knockout) pour le CYP2E1 sont protégées vis-à-vis du développement de l’insulinorésistance
secondaire à une alimentation riche en graisses (Abdelmegeed et al., 2012; Zong et al.,
2012).

Figure 3: Physiopathologie de NAFLD : mécanisme impliqué dans le développement d’une


stéatose et dans sa progression en stéatohépatite (NASH). La stéatose semble être le
résultat de plusieurs évènements importants : d’une part, l’insulinorésistance au niveau du
tissu adipeux active la lipolyse, libérant ainsi les acides gras libres captés librement par le
foie ; d’autre part, l’hyperinsulinémie associée à l’insulinorésistance active la lipogenèse
dans le foie via le facteur de transcription SREBP1c. Enfin, quand un diabète de type 2 est
installé, l’hyperglycémie active également la lipogenèse via le facteur de transcription
ChREBP. Chez certains patients, la stéatose peut évoluer en NASH sous l’influence de
facteurs additionnels, tels que le stress oxydant, un dysfonctionnement mitochondrial, la
lipotoxicité ou l’action de cytokines pro-inflammatoires.
20
II/ Les cytochromes P450 2E1 et 3A4

A. Généralités sur les CYPs

De par notre environnement, nous sommes constamment et inévitablement exposés


aux xénobiotiques, qu’ils soient d’origine médicamenteuse, industrielle ou alimentaire, et
qui peuvent avoir des effets néfastes selon leur absorption, distribution, métabolisation et
élimination (ADME). Notre organisme dispose de systèmes enzymatiques capables de
neutraliser ces composés, le plus souvent hydrophobes, en les rendant hydrosolubles pour
qu’ils puissent être éliminés dans les liquides biologiques, bile ou urine notamment. Les
cytochromes P450 (CYPs) font partie de ces enzymes du métabolisme des xénobiotiques. Ces
enzymes sont ubiquitaires mais sont principalement localisées dans le foie, et en plus faible
quantité dans plusieurs organes tels que les reins, les poumons, l’intestin ou la peau.

1. Cycle catalytique

Les CYPs sont des apoprotéines d’environ 500 acides aminés et de masse moléculaire
comprise entre 45 et 62kDa. Ils appartiennent à la famille des hémoprotéines. Le
groupement prosthétique de l’hème est composé de 4 azotes (protoporphirine IX) liés à un
atome de fer, lui-même coordonné à la chaine polypeptidique par un groupement thiol
d’une cystéine (Fig. 4). La sixième position de coordination du fer est libre et permet la
fixation de l’oxygène au cours du cycle catalytique.

Figure 4: Structure du groupement prosthétique des CYPs

21
A l’état de « bas spin », l’atome de fer est sous forme ferrique (Fe3+) et possède 6
liaisons, le centre actif de l’enzyme est plan et ne consomme pas d’énergie. La fixation d’un
substrat (RH dans la Fig. 5) provoque un changement conformationnel, ce qui transforme
l’état « bas spin » en état « haut spin », et l’enzyme devient alors fonctionnelle. L’électron
apporté par le système donneur d’électrons à partir du NAD(P)H et d’une réductase permet
la réduction du fer ferrique en fer ferreux (Fe2+), laissant la 6ème position de coordination du
fer libre de fixer l’oxygène. On obtient ainsi un complexe oxygéné. L’apport d’un autre
électron va ensuite permettre une réduction du complexe. Cette réaction initie l’étape
catalytique et l’activation de l’oxygène, conduisant à la libération du substrat hydroxylé, si
l’on prend l’exemple d’une réaction d’hydroxylation (Fig. 5). Pour résumer, l’oxygène
moléculaire va être réduit, formant l’entité peroxy-ferrique Fe3-OO- qui, par protonation,
donne ensuite un complexe hydroperoxo Fe3-OOH. Une seconde protonation provoque la
rupture de la liaison O-O, libérant ainsi une molécule d’eau et le composé Fer-oxo
hautement oxydant, qui peut transférer son atome d’oxygène au substrat. Après libération
du produit, l’enzyme est retrouvée libre sous forme ferrique, à l’état de « bas spin » (Lewis,
2003).

Dans certains cas particuliers, les CYPs s’affranchissent de l’apport d’un second
électron en utilisant des agents oxydants tels que les peracides ou les hydroperoxydes. Ce
cycle court est appelé « peroxyde shunt » (Guengerich and Munro, 2013). La synchronisation
entre les CYPs et leurs partenaires redox est primordiale. En effet, lorsque le couplage n’est
pas réalisé, les CYPs entrent dans des voies abortives conduisant à la décomposition du
complexe fer-oxygène et la production soit d’eau, soit d’espèces réactives de l’oxygène
(ERO) telles que le peroxyde d’hydrogène (H2O2) ou l’anion superoxyde (O2.-). La fréquence
de ces réactions indésirable dépend de nombreux paramètres dont la vitesse de transfert
d’électrons ou de protons, le mauvais positionnement des substrats dans le site catalytique,
ou encore la qualité de la reconnaissance et des interactions entre le CYP et ses partenaires
redox.

22
Figure 5: Représentation shématique du cycle catalytique des CYPs. La fixation d’un
substrat RH sur le CYP en état de « bas spin » rend l’enzyme fonctionnelle. Un électron
permet la réduction du fer ferrique (Fe3+) en fer ferreux (Fe2+), permettant ainsi au métal de
fixer l’oxygène. L’apport d’un second électron va permettre une réduction du complexe
oxygéné. L’oxygène moléculaire va être réduit, formant l’entité peroxy-ferrique Fe3-OO-. Une
première protonation donne ensuite un complexe hydroperoxo Fe3-OOH, puis une seconde
protonation provoque la rupture de la liaison O-O, libérant ainsi une molécule d’eau et le
composé Fer-oxo hautement oxydant, qui peut transférer son atome d’oxygène au substrat.
Après libération du produit, l’enzyme est retrouvée libre sous forme ferrique, à l’état de «
bas spin ». D’après Lewis, 2003 (LS : Low-spin; HS : High-spin ; RH: substrat ; ROH :
métabolite hydroxylé).

2. Nomenclature et classification

A partir d’informations basées sur des alignements de séquences et d’arbres


phylogénétiques d’évolution, Nelson a émis l’hypothèse d’un gène ancestral apparu il y a
environ 3,5 milliards d’années chez la bactérie. Ce dernier coderait pour une protéine qui
serait très proche du seul CYP retrouvé dans tous les organismes: le CYP51 qui catalyse la 14-

23
α-déméthylation du lanostérol, un intermédiaire dans les premières phases de la chaine de
synthèse des stérols (Nelson et al., 1996).

Les CYPs doivent leur nom à leur propriété d’absorbance à 450 nm. En effet, en 1962,
Sato et Omura ont appelé « pigment 450 » le composé responsable du pic d’absorbance à
450 nm qui apparaît lorsqu’on sature en monoxyde de carbone une préparation
subcellulaire de glandes surrénales (Omura and Sato, 1962).

La nomenclature utilisée pour désigner les différents CYPs repose sur la règle
suivante : l’abréviation CYP (pour cytochrome P450) est suivie d’un chiffre arabe désignant la
famille, puis d’une lettre désignant la sous famille, et enfin d’un nombre désignant les
variants alléliques d’un gène (Nebert et al., 1987; Nelson et al., 1996).
- Pour faire partie d’une même famille, les CYPs doivent présenter au moins 40%
d’homologie entre leurs séquences primaires en acides aminés constitutifs.
- Pour appartenir à la même sous-famille, il faut une homologie de séquence
supérieure à 55%.
- Les CYPs présentant une divergence inférieure à 3% sont considérés comme variants
alléliques.

Les CYPs font l’objet d’une classification internationale et leur nombre augmente
chaque année. En 2009, Nelson dénombrait 11 294 séquences différentes dont 3 282 chez
les animaux. Trois ans plus tard, ces chiffres sont passés à 18 687 séquences dont 5 442 chez
l’animal (http://drnelson.uthsc.edu) (Nebert et al., 2013).

Chez l’Homme, 18 familles de CYPs regroupant 57 CYPs sont répertoriées à ce jour, et


3 d’entre elles sont importantes pour le métabolisme des médicaments : les CYP1, CYP2 et
CYP3 (Nebert et al., 2013). Bien que les CYPs puissent se distinguer par leur spécificité de
substrat, cette dernière caractéristique peut être chevauchante : un CYP peut métaboliser
plusieurs substrats et un substrat peut être métabolisé par plusieurs CYPs.

24
Comme rappelé précédemment, les CYPs ont besoin pour leur activité catalytique
d’une source d’électrons transférés à partir du NAD(P)H (Nicotinamide Adénine Dinucléotide
Phosphate) par une protéine partenaire, une réductase. Il existe 4 classes de CYPs basées sur
leur système donneur d’électrons et suivant leur localisation microsomale ou mitochondriale
(Aguiar et al., 2005; Guengerich and Munro, 2013; Hannemann et al., 2007; Lamb and
Waterman, 2013).

- La classe I comprend les CYPs bactériens et mitochondriaux qui utilisent une chaine
d’électrons à 2 composants : une ferrédoxine réductase (FDR) à flavine FAD (Flavine-
Adénine Dinucléotide) et une ferrédoxine à centre fer-souffre Fe2S2 (Fdx). Chez les
eucaryotes, la FDR et la Fdx sont associées à la membrane interne des mitochondries.

- La classe II caractérise les CYPs microsomaux. Le système de transfert d’électrons, la


cytochrome P450 réductase (CPR ou POR pour «P450 oxydoréductase»), est ancrée
dans la membrane du réticulum endoplasmique et comporte 2 flavines : la FAD et la
FMN (Flavine Mononucléotide).

- Les CYPs de la classe III catalysent des isomérisations ou des déshydratations et


fonctionnent sans apport d’électrons extérieurs ni d’oxygène.

- La classe IV ne possède qu’un seul représentant : Le CYPnor qui catalyse la réduction


du monoxyde d’azote en recevant ses électrons directement du NADH sans protéines
intermédiaires (Takaya et al., 1999).

Cette classification est la plus connue et est admise par toute la communauté
scientifique. Néanmoins, il existe des cas particuliers, notamment pour les CYPs bactériens.
Ainsi, Hannemann a proposé une nouvelle classification plus précise, mais toujours basée sur
le transfert d’électrons (Hannemann et al., 2007).

25
3. Rôle physiologique des CYPs

Une des caractéristiques des CYPs est le grand nombre et la diversité des classes
chimiques de leurs substrats. C’est ainsi que les 57 CYPs actuellement découverts chez
l’Homme peuvent métaboliser des xénobiotiques (polluants, toxiques, médicaments…) mais
également participer au métabolisme de nombreuses molécules endogènes (hormones
stéroïdes, acides gras, acides biliaires, vitamine D3…) (Tab. 1) (Guengerich and Cheng, 2011).

Tableau 1: Classification des CYPs en fonction de leur classe de substrat majoritaire


(d’après Guengerich and Cheng, 2011).

• Métabolisme des xénobiotiques

Les CYPs interviennent dans la phase I du métabolisme des xénobiotiques. Les


réactions de phase I, dites de fonctionnalisation, permettent l’introduction d’une fonction
chimique nouvelle (-OH, NH2, COOH), rendant ainsi la molécule plus polaire. Le plus souvent,
il s’agit de réaction d’oxydation par l’introduction d’une fonction hydroxyle, mais il existe
également des réactions d’hydrolyse et de réduction. Les CYPs contribuent à
approximativement 80% des réactions de phase I (Evans and Relling, 1999). Les réactions de
phase II (réactions de conjugaison) ont lieu généralement après la phase I. Les métabolites
formés par les CYPs sont alors conjugués à un groupement polaire (glutathion, acétyle,
méthyle) par des enzymes de phase II (glucuronosyltransférase, sulfotransférase, glutathion
S-transférase..) pour augmenter leur solubilité. Enfin, le métabolite obtenu (ou le produit

26
parent inchangé) est transporté à travers la membrane cellulaire via des protéines de phase
III afin d’être éliminé par la bile ou l’urine (Fig. 6).

Figure 6: Métabolisme d’un xénobiotique au niveau de l’hépatocyte.

Chez l’Homme, le métabolisme des xénobiotiques fait intervenir la plupart du temps


plusieurs CYPs et un CYP peut métaboliser de nombreux xénobiotiques. Les CYPs impliqués
appartiennent aux familles 1, 2 et 3 principalement. D’un point de vue fonctionnel, le
CYP3A4 constitue l’enzyme la plus abondante exprimée au niveau hépatique (jusqu’à 37%
des CYPs) et la plus impliquée dans la biotransformation des médicaments utilisés en
clinique (30%). Le CYP2E1 quant à lui, représente 5 à 16% des CYPs hépatiques et métabolise
seulement 3% des médicaments (Guengerich, 2006; Zanger and Schwab, 2013).

Même si la plupart des réactions dans lesquelles interviennent les CYPs sont des
processus de détoxification, certains composés peuvent devenir toxiques à la suite du
métabolisme du composé d’origine. C’est notamment le cas du paracétamol, métabolisé par
le CYP2E1 et le CYP3A4 en N-Acétyl-p-benzoquinone-Imine (NAPQI), dérivé hautement
réactif capable de former des adduits aux protéines et à l’ADN (Corcoran et al., 1985; Jollow
et al., 1973; Rogers et al., 1997; Streeter et al., 1984). De plus, l’activité même de certains
CYPs génère la production d’ERO, délétères pour les cellules, comme c’est le cas pour le
CYP2E1. Enfin, il est à noter qu’il existe des variations interindividuelles importantes dans
l’expression des CYPs, liées à différents facteurs endogènes (sexe, âge, pathologies,
hormones, et facteurs génétiques) ou exogènes (médicaments, polluants, alcool,

27
alimentation..) et pouvant affecter significativement le métabolisme des médicaments
(Zanger and Schwab, 2013).

Figure 7: Les principaux CYPs des familles 1, 2 et 3 impliqués dans le métabolisme des
médicaments utilisés en clinique ainsi que les facteurs influençant la variabilité de ces
enzymes (d’après Zanger and Schwab, 2013). Les CYPs sont responsables de la majorité des
réactions de biotransformation des médicaments. Chez l’Homme, les CYP1, CYP2 et CYP3
constituent les familles les plus importantes dans le métabolisme des agents
pharmacologiques. Des changements et des différences dans l’activité des CYPs peuvent
affecter la biodisponibilité, l’efficacité ou la toxicité des xénobiotiques. Des facteurs
génétiques et environnementaux peuvent causer des différences intra-individuelles et
interindividuelles dans la biotransformation des médicaments, pouvant affecter l’équilibre
entre la détoxification et la toxicité.

• Métabolisme des molécules endogènes

Les CYPs, essentiellement des familles 4 à 51 (Tab. 1), sont impliqués dans la
biosynthèse et la métabolisation de molécules endogènes telles que le cholestérol, les acides
biliaires, les acides gras, les hormones stéroïdiennes, les eicosanoïdes et les vitamines (Fig. 8)
(McLean et al., 2012; Nebert et al., 2013). Les CYPs qui participent à cette voie de
métabolisation de molécules endogènes sont très sélectifs pour leur substrat. Néanmoins,
certains des CYPs métabolisant les xénobiotiques, beaucoup moins spécifiques pour leurs

28
substrats, peuvent également métaboliser des molécules endogènes, comme c’est le cas
pour le CYP2E1 et le CYP3A4.

Figure 8: Les CYPs impliqués dans le métabolisme de molécules endogènes (d’après Zanger
and Schwab, 2013). A. la biosynthèse des hormones stéroïdiennes. L’aldostérone, le cortisol
et la corticostérone sont synthétisés dans les glandes surrénales, la testostérone dans les
testicules et les œstrogènes dans les ovaires. D’autres CYPs participent au catabolisme des
hormones stéroïdiennes, notamment le CYP3A qui réalise la 6-β-hydroxylation des stéroïdes
et la 16-α-hydroxylation de la testostérone, permettant leur élimination urinaire après
conjugaison. B. la synthèse des eicosanoïdes à partir de l’acide arachidonique. C. la
biosynthèse du cholestérol et des acides biliaires. Cette voie est exclusivement hépatique
D. la transformation de la vitamine D3. Pour être active, la vitamine D3 doit être hydroxylée
en 25-hydroxy-vitamine D3 au niveau hépatique puis en 1-α, 25-dihydroxy-vitamine D3 au
niveau rénal. Outre ces 4 grandes voies métaboliques, les CYPs de la famille 4A réalisent l’ω-
hydroxylation des acides gras permettant leur dégradation et leur élimination.
29
B. Le CYP2E1

1. Généralités sur le CYP2E1

Le gène humain du CYP2E1 a été cloné et séquencé en 1988. Il est situé sur le
chromosome 10 en position 10q24.3. Sa partie codante comporte 9 exons et exprime une
protéine de 493 acides aminés (Umeno et al., 1988). Ce cytochrome P450 est principalement
exprimé au niveau du foie où il représente 6 à 10% des CYPs totaux, mais il a également été
mis en évidence au sein d’autres organes tels que le poumon (Hukkanen et al., 2002), le
colon (Plewka et al., 2014), le cœur (Sidorik et al., 2005) et le cerveau (Dutheil et al., 2009;
Upadhya et al., 2000) et le tissu adipeux (Ellero et al., 2010) chez l’Homme.

En ce qui concerne sa localisation subcellulaire, elle est principalement microsomale,


comme tous les CYPs qui métabolisent des xénobiotiques. Toutefois, il a été également
purifié et caractérisé dans des mitochondries hépatiques chez l’Homme (Bansal et al., 2013)
et chez le rat (Robin et al., 2001). Le CYP2E1 mitochondrial représente jusqu’à 40% du
CYP2E1 total. Les CYP2E1 d’origine mitochondriale et microsomale possèdent la même
structure primaire mais diffèrent par leur structure secondaire. En effet, le CYP2E1
mitochondrial présente un degré d’hélicité plus faible que celui d’origine microsomale,
suggérant une structure moins compacte et moins repliée. Une autre différence majeure
entre les deux formes est le degré de phosphorylation, plus important pour le CYP2E1
mitochondrial. Enfin, selon leur localisation, les deux formes du CYP2E1 requièrent pour leur
activité des systèmes donneurs d’électrons différents. Le CYP2E1 mitochondrial n’est actif
qu’en présence d’adrénodoxine et d’adrénodoxine réductase alors que le CYP2E1
microsomal reçoit ses électrons de la NADPH CYP réductase ( Robin et al., 2001). Le CYP2E1 a
également été localisé au niveau de la membrane plasmique, notamment lors d’hépatites
auto-immunes induites par l’halothane (Eliasson and Kenna, 1996) ou lors d’infection par le
virus de l’hépatite C (Vidali et al., 2007), au sein des peroxysomes (Pahan et al., 1997), de
l’appareil de Golgi (Neve et al., 1996), et des lysosomes (Ronis et al., 1992). Quelle que soit

30
sa localisation, le CYP2E1 est fonctionnel et inductible (Loeper et al., 1993; Pahan et al.,
1997; Robin et al., 1997; Wu and Cederbaum, 1992).

L’expression hépatique du CYP2E1 est soumise à une régulation intervenant à


différents niveaux : transcriptionnel, post-transcriptionnel, traductionnel et post-
traductionnel (Aguiar et al., 2005; Ingelman-Sundberg et al., 1994; Novak and Woodcroft,
2000; Oesch-Bartlomowicz and Oesch, 2005). Cette régulation du CYP2E1 est donc complexe
et semble de plus spécifique à chaque espèce.

Au niveau transcriptionnel, l’expression constitutive du CYP2E1 peut être induite par


différents facteurs de transcription selon l’espèce étudiée : HNF-1α (hepatocyte Nuclear
Factor-1α) chez la souris, le rat et l’Homme (Akiyama and Gonzalez, 2003; Cheung et al.,
2003; Hakkola et al., 2003; Liu and Gonzalez, 1995; Matsunaga et al., 2008) et Sp1 et NFκB
(Nuclear Factor-kappa B) chez le lapin (Peng and Coon, 2000). En effet, le site de fixation du
facteur Sp1 au niveau de la région promotrice du CYP2E1 chez le lapin n’est pas conservé
chez le rat et l’Homme (Peng and Coon, 2000). Une étude récente montre également que
l’expression du CYP2E1 chez la souris et l’Homme est régulée indirectement par le facteur de
transcription ATF4 par l’intermédiaire du facteur de transcription CREB (c-AMP Response
Element-Binding protein), qui se fixe à la séquence CRE (c-AMP Responsive Element) du
promoteur du CYP2E1 (Wang et al., 2014). Enfin, une autre étude récente montre que
l’expression du CYP2E1 chez l’Homme peut être régulée par la voie Wnt/β-caténine (Gerbal-
Chaloin et al., 2014).

Au niveau post-transcriptionnel, il a été montré que l’expression du CYP2E1 peut être


régulée par des microRNAs (miRNAs). Par exemple, le CYP2E1 peut être régulé négativement
par le miRNA-378 (Mohri et al., 2010). Dans ce travail, l’étude de 25 biopsies hépatiques
humaines n’a pas montré de corrélation entre les niveaux d’ARNm et protéiques du CYP2E1,
indiquant une régulation post-transcriptionnelle de cette enzyme. Les niveaux de miRNA-378
étaient quant à eux inversement proportionnels aux niveaux d’ARNm, aux niveaux
protéiques du CYP2E1 et à l’efficacité de la traduction (Mohri et al., 2010). Plus récemment,

31
Takahashi et coll. (2014) ont étudié l’effet du le miR-223 sur le CYP2E1 et ont démontré qu’il
inhibait l’activité du CYP2E1 sans affecter l’expression protéique de l’enzyme. Cette
inhibition de l’activité se ferait via l’inhibition de l’expression protéique de la protéine du
cytochrome b5 (Takahashi et al., 2014).

Au niveau post-traductionnel, le CYP2E1 peut subir plusieurs types de modifications


notamment par phosphorylation. Cependant, la plus étudiée est la phosphorylation de sa
sérine en position 129 (Ser129) par reconnaissance du motif Arg-Arg-Phe-Ser129 par la
protéine kinase A (PKA), elle-même activée par l’AMPc. La phosphorylation du CYP2E1 sur la
Ser129 entraîne une réduction rapide de l’activité de ce cytochrome P450, ainsi que sa
dégradation (Eliasson et al., 1990; Eliasson et al., 1992; Oesch-Bartlomowicz and Oesch,
2005; Oesch-Bartlomowicz et al., 1998). Il est à noter que la phosphorylation de la Ser129 a
été également décrite comme étant importante pour l’adressage du CYP2E1 dans les
mitochondries (Robin et al., 2002).

Bien qu’il y ait un grand polymorphisme au niveau du gène CYP2E1 (Carrière et al.,
1996), il n’existe pas de polymorphisme connu conduisant à un CYP2E1 inactif chez l’Homme
ou d’autres espèces animales (Gonzalez, 2007). Cependant, certains polymorphismes chez
l’Homme peuvent modifier significativement l’efficacité de la transcription (e.g. CYP2E1*5B)
ou l’efficacité catalytique de l’enzyme (e.g. CYP2E1*6) (Hayashi et al., 1991). McCarver et
coll. (1998) ont quant à eux étudié une mutation par insertion dans le gène du CYP2E1,
présente chez 31% des patients étudiés. Ils ont observé une corrélation entre augmentation
de l’activité du CYP2E1 et la mutation seulement chez les patients obèses ou ayant
consommé de l’alcool. Il semblerait également que cette mutation soit plus fréquente chez
les patients d’origine afro-américaine (31%) que chez les caucasiens (6.9%) (McCarver et al.,
1998). Une étude récente a également montré chez l’Homme que des mutations dans la
partie N-terminale du CYP2E1 modifiaient de façon importante l’adressage mitochondrial du
CYP2E1 (Bansal et al., 2013).

32
2. Les substrats endogènes et exogènes du CYP2E1

Le CYP2E1 intervient dans la biotransformation de composés endogènes comme les


corps cétoniques, le glycérol et certains acides gras (Caro and Cederbaum, 2001; Laethem et
al., 1993; Porubsky et al., 2008). De plus, il catalyse la biotransformation de nombreux
xénobiotiques comme le paracétamol, certains anesthésiques volatiles (enflurane,
isoflurane, halothane), l’éthanol ainsi qu’un large spectre de composés hydrophobes pro-
carcinogènes comme le tétrachlorure de carbone (CCl4), les nitrosamines, le benzène,
l’aniline ou la pyridine (Gonzalez, 2005; Koop, 1992). Au total, il a été montré que le CYP2E1
pouvait métaboliser plus de 70 substrats (Koop, 1992; Porubsky et al., 2008; Rendic and Di
Carlo, 1997; Tanaka et al., 2000).

• Le paracétamol

Le CYP2E1 est capable de convertir le paracétamol en N-acétyl-p-benzoquinone-


imine (NAPQI), un métabolite très réactif et cytotoxique. Le paracétamol, son métabolisme
et sa toxicité seront abordés en détail dans la dernière partie de l’introduction.

• L’alcool éthylique (éthanol)

Il existe 3 voies métaboliques d’oxydation de l’éthanol dans le foie : l’alcool


déshydrogénase (ADH) cytosolique, la catalase peroxisomale et le système microsomal
d’oxydation de l’éthanol (MEOS : Microsomal Ethanol Oxidizing System) (Tanaka et al.,
2000). L’ADH est la principale enzyme impliquée dans la conversion de l’éthanol en
acétaldéhyde. Le MEOS, dont le CYP2E1 appartient, est également impliqué lors d’une forte
ingestion d’alcool, et dans ce contexte d’intoxication alcoolique ce système métabolise plus
de 10% de la dose d’alcool. L’acétaldéhyde formé est ensuite dégradé en acétate par
l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH), localisée principalement dans les mitochondries. Il est
important de préciser que la métabolisation de l’alcool par le CYP2E1 génère également le
radical 1-hydroxyéthyl qui est très réactif et délétère au niveau cellulaire (Das and
Vasudevan, 2007; Lu and Cederbaum, 2008). L’induction du CYP2E1 par l’intoxication
alcoolique est abordée ci-dessous.

33
• La chlorzoxazone

La chlorzoxazone est un myorelaxant d’action centrale. Plusieurs études ont


démontré que l’hydroxylation de la chlorzoxazone (CZX) en 6-hydroxychlorzoxazone peut
être utilisée comme un indicateur de l’activité du CYP2E1, que ce soit in vitro ou in vivo
(Bachmann and Sarver, 1996; Mishin et al., 1998; Peter et al., 1990; Vesell et al., 1995).
L’utilisation de la chlorzoxazone comme « sonde » spécifique du CYP2E1 a permis de mettre
en évidence des différences interindividuelles de l’activité de cette enzyme, comme
l’augmentation de l’activité du CYP2E1 chez des patients atteints de NAFLD, partie
développée dans le prochain paragraphe (Tab. 2) (Lucas et al., 1998; Varela et al., 2008), ou
encore des variations interraciales. C’est ainsi que Kim et coll. (1996) ont trouvé que les
concentrations plasmatiques de chlorzoxazone étaient significativement plus élevées et le
taux d’élimination plus faible chez les japonais que chez les hommes caucasien in vivo (Kim
et al., 1996). Ces résultats ont été confirmés in vitro en utilisant les microsomes hépatiques
issus de ces deux groupes raciaux.

• CYP2E1, stress oxydant et formation de métabolites réactifs

Le CYP2E1 présente la propriété quasiment unique de produire des quantités


significatives d’ERO au cours de son cycle catalytique (Aubert et al., 2011; Cederbaum, 2014;
Wu and Cederbaum, 2008).

Ainsi, l’induction de cette enzyme dans différentes circonstances


physiopathologiques (e.g. intoxication alcoolique, NAFLD) va entraîner un stress oxydant et
des dommages oxydatifs de nombreux constituants cellulaires. En effet, les ERO peuvent
attaquer différentes macromolécules comme les acides nucléiques, les protéines et les
acides gras insaturés. L’attaque oxydative de ces acides gras est à l’origine de la
peroxydation lipidique qui aboutit à la génération d’aldéhyde hautement réactifs tels que le
malondialdéhyde et le 4-hydroxynonénal (Aubert et al., 2011). Les ERO et les produits de la
peroxydation lipidique peuvent aussi altérer certains composants mitochondriaux tels que
l’ADN mitochondrial et la cytochrome c oxydase (Cahill et al., 2002; Demeilliers et al., 2002).
Enfin, il est important de souligner que le CYP2E1 transforme un certain nombre de toxiques
34
ou de médicaments en métabolites très réactifs et délétères pour les cellules exprimant ce
CYP. Pour les toxiques, on peut citer l’alcool éthylique, le CCl4, le thioacétamide et
l’azoxyméthane (Chilakapati et al., 2007; Gonzalez, 2007; Koop, 1992) et pour les
médicaments, l’halothane, l’acide salicylique et le paracétamol, comme cela a été déjà
mentionné (Aubert et al., 2011; Doi and Horie, 2010; Dupont et al., 1999).

2. Altération de l’expression et/ou de l’activité du CYP2E1 en conditions


physiopathologiques

De nombreuses études expérimentales ou cliniques ont montré une augmentation de


l’expression (ARNm ou protéine) et/ou de l’activité du CYP2E1 au niveau hépatique dans
différentes conditions physiopathologiques comme ou le jeûne (O’Shea et al., 1994),
l’obésité et la NAFLD (O’Shea et al., 1994; Raucy et al., 1991), ainsi que le diabète de type 1
ou de type 2 (Dong et al., 1988; Wang et al., 2003). De plus, lors d’une intoxication
alcoolique, les taux protéiques de CYP2E1 sont significativement augmentés dans le foie
(Roberts et al., 1995; Song, 1996). A l’inverse, des situations d’inflammation aiguë réduisent
l’expression et l’activité du CYP2E1 hépatique (Projean et al., 2005; Sewer et al., 1996). Enfin,
certains médicaments comme le chlorméthiazole et le disulfirame peuvent altérer
l’expression et/ou de l’activité du CYP2E1 (Frye et al., 1999; Simi and Ingelman-Sundberg,
1999). Les situations d’obésité, de NAFLD et de diabètes seront plus particulièrement
discutées dans cette partie.

• Obésité et NAFLD

De nombreux travaux expérimentaux et cliniques ont montré une augmentation de


l’expression (ARNm, protéine) et/ou de l’activité du CYP2E1 hépatique dans un contexte
d’obésité et de NAFLD (Aubert et al., 2011; Chalasani et al., 2003; Emery et al., 2003;
Khemawoot et al., 2007; O’Shea et al., 1994; Raucy et al., 1991; Videla et al., 2004; Zou et al.,
2006).

Chez l’Homme, 9 études réalisées chez des patients souffrants de NAFLD ont montré
une corrélation nette entre le degré de stéatose hépatique et l’expression et/ou l’activité du
35
CYP2E1 (Tab. 2) (Baker et al., 2010; Chalasani et al., 2003; Chtioui et al., 2007; Donato et al.,
2006; Emery et al., 2003; Kohjima et al., 2007; Mitsuyoshi et al., 2009; Varela et al., 2008;
Videla et al., 2004; Weltman et al., 1998). Dans l’étude la plus récente de 2010, Bell et coll.
ont constaté chez des patients obèses ayant subi une chirurgie bariatrique une diminution
de l’expression protéique du CYP2E1 hépatique en corrélation avec l’amélioration de la
dyslipidémie (Bell et al., 2010).

Avant d’aborder les facteurs qui seraient responsables de l’augmentation du CYP2E1,


il est intéressant de souligner que différentes investigations in vitro et in vivo suggèrent que
cette induction pourrait jouer un rôle dans l’altération de la signalisation insulinique et la
survenue de l’insulinorésistance, une anomalie métabolique associée fréquemment à la
NAFLD (Kathirvel et al., 2009; Schattenberg et al., 2005; Zong et al., 2012).

Les facteurs et les mécanismes impliqués dans l’induction du CYP2E1 hépatique au


cours de l’obésité et de la NAFLD restent encore inconnus, mais plusieurs hypothèses
pourraient être avancées (Aubert et al., 2011).

- Une première hypothèse pourrait être l’implication de certains lipides, et en


particulier certains acides gras. Il a été montré à de nombreuses reprises que l’expression
et/ou l’activité du CYP2E1 étaient augmentées par un régime alimentaire riche en lipides in
vivo chez l’animal (Abdelmegeed et al., 2012; Khemawoot et al., 2007; Maksymchuk, 2014;
Osabe et al., 2008; Puccinelli et al., 2013). Néanmoins, certaines études réalisées chez le
canard, le rat et la souris et ont constaté une diminution de l’expression et/ou de l’activité
du CYP2E1 suite à un régime riche en lipides (Ito et al., 2006; Leclercq et al., 1998; Sugatani
et al., 2006). De plus, Yoshinari et coll. (2006), ainsi que Ghose et coll. (2011), ont constaté
quant à eux qu’un régime riche en lipides ne modifiait pas l’expression protéique et/ou
d’ARNm du CYP2E1 chez la souris (Ghose et al., 2011; Yoshinari et al., 2006). Une étude
menée chez le rat a évalué l’effet de 2 régimes hyperlipidiques différents sur l’expression
protéique du CYP2E1. Le premier régime (HF1) est composé principalement de sucrose (60%
de sucrose et 10% de lard) alors que le second régime (HF2) est surtout riche en graisse

36
(19.8% d’huile de maïs, 19.8% de lard et 24.1% de sucrose). Bien que le premier régime riche
en sucrose (HF1) induise une accumulation plus importante de triglycérides et d’acides gras
libres intra-hépatiques que le second régime (HF2), il ne modifie pas l’expression protéique
du CYP2E1, contrairement au second régime qui l’induit (Osabe et al., 2008). De façon
intéressante, grâce à l’utilisation de souris wild-type et de souris génétiquement obèses des
deux sexes, Aubert et coll. (2012) ont montré que l’activité du CYP2E1 hépatique n’était
augmentée significativement que chez les souris db/db femelles, alors que le degré de
stéatose hépatique chez ces souris était moindre comparé aux souris ob/ob du même sexe.
L’ensemble de ces résultats suggère que ce n’est pas la quantité globale de lipides qui joue
un rôle dans l’augmentation de l’expression et/ou de l’activité du CYP2E1 mais le type
d’acides gras s’accumulant dans les hépatocytes (Aubert et al., 2012).

Certaines études in vitro ont été réalisées sur des cellules hépatiques humaines et
animales traitées par différents types d’acides gras. Cependant, les protocoles
expérimentaux (durée d’incubation, concentrations des acides gras…) sont très variables et il
est difficile donc de tirer des conclusions définitives quant aux espèces lipidiques qui
pourraient être responsable de l’induction du CYP2E1. Par exemple, Zangar et Novak (1997)
ont étudié sur des hépatocytes de rat l’effet d’acides gras saturés à chaine courte ou
moyenne (C6-C10), ainsi que l’effet de l’acide palmitique, et n’ont constaté aucun effet de ces
acides gras sur l’expression des ARNm du CYP2E1 (Zangar and Novak, 1997). Quatre études
in vitro sur des cellules hépatiques humaines ont évalué l’effet individuel de certains acides
gras sur l’expression du CYP2E1 (Tab. 3). L’acide oléique et l’acide palmitique semblent
isolément augmenter l’expression (ARNm ou protéines) du CYP2E1 (Sung et al., 2004 ; Raucy
et al., 2004 ; Anthérieu et al., 2011) (Anthérieu et al., 2011; Raucy et al., 2004; Sung et al.,
2004). En revanche, en mélange, ces deux acides gras diminueraient les ARNm et l’activité
de l’enzyme ( Donato et al., 2007). Il est à noter que l’activité du CYP2E1 n’a pas été mesurée
dans les études montrant une augmentation de l’expression de ce CYP (Anthérieu et al.,
2011; Raucy et al., 2004).

37
Auteurs Conditions physiopathologiques investigations ARNm Protéines Activité
Patients obèses versus patients sains
O’shea et al., 1994 Mesure In vivo (1) - - ↗
(NAFLD non précisée)
NASH (50% de sujets obèses) versus foies sains
Weltman et al.,
Immunohistochimie - ↗ -
1998 (IMC des patients non précisé)
Patients obèses versus patients sains
Lucas et al., 1998 Mesure In vivo - - ↗ ca 40%
(NAFLD non précisée)
Patients souffrant d’obésité morbide et à ↗
Emery et al., 2003 Mesure In vivo(2) - -
différents stades de NAFLD versus patients sains
Chalasani et al., Patients obèses non-diabétiques souffrant de ↗
Mesure In vivo (2) - -
2003 NASH versus patients obèses sans NAFLD
↗ ns 70% ↗ ns
Patients obèses souffrants de stéatose ou NASH
steatose stéatose
Videla et al., 2004 versus patients sains Microsomes -
↗ ca 142% ↗ ca 52%
NASH NASH
Patients obèses souffrants de NASH versus
Chtioui et al., 2007 patients obèses souffrants de stéatose Mesure In vivo (1) - - ↗

Donato et al., 2006 Foies stéatosés versus foies sains (IMC des
Microsomes - - →
patients non précisé)
Foies stéatosés ou au stade NASH versus foies
Kohjima et al., 2007 Homogénat total ↗ ca 14X - -
sains (IMC des patients non précisé)
↗ ns
Varela et al., 2008 Patients obèses non-diabétiques souffrant de stéatose
Mesure In vivo (1) - -
NAFLD versus patients obèses sans NAFLD ↗ ca 35%
NASH
↗ ca 22%
Foies stéatosés ou au stade NASH versus foies stéatose
Fisher et al., 2009 microsomes - -
sains (IMC des patients non précisé) ↗ ca 45%
NASH
↘ ca 50%
stéatose
Homogénat total - -
↘ ca 80%
NASH
→ ↗ ns
Mitsuyoshi et al., Patients non obèses souffrants de stéatose ou stéatose stéatose
Microsomes -
2009 NASH versus patients sains ↘ ca 40% →
NASH NASH
↗ ca 8X
stéatose
Homogénat total - -
↗ ca 6.2X
NASH
Patients obèses souffrants de NASH versus
Baker et al., 2010 Homogénat total ↗ 2.17X - -
patients sains
Patients obèses ayant suivis une chirurgie
Bell et al., 2010 bariatrique : comparaison avant leur perte de Immunohistochimie - ↗ -
poids

Tableau 2: Altération de l’expression et/ou de l’activité du CYP2E1 lors de la stéatose et de


la NASH dans des foies humains : Investigations Ex vivo et mesure In vivo de l’activité du
CYP2E1. (1) Détermination de l’activité du CYP2E1 via la clearance plasmatique de la
chlorzoxazone et de son métabolite 6-hydroxylé ; (2) Détermination de l’activité du CYP2E1
via la clearance plasmatique et urinaire de la chlorzoxazone et de son métabolite 6-
hydroxylé.
38
Conditions
Auteurs Models Acides gras temps Concentration ARNm Proteines Activité
de culture
C16:0 - → -
HepG2 C18:1 - ↗* -
Sung et al.,
Sans insuline C18:2 12h 20µM - → -
2004
C18:3 - → -
C22:6 - → -
Hépatocytes 5.8µg/ml
Raucy et al., ↗ ca
primaires insuline C16:0 48h 200µM - -
2004 -6 3.2X
humains (10 M)
500µM total ↘ ns - ↘ ns
Hépatocytes 0,06µg/ml Mélange de ↘ ca
Donato et al., 1mM total - ↘ ns
primaires insuline C18:1/C16:0 14h 45%
2006 -8
humains (10 M) (2:1) ↘ ca
2mM total - -
50%
250µM → - -
24h
500µM → - -
HepaRG 2%DMSO
Anthérieu et 48h 500µM - → -
5µg/ml C18:1
al., 2011 14 ↗ ca
insuline 250µM - -
jours 58%
500µM ↗ ca 89% ↗ ca 50% -

Tableau 3: Régulation du CYP2E1 par les AG dans des hépatocytes humains in vitro. C16:0
acide palmitique ; C18:1 acide oléique ; C18:2 acide linoleïque ; C18:3 acide linolénique ;
C22:6 DHA (acide docosahexaénoïque) ; * : protéines non quantifiées ; ns: non significatif.

- La seconde hypothèse pouvant expliquer l’induction du CYP2E1 au cours de


l’obésité et de la NAFLD serait la présence concomitante d’une résistance intra-hépatique à
l’insuline, ou d’un diabète de type 2. Ces facteurs seront discutés ci-dessous dans le
paragraphe « Diabètes de type 1 et de type 2 ».

- La troisième hypothèse qui expliquerait l’induction du CYP2E1 hépatique pourrait


être l’implication d’une perturbation des taux circulants de leptine et d’adiponectine, deux
adipokines majeures produites par le tissu adipeux blanc (Aubert et al., 2011). Plus
précisément, les concentrations plasmatiques de leptine et d’adiponectine sont
respectivement augmentées et diminuées au cours de l’obésité et la NAFLD (Begriche et al.,
2013; Stojsavljević et al., 2014). Il a été montré par exemple que l’administration de leptine à
des souris ob/ob (qui sont totalement déficientes en leptine) entraîne une augmentation de

39
l’expression protéique en CYP2E1 par un mécanisme qui ne dépend pas uniquement de la
réduction de la prise alimentaire (Leclercq et al., 2000). Des travaux suggèrent également
que la leptine semble importante pour l’importation du CYP2E1 dans le compartiment
mitochondrial (Robin et al., 2005). Enfin, une étude montre que l’expression du CYP2E1
hépatique est augmentée chez des souris déficientes en adiponectine tandis qu’elle est
diminuée chez des souris surexprimant l’adiponectine (Kamada et al., 2007).

• Diabètes de type 1 et de type 2

Le diabète de type 1 est caractérisée par un déficit profond de la sécrétion d’insuline


par les cellules bêta du pancréas, ayant pour conséquence un défaut d’utilisation du glucose
et une hyperglycémie sévère. Chez l’homme, il a été montré que le diabète de type 1 était
associé à une activité plus élevée du CYP2E1, mais la différence n’était pas significative avec
les sujets témoins (Wang et al., 2003). Cependant, il est à noter que tous ces patients étaient
traités par l’insuline. Chez l’animal, il est possible d’induire un diabète de type 1 par
l’injection de streptozotocine, un agent alkylant qui détruit spécifiquement les cellules bêta
pancréatiques. Plusieurs études réalisées chez des rongeurs traités par la streptozotocine
ont ainsi montré une augmentation importante de l’expression et l’activité du CYP2E1
hépatique, qui était normalisée par l’injection d’insuline (Kataoka et al., 2005; Raza et al.,
2004; Sindhu et al., 2006)

Bien que ces études in vivo suggèrent un rôle de l’insuline sur l’expression et l’activité
du CYP2E1, il est possible que d’autres facteurs liés au diabète puissent être impliqués tels
que l’hyperglycémie et l’augmentation des corps cétoniques (hypercétonémie) secondaire
au catabolisme accru des acides gras. Concernant l’hyperglycémie, l’étude de Wang et coll.
(2003) effectuée chez des sujets présentant un diabète de type 1 ou de type 2 montre une
corrélation significative et positive entre l’activité du CYP2E1 et la glycémie (Wang et al.,
2003). De plus, l’étude de Aubert et coll. (2012) a montré chez des souris db/db femelles que
la forte activité du CYP2E1 hépatique est corrélée positivement et significativement (p<0.01)
à la glycémie, qui est particulièrement élevée chez ces souris diabétiques (Aubert et al.,
2012). Il est enfin intéressant de noter que l’administration de sulfate de vanadyl à des rats

40
prétraités par la streptozotocine est capable de réduire la glycémie et de diminuer
l’expression du CYP2E1 hépatique (Kataoka et al., 2005).

Concernant, l’hypercétonémie, il est important de mentionner que l’acétone est un


puissant inducteur du CYP2E1, par un mécanisme qui serait lié à la stabilisation de la
protéine (Forkert et al., 1994; Gonzalez, 2005). Cependant, les investigations de Woodcroft
et coll. (2002) chez des animaux diabétiques, ainsi que celles de Zangar et Novak (1997) sur
hépatocytes primaires de rat, ont montré que les corps cétoniques ne sont pas directement
responsables de l’augmentation de l’expression du CYP2E1. L’altération de la voie de
signalisation de l’insuline pourrait être à l’origine de cette induction (Woodcroft et al., 2002;
Zangar and Novak, 1997). Woodcroft et coll. ont également montré sur hépatocytes
primaires de rat que l’hydroxybutyrate et l’acétoacétate inhibent l’expression des ARNm du
CYP2E1 (Woodcroft et al., 2002).

Le diabète de type 2 est une des nombreuses anomalies métaboliques pouvant


survenir dans un contexte d’obésité. Il survient généralement après plusieurs d’années de
présence d’une insulinorésistance et de maintien d’une glycémie normale par augmentation
compensatrice de la sécrétion d’insuline. A long-terme, les patients présentant une
insulinorésistance peuvent cependant développer un diabète et nécessiter un traitement par
l’insuline en conséquence de la défaillance et de la destruction des cellules bêta. Deux
études indépendantes ont montré une augmentation de l’activité du CYP2E1 chez des
patients obèses présentant un diabète de type 2 (Lucas et al., 1998; Wang et al., 2003).
Cependant, il est important de noter que les investigateurs n’ont pas déterminé si les
patients présentaient une NAFLD.

L’ensemble de ces études suggère ainsi que la moindre sécrétion d’insuline (ou une
signalisation insulinique défectueuse) et/ou d’autres anomalies hormonales et métaboliques
associées pourraient jouer un rôle important dans l’induction du CYP2E1 hépatique. Dans ce
cadre, il est à noter que des investigations réalisées sur des cellules hépatiques de rat ont
montré que l’insuline inhibait l’expression du CYP2E1 en diminuant la stabilité des ARNm du

41
CYP2E1 (Moncion et al., 2002; Shukla et al., 2013; Woodcroft and Novak, 1999a; Woodcroft
et al., 2002), dont la demi-vie passe de 8,5h sans insuline à 3,3h en présence d’insuline (De
Waziers et al., 1995). Une séquence de 16 nucléotides au niveau de la région 5’ proximale de
l’ARNm du CYP2E1 interviendrait dans la régulation du CYP2E1 par l’insuline (Moncion et al.,
2002), mais les protéines se liant à ces séquences restent à identifier (Truong et al., 2005). A
l’inverse, il a été montré que le glucagon était capable d’augmenter l’expression du CYP2E1
grâce à la voie de signalisation impliquant l’AMPc et la protéine kinase A (PKA) (Woodcroft
and Novak, 1999b). A notre connaissance, une seule étude a évalué sur des hépatocytes
humains l’effet de l’insuline sur l’expression du CYP2E1. Dans cette étude, Raucy et coll.
(2004) ont montré que l’insuline n’altère pas significativement l’expression des ARNm dans
des hépatocytes primaires humains en culture, bien que les valeurs montrent une tendance
à la diminution. Il est important de noter cependant que dans toutes ces investigations les
effets de l’insuline ont été évalués sur des temps relativement courts (en général moins de
48 h et 4 jours pour une étude) et surtout, que l’activité du CYP2E1 n’a jamais été mesurée
(Raucy et al., 2004).

• Maladies alcooliques du foie

L’impact de la consommation excessive d’alcool demeure élevé en France en termes


de morbidité et de mortalité. Outre la dépendance qu’engendre une consommation
excessive d’alcool, sa toxicité sur différents organes et tissus doit être prise en compte. Au
niveau hépatique, l’alcool entraine diverses lésions telles que la stéatose, la stéatohépatite
et la cirrhose, qui peut évoluer en carcinome hépatocellulaire (Fromenty and Pessayre, 1995;
Rocco et al., 2014).

De nombreuses investigations expérimentales et cliniques ont montré que


l’intoxication alcoolique est caractérisée par une augmentation de l’activité du CYP2E1
(Liangpunsakul et al., 2005; Lieber, 2004; Mishin et al., 1998; Seitz and Wang, 2013). Cet
effet est la conséquence d’une diminution de la dégradation du CYP2E1 par le protéasome,
alors que les taux d’ARNm ne sont pas modifiés (Eliasson et al., 1992; Roberts et al., 1995;
Song et al., 1989; Winters and Cederbaum, 1992; Zhukov and Ingelman-Sundberg, 1999).

42
L’éthanol fait donc partie des composés inducteurs du CYP2E1 tout en étant un substrat de
l’enzyme. Cette augmentation de l’activité du CYP2E1 chez les sujets alcooliques joue un rôle
majeur dans la physiopathologie des maladies alcooliques du foie, en particulier en
favorisant le stress oxydant et la nécro-inflammation (Cederbaum et al., 2009; French, 2013;
Oneta et al., 2002; Song, 1996; Zhukov and Ingelman-Sundberg, 1999). De façon
intéressante, des travaux récents suggèrent que le CYP2E1 pourrait également jouer un rôle
dans la stéatose hépatique induite par l’intoxication alcoolique (Chen et al., 2014; Wu et al.,
2010). Cette induction du CYP2E1 explique également pourquoi les sujets alcooliques
présentent un risque accru d’hépatotoxicité au paracétamol, même en absence de
surdosage (Emby and Fraser, 1977; Jaya et al., 1993; Manchanda et al., 2013). En effet, dans
ce contexte toxicologique, une plus grande quantité de NAPQI est générée par le CYP2E1
hépatique. Néanmoins, une étude de 2007 suggère que l’ingestion d’alcool de façon
concomitante à un surdosage en paracétamol est associée à un risque plus faible
d’hépatotoxicité induite par ce médicament (Waring et al., 2008). Cela pourrait s’expliquer
par la moindre production de NAPQI due à une compétition entre l’alcool et le paracétamol
pour le CYP2E1.

• Autres facteurs

Inflammation et cytokines

Différentes investigations expérimentales ont montré que des situations


d’inflammation aiguë entraînent une diminution de l’expression et de l’activité du CYP2E1
(Projean et al., 2005; Rockich and Blouin, 1999; Sewer et al., 1996). Cet effet, qui est en fait
retrouvé pour d’autres CYPs, semble la conséquence de la surproduction de cytokines pro-
inflammatoires comme l’IL-1α, l’IL-1β, l’IL-6 et le TNFα (Abdel-Razzak et al., 1993; Hakkola et
al., 2003; Peng and Coon, 2000). Des investigations sur des hépatocytes humains en culture
primaire ont montré que l’IL-4, une cytokine anti-inflammatoire, induit significativement
l’expression du CYP2E1 ainsi que celle des GSTs (Glutathion S Transférases), alors que cette
cytokine inhibe la plupart des CYPs (Abdel-Razzak et al., 1993). Wang et coll. (2010) se sont
intéressés à la régulation transcriptionnelle du CYP2E1 par l’IL-4 dans la lignée d’hépatome
humain B16A2 où ils ont mis en évidence deux voies de signalisation indépendantes en
43
réponse à l’IL-4. L’IL-4 induit en effet l’expression du CYP2E1 via deux facteurs de
transcription, STAT6 (voie JAK-STAT) et NAFATc1 (voie IRS1/2), qui se fixent au niveau de la
région promotrice du gène (Wang et al., 2010).

Médicaments

Certains médicaments comme le chlorméthiazole et le disulfiram sont connus pour


altérer l’expression et/ou de l’activité du CYP2E1. Le chlorméthiazole (CMZ) est un sédatif et
un hypnotique utilisé couramment dans le traitement et la prévention de l’état de manque
des alcooliques. C’est un inhibiteur du CYP2E1 au niveau transcriptionnel, mais également au
niveau post-traductionnel, probablement par la déstabilisation allostérique de l’enzyme
(Simi and Ingelman-Sundberg, 1999). Le CMZ apparait comme un inhibiteur relativement
spécifique et efficace in vivo (Hu et al., 1994). En effet, les patients exposés au CMZ
présentent un métabolisme de la chlorzoxazone fortement inhibé (Eap et al., 1998). De
nombreuses études in vitro ont également montré que le CMZ était un puissant inhibiteur
du CYP2E1 (Simi and Ingelman-Sundberg, 1999; Wu et al., 2012). Le disulfiram est un
inhibiteur de l’acétaldéhyde déshydrogénase (ALDH) utilisé dans le traitement de
l’alcoolisme chronique. C’est également un puissant inhibiteur de l’activité du CYP2E1 in
vitro et in vivo. En effet, Frye et coll. (1999) ont mesuré une inhibition de 95% du
métabolisme de la chlorzoxazone chez les sujets prenant du disulfiram (Frye et al., 1999). Le
diéthyldithiocarbamate (DDTC), un métabolite du disulfiram, est également un inhibiteur du
CYP2E1 (Ohashi et al., 2005; Pratt-Hyatt et al., 2010). Cependant, le DDTC n’est pas
spécifique du CYP2E1 puisqu’il est capable d’inhiber d’autres CYPs comme les CYP1A1, 1A2,
2A6 et 3A4 (Eagling et al., 1998; Ono et al., 1996).

44
C. Le CYP3A4

1. Généralités sur le CYP3A4

Le gène humain du CYP3A4 a été séquencé en 1993. Il est situé sur le chromosome 7
en position q22.1. Il est composé de 13 exons et code pour une protéine de 503 acides
aminés (Hashimoto et al., 1993; Inoue et al., 1992; Jounaïdi et al., 1994; Lamba et al., 2002).
Il est à noter que les CYPs correspondant au CYP3A4 humain sont chez la souris et le rat le
Cyp3a11 et le Cyp3a2, respectivement.

Le CYP3A4 est le principal CYP au niveau hépatique puisqu’il représente 60% des CYPs
totaux dans le foie (Guengerich, 1999). Il est également retrouvé dans la prostate, le sein, le
colon, le petit et le gros intestin et dans certaines régions du cerveau (Dutheil et al., 2009;
Huang et al., 1996; Kolars et al., 1994; Lown et al., 1997; Shimada et al., 1994).

Dans le foie, le CYP3A4 est exprimé majoritairement dans les hépatocytes entourant
les veines centrales (Hata et al., 2010). C’est une enzyme microsomale localisée dans le
réticulum endoplasmique (Paine et al., 1999). Cependant, Jeon et coll. (2008) ont mis en
évidence une activité catalytique de cette enzyme dans la fraction cytoplasmique suite à
l’ajout d’un partenaire redox (CPR et b5). D’après ces auteurs, il s’agirait d’une forme de
CYP3A4 délété en partie N-terminale (Jeon et al., 2008). Le CYP3A4 n’est pas exprimé dans le
foie fœtal (Betts et al., 2015; Lacroix et al., 1997). Chez l’adulte, une grande variabilité
interindividuelle a été décrite dans la population générale (Hata et al., 2010; Ozdemir et al.,
2000), et par exemple une étude a rapporté que l’expression hépatique de la protéine
CYP3A4 pouvait varier de 5 à 376 pmol/mg de protéine microsomale (Lin et al., 2002). Cette
variabilité contribue à des différences importantes concernant les effets thérapeutiques et
toxiques des xénobiotiques. Près de 90% de cette variabilité sont accordés à des facteurs
génétiques (Ozdemir et al., 2000). Il est à noter qu’un faible nombre d’allèles altère
l’expression du CYP3A4 (Horsmans et al., 1992; Lamba et al., 2002) et que son activité
enzymatique présente une variabilité inter-ethnique (Ahsan et al., 1991; Krishna and Shekar,

45
2005; Shimada et al., 1994). Par exemple, Ashan et coll. (1991) ont remarqué une activité
réduite chez des individus originaire d’Asie du Sud vivant en Grande Bretagne comparé à des
descendant britanniques, et ce indépendamment du régime alimentaire différent (Ahsan et
al., 1991).

Du fait de la variabilité de l’activité du CYP3A4 (qu’elle soit basale ou secondaire à


l’exposition à des médicaments ou à d’autres xénobiotiques) et du nombre important de
médicaments métabolisés par cette enzyme (en métabolites toxiques ou non), il existe de
nombreuses interactions médicamenteuses impliquant ce CYP. L’aspect des effets des
xénobiotiques sur l’expression et l’activité du CYP3A4 sera évoqué plus loin.

Les modifications transcriptionnelles du CYP3A4 (et des CYPs homologues chez les
rongeurs) sont relativement bien connues, notamment sa régulation par les facteurs de
transcription HNF-4α (Hepatocyte Nuclear Factor-4α) (Jover et al., 2001; Kamiyama et al.,
2007), PXR (Pregnane X Receptor), CAR (Constitutive Androstane Receptor) (Krishna and
Shekar, 2005; Luo et al., 2002; Martínez-Jiménez et al. , 2007), et PPARα (Peroxisome
Proliferator-Activated Receptor α) (Thomas et al., 2013). Le promoteur du gène du CYP3A4
contient de nombreux sites de fixation de facteurs de transcription tels que HNF-4α, Oct-1
(Octamer-Binding Protein 1), un élément de réponse aux glucocorticoïdes (GRE) ainsi que
des séquences d’éléments de réponse aux récepteurs des œstrogènes (Hashimoto et al.,
1993; Itoh et al., 1992). Il est à noter que HNF-4α peut interagir avec PGC-1α (Proliferator-
Activated Receptor γ Coactivator-1α) au niveau du promoteur du Cyp3a11 et que cette
interaction peut être diminuée par SREBP-2 (Sterol Regulatory Element Binding Protein-2),
un facteur de transcription qui est activé lorsque les niveaux cellulaires de cholestérol sont
faibles (Inoue et al., 2011). De façon intéressante, une étude a montré que l’expression du
CYP3A pouvait être aussi contrôlée par SREBP-1, un facteur de transcription activé au niveau
hépatique par l’insuline (Roth et al., 2008). En particulier, la surexpression de SREBP-1 inhibe
la transcription du CYP3A4 via son interaction directe avec CAR et PXR. Ainsi, l’expression
génique du CYP3A4 peut être régulée directement ou indirectement par de nombreux
facteurs comme des hormones, des dérivés endogènes et des xénobiotiques, ce qui peut

46
expliquer, en plus du polymorphisme génétique, la grande variabilité interindividuelle de
l’activité du CYP3A4.

Les régulations post-transcriptionnelles quant à elles sont peut élucidées, mis à part
l’inhibition de l’expression du CYP3A4 par certains microARNs (Koturbash et al., 2012; Wei et
al., 2014). Takagi et coll. (2008) rapportent par exemple que le CYP3A4 serait indirectement
régulé par miR-148a, qui contrôlerait la régulation du facteur de transcription PXR (Takagi et
al., 2008). Une étude récente de 2014 a également mis en évidence que le miR-223 était
capable de réduire l’activité du CYP3A4 dans des cellules HepG2 surexprimant ce microARN
sans affecter l’expression protéique du CYP3A4. Cette inhibition de l’activité se ferait via
l’inhibition de l’expression protéique du cytochrome b5 (Takahashi et al., 2014). Lamba et
coll. (2014) identifient de plus miR-34a comme étant un microARN régulant fortement
l’expression (ARNm) du CYP3A4 et de différents facteurs de transcription hépatiques comme
HNF4α. Ils suggèrent que miR-34a peut réguler directement ou indirectement l’expression
du CYP3A4. Dans cette étude, ces auteurs ont de plus observé que les hommes exprimaient
plus fortement le miR-34a hépatique, et avaient une activité du CYP3A4 moindre comparés
aux femmes (Lamba et al., 2014). Enfin, grâce à une modélisation mathématique et des
approches expérimentales complémentaires, Wei et coll. (2014) ont montré que le CYP3A4
pourrait être également régulé dans le foie de façon post-transcriptionnelle par hsa-miR-
577, hsa-miR-1, hsa miR-532-3p et hsa miR-627 (Wei et al., 2014).

2. Les substrats endogènes et exogènes du CYP3A4

Le CYP3A4 peut métaboliser un large spectre de dérivés exogènes, mais également


des molécules endogènes. Il joue un rôle fondamental dans le métabolisme des
xénobiotiques puisqu’on estime qu’il métabolise plus de 50% des médicaments
(antibiotiques, anesthésiques, antihistaminique, corticostéroïdes, statines,
immunosuppresseurs…) dont plus de 100 sont actuellement connus (Tab. 4) (Rendic, 2002).
Certains pesticides comme le parathion et le malathion peuvent être également métabolisés
par le CYP3A4 (Butler and Murray, 1997; Josse et al., 2014). Enfin, le CYP3A4 est également

47
capable de métaboliser des dérivés endogènes tels que les stéroïdes naturels comme la
testostérone et la progestérone (Guengerich, 1999; Pelkonen et al., 1998).

• Le paracétamol

Bien que le CYP2E1 soit majoritairement responsable du métabolisme du


paracétamol en NAPQI, des études indiquent que le CYP3A4 est également impliqué dans
cette biotransformation, que cela soit chez les rongeurs ou l’Homme (Patten et al., 1993). Le
métabolisme du paracétamol par le CYP3A4 sera développé dans la partie suivante.

• La testostérone

De nombreuses études sur microsomes de foies humains ont démontré que des
inhibiteurs sélectifs du CYP3A4 diminuaient l’hydroxylation de la testostérone en 6β-
hydroxytestostérone (Bourrié et al., 1996; Newton et al., 1995; Wrighton et al., 1989). Des
anticorps anti-CYP3A4 ont également été utilisés pour démontrer la relation entre l’activité
du CYP3A4 et cette hydroxylation de la testostérone. En effet, l’utilisation d’un anticorps
monoclonal anti-CYP3A4 diminue très fortement l’hydroxylation de la testostérone en 6β-
hydroxytestostérone (Mei et al., 1999; Shou et al., 2000). De nombreux travaux in vitro
utilisent ainsi la biotransformation de la testostérone en 6β-hydroxytestostérone comme
marqueur d’activité du CYP3A4 (Racha et al., 2003).

48
Tableau 4: Médicaments substrats du CYP3A4 (stéroïdes inclus) (d’après Guengerich, 1999).

49
3. Altération de l’expression et/ou de l’activité du CYP3A4 en conditions
physiopathologiques

• Obésité et NAFLD

Malgré l’importance et la prédominance du CYP3A4 au niveau hépatique, très peu


d’études se sont intéressées à cette enzyme dans le contexte physiopathologique de
l’obésité et des NAFLD, qui pourtant représente aujourd’hui un enjeu majeur de santé
publique. Néanmoins, quelques études expérimentales et cliniques suggèrent que
l’expression et l’activité enzymatique du CYP3A4 seraient réduites au niveau hépatique au
cours de ces maladies dysmétaboliques (Tab. 5).

Concernant les investigations cliniques, les auteurs ont constaté en général une
diminution de l’expression protéique et de l'activité du CYP3A4 (Brill et al., 2012; Donato et
al., 2007; Fisher et al., 2009; Kolwankar et al., 2007; Weltman et al., 1998). Certaines de ces
études rapportent des diminution d’activité du CYP3A4 dans des foies stéatosiques pouvant
atteindre 50% par rapport à des foies sains (Donato et al., 2007; Kolwankar et al., 2007). En
revanche, Niemelä et coll. (2000) ont observé par immunohistochimie une augmentation
protéique du CYP3A4 chez des patients obèses ou diabétiques par rapport à des sujets en
phase précoce de maladie alcoolique du foie. Cependant, il est à noter que ces résultats sont
difficiles à interpréter car les auteurs n’ont pas inclus dans l’étude des sujets sains (Niemelä
et al., 2000).

Concernant les investigations expérimentales chez l’animal, plusieurs études ont


également constaté une diminution hépatique du CYP3A4 suite à un régime riche en lipides,
que ce soit chez le cobaye (Patoine et al., 2013), chez la souris (Ghose et al., 2011; Yoshinari
et al., 2006), chez le rat ou encore chez le canard (Leclercq et al., 1998). Ainsi, Ghose et coll.
(2011) ont mis en évidence une diminution de l’expression (protéine et ARNm) et de
l’activité hépatique du Cyp3a11 (analogue murin du CYP3A4) chez des souris nourries avec
un régime riche en graisses. Cette inhibition est accompagnée d’une diminution des ARNm
de PXR et CAR et d’une augmentation de l’expression de cytokines telles que Il-1β, Il-6 et

50
TNFα (Ghose et al., 2011). Par contre, Li et coll. (2011) ont quant à eux observé une nette
augmentation des ARNm du Cyp3a2 hépatique chez des rats nourris par un régime riche en
graisses (Li et al., 2011). La discordance de cette étude avec les autres pourrait être due à
différents facteurs comme la composition du régime riche en graisse et la durée d’exposition
à ce régime.

Auteurs Conditions physiopathologiques investigations ARNm Protéines Activité


Foies au stade NASH (50% de sujets
Weltman et al., obèses) versus foies sains (IMC des Immunohistochimie - ↘ -
1998
patients non précisé)
Donato et al., Microsomes - - ↘ ca 50%
Foies stéatosés versus foies sains (IMC
2006
des patients non précisé) Culture primaire - - ↘ ca 50%
Donato et al., Foies stéatosés versus foies sains (IMC
Culture primaire - - ↘ ca 50%
2007 des patients non précisé)
Homogénat total ↘ ca 40% - -
↘ ca 50%
stéatose
Kolwankar et Foies stéatosés (non-alcoolique) versus
légère
al., 2007 foies sains (IMC des patients non
Microsomes - ↘ ca 30%
précisé)
↘ 70%
stéatose
modérée

Homogénat total → - -
Foies stéatosés ou au stade NASH versus
Fisher et al., → →
foies sains (IMC des patients non
2009 stéatose stéatose
précisé)
Microsomes -
↘ ns ↘ ns
NASH NASH
Patients obèses ayant suivis une
Bell et al.,
chirurgie bariatrique : comparaison Immunohistochimie - → -
2010
avant leur perte de poids

Tableau 5: Altération de l’expression et/ou de l’activité du CYP3A4 lors de la stéatose et de


la NASH dans des foies humains.

51
D’autres études ont été effectuées avec des modèles expérimentaux d’obésité et de
stéatose plus particuliers. Par exemple, Su et coll. (1999) ont étudié des rats nourris avec un
régime standard ou un régime riche en sucrose, supplémenté ou non en l’acide orotique,
connu pour induire une stéatose microvésiculaire. Dans cette étude, seul le régime riche en
sucrose supplémenté en acide orotique induisait une accumulation intrahépatique de lipides
(phospholipides, triglycérides et cholestérol) qui était accompagnée d’une réduction de
l’activité hépatique du Cyp3a2 (Su et al., 1999). Vornoli et coll. (2014) ont quant à eux
travaillé sur un modèle de rats nourris avec un régime riche en graisses supplémenté en
streptozotocine, rendant ainsi ces rats obèses et diabétiques. Ces auteurs ont observé une
tendance à l’augmentation protéique et de l’activité du Cyp3a2 chez ces rats (Vornoli et al.,
2014).

Enfin, concernant les investigations in vitro, 4 études sur hépatocytes humains ont
évalué l’effet individuel de certains acides gras sur le CYP3A4 (Tab. 6). Madec et coll. (2011)
ainsi que Hu et coll. (2014) ont montré que l’acide linoléique augmentait l’expression des
ARNm ou l’activité du CYP3A4 (Hu et al., 2014; Madec et al., 2011).En revanche, alors que
l’acide oléique semble diminuer les ARNm du CYP3A4 dans l’étude d’Anthérieu et coll.
(2011), il augmente l’activité de l’enzyme dans l’étude de Hu et coll. (2014) (Anthérieu et al.,
2011; Hu et al., 2014). Ainsi, ces résultats semblent indiquer que le CYP3A4 pourrait être
régulé de façon différentielle en fonction du type d’acides gras, avec notamment certains
acides gras qui induiraient son expression tandis que d’autres pourraient la diminuer. Il est à
noter à ce sujet que l’augmentation de l’expression du CYP3A4 par certains acides gras (ou
certains lipides) pourrait être la conséquence d’une activation de PPARα (Thomas et al.,
2013). On ne peut pas exclure cependant que les différentes conditions de culture
(notamment des concentrations différentes d’insuline et de DMSO) aient pu également
influencer l’expression et/ou l’activité du CYP3A4 dans les différentes études citées ci-
dessus. Ainsi, d’autres études seraient nécessaires afin de mieux caractériser les effets des
acides gras et d’autres types de lipides sur l’expression et l’activité du CYP3A4.

52
Auteurs Models Acides gras temps Concentration ARNm Proteines Activité
sans 50µM → - -
HepaRG
Madec et al. DMSO 100µM ↗ ns - -
C18:2 24h
2011 5µg/ml
200µM ↗ ca 50% - -
insuline
Hépatocyte 0,06µg/ml Mélange de 500µM total ↘ ns - ↘ ns
Donato et al.
s primaires insuline C18:1/C16:0 14h 1mM total ↘ ca 30% - ↘ ca 40%
2006
humains (10-8M) (2:1) 2mM total - - ↘ ca 50%
250µM ↘ ns - -
24h
Anthérieu et HepaRG 2%DMSO 500µM ↘ ca 38% - -
al. 5µg/ml C18:1 48h 500µM - → -
2011 insuline 14 250µM ↘ ns - -
jours 500µM ↘ ns ↗ ca 30% -
50µM - - ↗ ca 20%
C16:0 100µM - - ↗ ca 23%
200µM ↗ ca 110% ↗ ca 70% ↗ ca 24%
100µM - - ↗ ca 15%
HepG2 C18 :0
Sans 48h 200µM - - ↗ ca 57%
insuline 50µM - - →
Hu et al. C18 :1 100µM - - ↗ ca 35%
2014 200µM ↗ ca 62% ↗ ca 57% ↗ ca 36%
100µM - - ↗ ca 15%
C18:2
200µM - - ↗ ca 44%
C16:0 - - ↗ ca 75%
Fa2N-4 Sans C18:0 - - ↗ ca 60%
48h 200µM
insuline C18:1 - - ↗ ns
C18:2 - - ↗ ca 115%

Tableau 6: Régulation du CYP2E1 par les AG dans des hépatocytes humains in vitro. C16:0
acide palmitique ; C18 :0 acide stéarique ; C18:1 acide oléique ; C18:2 acide linoleïque ;
ns :non significatif.

• Diabète de type 1 et de type 2

En ce qui concerne le diabète de type 2, il n’y a, à notre connaissance, qu’une seule


étude chez l’Homme ayant rapporté les effets de cette pathologie sur le CYP3A4 hépatique.
En effet, une étude publiée en 2011 et réalisée sur des foies humains a révélé que les ARNm,
l’expression protéique et l’activité du CYP3A4 étaient significativement diminuées dans les
foies de sujets diabétiques (Dostalek et al., 2011).
En revanche, plusieurs études ont été réalisées sur les rongeurs présentant un
diabète de type 2. Oh et coll. (2012) ont rapporté une augmentation de l’expression
protéique et de l’activité du Cyp3a2 chez des rats Goto-Kakizaki (rats GK) et Patoine et coll.
(2014) ont observé une augmentation significative de l’expression (ARNm et protéine) et de

53
l’activité du Cyp3a11 pour des souris db/db, accompagnée d’une augmentation de PXR et
CAR (Oh et al., 2012; Patoine et al., 2014). Par contre, une diminution de l’activité du
Cyp3a2est rapportée chez des rats Zucker par Zaluzny et coll. (1990) (Zaluzny et al., 1990).

Concernant le diabète de type 1, plusieurs études ont rapporté les effets du diabète
de type 1 sur le CYP3A chez des rongeurs traités par la streptozotocine. Ces études ont
montré globalement une augmentation de l’expression (ARNm ou protéine) et de l’activité
du Cyp3a11 chez des souris (Chatuphonprasert et al., 2012; Patoine et al., 2014) et du
Cyp3a2 chez le rat (Hu et al., 2011; Shimojo et al., 1993).

L’ensemble de ces études réalisées principalement chez les rongeurs suggère que le
glucose et/ou l’insuline pourraient modifier significativement l’expression du CYP3A.
Cependant, il existe peu de données concernant les effets de ces facteurs sur l’expression et
l’activité du CYP3A4, ou de ses homologues chez les rongeurs. Hu et coll. (2014) ont mis en
évidence que le glucose diminuait l’activité du CYP3A4 dans des hépatocytes humains alors
que l’insuline ne semblait pas modifier l’expression et/ou l’activité de cette enzyme (Hu et
al., 2014; Woodcroft and Novak, 1997). Néanmoins, Roth et coll. (2008) a montré que
l’insuline induit l’expression des ARNm du Cyp3a11 dans des hépatocytes primaires de souris
(Roth et al., 2008). Enfin, il est à noter que l’étude de Hu et al. (2014) a montré que
l’incubation d’hépatocytes humains avec du sérum de rats diabétiques entraine une
augmentation de l’activité du CYP3A4 (Hu et al., 2014). Clairement, d’autres études seraient
nécessaires afin de mieux connaitre les effets du glucose et de l’insuline sur l’expression et
l’activité du CYP3A et de déterminer s’il existe des différences entre les espèces.

• Autres situations physiopathologiques

L’expression hépatique du CYP3A4 semble être altérée lors des maladies alcooliques
du foie. Niemelä et coll. (2000) ont montré une induction protéique du CYP3A4 dans des
foies de patients alcooliques (Niemelä et al., 2000). Une étude sur hépatocytes primaires
humains montre également une induction des ARNm du CYP3A4 par l’éthanol (Kostrubsky et

54
al., 1995). Cependant, l’activité hépatique de l’enzyme ne semble pas altérée chez des
patients consommant de l’alcool modérément (Liangpunsakul et al., 2005).
Lors de l’inflammation et de l’infection, certaines cytokines sont responsables de
l’inhibition de l’expression et/ou l’activité du CYP3A4 (Aitken et al., 2006; Fardel and Le Vée,
2009). En effet, L’IL-6 et IL-1β diminue l’expression et l’activité catalytique du CYP3A4 in vitro
(Bachour-El Azzi et al., 2014; Rubin et al., 2015). L’inhibition du CYP3A4 par l’IL-6 semble
nécessiter le facteur de transcription PXR (Yang et al., 2010). Une étude chez des patients
après un stress chirurgical montre une corrélation négative entre l’induction d’IL-6 et
l’activité du CYP3A4 mesurée par une méthode non invasive (Haas et al., 2003). En revanche,
Il-18, IL-2 et IL-23 ne semble pas influencer l’expression et l’activité du CYP3A4 (Nguyen et
al., 2015; Rubin et al., 2015).

Certains xénobiotiques, en particulier des médicaments, peuvent augmenter


l’expression du CYP3A4 par activation des facteurs de transcription CAR et PXR. Pour les
médicaments, on peut citer par exemple la chlorpromazine, le phénobarbital, la rifampicine,
différentes statines (e.g. lovastatine et simvastatine), la troglitazone, l’irinotécan et le
tamoxifène (Ekins and Erickson, 2002; Faucette et al., 2007; Timsit and Negishi, 2007).
Différents inhibiteurs du CYP3A4 sont également connus, tels que le kétoconazole (Novotná
et al., 2014), le ritonavir et un de ses dérivés le cobicistat (Sevrioukova and Poulos, 2014),
ainsi que certains composés contenus dans le jus de pamplemousse (Uno and Yasui-
Furukori, 2006), ce qui peut induire des perturbations du métabolisme de nombreux
médicaments. Par exemple, l’absorption de jus de pamplemousse peut entraîner une
augmentation très importante des concentrations plasmatiques des statines par inhibition
du CYP3A4 au niveau intestinal et conduire ainsi à une toxicité accrue de ces hypolipémiants
(Dresser et al., 2000).

55
III/ Le paracétamol

A. Introduction

Le paracétamol (p-acétyl-aminophénol), aussi appelé « acetaminophen » par les


anglo-saxons, est une molécule synthétisée pour la première fois par le chimiste américain
Harmon Northrop Morse en 1878. Ses propriétés analgésiques et antipyrétiques furent
décrites en 1889 par le scientifique allemand Karl Morner, puis par le médecin allemand
Joseph Von Mering en 1893. Cependant, il fut mis de côté au profit d’autres médicaments
tels que l’acétanilide, la phénacétine et l’aspirine. Ce n’est que 50 ans plus tard, après
constatation des effets secondaires indésirables de l’acétanilide (méthémoglobinémie), de la
phénacétine (néphrotoxicité) et de l’aspirine (hémorragie, ulcère gastroduodénal, allergie),
que le paracétamol fut commercialisé.

1. Structure et propriétés chimiques

Le paracétamol est un dérivé de l’acétanilide (N-phényléthanamide). Un groupement


hydroxyle en position para le différencie de l’acétanilide. La phénacétine est également
synthétisé à partir de l’acétanilide, par ajout d’un groupement éthoxy.

Figure 9: structures chimiques de l’acétanilide, du paracétamol et de la phénacétine.

En conditions normales de température et de pression, le paracétamol est une


poudre blanche soluble dans l’alcool, l’acétone, le diméthylsulfoxyde (DMSO), mais peu
hydrosoluble et liposoluble (Prescott, 1980).

56
2. Pharmacologie

S’il est clair que le paracétamol agit au niveau du système nerveux central, son
mécanisme d’action complet n’est toutefois pas encore élucidé, et ce, plus d’un siècle après
sa découverte et de sa mise sur le marché. Il a été souvent associé à celui des anti-
inflammatoires non stéroïdiens (AINS), dont l’aspirine et l’ibuprofène de par ses propriétés
analgésiques et antipyrétiques, mais il s’en distingue par sa faible activité anti-inflammatoire
et antiplaquettaire.

Les activités thérapeutiques du paracétamol sont complexes et impliquent


probablement plusieurs voies ( Anderson, 2008). Comme les AINS, le paracétamol bloquerait
la production des prostaglandines en inhibant les cyclooxygénases synthases centrales
(Graham and Scott, 2005). D’autre part, un de ses métabolites actifs, la N-
arachidonoylphénolamine (ou AM404) agirait sur les récepteurs cannabinoïdes CB1 situées
dans le système nerveux central (Högestätt et al., 2005). Ces récepteurs sont impliqués dans
les voies de thermorégulation mais également celles de la douleur. Une autre hypothèse
serait que le paracétamol exerce un effet analgésique sur le système nerveux central par une
potentialisation des neurones sérotoninergiques descendants de la moelle épinière, ceci
ayant un effet sur les voies nociceptives (Björkman, 1995; Tjølsen et al., 1991).

3. Galénique et posologies

Le paracétamol existe sous plusieurs formes galéniques : comprimé sec ou


effervescent, poudre en gélules ou sachets, sirop, suppositoire, injectable pour voie
intraveineuse.

57
Dose thérapeutique Dose maximale recommandée
par 24 heures par 24 heures
Adultes et enfants de plus de 15 4g en 4 prises espacées de 6
3 x 1g espacés de 4 heures
ans (≥ 50kg) heures
Entre 38-50kg 3 x 1g espacés de 6 heures 3g
60 mg/kg/jour en 4 prises
Enfants et nourissons (≤38kg) soit 15 mg/kg toutes les 6 heures 80 mg/kg
ou 10 mg/kg toutes les 4 heures

Tableau 7: Posologies du paracétamol recommandées en France, d’après le dictionnaire


VIDAL.

4. Données pharmacocinétiques

L’absorption du paracétamol par l’intestin grêle après ingestion orale est rapide et
presque totale, avec une biodisponibilité d’environ 80%. La paracétamolémie thérapeutique
se situe entre 8 et 30 mg/l et les concentrations plasmatiques maximales sont atteintes 30 à
60 minutes après ingestion. Cependant, selon les formulations et le mode d’administration,
la biodisponibilité ainsi que le temps nécessaire pour atteindre la concentration plasmatique
maximale peuvent légèrement varier. Le paracétamol se distribue rapidement dans tous les
tissus avec un volume de distribution proche de 1l/kg et les concentrations sont
comparables dans le sang, la salive et le plasma. Du fait de sa faible liposolubilité et de sa
faible liaison aux protéines plasmatiques, son imprégnation dans le tissu adipeux semble
être relativement faible. Le paracétamol est connu pour traverser la barrière hémato-
encéphalique et le placenta.

Après absorption gastro-intestinale, le paracétamol entre dans la circulation entéro-


hépatique afin d’être métabolisé principalement par le foie. Son élimination est
essentiellement urinaire. Environ 90% de la dose ingérée sont éliminés par le rein en 24
heures, majoritairement sous forme glucuronoconjuguée et sulfoconjuguée pour seulement
5% sous forme inchangée. La demi-vie d’élimination est comprise entre 1,5 à 3h mais celle-ci
peut augmenter en cas d’insuffisance hépatique sévère ou de surdosage (Marzuillo et al.,
2014; Prescott, 1980).

58
Il est intéressant de noter que certaines études ont comparé la pharmacocinétique
du paracétamol entre des patients adultes obèses et non obèses (Abernethy et al., 1982;
Abernethy and Greenblatt, 1982). Dans ces travaux, le volume de distribution et la clairance
sont augmentés. Une autre étude, réalisée chez des enfants obèses pour qui une
stéatohépatopathie a été diagnostiquée, ne montre en revanche pas de différences
pharmacocinétiques avec des enfants sains, en particulier concernant la clairance (Barshop
et al., 2011).

59
B. Métabolisme

Le métabolisme du paracétamol a lieu essentiellement au niveau hépatique, par les


hépatocytes. Les deux voies métaboliques principales sont la glucuronoconjugaison (50-70%)
et la sulfoconjugaison (25-35%) (Fig. 10). En effet, 90% d’une dose normale ingérée sont pris
en charge par des enzymes de conjugaison, glucurotransférases et sulfotransférases, qui
greffent un groupement glucuronide ou sulfate à la molécule mère pour la rendre plus
hydrophile afin de faciliter l’élimination biliaire et urinaire du médicament. Une troisième
voie métabolique est également sollicitée. En effet, environ 5% du paracétamol sont
métabolisés par les cytochromes P450 (CYPs), majoritairement le CYP2E1 et le CYP3A4, en N-
acétyl-p-benzoquinone imine (NAPQI), un métabolite hautement réactif. A dose
thérapeutique, ce dernier est rapidement détoxifié par le glutathion (GSH) sous forme d’un
conjugué 3’-S-glutathionyl-paracétamol inactif, puis éliminé dans la bile et les urines à la
suite d’une réaction de conjugaison avec la cystéine et l’acide mercapturique (Fig. 10).
Finalement, une quatrième voie hépatique mineure de biotransformation aboutissant à la
formation de 3-hydroxy-paracétamol et de 3-méthoxy-paracétamol par les CYPs doit être
également considérée. Ces métabolites non toxiques sont rapidement éliminés par
glucurono et sulfoconjugaison (Marzuillo et al., 2014; McGill and Jaeschke, 2013; Zhao and
Pickering, 2011).

Enfin, un métabolite du paracétamol est connu pour ses propriétés


pharmacologiques, comme cela a été mentionné précédemment. En effet, le p-
aminophénol, provenant de la désacétylation hépatique du paracétamol, est conjugué au
niveau du cerveau à l’acide arachidonique par la Fatty Acid Amide Hydroxylase (FAAH) pour
former de la N-arachidonoylphénolamine (AM404) (Fig. 10) (Högestätt et al., 2005).

60
Figure 10: Les principales voies métaboliques du paracétamol après administration d’une
dose thérapeutique. Le paracétamol (APAP) est métabolisé dans le foie principalement par
conjugaison à des groupements glucuronides (50 à 70% de la dose administrée) et sulfates
(25 à 35%). Ces réactions sont catalysées respectivement par les UDP-
glucuronosyltransférases (UGTs) et les sulfotransférases (SULTs). Une faible portion du
paracétamol est prise en charge par les cytochromes P450 (CYPs), principalement le CYP2E1
et le CYP3A4, qui, par oxydation, forme le N-acétyl-p-benzoquinone imine (NAPQI). Ce
métabolite très réactif est rapidement détoxifié par conjugaison au glutathion (GSH) par la
glutathion-S-transférase (GST) pour former le 3’(S-glutathionyl)paracétamol qui est éliminé
dans les urines. D’autres métabolites hépatiques peuvent être formés tels que le 3’-hydroxy
ou 3’-méthoxy-paracétamol. L’excrétion biliaire des conjugués paracétamol-glucuronides
(APAP-glucuronide) et sulfates (APAP-sulfate) est dépendante des transporteurs MRP2
(Multidrug resistance-associated protein 2) et BCRP (Breast cancer resistance protein)
localisés au pôle apical des hépatocytes. L’excrétion biliaire du NAPQI-GSH requiert
également MRP2. L’excrétion basolatérale vers les sinusoïdes sanguins dépend plutôt de
MRP3 pour le paracétamol-glucuronide et de MRP2 / MRP4 pour le paracétamol-sulfate.
Une autre voie métabolique, en partie responsable de l’activité analgésique, est la formation
dans le cerveau du N-arachidonoylphénolamine (AM404). Après désacétylation hépatique
du paracétamol en p-aminophénol, ce dernier est conjugué à un acide arachidonique par la
fatty acid amide hydroxylase (FAAH) pour former l’AM404.

61
1. Les réactions de phase 1 et les cytochromes P450

Les réactions de phase 1 impliquent la biotransformation d’une molécule en un


métabolite polaire qui peut être éliminé directement, ou poursuivre les processus de
métabolisation par la phase 2. Il s’agit de réaction d’oxydation, de réduction, ou d’hydrolyse
impliquant majoritairement les CYPs, enzymes exprimées principalement dans le réticulum
endoplasmique mais également localisées au niveau mitochondrial (Bansal et al., 2013;
Matsuura et al., 1978; Robin et al., 2001). Les réactions catalysées par les CYPs consomment
du NADPH ainsi que de l’oxygène moléculaire.

RH + O2 +H+ + NADPH → ROH + H2O + NADP+

Au cours du métabolisme du paracétamol, les CYPs oxydent le médicament et forme


le NAPQI, qui est responsable de la toxicité hépatique (Dahlin et al., 1984; Gillette, 1981;
Potter and Hinson, 1987). Les principaux CYPs impliqués sont les CYP2E1 et le CYP3A4, mais
d’autres CYPs pourraient également être impliqués, tels que le CYP1A2 et 2D6 (Patten et al.,
1993; Raucy et al., 1989; Thummel et al., 1993; Wolf et al., 2007; Zaher et al., 1998).

2. Les réactions de conjugaison

Les réactions de conjugaison, ou réactions de phase 2, ont pour but de neutraliser les
groupements réactifs (thiol, amine, aldéhyde) d’une molécule ou de son métabolite, issus
d’une réaction de phase 1) et de rendre cette molécule plus hydrophile et donc facilement
éliminable par les liquides biologiques. Ces réactions sont catalysées par des enzymes de
phase 2 qui transfèrent un groupement polaire d’origine endogène sur un groupement
fonctionnel du xénobiotique, du substrat endogène ou de son métabolite. Les groupements
de conjugaison peuvent être des substrats hydrophiles (acide glucuronique, sulfurique ou
acétique), des acides aminés (glutamine, glycocolle), ou d’autres substrats tels que le
glutathion (GSH) ou la carnitine. Ces réactions sont catalysées par différentes transférases.

62
Le métabolisme du paracétamol fait intervenir trois types de conjugaison : la
glucuronoconjugaison, la sulfoconjugaison et la conjugaison au glutathion.

• La glucuronoconjugaison

La glucuronoconjugaison consiste en l’ajout d’un acide glucuronique, provenant de


l’acide uridine-5’-diphosphoglucuronique (UDPGA) à un groupement hydroxyle, carboxyle ou
amine d’une molécule cible. Ces réactions sont catalysées par des UDP-
glucuronosyltransférases (UGTs), protéines microsomales transmembranaires
principalement exprimées dans le foie, mais également dans les reins, la muqueuse
intestinale, la peau et les poumons (Buckley and Klaassen, 2007; Tukey and Strassburg,
2000). Les UGTs appartiennent à la superfamille des UDP-glycosyltransférases. Il existe une
vingtaines d’UGTs fonctionnelles chez l’Homme, subdivisées en quatre familles (UGT1, UGT2,
UGT3 et UGT8) (Mackenzie et al., 2005).

Dans le cas du paracétamol, la glucuronoconjugaison représente la voie majeure de


biotransformation chez l’adulte tandis que la sulfoconjugaison prédomine dans les
premières années de la vie (Van der Marel et al., 2003). Trois UGTs sont principalement
impliquées dans l’ajout d’une molécule de D-glucuronate sur le groupement hydroxyle du
paracétamol, pour former un ester-O-glucuronide : UGT1A6 qui a une forte affinité pour le
paracétamol (Km=2 mM) mais une faible capacité enzymatique, UGT1A9 qui, malgré sa
faible affinité pour la molécule (Km=50 mM), présente une forte capacité enzymatique, et
UGT1A1 qui possède une affinité (Km=9 mM) et une capacité enzymatique intermédiaires
(Court et al., 2001).

L’expression des UGTs peut être régulée selon différents facteurs : le sexe, le poids
et/le statut nutritionnel, l’exposition à des polluants environnementaux ou à des
médicaments. Certains de ces facteurs seront discutés plus en détail ci-dessous.

En ce qui concerne les xénobiotiques, l’expression de l’UGT1A6 est par exemple


augmentée via l’activation du récepteur AhR (Aryl hydrocarbon Receptor) chez les gros

63
fumeurs mais également via l’activation des facteurs de transcription CAR (Constitutive
Androstane Receptor) et PXR (Pregnane X Receptor) chez des patients traités par des
inducteurs enzymatiques de type phénobarbital, phénytoïne ou rifampicine (Bock and Bock-
Hennig, 2010).

Concernant le statut nutritionnel, il a été montré par exemple qu’un régime


hypercalorique, associé à une accumulation de triglycérides hépatiques et une augmentation
du poids corporel, induit l’expression des UGT1A1, 1A6 et 1A7 chez des rats mâles (Osabe et
al., 2008). Ce régime est également responsable d’une production accrue de conjugués
glucuronidés dans le plasma après un traitement au paracétamol chez ces mêmes rats
(Osabe et al., 2008). Des résultats similaires ont été mis en évidence sur des rongeurs
présentant une obésité d’origine génétique, comme par exemple les souris ob/ob (Aubert et
al., 2012; Xu et al., 2012) et les rats Zucker (Chaudhary et al., 1993). Chez l’Homme, la
glucuronoconjugaison du paracétamol semble également augmentée chez les patients
obèses et chez ceux présentant une stéatohépatopathie non alcoolique (Abernethy et al.,
1982; Barshop et al., 2011). Cependant, une étude plus récente menée chez des patients
présentant une stéatohépatopathie liée à l’obésité ne montre pas d’augmentation de la
glucuronidation du paracétamol, malgré une expression plus forte de certaines isoformes
d’UGTs au niveau hépatique (Hardwick et al., 2013).

• La sulfoconjugaison

Le transfert d’un groupement sulfate du « donneur » 3’-phosphoadénosine-


5’phosphosulfate (PAPS) à un «accepteur » par une sulfotransférase (SULT) représente la
réaction de sulfoconjugaison. Les SULTs sont retrouvées principalement au niveau du foie,
mais également dans les reins, les intestins et les poumons (Riches et al., 2009). Treize
isoformes cytosoliques des SULTs sont connues chez l’Homme, organisées en 4 familles
(Lindsay et al., 2008). Contrairement à la glucuronidation, cette voie est rapidement
saturable de par l’activité des SULTs ainsi que la disponibilité du PAPS, co-substrat de la
réaction (Boles and Klaassen, 2000).

64
Chez l’Homme, la sulfatation du paracétamol sur le groupement hydroxyle est
principalement due à SULT1A1, SULT1A3/4, SULT1E1 et SULT2A1 avec un Km de 2,4 mM, 1,5
mM, 1,9 mM et 3,7 mM, respectivement (Adjei et al., 2008).

Des polymorphismes génétiques du gène SULT1A1 chez l’Homme définissent 3


allèles (SULT1A1*1, SULT1A1*2 et SULT1A1*3). Leur fréquence diffère selon les
populations : le variant *1 est prédominant chez les orientaux (Chinois et Japonais), alors
que le variant *3 est majoritaire dans la population afro-américaine. Le variant *2, associé à
une plus faible activité enzymatique, est exprimé de manière équivalente au sein des
populations caucasiennes et afro-américaines (Coughtrie, 2002).

Actuellement, l’influence de l’obésité et des stéatohépatopathies associées sur la


sulfatation du paracétamol n’est pas clairement déterminée. En effet, les investigations chez
le rongeur et l’Homme ont données des résultats très contradictoires (Aubert et al., 2012;
Chaudhary et al., 1993; Corcoran et al., 1987; Hardwick et al., 2013).

• La conjugaison au glutathion

Le glutathion est un antioxydant endogène intervenant dans de nombreuses


réactions de détoxification et d’élimination d’espèces réactives de l’oxygène (ERO). Il joue un
rôle majeur dans le métabolisme du paracétamol car il permet la détoxification du NAPQI
(Mitchell et al., 1973). La réaction de conjugaison de ce métabolite réactif au groupement
thiol de la cystéine du glutathion, qui génère le 3-(glutathion-S-yl)paracétamol, est soit
spontanée soit catalysée par les glutathion-S-transférases (GSTs) (Coles et al., 1988; Dahlin
et al., 1984). Il est à noter que cette conjugaison du NAPQI au glutathion est très rapide,
mais également très limitée car les stocks cellulaires de glutathion sont vite saturables.
Différentes situations physiopathologiques peuvent réduire significativement les
concentrations basales de glutathion dans le foie telles que la malnutrition, le jeûne
prolongé et l’intoxication alcoolique chronique. En conséquence, ces situations favorisent
grandement l’hépatotoxicité du paracétamol (Bonkovsky et al. , 1994; Lauterburg and Velez,
1988; Wendel et al., 1979; Zhao et al., 2002).

65
Certaines études ont montré que les stéatohépatopathies liées à l’obésité peuvent
être également associées à une réduction des taux intra-hépatiques de glutathion, surtout
lorsque cette pathologie est au stade de la NASH (Begriche et al., 2013; Videla et al., 2004).
Cependant, au cours de la NASH, il semble que la déplétion en glutathion soit moins sévère
comparée aux autres situations physiopathologiques citées plus haut.

3. Le métabolisme de phase 3

Les conjugués du paracétamol résultant de la phase 1 et 2 du métabolisme sont


excrétés des hépatocytes via des transporteurs. L’excrétion biliaire des conjugués
paracétamol-glucuronide ainsi que des conjugués sulfates est dépendante des transporteurs
MRP2 (Multidrug Resistance-associated Protein 2) et BCRP (Breast Cancer Resistance
Protein) localisés au pôle apical des hépatocytes. L’excrétion biliaire du paracétamol-GSH
requiert également MRP2. L’excrétion basolatérale vers les sinusoïdes sanguins dépend
plutôt de MRP3 pour le paracétamol-glucuronide et de MRP2 / MRP4 pour le paracétamol-
sulfate.

Lors de la NASH, l’expression de ces transporteurs peut être modifiée (Cheng et al.,
2008; Halilbasic, Claudel and Trauner, 2013; Pizarro et al., 2004). Ainsi, l’élimination des
conjugués du paracétamol par la bile et les urines peut être altérée lors de la NASH. En effet,
Lickteig en 2007 a démontré qu’une NASH chez le rat était associée à une augmentation de
l’expression de MRP3, MRP4 et BCRP (ARNm et protéines) et à une diminution de l’excrétion
biliaire du paracétamol-glucuronide, du paracétamol-sulfate et du paracétamol-GSH
(Lickteig et al., 2007). Plus récemment chez l’Homme, Canet et coll. (2015) ont également
montré chez des patients souffrant de NASH sévère une induction hépatique de MRP3 et
une altération de la localisation intra-hépatocytaire de MRP2. De façon intéressante,
l’augmentation de l’expression de MRP3 pourrait expliquer, au moins en partie, pourquoi les
concentrations plasmatiques de paracétamol-glucuronide sont augmentées dans le contexte
d’une NAFLD (Barshop et al., 2011; Canet et al., 2015). Une autre explication pourrait être
également une augmentation de l’expression hépatique des UDP-glucuronosyltransférases,
comme indiqué précédemment (Osabe et al., 2008).
66
C. Toxicité hépatique du paracétamol

L’intoxication aiguë au paracétamol, qu’elle soit volontaire ou non, est actuellement


la première cause d’insuffisance hépatique aiguë aux Etats-Unis, au Royaume-Uni, en Suède
et dans de nombreux autres pays (Bernal et al., 2010; Larson et al., 2005; Megarbane et al.,
2007; Ostapowicz et al., 2002; Shi et al., 2011). Les premiers cas d’hépatotoxicité liés au
paracétamol ont été rapportés en 1966 (Davidson and Eastham, 1966; Thomson and
Prescott, 1966). Quelques années plus tard, le groupe de recherche dirigé par Bernard B.
Brodie s’est intéressé aux lésions induites par de fortes doses de paracétamol chez les
rongeurs ainsi qu’aux mécanismes de toxicité impliqués. Leurs travaux ont mis en évidence
différents évènements tels que la formation de plages de nécrose centrolobulaire, la
bioactivation du paracétamol par des enzymes microsomales, la formation d’un métabolite
réactif (le NAPQI) et la corrélation entre la quantité d’adduits NAPQI-protéines et le
développement d’une toxicité (Jollow et al., 1973; Mitchell et al., 1973; Potter et al., 1973).
Ces travaux ont également identifié le rôle critique du glutathion (GSH) dans la détoxification
de NAPQI (Mitchell et al.,1973).

La toxicité hépatique du paracétamol est caractérisée par une nécrose


centrolobulaire accompagnée d’une hypoxie liée à la congestion des vaisseaux hépatiques
(Walker et al, 1983) , et l’étendue de la nécrose est proportionnelle à la dose administrée
(Lee, 2003). Dans les cas extrêmes, lorsque la nécrose touche une trop grande quantité de
parenchyme hépatique, l’intoxication au paracétamol peut conduire à une hépatite
fulminante et engager le pronostic vital.

Le processus de toxicité du paracétamol conduisant à la nécrose hépatocytaire peut


être divisé en 3 phases : la phase d’initiation, la phase d’amplification et de propagation des
lésions, et la phase de réparation et de régénération tissulaire.

67
1. La phase d’initiation

L’évènement majeur à l’origine de la mort de l’hépatocyte est la bioactivation du


paracétamol en NAPQI par les CYPs, en particulier par le CYP2E1 et le CYP3A4 (Dahlin et al.,
1984; Gonzalez, 2007; Laine et al., 2009). Ainsi, tout composé capable d’induire ces 2 CYPs
favorise les lésions hépatiques dues au paracétamol, comme c’est le cas par exemple avec
l’éthanol qui induit le CYP2E1 (Wolf et al., 2007). A l’inverse, l’inhibition de ces enzymes, par
le diméthylsulfoxide (DMSO), le disulfiram ou le chlorméthiazole par exemple, protège de la
toxicité du paracétamol (Hazai et al., 2002; Lee et al., 1999; Park et al., 1988; Yoon et al.,
2006).

• Le NAPQI

La bioactivation hépatique du paracétamol par les CYPs conduit à la formation d’un


métabolite très réactif, le N-acétyl-p-benzoquinone-imine (NAPQI). Cet électrophile instable
est rapidement détoxifié par sa conjugaison au glutathion (GSH), comme précisé
précédemment (Mitchell et al., 1973; Rosen et al., 1984). Lors de la prise d’une forte dose de
paracétamol, ou au cours de situations physiopathologiques particulières, la production de
NAPQI peut excéder la capacité de conjugaison au glutathion. Ce dernier ne se restaurant
pas aussi rapidement qu’il est consommé, subit une déplétion rapide pouvant atteindre 90%.
De par son caractère électrophile et sa forte instabilité, le NAPQI se lie alors à d’autres
éléments nucléophiles de la cellule, tels que les bases puriques et pyrimidiques de l’ADN ou
les groupements thiols des protéines, formant ainsi différents adduits stables (Corcoran et
al., 1985; Jollow et al., 1973; Mitchell et al., 1973; Rogers et al., 1997; Streeter et al., 1984).

• Les adduits NAPQI-protéines

Les adduits NAPQI-protéines sont mesurables par des techniques telles que l’HPLC-
ECD (High-Performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection). Leur
concentration intra-hépatique est maximale environ 2 à 3 heures après l’intoxication au
paracétamol (Muldrew et al., 2002). De façon intéressante, il semblerait que ce ne soit pas la
déplétion en glutathion en elle-même qui soit responsable de la toxicité du paracétamol,

68
mais bien les liaisons covalentes du NAPQI aux protéines cellulaires. En effet, un traitement
au diéthymaléate (DEM) entraîne rapidement une déplétion du glutathion intra-hépatique
chez la souris semblable à celle obtenue avec le paracétamol, mais sans induire de nécrose
hépatocytaire (Mitchell et al., 1973). En revanche, l’administration de DEM 30 minutes avant
une forte dose de paracétamol (375 mg/kg) potentialise la formation d’adduits aux protéines
et la nécrose hépatocytaire. Enfin, la quantité d’adduits mesurées 2 heures après une
intoxication au paracétamol est corrélée chez la souris avec la sévérité de la nécrose
observée (Jollow et al., 1973).

Plusieurs protéines cibles du NAPQI ont été identifiées par des techniques
immunochimiques (Cohen et al., 1997), ou grâce au développement de la protéomique
(Hinson et al., 1996; Qiu et al. , 1998; Stamper bet al., 2011). Le NAPQI se fixe notamment
sur des protéines mitochondriales telles que la glutamate déshydrogénase (Halmes et al.,
1996), l’aldéhyde déshydrogénase, la carbamyl-phosphate synthétase-I et la sous-unité
alpha de l’ATP synthétase (Cohen et al., 1997; Myers et al., 1995; Nelson et al., 1991; Qiu et
al., 2001; Tirmenstein and Nelson, 1989). L’inactivation de certaines de ces enzymes par le
NAPQI est probablement à l’origine de l’inhibition de l’activité de la chaine respiratoire
mitochondriale (Burcham and Harman, 1991; Donnelly et al., 1994).

• La péroxidation lipidique

Malgré de nombreux arguments en faveur du rôle initiateur des adduits aux


protéines dans la cytotoxicité du paracétamol (Jaeschke et al., 2011a), cette hypothèse a été
contestée par certains chercheurs, en particulier du fait du manque de dose-réponse.
D’autres explications mécanistiques ont donc été recherchées (Jørgensen et al., 1988). Par
exemple, Wendel et ses collaborateurs ont observé chez des souris intoxiquées au
paracétamol une péroxydation lipidique massive, qui semble liée à la formation accrue
d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) dans le foie des animaux traités (Wendel and
Feuerstein, 1981; Wendel et al., 1982; Wendel et al., 1979). Les auteurs émettent
l’hypothèse que cette péroxydation lipidique est à l’origine de la toxicité hépatique du
paracétamol. Cependant, il est à noter que ces auteurs ont nourri les animaux avec un

69
régime déficient en vitamine E et riche en acides gras polyinsaturés, ce qui les a
probablement rendus particulièrement susceptibles à la péroxydation lipidique. De plus, des
souris nourries avec un régime standard ne développent que très peu de péroxydation
lipidique après un traitement au paracétamol (Jaeschke at al., 2003), et la vitamine E ne
protège pas in vitro les cellules hépatiques vis-à-vis de sa cytotoxicité (Knight et al., 2003).
Ainsi, dans les conditions classiques d’investigations expérimentales, le rôle de la
péroxydation lipidique reste incertain dans la toxicité hépatique du paracétamol.

70
2. La phase d’amplification et de propagation des lésions

Comme mentionné précédemment, les protéines mitochondriales sont des cibles


privilégiées du NAPQI (Bulera et al., 1996; Cheng et al., 2008; Cohen et al., 1997; Jollow et
al., 1973; Pumford et al. , 1990; Qiu et al., 1998). La mitochondrie semble donc jouer un rôle
important dans le processus d’amplification et de propagation des lésions induites par le
paracétamol.

• Les lésions mitochondriales

Des examens au microscope électronique de foie de souris traitées au paracétamol


(600mg/kg) indiquent des altérations de la morphologie mitochondriale survenant
seulement quelques heures après administration (Placke et al., 1987).

La dysfonction mitochondriale observée au cours d’une intoxication au paracétamol


associe plusieurs évènements intervenant en 3 étapes :

Etape 1 : Initiation des lésions mitochondriales et augmentation de la production d’ERO

Cette première étape est la conséquence directe de la bioactivation du paracétamol


en NAPQI. Ce métabolite entraine une déplétion des stocks de glutathion dans le cytosol,
mais également au niveau mitochondrial (Cover et al., 2005; Knight et al. , 2001;
Ramachandran et al., 2011). A dose toxique, les adduits NAPQI-protéines ainsi que la
déplétion en glutathion mitochondrial entraînent une inhibition de la chaine respiratoire
mitochondriale (Burcham and Harman, 1991; Donnelly et al., 1994) et favorisent la
production d’ERO par la mitochondrie (Hanawa et al., 2008). En effet, comme le glutathion
est un cofacteur essentiel à la GSH-peroxydase qui détoxifie le peroxyde d’hydrogène (H2O2)
en eau dans la matrice mitochondriale (Han et al., 2003), sa déplétion favorise
l’accumulation mitochondriale d’ERO.

Les ERO ont une action directe sur la mitochondrie. Par exemple, l’anion superoxyde
(O2˙-) réagit rapidement avec l’oxyde d’azote (NO) pour former l’anion peroxynitrite

71
(ONOO˙-) (Cover et al., 2005; Hinson et al., 1998), qui est capable d’inhiber la chaîne
respiratoire (Schöpfer et al., 2000). Il est important de noter que l’inhibition de la chaîne
respiratoire, qu’elle soit directe via le NAPQI ou indirecte par les ERO, est capable
d’entrainer elle-même une production plus importante d’ERO par certains constituants de
cette chaîne, notamment par les complexes I et III (Begriche et al., 2011). L’anion
peroxynitrite peut également endommager d’autres composants mitochondriaux tels que
les membranes, des protéines anti-oxydantes comme la superoxyde dismutase à manganèse
(MnSOD) (Agarwal et al., 2011) et l’ADN mitochondrial (ADNmt) (Cover et al., 2005; J A
Hinson et al., 1998) (Fig. 12).

Il est important de savoir que l’ADNmt, codant pour 13 protéines de la chaîne


respiratoire mitochondriale, est plus fragile que l’ADN nucléaire. En effet, fixé à la
membrane interne, ce petit fragment d’ADN est très proche des sites de production d’ERO
(complexe I et III), et dépourvu d’histones protectrices. Cet ADN ne possède quasiment que
des séquences codantes et son système de réparation est moins efficace que celui de l’ADN
nucléaire (Begriche et al., 2006; Begriche et al., 2011). Cependant le rôle des altérations de
l’ADNmt dans la physiopathologie de l’hépatotoxicité du paracétamol reste encore incertain.

72
Figure 12: Lésions mitochondriales et stress oxydant induits par le NAPQI. La déplétion
cytosolique et mitochondriale en glutathion (GSH) ainsi que l’inhibition de la chaine
respiratoire par la formation d’adduits NAPQI-protéines entraine à l’accumulation d’ERO
responsable d’un stress oxydant mitochondrial.

Etape 2 : Activation des voies cytosoliques de stress, en particulier la voie de la c-jun-N-


terminal kinase (JNK) par la génération d’ERO

Le stress oxydant généré dans la mitochondrie par la production d’ERO est capable
d’activer des voies de signalisation de stress cellulaire. C’est notamment le cas de la voie JNK
(c-Jun-N-terminal), avec un pic d’activation qui se situe environ deux heures après
l’intoxication au paracétamol (Gunawan et al., 2006; Hanawa et al., 2008; Xie et al., 2014a).
Cette activation de JNK pourrait se faire par l’intermédiaire de la kinase ASK-1 (Apoptosis
Signal-regulating Kinase 1). De plus, les ERO produites par les mitochondries semblent
activer plus précocement la GSK3β (Glycogen Synthase Kinase 3β), une kinase capable
d’initier également l’activation de JNK. Ainsi, les ERO mitochondriales pourraient activer JNK
via deux voies de signalisation : ASK-1 et GSK3β (Fig. 13) (Shinohara et al., 2010).

73
JNK est un membre de la superfamille des MAP kinases (Mitogen Activated Protein
kinase). La forme phosphorylée active de JNK peut participer à de nombreux évènements
cellulaires via la phosphorylation de facteurs de transcription tels que c-jun, p53 et ATF-2 et
celle de protéines de la famille Bcl-2 (Cheng et al., 2003; Hayakawa et al., 2004; Hibi et al.,
1993; Johnson and Nakamura, 2007; Latchoumycandane et al., 2007). JNK possède trois
isoformes : JNK1 et JNK2 exprimés de manière ubiquitaire, et JNK3 principalement exprimée
dans les neurones du système nerveux central (Sabapathy et al., 2004).

Certains travaux semblent indiquer que JNK1 et JNK2 jouent un rôle important dans
la toxicité du paracétamol. En effet, l’inhibition ou l’absence de ces deux kinases protège in
vivo de cette toxicité, sans interférer avec la bioactivation du médicament et la déplétion en
GSH (Gunawan et al., 2006; Hanawa et al., 2008; Henderson et al., 2007; Latchoumycandane
et al., 2007; Saito et al., 2010a). Cependant, l’inhibition sélective d’une seule de ces
enzymes, JNK1 ou JNK2, n’entraîne pas de protection (Bourdi et al., 2008; Saito et al.,
2010a). Au contraire, Bourdi et son équipe montrent que des souris déficientes pour JNK2
sont plus sensibles à la toxicité tardive du paracétamol (Bourdi et al., 2008). En effet, après
une dose de 300 mg/kg de paracétamol, 90% des souris KO pour le gène de JNK2 meurent
dans les 48 heures, contre 20% pour leurs homologues sauvages. Ces résultats suggèrent le
rôle bénéfique de JNK2 dans la réparation tissulaire après intoxication.

Malgré ces données, certaines investigations ne semblent pas être en faveur d’un
rôle majeur de l’activation de JNK dans certains modèles expérimentaux. Par exemple, une
étude récente chez des souris obèses ou wild-type montre que l’activation de JNK1/2 n’est
pas corrélée à la sévérité de la cytolyse hépatique (Aubert et al., 2012). En effet, 8 heures
après l’intoxication au paracétamol (500 mg/kg) l’expression de phospho-JNK1/2 était très
supérieure chez les souris ob/ob par rapport aux souris db/db et wild-type alors que la
cytolyse était significativement supérieure chez les souris db/db par rapport aux autres
groupes de souris (Aubert et al., 2012).

74
Etape 3 : Perméabilité mitochondriale et mort de l’hépatocyte

- Activation de BAX et relocalisation mitochondriale

Lorsque JNK est activé, il est capable de phosphoryler différentes protéines de la


famille Bcl-2, entraînant par exemple une inhibition des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et
Bcl-XL (B-cell Lymphoma-extra Large), ainsi que l’activation de la protéine pro-apoptotique
Bax (Bcl-2-Associated X protein) (Kharbanda et al., 2000; Saito et al., 2010a). Des études in
vivo chez des souris intoxiquées au paracétamol ont mis en évidence une relocalisation de
Bax du cytosol à la mitochondrie hépatique dès la première heure suivant l’administration
du médicament (Saito et al., 2010a). Bax, seul ou associé à Bad et à la forme tronquée de Bid
(tBid), est capable de former des pores dans la membrane externe de la mitochondrie (Chao
and Korsmeyer, 1998). La formation de ces pores facilite la libération précoce dans le cytosol
de protéines localisées dans l’espace inter-membranaire mitochondrial, telles que le
cytochrome c, SMAC (Second Mitochondrial Activator of Caspases), l’endonucléase G et AIF
(Apoptosis-Inducing Factor) (Adams et al., 2001; Bajt et al., 2008; El-Hassan et al., 2003;
Jaeschke and Bajt, 2006). La libération de ces protéines dans le cytosol joue un rôle dans la
survenue de la mort cellulaire. Par exemple, AIF et l’endonucléase G peuvent migrer au
noyau et participer à la fragmentation de l’ADN nucléaire (Fig.13) (Bajt et al., 2006; Bajt et
al., 2008; Jaeschke and Bajt, 2006; Kon et al., 2004; Ramachandran et al., 2011).

- Relocalisation mitochondriale de GSK3β et de phospho-JNK

Mise à part Bax, d’autres protéines peuvent subir un transfert du cytosol vers les
mitochondries, favorisant ainsi la mort cellulaire. Par exemple, la relocalisation
mitochondriale de GSK3β favoriserait le dégradation de Mcl-1 (induced Myeloid Leukemia
cell differentiation protein), une protéine anti-apoptotique de la membrane mitochondriale
(Shinohara et al., 2010). Phospho-JNK peut également se relocaliser dans la mitochondrie et
engendrer à son tour un stress oxydant par la formation d’ERO et de peroxynitrite (Hanawa
et al., 2008; Saito et al., 2010a). Le mécanisme impliqué est incertain mais il semblerait que
la liaison avec Sab, une protéine située dans la membrane externe des mitochondries, soit
nécessaire pour que phospho-JNK puisse induire la production d’ERO (Win et al., 2011).

75
Ainsi, l’intoxication au paracétamol entraîne dans la mitochondrie une dégradation ou
l’inactivation des facteurs anti-apoptotiques Mcl-2, Bcl-XL et Bcl-2, et une augmentation des
protéines pro-apoptotiques Bax (Fig. 13).

- Ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (PTPM)

L’augmentation de la production d’ERO et de peroxynitrite conduit à l’ouverture du


PTPM et à un découplage de la phosphorylation oxydative (Fig.13) (Jaeschke et al., 2012a).
En effet, les protons présents dans l’espace inter-membranaire peuvent entrer librement
dans la matrice mitochondriale sans transiter par le complexe de l’ATP synthase (ou
complexe V de la chaîne respiratoire). Ce découplage de la phosphorylation oxydative,
associé à la chute du potentiel de membrane, provoque l’arrêt de la synthèse d’ATP qui
concourt à la mort hépatocytaire par nécrose (Kon et al., 2004a; Masubuchi et al., 2005;
Ramachandran et al., 2011).

L’ouverture du PTPM provoque également un déséquilibre osmotique entre le


cytosol et la matrice mitochondriale, entraînant une entrée d’eau massive dans la
mitochondrie. Ceci a pour conséquence une augmentation du volume de la matrice
mitochondriale, un déploiement de la membrane interne et à la rupture de la membrane
externe de la mitochondrie. Cette rupture membranaire favorise non seulement la libération
de protéines pro-apoptotiques localisées dans l’espace inter-membranaire, telles que le
cytochrome c, mais également la sortie de calcium mitochondrial. Il s’ensuit alors une
augmentation de la concentration calcique cytosolique, provoquant l’activation de protéases
et d’endonucléases (Burcham and Harman, 1988; Donnelly et al., 1994; Nelson, 1990; Ray et
al., 1993; Salas and Corcoran, 1997; Tirmenstein and Nelson, 1989).

Des investigations in vivo chez la souris, et in vitro sur des mitochondries de foie de
rat, ont montré que le paracétamol induisait l’ouverture du PTPM et une libération de
calcium mitochondrial (Masubuchi et al., 2005; Moore et al., 1985; Weis et al., 1992). De
plus, des études ont montré que la toxicité du paracétamol pouvait être bloquée grâce à la
cyclosporine A, un inhibiteur de l’ouverture du PTPM. En effet, des souris prétraitées à la

76
cyclosporine A présentent une moindre augmentation des transaminases, malgré la
présence d’une déplétion en GSH, suggérant que cette molécule protectrice n’agit pas sur
l’activation métabolique du paracétamol (Beales and McLean, 1996; Haouzi et al., 2002;
Masubuchi et al., 2005). Ainsi, l’ouverture du PTPM semble être un évènement majeur
impliqué dans la physiopathologie de la toxicité hépatique induite par le paracétamol (Kon et
al., 2004a; Masubuchi et al., 2005; Reid et al., 2005). Cependant, il est important de noter
que certaines investigations in vitro montrant une ouverture du PTPM par le paracétamol
ont été réalisées en présence de calcium (Masubuchi et al., 2005), un activateur puissant du
PTPM. En revanche, en absence de calcium, ce médicament est incapable d’induire
l’ouverture du PTPM et la libération mitochondriale du cytochrome c (Porceddu et al., 2012).

Figure 13: Activation de la voie de la c-jun-N-terminal kinase (JNK) par les ERO suite à une
intoxication au paracétamol. Le stress oxydant mitochondrial favorise l’activation de JNK via
ASK-1 et GSK3β, l’ouverture du pore de transition de perméabilité, la dégradation de l’ADN
nucléaire et mitochondrial. Ces évènements conduisent à la mort de l’hépatocyte par
nécrose.

77
• La nécrose et l’apoptose dan l’hépatotoxicité du paracétamol

Le type de mort cellulaire après intoxication au paracétamol a fait l’objet de


controverses. En effet, l’intoxication au paracétamol implique certaines caractéristiques de
l’apoptose, comme la translocation mitochondriale des protéines pro-apoptotiques Bax et
Bid (Adams et al., 2001; Bajt et al., 2008; El-Hassan et al., 2003; Jaeschke and Bajt, 2006), la
libération mitochondriale du cytochrome c (Adams et al., 2001; El-Hassan et al., 2003; Knight
and Jaeschke, 2002), l’activation de JNK (Gunawan et al., 2006; Henderson et al., 2007), la
fragmentation de l’ADN en « ladder » (Cover et al., 2005; Ray et al., 1990; Shen et al., 1991),
et la positivité des noyaux par la technique TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-
mediated bio-dUTP Nick-End Labelling) (Gujral et al., 2002; Lawson et al., 1999). Pour ces
raisons, certains auteurs ont conclu que l’intoxication au paracétamol entraînait une mort
cellulaire par apoptose (El-Hassan et al., 2003; Hu and Colletti, 2010).

Cependant, les évènements cités ci-dessus (translocation de Bax, libération du


cytochrome c, positivité du TUNEL) ne sont pas spécifiques de l’apoptose. De plus, l’examen
anatomopathologique de foies de souris intoxiquées au paracétamol ne montre pas
d’altérations morphologiques des hépatocytes en faveur de l’apoptose : compaction de la
chromatine sous la membrane nucléaire, condensation du cytoplasme et fragmentation
cellulaire en corps apoptotiques (Fig. 14). Au contraire, les lésions cellulaires induites par le
paracétamol sont typiques de la nécrose : gonflement des cellules avec rupture de la
membrane plasmique, dégradation du noyau (caryorrhexie et caryolyse), réponse
inflammatoire (Gujral et al., 2002; Jaeschke and Lemasters, 2003) (Fig. 14). Enfin, plusieurs
études montrent qu’il n’y a pas d’activation significative des caspases, notamment la caspase
3, après intoxication au paracétamol, et que les inhibiteurs de caspases n’ont absolument
aucun effet protecteur vis-à-vis de sa toxicité (Gujral et al., 2002; Jaeschke and Bajt, 2006;
Jaeschke et al., 2011b; Lawson et al., 1999).

Il est à noter toutefois que d’autres études suggèrent le rôle significatif des caspases.
Par exemple, des investigations in vivo montrent un effet protecteur des inhibiteurs de
caspases, lorsqu’ils sont utilisés en préventif (El-Hassan et al., 2003; Hu and Colletti, 2010).
78
Cependant, ces molécules ont été dissoutes dans le DMSO, qui est lui-même un puissant
inhibiteur de l’activité enzymatique des CYPs ( Park et al., 1988), ainsi qu’un inhibiteur de la
libération de AIF dans le cytosol (Saito et al., 2010a). Même si les doses de DMSO utilisées
sont faibles, elles semblent suffisantes pour protéger entièrement de la toxicité du
paracétamol (Jaeschke et al., 2006; Jaeschke et al., 2011; Schulze-Osthoff and Bantel, 2011).
D’autres études montrent une activation de la caspase 3 après une forte dose de
paracétamol chez certaines souris non consanguines CD-1 ou Swiss Webster et non soumises
au jeûne (Antoine et al., 2009; Antoine et al., 2010; Williams et al., 2011). Malgré cette
activation, la proportion de cellules apoptotiques ne dépasse pas 0,5% des cellules
hépatiques totales alors que les auteurs observent environ 50% de cellules nécrotiques
(Williams et al., 2011). Ainsi, les cellules nécrotiques restent proportionnellement beaucoup
plus importantes suite à une intoxication au paracétamol.

Figure 14: Différences morphologiques entre la mort cellulaire par apoptose et par nécrose
observées après coloration à l’hématoxyline-éosine de coupes de foie de souris. Ces
dernières ont été traitées soit par un mélange galactosamine-endotoxine (à gauche), connu
pour entraîner une apoptose hépatocytaire, soit par 300 mg/kg de paracétamol pendant 6
heures (à droite). L’apoptose hépatocellulaire est caractérisée par la compaction de la
chromatine sous la membrane nucléaire, la condensation du cytoplasme et la fragmentation
de l’ADN. La nécrose est caractérisée par le gonflement des cellules avec rupture de la
membrane plasmique et dégradation du noyau. Objectif X400 (Jaeschke et al., 2011a).

79
3. Régénération et réparation tissulaire

La réparation et les capacités de régénération du foie jouent un rôle capital dans le


pronostic vital à la suite d’une intoxication au paracétamol. En effet, le foie présente une
capacité de régénération remarquable, même lorsqu’une quantité importante de
parenchyme hépatique a été détruite ou réséquée. Néanmoins cette régénération est un
processus complexe faisant intervenir la prolifération des hépatocytes, la régénération de la
matrice extracellulaire et l’angiogenèse afin de restaurer l’ensemble de la structure et des
fonctions du foie (Mehendale, 2005).

• Prolifération cellulaire

La prolifération cellulaire à la suite d’une intoxication au paracétamol s’effectue dans


la zone de transition entre les cellules nécrosées (principalement dans la zone
centrolobulaire) et les cellules saines. Des hépatocytes quiescents entre en phase G1 du
cycle cellulaire (Bajt et al., 2003) sous l’action de différents médiateurs tels que l’IL-6
(Interleukine-6) et le TNFα, mais également de facteurs de croissance comme le VEGF
(Vascular Endothelial Growth Factor) (Chiu et al., 2003; Donahower et al., 2006; James et al.,
2003; Kato et al., 2011).

Des souris KO pour IL6, p55 (récepteur de type 1 du TNFα) ou VEGFR- (récepteur de
type 1 du VEGF) présentent une réponse régénérative altérée après un surdosage au
paracétamol (Chiu et al., 2003; James et al., 2003; T. Kato et al., 2011). Cependant, un
prétraitement des animaux à l’IL-6 ne protège pas vis-à-vis de la toxicité du paracétamol
(Bajt et al., 2003). En revanche, un traitement par une faible dose de thioacétamide, qui
force l’entrée des hépatocytes dans le cycle cellulaire, atténue les lésions induites par une
forte dose de paracétamol (Chanda et al., 1995). L’activation du cycle cellulaire et de la
régénération tissulaire sont donc des évènements importants après intoxication au
paracétamol.

80
• Rôle de l’immunité innée dans la régénération tissulaire

A la suite d’une intoxication au paracétamol, de nombreuses molécules et


composants cellulaires sont libérés des cellules nécrosées tels que les protéines HMGB1
(High-Mobility Group Box 1), des HSPs (Heat Chock Proteins) ou des fragments d’ADN
(Antoine et al., 2009; Jahr et al., 2001; Martin-Murphy et al., 2010). Ces différents
composants peuvent activer les TLRs (Toll-Like Receptors) situés à la surface des
macrophages ainsi que sur d’autres cellules non parenchymateuses. L’activation de ces
récepteurs conduits alors à la production de diverses cytokines et chimiokines (MIP-2, IL-6,
TNFα, MCP-1), en particulier grâce à l’activation du facteur de transcription NFκB (Dambach
et al., 2002; Imaeda et al., 2009), ce qui initie une réponse inflammatoire en l’absence de
pathogènes (on parle alors d’inflammation stérile) (Bianchi et al., 2007). En effet, ces
cytokines et chimiokines vont favoriser le recrutement de phagocytes (neutrophiles et
macrophages dérivés de monocytes) dans les tissus endommagés, en particulier au niveau
du foie, pour faciliter le nettoyage des cellules mortes et activer les voies de régénération
(Holt et al., 2008; Jaeschke et al., 2011a; Lawson et al., 2000).

Plusieurs équipes ont étudiés le rôle de l’activation des cellules de Kupffer


(macrophages hépatiques) dans l’intoxication au paracétamol. Certaines études ont suggéré
un rôle délétère de ces cellules car l’inhibition de leurs fonctions par un traitement au
chlorure de gadolinium diminue le stress oxydant et la production de médiateurs
cytotoxiques (Blazka et al., 1995; Laskin et al., 1995; Michael et al., 1999). Au contraire,
d’autres études sont en faveur d’un rôle bénéfique de ces cellules dans la réparation
tissulaire, en particulier par l’intermédiaire de la production de nombreux facteurs
protecteurs (IL-10, IL-6, prostaglandine E2) (Ju et al., 2002). Par exemple, l’IL-10 inhibe
l’expression de iNOS (Nitric Oxyde Synthase inductible), ce qui réduit la génération de
peroxynitrite, prévient les lésions hépatocytaires et favorise la réparation tissulaire (M
Bourdi, 2002). De plus, les prostaglandines induisent les HSPs telles que HSP70 et HSP32
(également appelée hème oxygénase 1, HO1), qui ont un rôle protecteur (Chiu et al., 2002;
Tolson et al., 2006). Ainsi, bien que des travaux supplémentaires soient encore nécessaires

81
pour évaluer le rôle exact des cellules de Kupffer dans l’hépatotoxicité du paracétamol, il est
possible que ce rôle soit différent en fonction de l’intensité des altérations hépatiques due à
la dose de paracétamol, et le contexte inflammatoire.

Figure 15: Réponse innée au cours de l’intoxication hépatique au paracétamol. La nécrose


des hépatocytes suite à l’intoxication au paracétamol entraine la libération de différentes
molécules capable d’activer les cellules de Kupffer. Cette activation est responsable d’une
libération de cytokines et chémokines (MIP-2, IL-6, TNF-α, MCP1), générant une réponse
inflammatoire stérile afin de nettoyer le foie des cellules mortes et d’activer la régénération
tissulaire (Jaeschke et al., 2011a).

82
D. Prise en charge médicale de l’intoxication au paracétamol

Dans de nombreux pays, l’intoxication au paracétamol est un réel problème de santé


publique. Elle représente la principale cause d’insuffisance hépatique aiguë : 36% des cas en
Australie, 42% en Suède, 57% au Royaume-Uni, 39 à 46% aux Etats-Unis (Bernal et al., 2010;
Larson et al., 2005; Lee et al., 2008). Pour ces derniers, on dénombre plus de 100 000
intoxications par an, responsables en moyenne de 56 000 prises en charge médicales et de
500 décès (Lee, 2007; Nourjah et al., 2006). En France, le paracétamol est le médicament le
plus fréquemment impliqué dans les tentatives de suicide (Villa et al., 2008).

Bien que la majorité des intoxications au paracétamol soient volontaires, de récents


rapports rappellent qu’un quart des cas sont accidentels et associés à un fort taux de
mortalité. Ces intoxications involontaires peuvent être la conséquence de prises répétées de
doses supra-thérapeutiques de paracétamol et sont favorisées par la multitude de
spécialités pharmaceutiques existant sur le marché contenant cette molécule, seul
(doliprane®, efferalgan®, dafalgan® …) ou en association (actifed®, fervex® …) (Alhelail et al.,
2011; Clement et al., 2011). L’ANSM (Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des
Produits de Santé), anciennement l’AFSSAPS (Agence Française de Sécurité Sanitaire des
Produits de Santé), a édité en 2008 une fiche de recommandations destinées aux
professionnels de santé pour limiter ces accidents.

1. Symptômes

La symptomatologie clinique d’une intoxication au paracétamol est variable selon la


dose ingérée. La dose toxique est estimée chez l’enfant à 135 mg/kg et entre 8 et 10 g chez
l’adulte. Le stade précoce de l’intoxication aiguë, de 0 à 24 heures suivant l’ingestion, peut
être marqué par des nausées, des vomissements, une anorexie, des sueurs et parfois une
somnolence. La cytolyse hépatique, marquée par une élévation des transaminases
plasmatiques (ALAT, ASAT), débute au plus tôt 8 à 10 heures après ingestion et atteint un
maximum aux environs du 3ème jour. Au stade tardif (3 à 4 jours), on note une douleur de

83
l’hypochondre droit signifiant l’atteinte hépatique. L’atteinte hépatique se caractérise par
une nécrose hépatocytaire massive dans la région centrolobulaire, accompagnée d’une
hypoxie liée à la congestion des vaisseaux hépatiques (Walker et al., 1983). Selon la dose,
l’atteinte peut être plus ou moins importante. L’hépatite dite « fulminante » est
particulièrement redoutée car elle est marquée par une acidose métabolique, une
coagulopathie et une encéphalopathie hépatique, ce qui nécessite de considérer en urgence
la transplantation hépatique.

2. Traitements

Dans la grande majorité des cas, l’administration par voie orale ou intraveineuse de
N-acétyl-cystéine (NAC) suffit à améliorer l’état du patient. La NAC représente le traitement
de référence et de première intention de l’intoxication au paracétamol depuis plus de 35 ans
(Polson and Lee, 2005; Prescott et al., 1977). Son utilisation s’appuie sur des travaux
expérimentaux réalisés par l’équipe de Bernard Brodie, qui a mis en évidence le rôle de la
déplétion du glutathion dans la toxicité du paracétamol (Mitchell et al., 1973). La NAC agit
comme un précurseur de la resynthèse de glutathion, en fournissant aux hépatocytes la
cystéine, acide aminé limitant de la synthèse. Ainsi la NAC prévient la liaison du NAPQI aux
protéines et à d’autres constituants cellulaires (Corcoran and Wong, 1986). Elle est donc
d’autant plus efficace qu’elle est administrée précocement (dans les 10 premières heures),
avant que les transaminases n’augmentent de manière significative.
Cependant, même débuté 24 heures après intoxication, le traitement à la NAC
améliore le pronostic et diminue la progression des lésions (Keays et al., 1991), suggérant la
mise en jeu d’autres mécanismes de protection. Récemment, Saito et coll. (2010) ont
proposé en effet deux mécanismes tardifs d’action de la NAC. Elle pourrait, en favorisant la
restauration du glutathion mitochondrial, améliorer l’élimination des ERO et des
peroxynitrites, mais aussi faciliter le maintien des concentrations hépatiques d’ATP grâce à
l’oxydation mitochondriale des acides aminés du glutathion régénéré (Saito et al., 2010b).

Malgré le bénéfice indéniable de la NAC chez les patients intoxiqués au paracétamol,


cette molécule peut entrainer des effets secondaires, tels que vomissements, nausées,
84
réactions anaphylactiques après administration par voie intraveineuse, ce qui nécessite
l’arrêt du traitement. L’administration d’un antihistaminique peut être indispensable dans ce
cas (Sandilands and Bateman, 2009). La NAC est également responsable de rares cas
d’hépatites aiguës cytolytiques (Biour et al., 2004).

Des alternatives thérapeutiques à la NAC ont été proposées expérimentalement mais


celles-ci ne sont pas encore utilisées en clinique. Ainsi, le léflunomide, indiqué dans le
traitement de la polyarthrite rhumatoïde, protège la souris de l’hépatotoxicité du
paracétamol en inhibant l’activation de JNK (Latchoumycandane et al., 2006). Beaucoup
d’autres molécules ont démontré des propriétés protectrices chez les rongeurs par
l’intermédiaire de différents mécanismes comme le curcumin via des effets antioxydants
(Somanawat et al., 2013), le 2-aminoethoxy-diphenyl-borate via des effets inhibiteurs des
« gap junctions » et des CYPs (S. J. Patel et al., 2012) ainsi que le NecroX-7 , un dérivé
synthétique de l’indole, via sa fixation au NAPQI (Park et al., 2013).

3. Diagnostic

Le diagnostic de l’intoxication au paracétamol repose sur trois critères. Dans un


premier temps, l’interrogatoire du patient, s’il est possible, doit permettre d’estimer la dose
ingérée et l’heure de la prise. Le deuxième critère, la paracétamolémie, dont l‘interprétation
s’appuie sur le nomogramme de Rumack et Matthew, permet de prédire le risque lésionnel
après un surdosage aigu, au plus tôt 4 heures et au plus tard 24 heures après la prise
(Rumack and Matthew, 1975). Deux dosages à quelques heures d’intervalle permettent
d’évaluer la demi-vie d’élimination du médicament. Toutefois, une paracétamolémie
négative n’écarte pas le risque d’une intoxication si l’hospitalisation du patient est tardive,
ou si l’intoxication est due à une prise répétée de doses supra-thérapeutiques (Alhelail et al.,
2011). De plus, le nomogramme de Rumack et Matthew, limité aux intoxications aiguës, ne
prend pas en compte certains facteurs individuels tels que des variations métaboliques, la
préexistence de lésions hépatiques ou encore la prise concomitante d’autres médicaments
(Cheung et al., 1994). Enfin, l’augmentation tardive du taux de transaminases sériques
représente le troisième critère.
85
Figure 16: Nomogramme de Rumack et Matthew, représentant la concentration
plasmatique (mg/l) du paracétamol en fonction du temps après ingestion. La N-acétyl-
cystéine (NAC) doit être administrée au patient lorsque sa paracétamolémie est au-dessus
de la ligne noire.

Ces critères sont parfois insuffisants pour le diagnostic. Le dosage des adduits (APAP-
cystéine) dans le sérum des patients a été récemment proposé. Ce dosage consiste à
mesurer les adduits formés dans les hépatocytes par la liaison du NAPQI aux protéines
cellulaires et libérés dans la circulation lors de la nécrose cellulaire (Pumford et al., 1989). Il
reflète donc la quantité de NAPQI produite par bioactivation du paracétamol par les CYPs.
Cette quantité est proportionnelle à l’intensité des lésions et selon une étude prospective, ce
dosage permet de diagnostiquer une intoxication au paracétamol pour 1/5 des hépatites
aiguës d’étiologie inconnue aux Etats-Unis. Cette technique apporte un avantage certain
dans le cas d’intoxication par ingestion répétée de dose supra-thérapeutiques, où le
nomogramme de Rumack et Matthew est inutile (Heard et al., 2011). En effet, les adduits
APAP-cystéines sont mesurables jusqu’à 12 jours après l’intoxication même lorsque le
paracétamol plasmatique est indétectable. Cependant, cette technique très spécifique n’est

86
pas encore utilisée en clinique car elle nécessite un appareillage coûteux (HPLC couplée à un
détecteur électrochimique) (Davern et al., 2006; Heard et al., 2011; Khandelwal et al., 2011;
Muldrew et al., 2002).

D’autres chercheurs ont proposé comme marqueurs des lésions hépatiques après
intoxication au paracétamol le dosage plasmatique de protéines telles que la cytokératine-
18 et l’HMGB1 (Antoine et al., 2012), la détection de microARN circulants tels que mir-122 et
mir-192 (Wang et al., 2009), ou le dosage urinaire de métabolites endogènes et/ou dérivés
du NAPQI (Clayton et al., 2006; Winnike et al., 2010). Même s’il est encore trop tôt pour dire
si ces biomarqueurs pourront être utilisés en routine, les recherches dans ce domaine
méritent d’être poursuivies. En effet, outre l’aide apporté au diagnostic, ces nouveaux
marqueurs pourraient également prédire le risque lésionnel lors d’une intoxication au
paracétamol, et ainsi identifier les sujets qui sont les plus à risque de développer une
hépatite grave, voire fulminante.

E. Facteurs de susceptibilité à la toxicité du paracétamol

La prise d’une forte dose de paracétamol (≥8-10 grammes) ou de plusieurs doses


supra-thérapeutiques de paracétamol peut entraîner des lésions hépatiques plus ou moins
sévères en fonction des doses administrées et de différents facteurs de susceptibilité.
Cependant, quelques études récentes mettent en évidence qu’un traitement au long cours
aux doses thérapeutiques maximales recommandées (4 grammes/jour) peut entraîner
également des anomalies hépatiques chez certains patients, telles que l’élévation des
transaminases plasmatiques, ou la présence de foyers de nécro-inflammation sur la biopsie
(Claridge et al., 2010; Harrill et al., 2009; Heard et al., 2007; Kurtovic and Riordan, 2003;
Schiødt et al., 1997; Watkins et al., 2006; Winnike et al., 2010). L’étude prospective menée
par Watkins chez des sujets sains montre que 31 à 44% d’entre eux présentent une
augmentation des transaminases plasmatiques 3 fois supérieure à la normale (fixée à 40
UI/L) après 14 jours de traitement au paracétamol à dose thérapeutique (Watkins et al.,
2006). Ces résultats suggèrent ainsi fortement l’existence de facteurs individuels de
87
sensibilité à la toxicité hépatique du paracétamol, que cela soit dans des conditions
d’intoxication par surdosage (Larson et al., 2005), ou de traitements aux doses
thérapeutiques (Winnike et al., 2010).

Les susceptibilités individuelles à la toxicité des médicaments sont déterminées selon


de multiples facteurs de risque génétiques et/ou environnementaux, tels que l’âge du
patient, les polymorphismes des gènes codant pour les enzymes du métabolisme du
paracétamol, l’exposition à des toxiques, le traitement par d’autres médicaments ou la
présence de pathologies hépatiques et extra-hépatiques (Larrey, 2002). Dans le cas du
paracétamol, sa toxicité est intimement liée à la formation du NAPQI et aux capacités du foie
à éliminer ce métabolite hautement réactif, comme cela a été mentionné précédemment.
Ainsi, tout facteur qui favorise la production du NAPQI ou freine sa détoxification est
susceptible d’augmenter la toxicité hépatique de ce médicament (Mitchell et al., 1973;
Tanaka et al., 2000). L’identification de ces facteurs de risque représente un « challenge »
pour les équipes médicales, car elle permet en aval d’affiner la prescription et la délivrance
de ce médicament dans les groupes à risque et ainsi de réduire les cas d’intoxication
médicamenteuse.

Il existe actuellement plusieurs facteurs de risque bien identifiés tels que


l’intoxication alcoolique chronique et d’autres facteurs qui sont moins clairement établis
pour différentes raisons (e.g. manque de données cliniques robustes publiées, fréquence
d’évènement trop faible pour que le risque soit bien identifié…). Bien que l’obésité et la
NAFLD rentrent plutôt dans la 2ème catégorie des facteurs de risque, nous le traiterons en
premier lieu puisque ma thèse porte sur ce sujet précis. Les autres facteurs de risque seront
ensuite abordés.

88
1. Obésité et pathologies hépatiques associées

Différentes investigations cliniques et expérimentales suggèrent que l’obésité et les


pathologies hépatiques associées (NAFLD) peuvent augmenter le risque et la sévérité de
l’hépatotoxicité au paracétamol après intoxication volontaire, ou non (Michaut et al., 2014).
Concernant l’hépatotoxicité de ce médicament lors d’une administration de doses
thérapeutiques chez des sujets obèses, le risque semble moins net, même si quelques cas
ont été décrits dans la littérature (Forget et al., 2009). Ainsi, le problème de l’hépatotoxicité
du paracétamol dans une situation d’obésité et de NAFLD sera principalement développé ci-
dessous en prenant en compte le contexte du surdosage, que cela soit chez l’Homme ou
expérimentalement chez le rongeur. Il est à noter enfin que l’augmentation du risque et de
la sévérité d’une hépatotoxicité dans un contexte d’obésité n’est pas spécifique à cet
antalgique. En effet, d’autres médicaments semblent être concernés tels que l’halothane, les
analogues antirétroviraux et le méthotrexate (Fromenty, 2013).

• Données cliniques

Une large étude rétrospective a rapporté un risque accru d'atteinte hépatique aiguë
induite par un surdosage de paracétamol chez les patients présentant une maladie
hépatique stéatosique non alcoolique (NAFLD). En effet, dans cette étude, les patients
atteints d’une NAFLD préexistante et hospitalisé pour surdosage au paracétamol avaient un
risque multiplié par 7 de survenue d’atteinte hépatique aiguë par rapport à ceux ne
présentant de NAFLD (Nguyen et al., 2008). Dans une étude ultérieure, Myers et Shaheen
(2009) ont analysé une nouvelle fois la même base de données mais en tenant compte des
différences possibles existant dans les circonstances de surdosage, ce qui aurait pu
constituer un facteur confondant important (Myers and Shaheen, 2009). Cette nouvelle
analyse a confirmé le risque plus élevé d'hépatotoxicité suite à un surdosage au paracétamol
chez les patients présentant une NAFLD (Nguyen et al., 2008), même si l'ampleur de ce
risque était atténué dans cette étude (3,91 vs 7,43). Cependant, il est important de souligner
que ces deux études ont montré que le risque d’hépatotoxicité après surdosage au

89
paracétamol était similaire chez les patients présentant une NAFLD et chez ceux atteints
d’une maladie alcoolique du foie (Myers and Shaheen, 2009; Nguyen et al., 2008).

En revanche, deux études ont montré que le risque de lésions hépatiques aiguës
après surdosage au paracétamol était similaire ou inférieure, chez les patients obèses par
rapport aux sujets non obèses, mais la présence d’une NAFLD n’a pas été déterminée dans
ces travaux (Radosevich et al., 2013; Rutherford et al., 2006). Cependant, dans l'une de ces
études, l’insuffisance hépatique aiguë avait une issue plus défavorable chez les patients
obèses (Rutherford et al., 2006).

L’ensemble de ces études cliniques suggère ainsi que la NAFLD, plutôt que l'obésité
en elle-même, pourrait augmenter le risque d'atteinte hépatique aiguë après un surdosage
au paracétamol. En fait, le risque et la sévérité de l’hépatotoxicité au paracétamol
pourraient être la résultante chez chaque patient de la présence de facteurs favorisant sa
toxicité (induction du CYP2E1, diminution préalable des stocks de glutathion) et l’existence
éventuelle de facteurs plutôt protecteurs (augmentation du volume de distribution et de la
glucuronidation, diminution de l’activité du CYP3A4) (Michaut et al., 2014).

• Données expérimentales chez les rongeurs

De 1987 à 2012, six études différentes ont rapporté l'effet de l'intoxication aiguë au
paracétamol dans plusieurs modèles animaux d'obésité et de NAFLD (Aubert et al., 2012;
Blouin et al., 1987; Corcoran et al., 1987; Ito et al., 2006; Kon et al., 2010; Kučera et al.,
2012). De plus, une étude a rapporté l’hépatotoxicité de fortes doses de paracétamol dans
un modèle murin de stéatohépatite induite par un régime déficient en méthionine et en
choline (régime « MCD ») (Donthamsetty et al., 2008). Cependant, il faut souligner que le
régime MCD entraîne une perte importante du poids corporel chez les animaux (Leclercq et
al., 2007; Rizki et al., 2006) et qu’il n'induit pas de résistance systémique à l'insuline (Leclercq
et al., 2007; Rinella and Green, 2004). Ainsi ce modèle de stéatohépatite n’est pas
totalement comparable aux modèles de NAFLD liés à la consommation excessive de calories.

90
Parmi ces différentes études, quatre d'entre elles ont montré que la présence d’une
NAFLD était associée à des lésions hépatiques plus sévères après une intoxication aiguë au
paracétamol (Aubert et al., 2012; Donthamsetty et al., 2008; Kon et al., 2010; Kučera et al.,
2012). Une autre étude a également montré une toxicité accrue du paracétamol chez les rats
nourris avec un régime riche en graisses (Corcoran et al., 1987), même si la présence
préalable de stéatose hépatique chez ces rats n’a pas été objectivée dans cette étude. En
revanche, les autres études ont montré des atteintes hépatiques moins graves (Ito et al.,
2006), ou similaires (Blouin et al., 1987) dans les modèles expérimentaux utilisés.

Il est difficile de donner des explications formelles concernant la divergence des


résultats obtenus dans les différents modèles de NAFLD chez les rongeurs, mais certaines
hypothèses peuvent cependant être avancées. Par exemple, les investigations réalisées chez
les souris ob/ob et db/db mâles et femelles suggèrent que les différences d’activité du
CYP2E1 hépatique pourraient jouer un rôle important (Aubert et al., 2012). En effet, une
hépatotoxicité accrue du paracétamol a été observée chez les souris db/db femelles, mais
pas chez les souris ob/ob femelles, et ceci était associé à une activité plus forte du CYP2E1
dans le premier groupe d'animaux. Il est intéressant de noter que l'activité du CYP2E1
hépatique est normale (Aubert et al., 2012), ou réduite (Enriquez et al., 1999), chez les souris
ob/ob mâles ce qui pourrait expliquer pourquoi Ito et coll. (2006) ont rapporté une
hépatotoxicité aiguë moins sévère du paracétamol dans ce modèle (Ito et al., 2006). Il est
également intéressant de souligner que les concentrations plasmatiques des métabolites
paracétamol-glucuronide et paracétamol-sulfate étaient assez similaires entre les souris
db/db femelles et les souris ob/ob femelles après un traitement de 500 mg/kg de
paracétamol (Aubert et al., 2012). Ainsi, la différence d'hépatotoxicité du paracétamol entre
ces modèles murins ne peut pas être attribuée à une différence significative de
glucuronidation ou de sulfatation de ce médicament.

Mis à part le rôle de l’induction du CYP2E1 et de la formation accrue du NAPQI,


d’autres hypothèses peuvent être avancées pour expliquer la plus grande sensibilité à

91
l’hépatotoxicité au paracétamol dans un contexte de NAFLD, comme par exemple
l'accumulation de lipides et un stress oxydant plus important.

En ce qui concerne l’accumulation lipidiques il est à noter que, dans le travail déjà
cité précédemment (Aubert et al., 2012), malgré une stéatose moins marquée chez les souris
db/db par rapport au souris ob/ob, une plus grande hépatotoxicité du paracétamol chez les
souris db/db est observée. De plus, les niveaux plasmatiques de base des transaminases
ALAT et ASAT (i.e. avant intoxication) étaient comparables entre les souris db/db et ob/ob
(Aubert et al., 2012). Ainsi, une sensibilité accrue à hépatotoxicité du paracétamol chez les
souris db/db femelles ne peut pas être attribuée à la préexistence d'une cytolyse hépatique
élevée. Cependant, cette étude ne permet pas d’exclure la possibilité que l'accumulation de
certaines espèces de lipides pourrait être impliquée. En effet, il est à noter que les
hépatocytes db/db présentent une stéatose plutôt microvésiculaire et moins
macrovacuolaire par rapport aux hépatocytes ob/ob (Aubert et al., 2012; Trak-Smayra et al.,
2011). Parce que la taille des gouttelettes est fortement influencée par la composition
lipidique (Guo et al., 2008; X. Shi et al., 2013), il est possible que l'accumulation de certaines
espèces de lipides spécifiques dans les hépatocytes des souris db/db femelles ait pu
contribuer à la plus grande susceptibilité à la toxicité du paracétamol.

La NAFLD est associée à un stress oxydant, susceptible d’altérer différents


composants cellulaires tels que des acides nucléiques et des acides gras insaturés (Begriche
et al., 2013; Bell et al., 2010; Seki et al., 2005). En outre, les réserves de GSH hépatique
peuvent être réduites au cours NAFLD (surtout au stade NASH), diminuant ainsi la capacité
antioxydantes des hépatocytes surchargés en graisse (Begriche et al., 2013; Videla et al.,
2004). Par conséquent, la sensibilité au paracétamol observée dans certains modèles de
rongeurs obèses pourrait être liée à un stress oxydant basal élevé et à des niveaux de GSH
plus bas. Cependant, les taux de base de GSH hépatique n’étaient pas significativement
réduits dans deux modèles de rongeurs d'obésité et de NAFLD pour lesquels une plus grande
vulnérabilité à la toxicité du paracétamol a été montrée (Aubert et al., 2012; Kučera et al.,
2012). Mais il est important de noter que seules les concentrations totales du GSH cellulaire

92
ont été mesurées dans ces études et ainsi il serait important de déterminer si les stocks de
GSH mitochondrial sont spécifiquement diminués dans ces modèles de NAFLD. En effet,
certaines études ont suggéré un rôle clé du pool mitochondrial de GSH dans les lésions
hépatiques induites par le paracétamol (Fernandez-Checa and Kaplowitz, 2005; Zhao et al.,
2002).

Comme mentionné précédemment, l'activation de JNK semble jouer un rôle


important dans l'hépatotoxicité induite par le paracétamol (Han et al., 2010; Hinson et al.,
2010; Jaeschke et al., 2012; Xie et al., 2014b). De façon intéressante, l'activation de JNK
pourrait également jouer un rôle important dans la pathogenèse de la NAFLD (Abdelmegeed
et al., 2012; Gadang et al., 2013; Singh et al., 2009). Seules deux études ont examiné
l’activation hépatique de JNK chez les animaux obèses intoxiqués par le paracétamol (Kon et
al., 2010; Aubert et al., 2012). Dans la première étude, l'activation de JNK (évaluée par
phospho-JNK) après intoxication était significativement plus forte chez les souris KK-Ay
obèses et diabétiques par rapport aux souris sauvages, et ceci était associé à une
hépatotoxicité plus importante du paracétamol chez les animaux obèses (Kon et al., 2010).
Dans la seconde étude, l'hépatotoxicité accrue observée chez les souris db/db femelles
n'était pas associée à une augmentation de la phosphorylation de JNK (Aubert et al., 2012).
De plus, et de façon inattendue, JNK était spécifiquement activée dans le foie des souris
ob/ob femelles intoxiquées, bien que ces animaux présentaient une cytolyse hépatique
moins importante par rapport aux souris db/db femelles (Aubert et al., 2012). Ainsi,
l'activation de JNK pourrait ne pas être un mécanisme clé de l’hépatotoxicité du paracétamol
dans certains modèles murins de NAFLD.

En plus des investigations réalisées sur des modèles de rongeurs obèses, une étude a
rapporté l'effet de l’intoxication aiguë au paracétamol dans un modèle murin de
stéatohépatite induite par un régime « MCD » (Donthamsetty et al., 2008). Dans cette étude,
une plus grande hépatotoxicité du paracétamol était observée malgré l'absence d’induction
préexistante du CYP2E1 et la présence de concentrations normales de base du GSH
hépatique (Donthamsetty et al., 2008), suggérant ainsi l'implication d'autres mécanismes. De

93
façon intéressante, les concentrations basales d’ATP hépatique étaient réduites de 45% chez
les souris nourries par le régime « MCD » (Donthamsetty et al., 2008), suggérant une
altération importante de la chaîne respiratoire mitochondriale et de la phosphorylation
oxydative dans ce modèle expérimental (Serviddio et al., 2008, 2010). Par conséquent, un
dysfonctionnement mitochondrial préexistant pourrait avoir joué un rôle significatif dans la
plus grande hépatotoxicité du paracétamol observée chez les souris nourries avec le régime
« MCD ». Même si ces résultats sont intéressants, il faut néanmoins garder à l’esprit que ce
modèle de NAFLD présente beaucoup de différences par rapport aux modèles de NAFLD
induite par des régimes hypercaloriques, comme cela a déjà été souligné plus haut.

• Synthèse des données cliniques et expérimentales

Bien que la présence d’une NAFLD chez les personnes obèses semble augmenter le
risque d'atteinte hépatique aiguë après intoxication au paracétamol (Nguyen et al., 2008;
Myers et al., 2009), ces études cliniques n'ont pas déterminé le mécanisme par lequel le
paracétamol pourrait être plus toxique dans cette situation pathologique. Néanmoins, il est
à noter qu’une augmentation de l'activité du CYP2E1 hépatique a été fréquemment
rapportée chez les patients présentant une NAFLD (Aubert et al., 2011; Chalasani et al.,
2003; Chtioui et al., 2007; Emery et al., 2003; Varela et al., 2008), même s'il est encore
difficile de savoir si l’induction du CYP2E1 est spécifiquement liée à cette maladie du foie, ou
à d'autres troubles métaboliques liés à l'obésité, tels que la résistance à l'insuline et le
diabète de type 2 (Aubert et al., 2011).

Dans les études expérimentales, la stéatose chez les rongeurs obèses était en général
associée à une hépatotoxicité plus élevée après un surdosage au paracétamol (Aubert et al.,
2012; Kon et al., 2010; Kučera et al., 2012). De plus, dans une de ces études, une cytolyse
hépatique aiguë plus sévère semblait corrélée avec une activité accrue préexistante du
CYP2E1 hépatique, mais pas avec le degré d'accumulation des lipides, c'est-à-dire avec la
sévérité de la stéatose hépatique (Aubert et al., 2012).

94
Contrastant avec ces études, l'obésité n’était pas associée à une plus grande
hépatotoxicité du paracétamol chez les patients chez lesquels la présence d’une NAFLD n'a
pas été recherché, comme précédemment indiqué (Rutherford et al., 2006; Radosevich et
al., 2013). De façon intéressante, une hépatotoxicité au paracétamol similaire ou inférieure a
été observée dans certains modèles de rongeurs obèses (Blouin et al., 1987; Ito et al., 2006;
Aubert et al., 2012). Différentes études cliniques et expérimentales ont montré que l'obésité
était associée à une plus grande glucuronidation hépatique du paracétamol et de sa
clairance (Abernethy et al., 1983; Aubert et al., 2012; Barshop et al., 2011; Brill et al., 2012;
Gicquel et al., 2013; Xu et al., 2012) . En revanche, l'influence de l'obésité et de la NAFLD sur
la sulfatation du paracétamol n’est pas clairement établie car les investigations chez les
rongeurs et les patients ont fourni des résultats divergents (Aubert et al., 2012; Chaudhary
et al., 1993; Corcoran et al., 1987; Hardwick et al., 2013). Il est à noter aussi que l'activité
hépatique du CYP3A4 est plus faible au cours de l'obésité et de la NAFLD chez l’Homme et
l’animal (Brill et al., 2012; Kolwankar et al., 2007; Patoine et al., 2013; Yoshinari et al., 2006),
ce qui peut réduire la production de NAPQI. Enfin, l'obésité semble être associée à une
moindre absorption gastro-intestinale du paracétamol et à un plus grand volume de
distribution, ce qui pourrait réduire les concentrations plasmatiques de cet antalgique
(Abernethy et al., 1982; Lee et al., 1981) .

Ainsi, il semble que l'apparition de lésions hépatiques aiguës chez une personne
obèse après un surdosage au paracétamol pourrait dépendre d'un équilibre délicat entre les
facteurs métaboliques qui peuvent avoir un effet protecteur (augmentation de la
glucuronidation et du volume de distribution, moindre absorption gastro-intestinale et
activité plus faible du CYP3A4) et d'autres susceptibles d’augmenter la production hépatique
de NAPQI (induction du CYP2E1) ou de réduire la détoxication de ce métabolite réactif
(baisse des stocks de GSH). L’implication possible de tous ces facteurs est présentée
schématiquement dans la Figure 17.

95
Figure 17: Facteurs pouvant moduler le risque et la sévérité de l’hépatotoxicité induite par
le paracétamol dans un contexte d’obésité et de NAFLD. Les facteurs pouvant protéger
contre les lésions hépatiques liées au paracétamol incluent la diminution de l’absorption
intestinale et de l’activité du CYP3A4, ainsi que l’augmentation du volume de distribution et
de la glucuronidation hépatique. Ces facteurs peuvent réduire le taux plasmatique de
paracétamol et diminuer la formation de NAPQI, un métabolite toxique du paracétamol. Les
facteurs pouvant aggraver les lésions hépatiques dues au paracétamol comprennent une
augmentation de l’activité du CYP2E1, qui mène à une production plus accrue de NAPQI, et
un faible stock de glutathion hépatique, ce qui diminue les capacité de détoxification du
NAPQI. D’autres investigations sont nécessaires pour déterminer si la présence d’une
stéatohépatite (NASH) et/ou des dysfonctions mitochondriales peuvent favoriser
l’hépatotoxicité du paracétamol chez les sujets obèses (Michaut et al., 2014).

96
• Questions en suspens

Bien qu'il existe des arguments expérimentaux indiquant que l’induction du CYP2E1
hépatique au cours de la NAFLD peut favoriser l'hépatotoxicité du paracétamol, il est
concevable que d'autres mécanismes puissent également jouer un rôle. Par exemple, il sera
important de déterminer si la gravité de la NAFLD peut être un facteur important.
Intuitivement, on peut s'attendre à ce que la présence d’une nécro-inflammation importante
(présence d’une NASH) puisse être associée à un risque plus élevé, par rapport à la stéatose
hépatique simple. La préexistence d'un dysfonctionnement mitochondrial liée à la NASH
(Begriche et al., 2013; Grattagliano et al., 2012) pourrait effectivement être impliqué
puisque ce dysfonctionnement joue un rôle clé dans l’apparition de la cytolyse induite par le
paracétamol (Han et al., 2010; Jaeschke et al., 2012; Knockaert et al., 2011). Il sera
également intéressant d’étudier la relation entre les concentrations intra-hépatiques de GSH
au cours de la NAFLD (et surtout de la NASH) et la sévérité des lésions hépatiques induites
par une intoxication au paracétamol.
Compte tenu du faible nombre d'études cliniques publiées sur l’hépatotoxicité du
paracétamol dans un contexte d’obésité et de NAFLD, d'autres investigations sont
clairement nécessaires pour obtenir plus d'informations sur cette question. En particulier, il
sera important de déterminer s’il existe un sous-groupe de sujets obèses présentant un
risque accru d'hépatotoxicité suite à une intoxication au paracétamol. Il est possible en effet
qu’un tel risque ne concerne pas tous les sujets obèses étant donné qu’il existe des facteurs
métaboliques liés à l’obésité qui peuvent constituer une protection vis-à-vis de
l’hépatotoxicité de cet antalgique, comme cela a été souligné précédemment. Ces
investigations cliniques devront porter non seulement sur les cas d’intoxication aiguë liés à
un surdosage, mais également sur les cas d’hépatotoxicité survenant dans le cadre d’une
administration chronique de paracétamol (Biour et al., 2004; Watelet et al., 2007). Des
investigations sont en cours dans l’équipe afin de déterminer si l’administration pendant
plusieurs semaines de doses thérapeutiques chez des souris nourries par un régime normal
ou riche en graisses est susceptible d’entraîner une cytolyse plus importante chez les souris
présentant une stéatose.

97
Des investigations seraient également nécessaires afin de déterminer si les troubles
métaboliques autres que la NAFLD pourraient favoriser l’hépatotoxicité du paracétamol, tels
que la résistance à l'insuline et le diabète de type 2. De façon intéressante, le diabète a été
associé à un risque plus élevé de lésions hépatiques graves induites par les médicaments
(Chalasani et al., 2008), bien que les cas d’hépatotoxicité au paracétamol n’aient pas été
inclus dans cette étude. Il sera également important de déterminer le(s) mécanisme(s) précis
de l’induction du CYP2E1 chez les patients obèses présentant une NAFLD. Les quelques
pistes existant actuellement ont été présentées dans le chapitre consacré à la
physiopathologie de la NAFLD.

2. Alcoolisme et maladies hépatiques liées à l’alcool

Un facteur de risque bien connu est l’intoxication alcoolique chronique et les


maladies alcooliques du foie qui lui sont associées (Larson et al., 2005 ; Nguyen et al., 2008).
En effet, de nombreux cas cliniques d’intoxication au paracétamol ont été mis en évidence
chez des malades alcooliques chroniques (Emby and Fraser, 1977; Licht et al., 1980; McClain
et al., 1980; Teschke et al., 1979; Zimmerman and Maddrey, 1995). Zimmerman et Maddrey
(1995) ont étudié 67 cas d’insuffisances hépatiques induites par le paracétamol: tous les
patients étaient consommateurs réguliers d’alcool, et 60% d’entre eux avaient consommé
moins de 6 grammes de paracétamol (Zimmerman and Maddrey, 1995). D’autres études
confirment que l’abus d’alcool, ou l’existence de pathologies hépatiques associées, sont des
facteurs de risque indépendants de mauvais pronostic à la suite d’une intoxication au
paracétamol, avec une augmentation du risque variant selon les études de 3,5 [IC95% 1,78-
6,97] à 6,46 [IC95% 4,53-9,21] (Nguyen et al., 2008; Schmidt et al., 2002).

La susceptibilité des sujets alcooliques chroniques semble s’expliquer par au moins


deux mécanismes:

1. Une forte augmentation de l’activité du CYP2E1, principalement liée à une


stabilisation accrue de la protéine par l’alcool (Gonzalez, 2007; Roberts et al., 1995). Il est à
noter que des travaux expérimentaux ont montré que l’augmentation de l’expression
98
protéique et de l’activité du CYP2E1 par l’éthanol concernent non seulement le CYP2E1
microsomal mais également le CYP2E1 localisé dans les mitochondries (Robin et al., 2005).
L’induction du CYP2E1 par l’alcool favorise ainsi fortement la transformation du paracétamol
en NAPQI et abaisse le seuil de toxicité (Zimmerman and Maddrey, 1995).

2. Une déplétion préexistante des stocks intra-hépatocytaires du glutathion(Sato et


al., 1981; Zimmerman and Maddrey, 1995). Il est à noter que cette déplétion préalable en
glutathion pourrait être liée au stress oxydant induit par l’intoxication alcoolique chronique
et/ou à la malnutrition fréquemment observée au cours de cette situation physio
pathologique (Gao and Bataller, 2011; Zimmerman and Maddrey, 1995).

Enfin, il est intéressant de noter que, contrairement à l’intoxication chronique, des


études expérimentales et cliniques ont montré que l’intoxication alcoolique aiguë semble au
contraire protéger vis-à-vis de l’hépatotoxicité du paracétamol (Sato and Lieber, 1981; Sato
et al., 1981; Schmidt et al., 2002; Waring et al., 2008). Bien que le mécanisme impliqué reste
encore incertain, cette protection est probablement la conséquence de la métabolisation de
l’éthanol par le CYP2E1, ce qui limite ainsi la biotransformation du paracétamol en NAPQI
(Sato et al., 1981). Cette compétition entre les deux substrats disparait dès lors que l’alcool
est éliminé de l’organisme.

3. Jeûne prolongé et dénutrition

Le jeûne et la dénutrition peuvent être fréquemment observés dans la pratique


clinique. Par exemple, les facteurs suivants peuvent entraîner une dénutrition: alcoolisation
chronique, anorexie mentale, vieillesse, conditions sociales défavorables, état dépressif et
situations post-opératoires, en particulier après une chirurgie dentaire (Clement et al., 2011;
Pickering et al., 2011).

Le jeûne prolongé et la dénutrition semblent augmenter significativement le risque


d’hépatotoxicité au paracétamol (Ferner et al., 2011), même si certains auteurs pensent que
ces facteurs jouent un rôle moins important que l’intoxication alcoolique chronique
99
(Rumack, 2004). Quoi qu’il en soit, différents cas cliniques d’insuffisance hépatique aiguë
après administration de doses thérapeutiques de paracétamol ont été rapportés chez des
sujets maigres et/ou dénutris (Claridge et al., 2010; Kurtovic and Riordan, 2003). De plus,
l’analyse multivariée menée par Nguyen confirme que la malnutrition est un facteur de
risque important de toxicité hépatique lors d’un surdosage au paracétamol, avec une
augmentation du risque (« odd-ratio ») de 3,84 [IC95% : 2,63-5,65] (Nguyen et al., 2008). Il
est également intéressant de noter que les investigations expérimentales in vivo concernant
l’hépatotoxicité du paracétamol chez les rongeurs s’effectuent classiquement chez des
animaux qui ont été placés préalablement à jeun afin de potentialiser cette toxicité.

Au moins quatre mécanismes différents pourraient expliquer l’hépatotoxicité accrue


du paracétamol dans un contexte de jeûne et de dénutrition. :

1. Une forte diminution des stocks intra-hépatiques de glutathion (Pessayre et al.,


1980; Price et al., 1987) . Un régime pauvre en protéines altère de la même manière les
stocks de glutathion. En effet, le glutathion est synthétisé à partir d’acides aminées
provenant des protéines fournies par l’alimentation. Une déplétion des stocks de glutathion
induit une moindre détoxication du NAPQI après un traitement au paracétamol.

2. Une diminution des stocks intra-hépatocytaires de glycogène et d’ATP,


sensibilisant ainsi les hépatocytes aux effets délétères du paracétamol sur les réserves
énergétiques de l’hépatocytes. De plus, le jeûne prolongé est associé à une diminution de la
glucuronoconjugaison, au profit de l’oxydation microsomale par les CYPs. Effectivement, la
glucuronoconjugaison dépend des réserves de glucose hépatique, qui peuvent être divisées
par 10 après une période de jeûne (Whitcomb and Block, 1994).

3. Une augmentation de l’expression du CYP2E1, qui pourrait être liée à la diminution


de l’insulinémie et/ou à l’augmentation du glucagon (Moncion et al., 2002; Woodcroft and
Novak, 1999a). Il est à noter que la régulation du CYP2E1 par l’insuline a été développée plus
longuement dans la 2ème partie de l’introduction. L’augmentation de l’expression du CYP2E1

100
pourrait également être liée à la plus grande production des corps cétoniques, et en
particulier de l’acétone (Forkert et al., 1994; Kraner et al., 1993).

4. Une diminution du volume de distribution associée à la réduction du poids


corporel. Ceci est associé à une augmentation des concentrations plasmatiques du
paracétamol et donc à une exposition plus forte du foie à son effet toxique. Claridge et ses
collaborateurs proposent de réduire de moitié la posologie quotidienne maximale
recommandée pour les adultes (2g/jour) dont le poids corporel est inférieur à 50 kg (Claridge
et al., 2010).

4. Autres facteurs de risques

• Hépatites virales

Les patients infectés par le virus de l’hépatite A ou le virus de l’hépatite C (VHC)


apparaissent plus à risque de développer des lésions hépatiques après la prise de
paracétamol, même pour des doses thérapeutiques (Myers and Shaheen, 2009; Nguyen et
al., 2008; Rezende et al., 2003; Stine and Lewis, 2011; Tarantino et al., 2007; Yaghi et al.,
2006). Selon l’analyse multivariée menée par Nguyen, portant sur plus de 42000 cas de
patients hospitalisés à la suite d’une intoxication au paracétamol, le risque de développer
des lésions hépatiques graves est multiplié par 1,80 si le patient est infecté par le VHC
(Nguyen et al., 2008). Cette susceptibilité accrue pourrait être la conséquence de la présence
d’un état inflammatoire lié au virus qui sensibiliserait le foie (Maddox et al., 2010). Le
principal médiateur pro-inflammatoire impliqué dans la sensibilisation des hépatocytes est le
TNFα (Tumor Necrosis Factor-alpha), probablement par l’intermédiaire d’un mécanisme
faisant intervenir JNK (Gandhi et al., 2010). Des dysfonctions mitochondriales induites par le
VHC pourraient également jouer un rôle important (Uehara et al., 2013).

• Interactions médicamenteuses

Lors d’un surdosage au paracétamol, la toxicité hépatique pourrait être en théorie


potentialisée par la prise concomitante d’inducteurs enzymatiques, tels que la phénytoïne,
101
ou le phénobarbital. Cependant, aucune étude clinique ne montre d’augmentation
significative du risque de lésons hépatiques chez les patients traités par ces médicaments. A
dose thérapeutique de paracétamol, ce risque semble néanmoins très faible (Rumack, 2004;
Toes et al., 2005).

• L’âge

Le métabolisme du paracétamol évolue avec l’âge. Principalement éliminé sous


forme sulfoconjugué au cours des premières années de vie, la forme glucuronidée devient
majoritaire pendant l’enfance, pour occuper 50 à 65% des métabolites excrétés chez
l’adulte. Le paracétamol est relativement bien toléré à tout âge, même chez les nourrissons.
On peut toutefois noter que l’intoxication volontaire au paracétamol touche principalement
des personnes entre 10 et 50 ans. Concernant les personnes âgées (plus de 70 ans), les
hospitalisations sont moins nombreuses, mais principalement liées à une intoxication
accidentelles (Myers et al., 2007). Les séniors seraient plus exposés à la malnutrition et
présenteraient plus de difficultés à restaurer les stocks de glutathion, en particulier en post-
opératoire (Pickering et al., 2011; Schmidt et al., 2002; Stio et al., 1994). De plus,
l’élimination du paracétamol semble aussi être affectée par l’âge, comme le montre
l’allongement de sa demi-vie, en particulier chez les hommes (Greenblatt et al., 1983).

• Le sexe

Un dimorphisme sexuel peut être à l’origine de variations du métabolisme du


paracétamol aussi bien chez les humains que chez les rongeurs, et par conséquent entrainer
des réponses toxiques plus ou moins fortes en fonction du sexe (Anderson, 2005; Kato,
1974; Waxman and Holloway, 2009). L’étude de Critchley et coll. (1986) sur des sujets
caucasiens met en évidence une moindre activité de glucuronidation ainsi qu’un plus fort
métabolisme microsomal chez les femmes comparés aux hommes (Critchley et al., 1986).
Ces résultats peuvent en partie expliquer pourquoi l’intoxication au paracétamol touche en
majorité les femmes (74% des cas) (Lee, 2008). Cependant, outre ces raisons métaboliques,
cette disproportion pourrait aussi s’expliquer par une préférence des femmes pour les
médicaments lors des tentatives de suicides (Saviuc et al., 1999).
102
Expérimentalement, plusieurs études mettent en évidence un dimorphisme sexuel
concernant la toxicité hépatique du paracétamol, observé aussi bien chez des souris
consanguines (C57Bl6J) que non consanguines (CD-1) (Botta et al., 2006; Dai et al., 2006;
Masubuchi et al., 2011; McConnachie et al., 2007). Dans toutes ces études, les souris
femelles ont montré moins de lésions hépatiques que leurs homologues mâles suite à une
intoxication au paracétamol. Selon les auteurs, cette moindre sensibilité serait liée à une
restauration plus rapide des quantités de GSH, en partie grâce à une plus forte activité de la
glutamate-cystéine synthase (GCS) chez les femelles (Botta et al., 2006; Masubuchi et al.,
2011; McConnachie et al., 2007).

• Polymorphismes génétiques

La susceptibilité à la toxicité du paracétamol pourrait également résulter de


variations d’expression de gènes codant pour des protéines impliquées dans le métabolisme
(SULTs, UGTs, CYPs), dans la réponse au stress cellulaire et/ou dans l’immunité innée (Adjei
et al., 2008; Court et al., 2001, 2014; Critchley et al., 1986; Miners et al., 1990; Patel, Tang, &
Kalow, 1992). Par exemple, la sulfotransférase SULT1A1 possède 3 allèles différents, dont la
fréquence d’expression varie selon les populations et qui sont associés à une activité
enzymatique plus ou moins forte (cf. chapitre métabolisme). En ce qui concerne les UGTs et
les CYPs, Critchley et coll. (1986) ont mis en évidence, après un traitement par une dose de
1,5 grammes de paracétamol, une excrétion urinaire accrue de conjugués glucuronides et
réduite de métabolites dérivés de l’oxydation par les CYPs chez les patients originaires
d’Afrique (Ghana et Kenya) comparés à des sujets caucasiens (Ecosse) (Critchley et al., 1986).
Ces résultats suggèrent une meilleure élimination du paracétamol non bioactivé dans les
populations africaines, qui pourraient être alors moins sensibles à la toxicité de cet
antalgique. Moyer et coll. (2011) se sont quant à eux intéressé aux SNP (Single Nucleotide
Polymorphism) des gènes impliqués dans la conjugaison au glutathion. Ils ont ainsi identifié
un groupe de SNP situé sur le chromosome 3 fortement associés à une toxicité plus accrue
du NAPQI, et ce indépendamment du sexe et du groupe ethnique (Moyer et al., 2011).

103
La susceptibilité au paracétamol pourrait être également influencée par l’expression
de gènes impliqués dans la réponse immunitaire. En effet, des investigations réalisées chez
des adultes sains traités par des doses maximales recommandées de paracétamol ont
montré qu’un polymorphisme sur le gène CD44 (qui code pour une molécule d’adhésion
cellulaire exprimée sur les lymphocytes) était associé à une augmentation des transaminases
sériques et donc à une plus grande sensibilité à cet antalgique (Harrill et al., 2009).
Cependant, une étude plus récente n’a pas montré de lien statistiquement significatif entre
la présence de ce polymorphisme et une hépatotoxicité au paracétamol secondaire à un
surdosage (Court et al., 2014).

Expérimentalement, la toxicité du paracétamol varie en fonction des souches de


souris utilisées (Harrill et al., 2009; Williams et al., 2011): certaines souches apparaissent
protégées (CAST/EiJ), alors que d’autres au contraire sont beaucoup plus sensibles (C57Bl/6J
ou B6C31/J). Cette susceptibilité pourrait être influencée par l’expression de gènes impliqués
dans la réponse immunitaire. Par exemple, les souches de souris exprimant moins de CD44
sont plus susceptibles à l’hépatotoxicité du paracétamol, comparées à des souris sauvages
(Harrill et al., 2009). Ainsi, des variations génétiques sur le gène CD44 semblent jouer un rôle
majeur dans la susceptibilité à l’hépatotoxicité au paracétamol, chez la souris et chez
l’Homme. Quoi qu’il en soit, et malgré les différents rôles déjà attribués à CD44 in vivo, tels
que les interactions cellules-matrices, la migration cellulaire ou encore la cicatrisation
(Rouschop et al., 2006), les mécanismes spécifiques impliqués dans la susceptibilité du
paracétamol nécessite d’être précisés.

Ainsi, certains polymorphismes génétiques pourraient expliquer des variations de


susceptibilité à la toxicité hépatique du paracétamol, non seulement au niveau des gènes
impliqués dans le métabolisme de cet antalgique, mais également de gènes impliqués dans
les processus de réparation, ou de régénération hépatique. Cependant, des investigations
cliniques supplémentaires seraient nécessaires afin d’identifier les principaux
polymorphismes impliqués dans cette susceptibilité accrue, car tous les polymorphismes
identifiés ne jouent pas nécessairement un rôle important.

104
F. Réglementation concernant la délivrance

Au sein de la population occidentale, le nombre de cas d’intoxication au paracétamol


varie grandement en fonction des pays. L’Espagne et la France sont deux des pays où l’on
note le plus faible pourcentage d’hépatites aiguës dues au paracétamol, respectivement 2,2
et 7% (Bernal et al., 2010; Escorsell et al., 2007; Ichai and Samuel, 2011; Polson and Lee,
2007). Cette moindre fréquence pourrait être la conséquence de réglementations plus
contraignantes quant à la délivrance de ce médicament. En effet, en France et en Espagne,
bien que le paracétamol soit en accès direct sans prescription médicale, il est vendu
uniquement en officine. De plus, son conditionnement est limité à 8 grammes par boîte
(Gunnell et al., 1997).

Au Royaume-Uni, pour diminuer le nombre d’intoxications volontaires, il a été adopté


une politique de restriction commerciale en 1998, en autorisant un maximum de 16
grammes de paracétamol par boîte vendue en pharmacie et 9 grammes hors officine
(Zarowitz, 2012). Cette politique semble avoir fait baisser les premières années le taux de
mortalité dû au paracétamol (Hawton et al., 2004; Inglis, 2004). Cependant, sur une période
plus longue, cette baisse est discutée (Bateman, 2009; Buckley and Gunnell, 2007; Hawkins
et al., 2007; Morgan et al., 2007).

Aux Etats-Unis, dans le but de diminuer le nombre de cas d’intoxications


accidentelles, la FDA (Food and Drug Administration) a demandé en juillet 2009 aux
industriels de clarifier l’étiquetage sur les conditionnements de toute formulation
pharmaceutique contenant du paracétamol. La composition doit être lisible et le mot
« acetaminophen » écrit en toute lettre. Les posologies recommandées, ainsi que les risques
de toxicité hépatique (en particulier lors d’une association avec l’alcool), doivent être
désormais clairement indiqués sur l’emballage. Une diminution des posologies maximales
recommandées (passage de 4 à 3,25gr/jour) a été proposée, mais celle-ci n’a pas encore été
adoptée (Graham et al., 2010).

105
Alors que la vente exclusive du paracétamol en pharmacie semble limiter les cas
d’intoxication, notamment en France (Polson and Lee, 2007), le rapport ATTALI en 2008 avait
troublé les professionnels de santé en proposant la levée du monopole officinal dans la
vente des médicaments ne nécessitant pas de prescription médicale. Ce débat a d’ailleurs
ressurgit récemment en France avec un rapport de l'Inspection Générale des Finances (IGF)
qui s'en prend, entre autre, au monopole des pharmaciens. De fait, vu le nombre de cas
d’intoxications médicamenteuses et les coûts de santé engendrés par les hospitalisations
dans les pays où la vente est moins restrictive, les autorités de santé devront bien réfléchir
quant aux conséquences sanitaires potentiellement délétères d'ouvrir à la concurrence la
vente de médicaments dont la prescription est facultative (ou de médicaments non
remboursables), en particulier pour ceux contenant du paracétamol.

106
ARTICLE 1

Michaut A, Moreau C, Robin MA, Fromenty B. Acetaminophen-induced liver injury in


obesity and nonalcoholic fatty liver disease. Liver International 2014; 34: e171-9.

Cette revue de la littérature fait le point sur l’hépatotoxicité du paracétamol dans un


contexte d’obésité et de NAFLD. Dans cet article, nous faisons d’abord un bref rappel sur les
principales caractéristiques du métabolisme du paracétamol ainsi que sur les mécanismes
généraux d’hépatotoxicité de ce médicament. Nous citons ensuite toutes les études
cliniques et expérimentales publiées se rapportant à l’hépatotoxicité du paracétamol chez
des patients ou des animaux obèses présentant une NAFLD. Concernant les études
expérimentales sur des rongeurs, nous en citons sept publiées depuis 1987. Parmi ces
études, cinq d'entre elles ont constaté que l’obésité et la NAFLD étaient associées à une plus
forte hépatotoxicité du paracétamol administré à fortes doses. Malheureusement, ces
études observationnelles ne permettent pas de proposer des mécanismes qui pourraient
expliquer cette toxicité hépatique accrue, bien que certaines investigations suggèrent que
l'induction préexistante du cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) pourrait jouer un rôle important
en favorisant la génération de N-acétyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI), le métabolite toxique
de paracétamol. De plus, certaines données suggèrent que d’autres facteurs pourraient
favoriser l’hépatotoxicité du paracétamol, telles que la déplétion en glutathion et la
dysfonction mitochondriale qui peuvent être associées à la NAFLD, en particulièrement au
stade de la NASH (Nonalcoholic Steatohepatitis). En revanche, d’autres investigations
semblent indiquer que certains facteurs pourraient protéger vis-à-vis de l’hépatotoxicité du
paracétamol chez les personnes obèses. C’est le cas par exemple de l’augmentation de la
glucuronidation du paracétamol et de la diminution de l'activité du CYP3A4 au niveau
hépatique, ainsi que de l'augmentation du volume de distribution de ce médicament. En
conséquence, le risque et la gravité de l’hépatotoxicité du paracétamol chez les personnes
obèses souffrant d’une NAFLD pourraient dépendre d'un équilibre précaire entre les facteurs
métaboliques qui protègent le foie et d’autres facteurs qui vont favoriser la génération
hépatique de grandes quantités de NAPQI ainsi que ses effets toxiques sur certaines cibles
cellulaires, et en particulier les mitochondries.
107
108
Liver International ISSN 1478-3223

REVIEW ARTICLE

Acetaminophen-induced liver injury in obesity and nonalcoholic fatty


liver disease
Ana€ıs Michaut1, Caroline Moreau1,2, Marie-Anne Robin1 and Bernard Fromenty1
1 INSERM, U991, Universite de Rennes 1, Rennes, France
2 Laboratoire de Biochimie et Toxicologie, CHU Pontchaillou, Rennes, France

Keywords Abstract
acetaminophen – hepatotoxicity – obesity – Although acetaminophen (APAP) is usually considered as a safe drug, this
fatty liver – steatosis – cytochrome P450 2E1 painkiller can lead to acute liver failure after overdoses. Moreover, there is
evidence that the maximum recommended dosage can induce hepatic cytoly-
sis in some individuals. Several predisposing factors appear to enhance the
Correspondence
risk and severity of APAP-induced liver injury including chronic alcoholic
Dr Bernard Fromenty, INSERM UMR991,
liver disease and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), which refers to a
Facult
e de Pharmacie. 2, avenue du
Professeur L
eon Bernard, 35043 Rennes
large spectrum of hepatic lesions linked to obesity. In contrast, obesity by
Cedex, France
itself does not seem to be associated with a higher risk of APAP-induced liver
Tel: +33 2 23 23 30 44 injury. Since 1987, seven studies dealt with APAP-induced hepatotoxicity in
Fax: +33 2 23 23 53 85 rodent models of NAFLD and five of them found that this liver disease was
e-mail: bernard.fromenty@inserm.fr associated with higher APAP toxicity. Unfortunately, these studies did not
unequivocally established the mechanism(s) whereby NAFLD could favour
Received 9 January 2014 APAP hepatotoxicity, although some investigations suggested that pre-exis-
Revised 10 February 2014 tent induction of hepatic cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) could play a sig-
Accepted 23 February 2014 nificant role by increasing the generation of N-acetyl-p-benzoquinone imine
(NAPQI), the toxic metabolite of APAP. Moreover, pre-existent mitochon-
DOI:10.1111/liv.12514 drial dysfunction associated with NAFLD could also be involved. In contrast,
Liver Int. 2014: 34: e171–e179 some investigations suggested that factors that could reduce the risk and
severity of APAP hepatotoxicity in obesity and NAFLD include higher hepa-
tic APAP glucuronidation, reduced CYP3A4 activity and increased volume of
body distribution. Thus, the occurrence and the outcome of APAP-induced
liver injury in an obese individual with NAFLD might depend on a delicate
balance between metabolic factors that can be protective and others that
favour large hepatic levels of NAPQI.

Acetaminophen (APAP), also known as paracetamol, is APAP-induced hepatotoxicity. These factors include
one of the most widely prescribed drugs for the manage- malnutrition and fasting, chronic alcohol abuse and
ment of pain and hyperthermia, even though its mode alcoholic liver disease, and hepatitis C virus infection
of action is still under investigation (1). The current (9–11). Another factor could be comedication with
maximum recommended dosage of APAP is 4 g/day in drugs inducing cytochromes P450 (CYPs), such as iso-
adults and 60–75 mg/kg/day in children. Although niazid, rifampicin and phenobarbital (12, 13), or with
APAP is usually considered as a safe drug, APAP intoxi- drugs which may modulate liver injury and/or repair
cation after overdosage can lead to massive hepatocellu- (14). The risk of APAP-induced liver injury could also
lar necrosis and acute liver failure (2, 3). At the be enhanced by some gene polymorphisms, in particular
moment, N-acetylcysteine is the only approved drug to in genes encoding APAP metabolizing enzymes (15, 16).
treat APAP-induced liver injury in patients after volun- Lastly, a large retrospective study also reported that
tary, or unintentional, APAP overdose (4). Importantly, obesity-related nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD)
there is accumulating evidence that the maximum rec- could be a risk factor for APAP-induced acute liver
ommended dose can induce mild-to-moderate hepatic injury after APAP overdose (9).
cytolysis, even in healthy individuals (5, 6). It is also Nonalcoholic fatty liver disease refers to the large
noteworthy that long-term APAP ingestion can induce spectrum of liver lesions in obese individuals ranging
chronic liver injury in some patients, such as granulom- from fatty liver to nonalcoholic steatohepatitis (NASH)
atous hepatitis and cirrhosis (7, 8). and cirrhosis. In some countries such as the United
Different predisposing factors are known, or sus- States, it is estimated that the prevalence of NAFLD in
pected, to significantly enhance the risk and severity of the general population could be about 20% in adults

Liver International (2014)


© 2014 John Wiley & Sons A/S. Published by John Wiley & Sons Ltd e171
Acetaminophen hepatotoxicity in obesity Michaut et al.

and 10% in children and adolescents (17, 18). Actually, hepatic activity of CYP2E1 and higher APAP glucuroni-
a majority of overweight and obese people develop fatty dation have consistently been reported in obesity and
liver, which is characterized by the presence of large vac- NAFLD (22, 34–36), although the exact mechanisms of
uoles of lipids (mainly triacylglycerol) within the he- these alterations are still poorly understood. In contrast,
patocytes. During obesity, a major mechanism leading hepatic activity of CYP3A4 is reduced in obesity and
to hepatic accretion of lipids is insulin resistance, which NAFLD (36, 37).
favours the redistribution of fat from adipose tissue to After its formation, NAPQI is rapidly detoxified by
the liver and higher de novo lipogenesis in hepatocytes hepatic reduced glutathione (GSH) when APAP is taken
(19, 20). Importantly, fatty liver can progress in the long at the recommended dosage. However, after APAP over-
term to NASH in 10–20% of patients. NASH is charac- dose, high levels of NAPQI can induce several detrimen-
terized not only by steatosis but also by necroinflamma- tal effects within the liver. Indeed, hepatocellular GSH
tion (with ballooning degeneration of hepatocytes), stocks are quickly depleted and once GSH is no longer
some fibrosis and the presence of apoptotic hepatocytes. available for NAPQI detoxication, this reactive metabo-
Key factors involved in the pathogenesis of NASH lite binds to different macromolecules, including cyto-
include oxidative stress, lipid peroxidation, mitochon- solic and mitochondrial proteins (38, 39). These early
drial dysfunction and overproduction of proinflamma- cellular events are then followed by c-jun N-terminal
tory and profibrotic cytokines (20, 21). Impaired kinase (JNK) activation, profound mitochondrial dys-
activity of the mitochondrial respiratory chain and function and ATP depletion, overproduction of ROS
induction of CYP2E1 are two major factors leading to and peroxynitrite and massive hepatocellular necrosis
reactive oxygen species (ROS) overproduction during (23, 26, 40). Finally, this initial liver injury is followed
NASH (20, 22). by other key events such as inflammation, repair and
As previously mentioned, clinical investigations regeneration that play a major role in the outcome of
reported that NAFLD could favour APAP-induced acute APAP-induced hepatotoxicity (23, 25, 41).
liver failure after an overdose. Moreover, studies were
performed in different animal models of obesity and
Data from clinical investigations
NAFLD to find out whether these metabolic diseases
could favour APAP-induced liver injury. To find out the As already mentioned in the introduction, a large retro-
clinical and experimental studies dealing with the topic spective study reported an increased risk of APAP-
of this review, we performed a PubMed search of litera- induced acute liver injury after APAP overdose in
ture published in the English language using the combi- patients with NAFLD (9). In this study, patients with
nation of at least two of the following queries: pre-existent NAFLD and hospitalized for APAP over-
acetaminophen, obesity (or obese), liver, ‘fatty liver’, dose had more than a seven-fold higher prevalence of
NASH, injury and ‘risk factors’. In the present article, acute liver injury as compared to those without NAFLD
the main findings of these clinical and experimental (9). In a subsequent report, Myers and Shaheen reanaly-
investigations will be presented and subsequently dis- sed the same database by taking into account potential
cussed. Prior to these sections, some major features of differences in overdose circumstance, which could be a
APAP metabolism and liver toxicity will be recalled. significant confounding factor (42). This reanalysis sup-
ported the previous findings of a higher risk of APAP-
induced hepatotoxicity in patients with NAFLD (9),
Main features of APAP metabolism and hepatotoxicity
even though the magnitude of this risk was attenuated
This section will only summarize the current knowledge (i.e. 3.91 vs. 7.43). Importantly, both studies showed
about APAP metabolism and mechanisms of hepatotox- that the risk of severe acute liver injury after APAP over-
icity as several comprehensive reviews were recently dose was increased about similarly with NAFLD and
published on these topics (23–26). Briefly, APAP is alcoholic liver disease (9, 42). In contrast, two studies
mainly metabolized in the liver by phase II conjugating reported that the susceptibility to APAP-induced acute
enzymes into the nontoxic glucuronide and sulphate liver injury was similar, or lower, in obese patients com-
conjugates, which respectively represent about 55% and pared to nonobese individuals, but NAFLD was unfor-
30–40% of the initial APAP dose (24, 27). In addition, a tunately not taken into consideration in these
small amount of APAP is oxidized to the highly reactive investigations (43, 44). Interestingly, in one of these
metabolite N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) by studies, obese patients had significantly poorer out-
several CYPs, especially by CYP2E1 and CYP3A4 (28, comes after acute liver failure (43). Altogether, these
29). There is strong evidence that CYP2E1 is the main clinical investigations suggest that NAFLD, rather than
enzyme generating NAPQI in mice (29, 30), but several obesity by itself, could increase the risk of APAP-
investigations suggested that CYP3A4 could also be an induced acute liver injury after APAP overdose. This
important enzyme catalysing NAPQI generation in important point will be discussed later on. However, it
human (31–33). Importantly, obesity and related meta- is noteworthy that the discordant results between the
bolic disorders are associated with significant alterations aforementioned studies on the association between NA-
of APAP pharmacokinetics. In particular, increased FLD/obesity and APAP-induced acute liver injury could

Liver International (2014)


e172 © 2014 John Wiley & Sons A/S. Published by John Wiley & Sons Ltd
Michaut et al. Acetaminophen hepatotoxicity in obesity

be caused by differences in the criteria adopted to define C57BL/6J-ob/ob (ob/ob) are characterized by a muta-
these conditions in patients. tion in the leptin gene. Indeed, lack of the adipokine
As previously mentioned, there is evidence that pre- leptin leads to increased food consumption and lower
scription of APAP at the recommended dosage can energy expenditure, thus resulting in massive obesity,
induce mild-to-moderate hepatic cytolysis, even in insulin resistance, dyslipidaemia and severe fatty liver
healthy individuals (5, 6). However, it is still unclear (51, 52). C57BL/KsJ-db/db mice and Zucker fa/fa rats
whether NAFLD could enhance the risk, or the severity, present a mutation in the gene encoding leptin receptor,
of liver injury after therapeutic dose of APAP, although which disrupts leptin signalling and induces obesity,
this has been reported in some obese patients (45). insulin resistance and fatty liver (46, 52). The KK-Ay
mice, which present a defect in the signalling of the mel-
anocortin receptors, spontaneously develop obesity,
Data from experimental studies
fatty liver, type 2 diabetes, arterial hypertension and dia-
Different rodent models of obesity and NAFLD can be betic nephropathy (46, 52, 53). These genetic rodent
used experimentally, in particular in investigations deal- models of obesity are associated with metabolic disor-
ing with the hepatotoxic effects of chemicals such as ders that are more severe compared to the nutritional
APAP (Table 1). Classically, obesity and related meta- models, but usually with less variability between the ani-
bolic disorders can be induced by different types of mals.
high-calorie diets (including high-fat and high-sucrose/ From 1987 to 2012, six different studies reported the
fructose diets), by genetic defects altering different key effect of acute APAP intoxication in several animal
physiological functions such as food intake and energy models of obesity and NAFLD (54–59). The main data
expenditure, or by the combination of nutritional and from these investigations are presented in Table 1. In
genetic approaches (46–50). Among the more com- addition, one study reported APAP hepatotoxicity in a
monly used murine models of genetic obesity, the murine model of methionine and choline deficient

Table 1. Studies reporting APAP-induced acute liver injury in different animal models of NAFLD
References Animal models of NAFLD Presence of NAFLD Dose of APAP Response to APAP toxicity CYP2E1 activity
Corcoran and Male Sprague-Dawley Not reported in 710 mg/kg Higher toxicity after 48 h, Not reported in this
Wong (54) rats fed with a high-fat this study* (i.p.) compared to rats fed a study*
diet for 24 weeks standard diet
Blouin Obese male Zucker Not reported in 1300 mg Similar toxicity after 48 h, Not reported in this
et al. (55) fa/fa rats this study† (p.o.) compared to lean rats study†
Ito et al. (56) Male C57Bl/6 mice Yes 300 mg/kg Lower toxicity after 6 h, Not reported in this
fed a ‘Western-style’ (p.o.) compared to mice fed study*
diet for 16 weeks a standard diet
Male ob/ob mice Not reported in 300 mg/kg Lower toxicity after 6 h, Not reported in this
this study‡ (p.o.) compared to wild-type study‡
mice
Kon et al. (57) Male KK-Ay mice Yes 300 or Higher toxicity after 6 h, Not reported in this
600 mg/kg compared to wild-type study§
(p.o.) mice
Kucera Male Sprague-Dawley Yes 1 g/kg Higher toxicity after Not reported in this
et al. (58) rats fed a high-fat (p.o) 24 and 48 h, compared study*
diet for 6 weeks to rats fed a standard diet
Aubert Female db/db mice Yes 500 mg/kg Higher toxicity after 8 h, Increased
et al. (59) (p.o.) compared to wild-type
mice
Female ob/ob mice Yes 500 mg/kg Similar toxicity after 8 h, Unchanged
(p.o.) compared to wild-type
mice
Donthamsetty Male Swiss Webster mice Yes 360 mg/kg Higher toxicity from 6 to Unchanged
et al. (60) fed a MCD diet for (i.p.) 48 h after overdose, compared
1 month to mice fed a standard diet

*Different investigations in rats showed that long-term feeding with high-fat diets induce NAFLD (reviewed in 46 and 49) and increase the expression
and/or activity of CYP2E1 (reviewed in 22).
†Other studies showed that male obese and insulin resistant Zucker fa/fa rats present moderate fatty liver (106, 107), but reduced CYP2E1 activity
(106, 108).
‡Other studies showed that male obese and diabetic ob/ob mice present major fatty liver (50, 104, 109), with unchanged (59) or reduced (67)
CYP2E1 activity.
§One study showed that male KK-Ay mice present unchanged hepatic mRNA expression of CYP2E1 (110).

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Acetaminophen hepatotoxicity in obesity Michaut et al.

(MCD) diet-induced steatohepatitis (Table 1) (60). injury might be explained by lipid accumulation and
However, it must be pointed out that the MCD diet oxidative stress associated with NAFLD. Regarding lipid
consistently leads to a dramatic loss of body weight (61– accretion, it is noteworthy that higher APAP hepatotox-
63) and does not induce systemic insulin resistance (63, icity in female db/db mice compared to female ob/ob
64). It is also noteworthy that the doses of APAP greatly mice was observed despite lower lipid accumulation in
varied in these seven studies, with the highest doses used db/db liver (59). Importantly, the basal plasma levels of
in the rat models (Table 1). This is because rats are ALT and AST (i.e. before APAP intoxication) were com-
much more resistant to APAP-induced liver injury com- parable between female db/db and female ob/ob mice
pared to mice (65, 66). (59). Thus, increased susceptibility to APAP hepatotox-
Among these different studies (Table 1), four of them icity in female db/db mice cannot be attributed to the
showed that NAFLD was associated with higher liver pre-existence of higher hepatic cytolysis. However, fur-
injury after a single APAP overdose (57–60). Another ther studies will be required to find out whether the
study also showed higher APAP toxicity in rats fed a accumulation of some lipid species could be involved.
high-fat diet (54), although the presence of NAFLD can Indeed, it is noteworthy that db/db hepatocytes present
only be suspected in this study (Table 1). In contrast, more microvesicular steatosis and less macrovacuolar
the remaining investigations showed similar (55) or steatosis compared to ob/ob hepatocytes (50, 59).
lower liver injury (56). Unfortunately, there is no defi- Because the size of the droplets is greatly dependent on
nite explanation for these discrepancies, although some their lipid composition (69, 70), it is possible that the
hypotheses can be put forward. For instance, investiga- accumulation of some specific lipid species in female
tions in male and female ob/ob and db/db mice showed db/db hepatocytes could have played a role in the higher
that the hepatic CYP2E1 status could play a significant susceptibility to APAP toxicity.
role (59). Indeed, higher APAP hepatotoxicity was Nonalcoholic fatty liver disease is associated with oxi-
observed in female db/db mice but not in female ob/ob dative stress, which can alter different cellular compo-
mice and this was associated with a specific induction of nents such as nucleic acids and unsaturated fatty acids
CYP2E1 activity in the first group of animals. Interest- (20, 71, 72). Moreover, hepatic GSH reserves could be
ingly, hepatic CYP2E1 activity was unchanged (59) or lowered in NAFLD, thus reducing the antioxidant
reduced (67) in male ob/ob mice and this could explain capacity of the fatty hepatocytes (20, 73). Hence, the
why Ito and collaborators reported lower acute APAP higher susceptibility to APAP hepatotoxicity observed
hepatotoxicity in this model (56). It is also noteworthy in some rodent models of obesity might be related to
that plasma levels of APAP-glucuronide and APAP-sul- basal oxidative stress and lower GSH levels. Yet, basal
phate were almost similar between female db/db mice hepatic GSH levels were not significantly reduced in two
and female ob/ob mice after 500 mg/kg of APAP (59). rodent models of obesity showing higher vulnerability
Hence, the observed difference of APAP-induced hepa- to APAP toxicity (58, 59). It is however noteworthy that
totoxicity between these murine models cannot be total GSH levels were assessed in these studies and thus
attributed to APAP glucuronidation and sulphation. it will be important to determine whether mitochon-
At the moment, it is still unclear why hepatic CYP2E1 drial GSH was specifically depleted. Indeed, some inves-
is specifically induced in female but not in male db/db tigations suggested a key role of the mitochondrial pool
mice (59). Although there was an overall positive corre- of GSH in APAP-induced liver injury (74, 75).
lation between hepatic CYP2E1-mediated aniline As previously mentioned, JNK activation plays a
hydroxylase activity and plasma glucose in all groups of major role in APAP-induced hepatotoxicity (23, 26, 40).
untreated mice (i.e. wild-type, ob/ob and db/db of both Interestingly, JNK activation could also play a signifi-
sexes), plasma glucose levels were not different between cant role in NAFLD pathogenesis (76, 77). Only two
male and female db/db mice (59). Thus, hepatic studies examined the hepatic JNK status in obese ani-
CYP2E1 induction in female db/db mice may not be mals intoxicated by APAP (57, 59). In the first study,
explained by the severity of insulin resistance and type 2 JNK activation (as assessed by phospho-JNK) after
diabetes in these animals, contrary to what has been APAP intoxication was significantly stronger in obese
suggested by some investigations (22). In addition, there and diabetic KK-Ay mice compared to wild-type mice,
was no difference in plasma b-hydroxybutyrate levels and this was associated to higher APAP hepatotoxicity
between female and male db/db mice (59). This suggests in the obese animals (57). In the second study, increased
that ketone bodies may not be responsible for CYP2E1 APAP hepatotoxicity in db/db mice was not associated
induction in female db/db mice, although previous to higher JNK phosphorylation (59). Unexpectedly,
investigations found a significant correlation between hepatic JNK was specifically activated in ob/ob mice
plasma b-hydroxybutyrate levels and hepatic CYP2E1 although these animals did not present higher APAP
activity (34, 68). Thus, further investigations will be liver injury (59). Thus, JNK activation might not be a
needed to determine the exact mechanism of higher key mechanism of APAP hepatotoxicity in some murine
hepatic CYP2E1 activity in female db/db mice. models of NAFLD. Further investigations will be needed
Besides differences in APAP biotransformation to to assess phospho-JNK not only in whole liver but also
NAPQI, higher susceptibility to APAP-induced liver in isolated mitochondria (78).

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Michaut et al. Acetaminophen hepatotoxicity in obesity

In addition to the investigations performed in rodent obesity and NAFLD (36, 37, 90, 91), and this may
models of obesity, one study reported the effect of acute reduce the generation of NAPQI. In addition, obesity
APAP intoxication in a murine model of MCD diet- could lead to reduced APAP gastrointestinal absorption
induced steatohepatitis (Table 1) (60). In this study, rate and higher APAP volume of distribution, thus
higher APAP hepatotoxicity was observed despite the favouring lower APAP plasma concentrations (92, 93).
lack of pre-existent CYP2E1 induction and the presence Thus, it appears that the occurrence of APAP-induced
of normal basal hepatic GSH levels (60), suggesting the liver injury in an obese individual will depend on a deli-
involvement of other mechanism(s). Interestingly, the cate balance between metabolic factors that can be pro-
basal hepatic ATP levels were already reduced by 45% in tective (higher APAP glucuronidation and volume of
mice fed the MCD diet (60), which is consistent with a distribution, lower absorption rate and CYP3A4 activ-
significant impairment of the mitochondrial respiratory ity) and others that can augment the hepatic production
chain and oxidative phosphorylation in this experimen- of NAPQI (CYP2E1 induction), or reduce the detoxica-
tal model (79, 80). Hence, severe pre-existent mitochon- tion of this highly reactive metabolite (lower GSH
drial dysfunction might have played a role in the higher stores) (Fig. 1).
APAP hepatotoxicity observed in mice fed the MCD
diet.

General discussion APAP-induced liver injury in obesity and NAFLD


Although the presence of NAFLD in obese individuals Factors that could protect against liver injury
seems to increase the risk of APAP-induced acute liver
injury (9, 42), these clinical studies did not address the Gastrointestinal absorption Hepatic glucuronidation
mechanism whereby APAP could be more toxic in this
Volume of distribution Hepatic CYP3A4 activity
metabolic situation. Nevertheless, increased hepatic
CYP2E1 activity has frequently been reported in patients
with NAFLD (22, 34, 81–83), as previously mentioned.
However, it is still unclear whether CYP2E1 induction is APAP plasma levels Generation of NAPQI
specifically linked to this liver disease, or to other meta-
bolic disturbances linked to obesity, such as insulin
resistance and type 2 diabetes (22). In the experimental
studies, fatty liver in obese rodents was in general associ- Lower risk and severity of hepatic cytolysis
ated with higher hepatotoxicity after APAP overdoses
(Table 1)(57–59). In one of these studies, increased Factors that could favour liver injury
acute liver injury seemed to correlate with pre-existent
hepatic CYP2E1 induction, but not with the degree of Hepatic CYP2E1 activity Presence of NASH?
fat accretion (i.e. severity of fatty liver) (59). However, it Hepatic GSH stores Mito dysfunction?
is important to point out that greater hepatotoxicity in
these different experimental studies was observed after
the administration of APAP doses that were adapted to
body weights. Hence, obese animals were treated with Generation of NAPQI Mito dysfunction
higher absolute doses of APAP. NAPQI detoxication Oxidative stress
Contrasting with these studies, obesity was not asso-
ciated with higher APAP hepatotoxicity in patients (for
whom the presence of NAFLD was not reported, as pre- Stronger risk and severity of hepatic cytolysis
viously pointed out) (43, 44). Experimentally, similar or
lower APAP hepatotoxicity was observed in some
rodent models of obesity (Table 1) (55, 56, 59). NAFLD Fig. 1. Factors that could modulate the risk and severity of APAP-
induced hepatotoxicity in obesity and NAFLD. (A) Factors that could
was objectified only in some of these investigations, but
protect against APAP-induced liver injury include reduced gastroin-
for those where NAFLD was not determined it should testinal absorption and hepatic CYP3A4 activity, as well as higher
be mentioned that previous studies demonstrated the volume of distribution and hepatic glucuronidation. Overall, these
presence of NAFLD in the same animal models factors can reduce plasma levels of APAP and the hepatic genera-
(Table 1). Interestingly, obesity has been associated with tion of NAPQI, a highly toxic APAP metabolite. (B) Factors that
higher APAP glucuronidation and clearance in different could favour APAP-induced liver injury include higher hepatic
clinical and experimental investigations (35, 36, 59, 84– CYP2E1 activity, which leads to NAPQI overproduction and lower
GSH stores in liver, which reduce its ability to detoxify NAPQI. Fur-
86), as previously mentioned. In contrast, the influence ther investigations will be required to determine whether the pres-
of obesity and NAFLD on APAP sulphation is unclear ence of steatohepatitis (NASH) and/or the pre-existence of
since investigations in rodents and patients provided mitochondrial dysfunction could favour APAP-induced hepatotoxic-
divergent results (59, 87–89). CYP3A activity is lower in ity in obese individuals.

Liver International (2014)


© 2014 John Wiley & Sons A/S. Published by John Wiley & Sons Ltd e175
Acetaminophen hepatotoxicity in obesity Michaut et al.

potential CYP2E1 endogenous inducers might help not


Remaining issues and future directions
only to decipher the pathophysiology of NAFLD (22)
Although there is some evidence that CYP2E1 induction but also to understand why some obese individuals seem
could favour APAP-induced hepatotoxicity in the con- to present a higher risk of APAP-induced liver injury.
text of obesity and NAFLD, it is conceivable that other It must finally be pointed out that besides APAP,
hepatic disturbances could play a role. For instance, it other drugs such as halothane, methotrexate and some
will be important to determine whether the severity of antiretroviral drugs are suspected to be more hepato-
NAFLD could be a significant factor. Intuitively, one toxic in patients suffering from obesity and related
may expect that the presence of necroinflammation (i.e. metabolic disorders (99, 100). In contrast to APAP,
NASH) could be associated with a higher risk, as com- virtually no experimental investigations have been
pared to simple fatty liver. Likewise, the pre-existence of performed with these drugs to understand why obesity
mitochondrial dysfunction linked to NASH (20, 94) can favour their hepatotoxicity. In future, it will be
could be of importance since this cellular event plays a important to carry out experimental studies with the
key role in APAP-induced liver injury (23, 26, 40, 95). suspected drugs to determine the mechanism(s) of
The relationship between NAFLD, reduced levels of hepatotoxicity in the context of obesity and fatty liver,
hepatic GSH and APAP-induced liver injury will also although one may expect that some mechanisms of
require further investigations. hepatotoxicity could be common between certain drugs.
Considering the low number of clinical studies pub- In addition to in vitro studies using cellular models of
lished on APAP hepatotoxicity in obese patients, further nutritional fatty liver (101), in vivo investigations in
investigations are clearly required to gain more informa- obese rodents will be also required. Indeed, recent stud-
tion on this matter. More specifically, investigations will ies suggested that the effects of some xenobiotics on
be needed to determine which obese individuals will be liver could be dependent on extra-hepatic tissues such
at risk for APAP-induced hepatotoxicity and those who as intestine and white adipose tissue (102–105). Hence,
will not. Indeed, at the current stage of knowledge, the the mechanisms of drug-induced liver injury in obesity
health authorities cannot provide specific warnings for and NAFLD might be more complex than expected.
the whole obese population. Novel findings are not only
needed on acute liver injury after APAP overdose but Acknowledgements
also regarding APAP hepatotoxicity occurring during Conflict of interest: The authors do not have any disclo-
chronic administration (7, 8). Thus, physicians could be sures to report.
encouraged to carry out a regular monitoring of liver
function in obese patients treated with APAP, in partic-
ular in patients with pre-existing NAFLD. Large pro- References
spective studies will also be required to establish 1. Toussaint K, Yang XC, Zielinski MA, et al. What do we
whether dysmetabolic disturbances other than NAFLD (not) know about how paracetamol (acetaminophen)
could favour APAP hepatotoxicity, such as insulin resis- works? J Clin Pharm Ther 2010; 35: 617–38.
tance and type 2 diabetes. Interestingly, diabetes has 2. Craig DG, Bates CM, Davidson JS, et al. Overdose
been associated with a higher risk of severe drug- pattern and outcome in paracetamol-induced acute
induced liver injury (96), although APAP cases were severe hepatotoxicity. Br J Clin Pharmacol 2011; 71:
273–82.
excluded in this study. It will also be important to deter-
3. Antoine DJ, Dear JW, Lewis PS, et al. Mechanistic bio-
mine the precise mechanism of CYP2E1 induction in markers provide early and sensitive detection of acetami-
obese patients with NAFLD. Previous clinical studies nophen-induced acute liver injury at first presentation to
showed that hepatic CYP2E1 activity correlated with hospital. Hepatology 2013; 58: 777–87.
plasma ketone bodies and the degree of steatosis (34, 81, 4. Ferner RE, Dear JW, Bateman DN. Management of par-
82), suggesting that some lipid derivatives could be acetamol poisoning. BMJ 2011; 342: d2218.
CYP2E1 inducers in humans. In keeping with this 5. Watkins PB, Kaplowitz N, Slattery JT, et al. Aminotrans-
notion, current investigations in our laboratory indicate ferase elevations in healthy adults receiving 4 grams of
that CYP2E1 activity can significantly be induced in acetaminophen daily: a randomized controlled trial.
human hepatocytes by stearic acid, but not oleic acid. JAMA 2006; 296: 87–93.
6. Winnike JH, Li Z, Wright FA, et al. Use of pharmaco-
Moreover, our data show that stearate-induced CYP2E1
metabonomics for early prediction of acetaminophen-
induction is reduced by insulin in a concentration- induced hepatotoxicity in humans. Clin Pharmacol Ther
dependent manner. Interestingly, CYP2E1 activity was 2010; 88: 45–51.
not correlated with its mRNA and protein expression 7. Biour M, Ben Salem C, Chazouilleres O, et al. Drug-
suggesting post-translational regulation, as previously induced liver injury; fourteenth updated edition of the
reported in other pathophysiological situations (97, 98). bibliographic database of liver injuries and related drugs.
Thus, it appears that CYP2E1 activity in human liver Gastroenterol Clin Biol 2004; 28: 720–59.
could be controlled by some lipid derivatives and that 8. Watelet J, Laurent V, Bressenot A, et al. Toxicity of
lipid-induced CYP2E1 induction could be variable chronic paracetamol ingestion. Aliment Pharmacol Ther
depending on insulin signalling. Identification of the 2007; 26: 1543–4.

Liver International (2014)


e176 © 2014 John Wiley & Sons A/S. Published by John Wiley & Sons Ltd
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118
ARTICLE 2

Michaut A, Le Guillou D, Moreau C, McGill MR, Bucher S, Martinais S, Gicquel T, Morel I,


Robin MA, Jaeschke H, Fromenty B. A cellular model to study drug-induced liver injury in
nonalcoholic fatty liver disease: application to acetaminophen.

Cet article sera soumis dans les semaines à venir.

Dans ce travail, nous avons dans un premier temps mis au point un modèle cellulaire
de NAFLD, en essayant de reproduire certaines caractéristiques importantes de ces
pathologies hépatiques associées à l’obésité. Nous nous sommes en particulier intéressés à
l’activité des cytochromes P450 2E1 (CYP2E1) et 3A4 (CYP3A4), ainsi qu’aux modifications de
l’expression de certains gènes liés au métabolisme glucido-lipidique. Pour cela, nous avons
incubé pendant une semaine des cellules HepaRG avec de l’acide stéarique (C18:0), ou de
l’acide oléique (C18:1), en présence de 3 concentrations différentes d’insuline (0, 0,01 et 5
µg/ml). Dans un deuxième temps nous avons traitées les cellules HepaRG stéatosiques ou
non avec différentes concentrations de paracétamol. Les principaux résultats obtenus au
cours de mon travail de thèse sont les suivants:

1) Les quantités de triglycérides cellulaires sont équivalentes entre les conditions


d’incubation des cellules HepaRG avec l’acide stéarique et l’acide oléique. De plus, ces deux
acides gras entraînent une l’augmentation similaire de l’expression des gènes connus pour
être régulés par les lipides, comme APOA4, PLIN1 et PLIN2.

2) L’incubation des cellules HepaRG avec l'acide stéarique est associée à une
augmentation de l'activité du CYP2E1 et à une diminution de l'activité du CYP3A4,
reproduisant ainsi différents données cliniques et expérimentales obtenues dans un
contexte d’obésité et de NAFLD. En revanche, l'acide oléique n'a pas d’effet sur l'activité de
ces CYPs. Les effets des deux acides gras sur ces CYPs sont donc différents alors que
l’intensité de la stéatose est comparable.

3) Les expériences effectuées avec différentes concentrations d'insuline montrent


que l'activité du CYP2E1 est régulée négativement par l'insuline de façon concentration-

119
dépendante. Malgré cela, l'insuline est responsable d’une augmentation de l’expression du
CYP2E1, un effet qui est également dépendant de la concentration de cette hormone. Des
expériences réalisées sur des cultures d’hépatocytes primaires humains montrent que
l'insuline réduit également l'activité de CYP2E1 avec une augmentation concomitante des
taux d'ARNm de ce CYP.

4) Comme attendu, l'insuline augmente l'expression de différents gènes impliqués


dans la synthèse des lipides tels que SREBF1, FASN et SCD1. L'insuline induit également une
augmentation de l'expression de PNPLA3. Ces effets de l’insuline sont observés sur les
cellules HepaRG et sur les hépatocytes primaires humains.

5) Les investigations réalisées avec une large gamme de concentrations de


paracétamol (2,5 à 20 mM) montrent que la perte d'ATP cellulaire est presque toujours plus
forte en présence d'acide stéarique. En revanche, la cytotoxicité de ce médicament était à
peu près semblable entre les cellules HepaRG non stéatosiques et celles incubées avec de
l'acide oléique.

6) Les expériences effectuées avec le chlorméthiazole (CMZ, un inhibiteur


prototypique du CYP2E1) indiquent que la plus forte cytotoxicité observée avec 2,5 et 20
mM de paracétamol en présence d'acide stéarique peut être attribué, au moins en partie, à
l'activité du CYP2E1. Toutefois, l'implication du CYP2E1 dans la cytotoxicité du paracétamol
observée en absence d’insuline ne semble significative qu’avec 20 mM de ce médicament.
De façon intéressante, nos expériences montrent également que dans les cellules HepaRG
non traitées avec le paracetamol, la perte (légère à modérée) de l'ATP cellulaire observée
dans certaines conditions est secondaire à l'activité basale du CYP2E1.

7) De façon surprenante, la protection exercée par le CMZ vis-à-vis de la cytotoxicité


du paracétamol (i.e. perte d’ATP) n’est pas associée à une augmentation des concentrations
cellulaires de GSH, ni à une diminution des quantités d’adduits paracétamol-protéines.

Ces résultats seront globalement repris et discutés dans la discussion générale de la


Thèse.

120
A cellular model to study drug-induced liver injury in nonalcoholic
fatty liver disease: application to acetaminophen

Anaïs Michaut1, Dounia Le Guillou1, Caroline Moreau1,2, Mitchell R. McGill3, Simon Bucher1,
Sophie Martinais1, Thomas Gicquel1,2, Isabelle Morel1,2, Marie-Anne Robin1, Hartmut
Jaeschke3, Bernard Fromenty1*

1
INSERM, U991, Université de Rennes 1, Rennes, France ; 2Laboratoire de Biochimie et
Toxicologie, CHU Pontchaillou, Rennes, France ; 3Department of Pharmacology, Toxicology
and Therapeutics, University of Kansas Medical Center, Kansas City, KS, USA

*To whom correspondence should be addressed. Phone: 33-2-23-23-30-44; Fax: 33- 2-23-23-
53-85; E. mail : bernard.fromenty@inserm.fr

Running title: Cellular model of human NAFLD and APAP hepatotoxicity

Abbreviations: ACACA, acetyl-CoA carboxylase alpha; AICAR, 5-aminoimidazole-4-


carboxyamide ribonucleoside; APAP, acetaminophen; APOA4, apolipoprotein A-IV; CMZ,
chlormethiazole; CYP, cytochrome P450; FABP4, fatty acid binding protein 4; FASN, fatty acid
synthase; GSH, glutathione; NAFLD, nonalcoholic fatty liver disease; NAPQI, N-acetyl-p-
benzoquinone imine; PDK4, pyruvate dehydrogenase kinase 4; PHH, primary human
hepatocytes; PNPLA3, patatin-like phospholipase domain containing 3; PLIN, perilipin; SCD1,
stearoyl-Coenzyme A desaturase 1; SREBF1, sterol regulatory element binding transcription
factor 1

Key words: NAFLD, obesity, liver, hepatotoxicity, acetaminophen, CYP2E1

121
Abstract

Obesity and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) have been reported to increase the
susceptibility of hepatotoxicity induced by some xenobiotics including drugs, but the involved
mechanisms are still poorly understood. For toxic compounds such as ethanol and
acetaminophen (APAP), a role of hepatic cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) is suspected since the
activity of this enzyme is consistently enhanced during obesity and NAFLD. The first aim of our
study was to set up a cellular model of NAFLD characterized not only by triglyceride
accumulation but also by higher CYP2E1 activity. To this end, differentiated human HepaRG
cells were incubated during one week with stearic acid, or oleic acid, in the presence of
different concentrations of insulin. Cellular triglycerides and the expression of lipid-responsive
genes were similar with both fatty acids. However, CYP2E1 activity was significantly increased
only by stearate and this was associated with lower CYP3A4 activity, another metabolic feature
reported in NAFLD. CYP2E1 activity in HepaRG cells was reduced by insulin in a concentration-
dependent manner and this effect was reproduced in cultured primary human hepatocytes.
Hence, the highest CYP2E1 activity was observed in HepaRG cells with stearate and without
insulin. Next, the second aim of our study was to assess APAP cytotoxicity in HepaRG cells
presenting or not lipid accretion and CYP2E1 induction. Experiments with a large range of APAP
concentrations (1 to 20 mM) showed that the cellular loss of ATP and glutathione (GSH) was
almost always stronger in the presence of stearic acid. In cells pretreated with the CYP2E1
inhibitor chlormethiazole (CMZ), recovery of cellular ATP was significantly higher in the
presence of stearic acid with both low (2.5 mM) and high (20 mM) concentrations of APAP.
However, in the absence of insulin, CMZ-induced ATP recovery was significantly greater only for
20 mM of APAP. Surprisingly, there was no recovery of cellular GSH and no reduction of APAP-
protein adducts following CMZ pretreatment. Finally, levels of APAP-glucuronide were
significantly enhanced in the presence of insulin. Conclusions: When studied in specific
conditions of culture, the HepaRG cell line can be a valuable model of human NAFLD, especially
regarding CYP2E1 and CYP3A4 activity. Our data also suggest that higher CYP2E1 activity in
NAFLD could be secondary to the hepatic accumulation of some fatty acids and to the presence
of low insulin signaling. Hence, this cellular model can be used to unveil some important
metabolic and hormonal factors which can favor APAP hepatotoxicity in obese individuals.
122
Introduction

Liver injury can be induced by numerous drugs of our modern pharmacopoeia, herbals
and industrial toxicants (Biour et al., 2004; Seeff et al., 2015; Wahlang et al., 2013). In the most
severe cases, xenobiotic-induced liver injury can require a hospitalization and eventually lead to
the death of the patient (Björnsson, 2009). Among the different predisposing factors increasing
the risk of liver injury, there are growing evidence that nonalcoholic liver disease (NAFLD) could
play a significant role (Robin et al., 2005a; Fromenty, 2013; Tarantino et al., 2007). NAFLD is
often associated with obesity and type 2 diabetes and encompasses a large spectrum of liver
lesions such as fatty liver, nonalcoholic steatohepatitis (NASH) and cirrhosis (Michelotti et al.,
2013).

Greater hepatotoxicity in the context of obesity and NAFLD has been documented in
rodents and humans with some drugs including acetaminophen (APAP), halothane and
methotrexate as well as other xenobiotics such as ethanol and carbon tetrachloride (Robin et
al., 2005a; Donthamsetty et al., 2007; Tarantino et al., 2007; Michaut et al., 2014; Fromenty,
2013). However, the mechanisms involved in this higher susceptibility are poorly understood
although different hypotheses have been put forward (Fromenty, 2013). Furthermore, these
mechanisms could be complex and different from one compound to another (Robin et al.,
2005a; Fromenty, 2013; Carmiel-Haggai et al., 2003). Importantly, obesity and NAFLD in rodents
and humans are associated with different alterations in the expression and activity of hepatic
enzymes involved in drug metabolism including cytochromes P450 (CYPs) and UDP-
glucuronosyltransferases. More specifically, these dysmetabolic disorders are associated with
higher CYP2E1 activity, lower CYP3A4 activity and increased capacity of glucuronide conjugation
for different drugs such as APAP and lorazepam (Aubert et al., 2011; Brill et al., 2012; Chalasani
et al., 2003; Emery et al., 2003; Kolwankar et al., 2007; Michaut et al., 2014).

Deciphering the mechanisms whereby some drugs and environmental toxins are more
hepatotoxic in the context of obesity and NAFLD requires appropriate experimental models.
Although obese mice and rats can be useful (Robin et al., 2005a; Carmiel-Haggai et al., 2003;
Aubert et al., 2011; Massart et al., 2012), there are numerous differences between rodents and
humans regarding hepatic drug metabolism (Chu et al., 2013; Martignoni et al., 2006). In
123
addition, investigations in animals are cumbersome and ethically problematic. Thus, a relevant
human cellular model could be helpful in order to study hepatotoxicity in NAFLD.

In the past few years, the metabolically competent human hepatoma HepaRG cells have
been shown to be a valuable model to study the mechanism of hepatotoxicity induced by drugs
and toxicants (Anthérieu et al., 2011; McGill et al., 2011; Savary et al., 2014; Sharanek et al.,
2014; Tobwala et al., 2015). In addition, HepaRG cells have been successfully used to study the
effects of nutrients, hormones and drugs on the expression of various enzymes involved in
carbohydrate and lipid metabolism (Anthérieu et al., 2011; Madec et al., 2011; Nagasawa et al.,
2007; Samanez et al., 2012).

By using the human HepaRG cell line, the aim of the present study was two-fold. First,
we thought to set up a cellular model of NAFLD, in particular regarding the alterations of
CYP2E1 and CYP3A4 activity that are observed in this hepatic disease. To this end,
differentiated HepaRG cells were treated for one week with stearic acid (C18:0) or oleic acid
(C18:1) in the presence of different concentrations of insulin. Second, we used this cellular
model of NAFLD in order to determine the cytotoxic effects of the painkiller APAP. Indeed,
several studies in rodents and humans reported that NALFD is associated with more severe
APAP-induced hepatotoxicity, especially after an overdose (Aubert et al., 2012; Kon et al., 2010;
Michaut et al., 2014; Myers and Shaheen, 2008; NGuyen et al., 2008). Notably, some of the
studies performed in rodents suggested that higher APAP hepatotoxicity in NAFLD could be
attributed to greater CYP2E1 activity (Aubert et al., 2012; Michaut et al., 2014), the primary
enzyme responsible for the biotransformation of APAP to the highly reactive and toxic
metabolite N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) (Hinson et al., 2010; McGill and Jaeschke,
2013). Overall, the results of the present study indicated that under selected culture conditions,
steatotic HepaRG cells can be used as a valuable model to study the impact of NAFLD on the
hepatotoxicity induced by APAP and other xenobiotics.

124
Materials and Methods

Chemicals. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside (AICAR), APAP, APAP-β-D-


glucuronide, APAP-sulfate, testosterone, 6β-hydroxytestosterone, chlormethiazole (CMZ),
chlorzoxazone, metformin, dimethyl sulfoxide (DMSO), oleic acid, stearic acid, insulin and oil
Red O were purchased from Sigma Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, France). William’s E
medium was obtained from Eurobio laboratories (Les Ulis, France). Fetal Bovine Serum (FBS)
was supplied by Lonza (Levallois-Perret, France). Glutamine, penicillin and streptomycin
were obtained from Invitrogen (Cergy Pontoise, France). Hydrocortisone hemisuccinate was
purchased from Upjohn Pharmacia (Guancourt, France). Protease and phosphatase
inhibitors were purchased from Roche Diagnostics (Indianapolis, IN).

Cell cultures and treatments. Native HepaRG cells were cultured as previously described
(Aninat et al., 2006). Briefly, HepaRG cells were seeded at a density of 2.6 104 cells/cm2 and
were first incubated in a William’s medium supplemented with 10% FBS, 100 units/ml
penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 mM glutamine, 5 µg/ml insulin and 50 µM
hydrocortisone hemisuccinate. After 2 weeks, cell differentiation was induced by the same
culture medium supplemented with 2% DMSO (differentiation medium) for 2 additional
weeks. Cells were subsequently treated for 7 days with different concentrations of insulin (0,
0.01 or 5µg/ml), stearic acid (0 or 100 µM), or oleic acid (0 or 100 µM). In some experiments,
lower or higher concentrations of fatty acids were used. For the APAP experiments, cells
were incubated with different concentrations of this drug (0 to 20 mM) during the last 6, 24
or 48h of the 7-day treatment. Stearic acid, oleic acid and APAP were dissolved in DMSO. For
the investigations performed with the prototypical CYP2E1 inhibitor CMZ, cells were
incubated 7 days with 150 µM of CMZ. Whatever the treatments, the culture medium was
renewed every 2 or 3 days during the 7-day experiments. For the experiments carried out
with the AMP-activated protein kinase (AMPK) activators AICAR and metformin, cells were
first preincubated for 6h with or without 500 µM of each activator. Cells were then treated
for 24h with 20 mM of APAP, with or without each AMPK activator (500 µM). HepaRG cells
were used at passages 11 to 15.

125
Primary human hepatocytes (PHH) from adult donors were prepared at Biopredic
International (Saint-Grégoire, France) by perfusion of liver fragments provided by the Centre
de Ressources Biologiques (CRB) Santé de Rennes. Hepatocytes were then immediately
seeded at a density of 11 104 cells/cm2 in a William’s E medium supplemented with 10% FBS,
100 units/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 mM glutamine, 5 µg/ml insulin and 5 µM
hydrocortisone hemisuccinate. The medium was discarded 12 h after seeding and cells were
then maintained in the same differentiation medium used for HepaRG cells, which was
renewed every other day. Two days after seeding, PHH were then treated or not with oleic
acid, stearic acid and insulin for one week.

Oil red O staining and triglycerides. For staining of neutral lipids, cells were washed with
phosphate-buffered saline, incubated for 45 min at room temperature with an oil red O-
saturated solution, washed in water, and observed under a phase-contrast microscope.
Triglyceride quantification was measured with a colorimetric kit purchased from Biovision
(Milpitas, CA), using the manufacturer’s recommendations.

Determination of CYP2E1 and CYP3A4 activities. In order to measure CYP2E1 and CYP3A4
activities, HepaRG cells or PHH were incubated for 6 and 2 hours in phenol red-free and
DMSO-free William’s E medium containing 300 µM chlorzoxazone or 200 µM testosterone,
respectively. At the end of the incubation, aliquots of culture media were collected and
stored at -80°C until analysis. 6-Hydroxychlorzoxazone was then quantified by high-
performance liquid chromatography (HPLC)-tandem mass spectrometry (Xenoblis, Rennes,
France), whereas 6β-hydroxytestosterone was measured by HPLC analysis, as previously
described (Aninat et al., 2006).

Cellular ATP and GSH. Cellular ATP was measured with the CellTiter-Glo® assay purchased
from Promega (Charbonnieres, France), using the manufacturer’s recommendations. Briefly,
HepaRG cells were incubated with the reagent 10 min at 37°C and the luminescent signal
was quantified using a POLARstar Omega microplate reader (BMG Labtech, Ortenberg,
Germany). Results were expressed in comparison to untreated cells. Total glutathione (GSH)

126
was quantified with the Glutathione assay kit purchased from Cayman Chemical (Ann Arbor,
USA), using the manufacturer’s recommendations.

Assessment of APAP metabolites and APAP-protein adducts. The quantification of APAP-β-


D-glucuronide and APAP-sulfate in the cell supernatants was performed on a Thermo
Scientific Q ExactiveTM mass spectrometer (San Jose, CA). An HESI-II ion source was used for
the electrospray ionization of the target compounds. Chromatographic separation of the
analytes was performed with an Accela pump (Thermo Scientific) equipped with a Thermo
Fisher Hypersil Gold C18 column (3.0 mm, 2.1, 100 mm) as previously described (Gicquel et
al. 2013). Data were acquired in Targeted SIM (Single Ion Monitoring) mode. For the
assessment of APAP-protein adducts in treated HepaRG cells, APAP-cysteine was measured
by using HPLC separation and electrochemical detection, as previously described (McGill et
al., 2011).

Isolation of RNA and real-time quantitative PCR analysis. Total RNA was extracted from ca.
106 HepaRG cells with the SV total RNA isolation system purchased from Promega
(Charbonnières-les-Bains, France) and from ca. 600.000 PHH with RNeasy Micro kit
purchased from Qiagen (Courtaboeuf, France). Each kit included a DNase treatment step.
RNAs were reverse-transcribed into cDNA using the High-Capacity cDNA Archive kit
purchased from Life technologies (Saint-Aubin, France). Real-time quantitative PCR (RT-
qPCR) was then performed using the SYBR Green PCR Master Mix on an Applied Biosystems
7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem, Woolston, UK). Expression of the
human TATA box binding protein (TBP) was used as reference, and the 2–ΔΔCt method was
used to express the relative expression of each selected gene. The sequences of the primers
used in this study are presented in the supplementary Table 1.

Western blot analysis. To assess the protein expression of CYP2E1 and CYP3A4 in HepaRG
cells, proteins underwent SDS-polyacrylamide electrophoresis. Briefly, cells were lysed in a
RIPA buffer (25 mM Tris-HCL pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP40, 1% sodium deoxycholate and
0.1% sodium dodecyl sulfate) supplemented with protease and phosphatase inhibitors.

127
Fifteen µg of protein were then separated by electrophoresis on 4-12% gradient Bis-Tris gels
(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France), transferred to 0.2 µM nitrocellulose membranes (Bio-
Rad, Hercules, CA), which were saturated in 2% BSA/TBS-T (0.2% tween in TBS) for 2 h at
room temperature. Proteins were then immunoblotted with antibodies against CYP2E1
(Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, MI), CYP3A4 (Oxford Biomedical Research), or
heat-shock cognate 70 (HSC70) (Tebu-bio, Le Perray-en-Yvelines, France). Finally, blots were
incubated with appropriate secondary antibodies, and protein bands were revealed by
enhanced chemiluminescence in a Chemi-smart imager (Fisher Scientific, Illkirch, France).
HSC70 was used to normalize protein loadings, and quantification was performed with the
BIO-1D software.

Statistical analysis. All results are expressed as mean ± SEM (standard error of mean).
Comparison between multiple groups were performed with two-way analysis of variance
(ANOVA). When ANOVA provided significant differences, individual means were compared
with the post-hoc Bonferroni test. The Mann and Whitney test were used for the
experiments carried out in cultured PHH.

128
Results

Effects of stearic acid, oleic acid and insulin on lipid content, CYP2E1 and CYP3A4 activity
and gene expression in HepaRG cells. HepaRG cells were incubated without or with stearic
acid, oleic acid and insulin for 7 days, as described in the Methods section. Because insulin
was studied at three different concentrations (0, 0.01 and 5 µg/ml), nine different
experimental conditions were initially studied. As expected, incubation of these cells with
each fatty acid (100 µM) was associated with significantly higher cellular triglycerides (Fig.
1A) and total neutral lipids (Fig. 1B). In addition, insulin significantly decreased triglycerides
in cells overloaded with each fatty acid (Fig. 1A). The latter result is in keeping with previous
data in rat and human indicating that chronic insulin favours hepatic triglycerides secretion
(Bartlett and Gibbons, 1988; Reaven et al., 1967; Zammit et al., 2001).

Next, the activity and expression of CYP2E1 and CYP3A4 were studied in all the
experimental conditions. Regarding CYP2E1, its activity was increased by stearic acid but not
by oleic acid (Fig. 1C). Moreover, insulin reduced CYP2E1 activity in a concentration-
dependent manner in HepaRG cells overloaded with stearic acid (Fig. 1C). Surprisingly,
insulin increased the mRNA expression of CYP2E1 in a concentration-dependent manner
(Fig. 1D). Similarly, insulin augmented the protein expression of CYP2E1 (Supplementary Fig.
1). In contrast, CYP3A4 activity was significantly reduced by stearic acid, but not oleic acid,
without significant effect of insulin (Fig. 1C). The mRNA expression of CYP3A4 was decreased
by stearic acid, especially in the absence of insulin (Fig. 1D). The protein expression of
CYP3A4 was also reduced by stearic acid (data not shown). Importantly, the activity of both
CYP2E1 and CYP3A4 was not significantly changed after 7 days of incubation with 50 µM of
each fatty acid, or after 48 h of incubation with 100 µM of these fatty acids (Supplementary
Fig. 2).

Finally, we measured the mRNA expression of different genes known to be regulated


by lipids, insulin or both factors. As expected, the expression of sterol regulatory element
binding transcription factor 1 (SREBF1, also known as SREBP-1c), acetyl-CoA carboxylase
alpha (ACACA), fatty acid synthase (FASN), stearoyl-Coenzyme A desaturase 1 (SCD1) and
patatin-like phospholipase domain containing 3 (PNPLA3) was positively regulated by insulin
129
in a concentration-dependent manner, whereas each fatty acid had no effect (Fig. 2). In
addition, the expression of pyruvate dehydrogenase kinase 4 (PDK4), fatty acid binding
protein 4 (FABP4) and apolipoprotein A-IV (APOA4) was regulated by the fatty acids and
insulin, while that of perilipin 1 (PLIN1) and 2 (PLIN2, also known as ADFP) was regulated
only by the fatty acids (Fig. 2).

Effects of stearic acid, oleic acid and insulin on CYP2E1 and CYP3A4 activity and gene
expression in cultured PHH. In another series of experiments, the effects of stearic acid,
oleic acid and insulin were studied in PHH cultured for 7 days. In the absence of fatty acids,
insulin (5 µg/ml) significantly decreased CYP2E1 activity with a concomitant increase in
CYP2E1 mRNA levels (Fig. 3). Insulin also enhanced the protein expression of CYP2E1 in a
concentration-dependent manner in cultured PHH of 3 different donors (data not shown). In
contrast, insulin did not change CYP3A4 mRNA expression and activity (Fig. 3). Importantly,
insulin increased the mRNA expression of SREBF1, ACACA, FASN, SCD1 and PNPLA3 and
reduced that of PDK4 (Fig. 3). Thus, when incubated without fatty acid, the effects induced
by insulin were similar between cultured PHH and HepaRG cells. However, treatment with
100 µM of stearic acid did not increase CYP2E1 activity (data not shown). Notably, our PHH
often presented steatosis to a variable degree (from 10 to 40%) (Supplemental Fig. 3), and
thus CYP2E1 activity might have already been augmented in these hepatocytes. Although we
did not have the anthropomorphic data for all the different liver donors, it was noteworthy
that several of them presented overweight or obesity, sometimes associated with type 2
diabetes. Moreover, most of the donors were over age 60. This could also have contributed
to the presence of steatosis since NAFLD is common in the elderly (Bertolotti et al., 2014;
Gan et al., 2011).

APAP-induced cytotoxicity and GSH depletion in normal and steatotic HepaRG cells. In
order to determine APAP cytotoxicity in normal and steatotic HepaRG cells, a large range of
APAP concentrations was selected and cellular ATP was measured after 6, 24 and 48 h of
treatment. Whereas no significant cytotoxicity was observed for 1 mM APAP, reduced ATP
levels was already observed with 2.5 mM although the effects greatly depended of the

130
culture conditions (Supplementary Fig. 4). Indeed, APAP-induced loss of cellular ATP was
consistently more important in the presence of stearic acid (Fig. 4). Moreover, incubation
without insulin was associated with a significantly stronger ATP depletion after 6 and 12 h
for 2.5 mM APAP and after 6 h for 5 mM of this drug (Fig. 4). It was noteworthy that cellular
ATP levels in the basal state (i.e. without APAP treatment) were significantly lower with
stearic acid (Fig. 4). However, when the basal ATP levels were equally set for the three
different conditions of fatty acid incubation, APAP cytotoxicity remained most of the time
stronger in the presence of stearic acid, excepted in the presence of 5 µg/ml of insulin after
6 h of APAP treatment (Supplementary Fig. 4). Thus, these results indicated that the higher
ATP depletion induced by APAP in the presence of stearic acid was not a mere consequence
of the basal cytotoxicity induced by this fatty acid.

In the next series of investigations, cellular GSH levels were measured after a
treatment with low (2.5 mM) and high (20 mM) APAP concentrations. These investigations
were carried out with the three conditions of fatty acid incubation but with only two
concentrations of insulin (i.e. 0 and 5 µg/ml). After APAP treatment, GSH depletion was
generally stronger in the presence of stearic acid (Fig. 5). A significant effect of insulin was
also observed in some conditions. Indeed, GSH depletion after 12 h of 2.5 mM APAP was
stronger in the presence of insulin, whereas GSH depletion after 24 h of 20 mM APAP was
stronger in the absence of insulin (Fig. 5). Importantly, basal GSH levels were not significantly
different between the 6 different conditions, although there was a trend towards lower GSH
in the presence of stearic acid (P=0.11) (Fig. 5).

APAP-induced expression of oxidative stress genes in normal and steatotic HepaRG cells.
Oxidative stress, including induced by APAP, can secondarily increase the expression of
different genes such as heme oxygenase 1, γ-glutamylcysteine synthase, different
glutathione S-transferases, heat shock protein 70 and tribbles pseudokinase 3 (Aubert et al.,
2012; Chan et al., 2001). Importantly, nuclear factor, erythroid 2-like 2 (NRF2, or NFE2L2) is a
transcription factor playing a major role in the regulation of most of these genes (Chan et al.,
2001; Ma and He, 2012). Hence, the mRNA expression of some of these genes was assessed
in HepaRG cells treated with 2.5 or 20 mM APAP (Fig. 6). Notably, the expression of NRF2,
131
HMOX1, TRIB3 and HSP70 was increased by APAP, sometimes in a dose-dependent manner.
However, it was noteworthy that the expression of some oxidative stress genes was already
induced in the basal state (i.e. in cells not treated with APAP), in particular when HepaRG
cells were incubated with stearic acid. This was observed for instance with HMOX1, TRIB3
and HSP70. Moreover, we also found that in the basal state insulin significantly increased the
expression of GSTA1/2 and GSTA3. Previous studies in primary cultured rat hepatocytes also
showed that insulin enhanced the expression of GSTA1/2 and GSTA3//5 (Kim et al., 2006).
Finally, the expression of these genes was significantly decreased after APAP treatment in
cells incubated with stearic acid.

APAP-induced cytotoxicity, GSH depletion and APAP-protein adducts in normal and


steatotic HepaRG cells treated or not with the CYP2E1 inhibitor CMZ. Another series of
experiments was subsequently designed in order to determine the exact role of CYP2E1 in
APAP-induced toxicity in HepaRG cells. For this purpose, HepaRG cells were incubated with
150 µM of CMZ for 7 days before APAP treatment. This protocol of CMZ treatment was
selected because preliminary experiments showed a maximal inhibitory effect of CYP2E1
activity without significant cytotoxicity (data not shown).

Because our experiments were carried out simultaneously with and without CMZ, the
recovery of ATP in the presence of CMZ could be calculated for these experiments. ATP
recovery was almost always observed in the different tested conditions (Fig. 7). With 2.5 mM
of APAP, ATP recovery with CMZ was significantly higher in the presence of stearic acid after
6 and 24 h of APAP treatment, but no significant effect was observed regarding insulin (Fig.
7). With 20 mM of APAP, ATP recovery was also higher in the presence of stearic acid but
only after 6 h of APAP treatment (Fig. 7). A significant effect of insulin was also observed at
this time point. Indeed, ATP recovery was significantly lower in the presence of insulin,
especially in cells incubated with oleic acid (Fig. 7). Notably, ATP recovery in the basal state
was significantly changed in the presence of fatty acids. In particular, ATP recovery was
higher with stearic acid and lower with oleic acid (Fig. 7). Taken together, these results
indicated that in HepaRG cells CYP2E1 was involved in the loss of ATP levels after APAP

132
treatment, but also in the basal state at a lesser degree. Moreover, ATP loss related to
CYP2E1 activity was usually higher in the presence of stearic acid.

The effect of CMZ pretreatment on total GSH levels and APAP-protein adducts was
also assessed in different conditions of fatty acids, insulin and APAP treatment (2.5 and 20
mM). Surprisingly, CMZ did not prevent the loss of total GSH after 24 h (Supplementary Fig.
5), thus indicating that CYP2E1 was not primarily involved in GSH depletion after APAP
treatment in HepaRG cells. Moreover, CMZ did not prevent the generation of APAP-protein
adducts 6 h after 2.5 or 20 mM of APAP (data not shown).

APAP-glucuronide and APAP-sulfate in normal and steatotic HepaRG cells. APAP-


glucuronide and APAP-sulfate were measured in the culture media of normal or steatotic
HepaRG cells treated for 1 or 6 h with 2.5 and 20 mM of APAP. Whereas APAP-sulfate levels
were unchanged in the different conditions of culture, APAP-glucuronide levels were
consistently higher in the presence of insulin (Fig. 8). In contrast, there was no effect of
stearic acid or oleic acid on APAP-glucuronide levels (Fig. 8).

Prevention of APAP-induced cytotoxicity in HepaRG cells by the AMPK activators AICAR


and metformin. Recent investigations in primary mouse hepatocytes showed that APAP-
induced necrosis was prevented by the AMPK activator III (DHPO), thus suggesting a role of
AMPK impairment in APAP cytotoxicity (Saberi et al., 2014). Thus, in a last series of
investigations, we determined the effect of AICAR and metformin on APAP-induced
cytotoxicity in non-steatotic and steatotic HepaRG cells. Preliminary experiments allowed us
to show that the expression of both phospho-AMPK and phospho-acetyl-CoA carboxylase
(phospho-ACC) was efficiently enhanced with 500 µM of each prototypical AMPK activator
(data not shown). Using this concentration, both AMPK activators prevented the ATP
depletion measured 24 h after 20 mM of APAP (Supplementary Fig. 6), although the ATP
recovery was lower compared to CMZ in the same conditions of APAP treatment (Fig. 7).
Nevertheless, ATP recovery with AICAR and metformin tended to be higher in HepaRG cells
incubated with stearic acid (Supplementary Fig. 6). Finally, there was almost no GSH

133
recovery with both AMPK activators, excepted in HepaRG cells incubated without fatty acid
and without insulin (Supplementary Fig. 6).

134
Discussion

There are growing evidence that NAFLD can increase the risk and the severity of
hepatotoxicity induced by some drugs and toxins (Robin et al., 2005a; Fromenty, 2013;
Tarantino et al., 2007). However, little is known regarding the involved mechanisms,
although some hypotheses have been proposed (Fromenty, 2013). Thus, relevant
experimental models are needed to determine which compounds can pose a specific risk in
NAFLD and to understand why they are more hepatotoxic in this dysmetabolic context. Since
the HepaRG cell line has been shown to be a valuable model to study hepatotoxicity induced
by drugs and toxins (Anthérieu et al., 2011; McGill et al., 2011; Savary et al., 2014; Sharanek
et al., 2014; Tobwala et al., 2015), a first goal of our study was to determine whether this cell
line could also be used as a pertinent model of human NALFD. To this end, HepaRG cells
incubated for one week in different conditions of incubation with stearic acid, oleic acid and
insulin.

Several investigations in rodents and humans reported that NALFD is associated with
more severe APAP-induced hepatotoxicity, especially after an overdose (Aubert et al., 2012;
Kon et al., 2010; Michaut et al., 2014; Myers and Shaheen, 2008; NGuyen et al., 2008).
Although the mechanism is still poorly understood, there is evidence for a significant role of
CYP2E1 whose activity is consistently increased in NAFLD (Aubert et al., 2011; Aubert et al.,
2012; Michaut et al., 2014). Thus, the second objective of our study was to assess APAP-
induced toxicity in non-steatotic and steatotic HepaRG cells.

The most relevant data from this study can be summarized as followed:

1) The incubation of HepaRG cells for one week with stearic acid was associated to higher
CYP2E1 activity and lower CYP3A4 activity, thus reproducing data collected in patients with
obesity and NAFLD (Aubert et al., 2011; Brill et al., 2012; Chalasani et al., 2003; Emery et al.,
2003; Kolwankar et al., 2007). In contrast, oleic acid had no effect on CYP2E1 and CYP3A4
activity.

135
2) Our data with different concentrations of insulin showed that CYP2E1 activity in HepaRG
cells was negatively regulated by insulin in a concentration-dependent manner. Surprisingly,
insulin was responsible for an increased CYP2E1 expression in a concentration-dependent way.
Notably, experiments in cultured PHH indicated that insulin also reduced CYP2E1 activity with a
concomitant increase in CYP2E1 mRNA levels.

3) Steatosis in HepaRG cells induced by stearic or oleic acid was associated with higher
expression of different genes known to be regulated by lipids such as APOA4 and PLIN1.
Moreover, insulin enhanced the expression of different genes involved in lipid synthesis such as
SREBF1, FASN and SCD1 (Begriche et al., 2013; Postic and Girard, 2008). Insulin also increased
the expression of PNPLA3, in keeping with recent studies (Dubuquoy et al., 2011; Huang et al.,
2010).

4) Experiments with a large range of APAP concentrations (2.5 to 20 mM) showed that APAP-
induced loss of cellular ATP was almost always stronger in the presence of stearic acid. In
contrast, APAP cytotoxicity was about similar between non-steatotic cells and HepaRG cells
incubated with oleic acid.

5) Investigations with the prototypical CYP2E1 inhibitor CMZ indicated that the stronger
cytotoxicity observed with 2.5 and 20 mM APAP in the presence of stearic acid could be
attributed, at least in part, to higher CYP2E1 activity. However, the involvement of CYP2E1 in
the higher APAP cytotoxicity observed without insulin was significant only with 20 mM APAP.
Our experiments also provided evidence that in HepaRG cells not treated with APAP, the
slight to moderate loss of cellular ATP observed in some conditions was secondary to basal
CYP2E1 activity.

Our results regarding the effects of stearic acid, oleic acid and insulin on the activity
of CYP2E1 and CYP3A4 in HepaRG cells deserves further discussion.

Although different investigations consistently reported higher hepatic CYP2E1 activity


in human NAFLD (Aubert et al., 2011; Brill et al., 2012; Chalasani et al., 2003; Emery et al.,
2003), the exact mechanism of this induction is still unknown. It has been reported that
CYP2E1 induction in obese individuals was associated with several dysmetabolic parameters

136
such as the degree of steatosis, hyperketonemia (especially high β-hydroxybutyrate),
hyperlipidemia, insulin resistance, type 2 diabetes and even nocturnal hypoxemia (Chalasani
et al., 2003; Chtioui et al., 2007; Emery et al., 2003; Lucas et al., 1998; Wang et al., 2003).
Importantly, our study showed that despite the similar amount of cellular triglycerides,
CYP2E1 activity was selectively enhanced when steatosis was induced by stearic acid, but not
by oleic acid. Altogether, these data suggest that higher CYP2E1 activity in human NAFLD
could depend not only on the degree of steatosis but also by the composition of the
deposited lipids. Moreover, our data suggested a post-translational regulation of CYP2E1 by
stearic acid in HepaRG cells since this saturated fatty acid increased CYP2E1 activity but not
its mRNA and protein expression. Notably, previous investigations in rats showed that
CYP2E1 could be post-translationally regulated via phosphorylation (Oesch-Bartlomovicz and
Oesch, 2005; Oesch-Bartlomovicz et al., 1998). Moreover, an inverse relationship between
hepatic CYP2E1 protein expression and activity was reported during ageing in rat (Wauthier
et al., 2006).

An important observation in this study was that insulin significantly reduced CYP2E1
activity in HepaRG cells and PHH in a concentration-dependent manner. Hence, low insulin
was associated with higher CYP2E1 activity. This could be in keeping with some data in
human NAFLD reporting an association between higher CYP2E1 activity and insulin
resistance, as already mentioned (Chalasani et al., 2003). Moreover, insulin deficiency in
rodents treated with streptozotocin was associated to higher hepatic CYP2E1 activity and
this induction was corrected by insulin therapy (Ioannides et al., 1998; Raza et al., 2004). In
addition to the accumulation of some lipid species, higher CYP2E1 activity in human NAFLD
could thus be linked to insulin resistance, which is frequently associated to this liver disease
(Begriche et al., 2013; Tilg and Moschen 2014).

In HepaRG cells and PHH, insulin reduced CYP2E1 activity but increased the mRNA
and protein expression of this CYP. This suggest that CYP2E1 activity could be regulated post-
translationally by this hormone in human hepatocytes. It is also noteworthy that the positive
effect of insulin on CYP2E1 mRNA expression in human hepatocytes is in sharp contrast with
previous investigations carried out in rat hepatocytes (Moncion et al., 2002; Woodcroft and

137
Novak, 1999). However, CYP2E1 activity was not reported in these studies. Thus, CYP2E1
expression could be differentially regulated by insulin between rat and human. Further
investigations will be needed in order to determine the transcriptional, translational and
post-translational regulation of CYP2E1 in human hepatocytes. HepaRG cells could be helpful
for this purpose.

In contrast to CYP2E1, CYP3A4 activity in HepaRG cells was reduced by stearic acid
but not by oleic acid. Moreover, reduced CYP3A4 activity was associated with lower mRNA
levels. Interestingly, a previous study performed in PHH showed that a mixture of palmitic
acid (C16:0) and oleic acid reduced CYP3A4 activity (Donato et al., 2006). Thus, CYP3A4
activity could be specifically reduced by long-chain saturated fatty acids. It will be interesting
to determine whether oxidative stress is involved in this effect, as suggested by previous
studies (Anthérieu et al., 2013; Gallagher et al., 1995).

In our experiments performed with APAP, pretreatment of HepaRG cells with CMZ
was associated with significant cellular ATP recovery although this CYP2E1 inhibitor did not
afford a significant protection regarding total GSH and APAP-protein adducts. Notably,
APAP-induced cytotoxicity could be the consequence of the covalent binding of NAPQI to
specific cellular proteins, in particular within the mitochondrial compartment (McGill and
Jaeschke, 2013; Tirmenstein and Nelson, 1989). In addition, several studies reported the
presence of significant amount of CYP2E1 in liver mitochondria, in particular in humans
(Bansal et al., 2013; Knockaert et al., 2011). Thus, it is conceivable that inhibition of CYP2E1
by CMZ could have prevented APAP-induced ATP depletion by inhibiting the covalent
binding of this drug to a small number of key mitochondrial proteins and without modifying
the total GSH levels since the mitochondrial pool of this antioxidant is rather low. Indeed,
mitochondrial GSH represents 10 to 15% of the whole cellular GSH reserve (Fernandez-
Checa and Kaplowitz, 2005; Robin et al., 2005b). Finally, CMZ pretreatment of HepaRG cells
could have not be able to prevent the generation of most APAP-protein adducts and the
depletion of total GSH because NAPQI is also generated by CYP3A4, a microsomal enzyme
that has not been reported to be also located in the mitochondrial compartment.

138
In conclusion, we set up a cellular model of human NAFLD which can be a valuable
tool to gain insight regarding the mechanisms whereby this frequent hepatic disease appears
to favour APAP-induced acute liver failure, in particular after an overdose (Michaut et al.,
2014; Myers and Shaheen, 2009; NGuyen et al., 2008). This model can also be used to test
the effect of other drugs or toxins that are suspected to be more hepatotoxic in the context
of obesity and NAFLD, in particular as a consequence of CYP2E1 induction (Fromenty, 2013).
Because AMPK can be activated in HepaRG cells, it will be also interesting to determine
whether AMPK activators such as metformin and AICAR could afford also a protection
against the cytotoxicity of these drugs.

Acknowledgement

This work was supported by INSERM (Institut National de la Recherche et de la Santé


Médicale). Anaïs Michaut was a recipient of a 6-month fellowship from the Fondation pour
la Recherche Médicale (FRM, fellowship n°FDT20140931112). We are grateful to the Conseil
Régional de Bretagne for its financial support via a project call from ID2Santé (formerly
known as CRITT Santé Bretagne). We are also grateful to Mireille Desille-Dugast and Dr
Bruno Turlin from the Centre de Ressources Biologiques (CRB) Santé de Rennes for their
involvement in the preparation of the primary human hepatocytes.

139
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144
Legends to the figures

Figure 1. Effects of 1 week of treatment with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1) and
insulin on cellular triglycerides, neutral lipid deposition and mRNA expression and activity of
CYP2E1 and CYP3A4 in HepaRG cells. (A) Cellular triglycerides. Results are means ± SEM for 5
independent cultures, with data in duplicates for each culture. (B) Cellular lipids stained with
oil red O. The pictures 1 to 6 are representative of the following conditions: 1) HepaRG cells
incubated without insulin and fatty acids; 2) HepaRG cells incubated without insulin and
with stearic acid; 3) HepaRG cells incubated without insulin and with oleic acid; 4) HepaRG
cells incubated with insulin and without fatty acids; 5) HepaRG cells incubated with insulin
and with stearic acid; 6) HepaRG cells incubated with insulin and with oleic acid . (C) CYP2E1
and CYP3A4 activity. Results are means ± SEM for 5 independent cultures, with data in
duplicates for each culture. (D) mRNA levels of CYP2E1 and CYP3A4. Results are means ± SEM
for 5 independent cultures, with data in duplicates for each culture. In panels showing bar
graphs, letters F and I indicate a significant effect (P<0.05) of fatty acids and insulin,
respectively. *Significantly different from HepaRG cells incubated without fatty acids and
with the same condition of insulin treatment (P<0.05). #Significantly different from HepaRG
cells incubated without insulin and with the same condition of fatty acid treatment (P<0.05).

Figure 2. Effects of 1 week of treatment with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1) and
insulin on the expression of genes responsive to lipids and insulin in HepaRG cells. Results are
means ± SEM for 5 independent cultures, with data in duplicates for each culture. Letters F
and I indicate a significant effect (P<0.05) of fatty acids and insulin, respectively. FxI indicates
a significant interaction between the effects of fatty acids and insulin. *Significantly different
from HepaRG cells incubated without fatty acids and with the same condition of insulin
treatment (P<0.05). #Significantly different from HepaRG cells incubated without insulin and
with the same condition of fatty acid treatment (P<0.05).

145
Figure 3. Effects of 1 week of treatment with insulin in cultured PHH. (A) CYP2E1 and CYP3A4
activity. Results are means ± SEM for 5 and 4 independent cultures, respectively for the
activity of CYP2E1 and CYP3A4. #Significantly different from HepaRG cells incubated without
insulin (P<0.05). (B) mRNA levels of CYP2E1 and CYP3A4. Results are means ± SEM for 4
independent cultures. #Significantly different from HepaRG cells incubated without insulin
(P<0.05). (C) mRNA expression of genes responsive to insulin. Results are means ± SEM for 4
independent cultures. #Significantly different from HepaRG cells incubated without insulin
(P<0.05).

Figure 4. Levels of ATP in HepaRG cells treated or not with APAP. HepaRG cells were
incubated for 1 week with different conditions of incubation with stearic acid (C18:0), oleic
acid (C18:1) and insulin and subsequently treated or not with 2.5, 5, 10 or 20 mM of APAP.
ATP levels were measured 6, 12 or 24 hours after APAP treatment. Cellular ATP levels were
set at 100% in HepaRG cells incubated for 1 week without fatty acids and with 5 µg/ml of
insulin and not treated with APAP. Results are means ± SEM for 3 to 6 independent cultures,
with data in duplicates for each culture. Letters F and I indicate a significant effect (P<0.05)
of fatty acids and insulin, respectively. *Significantly different from HepaRG cells incubated
without fatty acids and with the same condition of insulin treatment (P<0.05). #Significantly
different from HepaRG cells incubated without insulin and with the same condition of fatty
acid treatment (P<0.05).

Figure 5. Levels of total GSH in HepaRG cells treated or not with APAP. HepaRG cells were
incubated for 1 week with different conditions of incubation with stearic acid (C18:0), oleic
acid (C18:1) and insulin and subsequently treated or not with 2.5 or 20 mM of APAP. Total
GSH levels were measured 6, 12 or 24 hours after APAP treatment. Results are means ± SEM
for 5 independent cultures. Letters F and I indicate a significant effect (P<0.05) of fatty acids
and insulin, respectively and ns, not significant with a two-way ANOVA analysis. *Significantly
different from HepaRG cells incubated without fatty acids and with the same condition of
insulin treatment (P<0.05).

146
Figure 6. Expression of different genes involved in oxidative stress in HepaRG cells treated or
not with APAP. HepaRG cells were incubated for 1 week with different conditions of
incubation with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1) and insulin and subsequently treated
with 2.5 and 20 mM of APAP. Gene expression was measured 6 hours after APAP treatment.
Results are means ± SEM for 3-4 independent cultures, with data in duplicates for each
culture. Letters F and I indicate a significant effect (P<0.05) of fatty acids and insulin,
respectively and ns, not significant with a two-way ANOVA analysis. *Significantly different
from HepaRG cells incubated without fatty acids and with the same condition of insulin
treatment (P<0.05).

Figure 7. Recovery of ATP in HepaRG cells pretreated with the CYP2E1 inhibitor CMZ and
subsequently treated with APAP. HepaRG cells were incubated for 1 week with different
conditions of incubation with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1), insulin and CMZ and
subsequently treated or not with 2.5 or 20 mM of APAP. ATP levels were measured 6, 24 or
48 hours after APAP treatment. ATP recovery was determined by calculating the difference
of ATP levels measured with and without CMZ. Results are means ± SEM for 3 independent
cultures, with data in triplicates for each culture. Letters F and I indicate a significant effect
(P<0.05) of fatty acids and insulin, respectively and ns, not significant with a two-way ANOVA
analysis. *Significantly different from HepaRG cells incubated without fatty acids and with
the same condition of insulin treatment (P<0.05). #Significantly different from HepaRG cells
incubated without insulin and with the same condition of fatty acid treatment (P<0.05).

Figure 8. Concentrations of APAP-glucuronide and APAP-sulfate in the culture media of


HepaRG cells treated with 2.5 or 20 mM of APAP. HepaRG cells were incubated for 1 week
with different conditions of incubation with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1) and insulin
and subsequently treated with 2.5 and 20 mM of APAP. APAP-glucuronide and APAP-sulfate
were measured 1 and 6 hours after APAP treatment. Results are means ± SEM for 4
independent cultures. The letter I indicates a significant effect (P<0.05) of insulin, and ns, not
significant with a two-way ANOVA analysis. #Significantly different from HepaRG cells
incubated without insulin and with the same condition of fatty acid treatment (P<0.05).
147
Figure 1
A Cellular triglycerides
100
F, I
* *
80

(nmol / mg of proteins)
Triglycerides
60
#

40

20

0
Insulin
01

01

01
0

5
(µg/ml)
0.

0.

0.
B no FA C18:0 C18:1

1 2 3

4 5 6
CYP2E1 activity CYP3A4 activity
C 200
*
40
(nmol 6OH-testosterone / h / mg of proteins)

F, I F
(pmol OH-CZX / h / mg of proteins)

150 30
CYP3A4 activity
CYP2E1 activity

*
100 20 *
#

50 10

0 0
Insulin Insulin
01

01

01
0

5
01

01

01
0

0.

0.

0.
0.

0.

0.

(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1

D CYP2E1 mRNA 1.2


CYP3A4 mRNA
8
I # F
1.0
6
CYP3A4 mRNA
CYP2E1 mRNA

relative expression
relative expression

# 0.8

4 0.6
*
0.4
2
0.2

0 0.0
Insulin Insulin
01

01

01
0

5
0

01

01

01

0.

0.

0.
0.

0.

0.

(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
Figure 2 SREBF1 ACACA
3 2.0
#
I # # I
#
#

SREBPF1 mRNA
1.5

ACACA mRNA
relative expression
relative expression
2

1.0

1
0.5

0 0.0
Insulin Insulin

01

01

01

5
01

01

01
0

0.

0.

0.
0.

0.

0.
(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1

FASN SCD1
2.0 # 4
I I # #
#
#
1.5 3
relative expression

relative expression
FASN mRNA

SCD1 mRNA
#
1.0 2

0.5 1

0.0 0
Insulin Insulin

01

01

01

5
0
01

01

01

0.

0.

0.
0.

0.

0.

(µg/ml) (µg/ml)

no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1

PNPLA3 PDK4
2.0 2.0
I F, I
# # *
1.5 # 1.5
PNPL A3 mRNA
relative expression

relative expression
PDK4 mRNA

1.0 1.0 #
# #
#
0.5 0.5

0.0 0.0
Insulin Insulin
01

01

01
0

01

0
01

01

5
0.

0.

0.

0.

0.

0.

(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1

FABP4 APOA4
2.5 8
F, I F, I, FXI
2.0 * *
# 6
FABP4 mRNA
relative expression

APO A4 mRNA
relative expression

1.5

4
1.0 #

2
0.5

0.0 0
Insulin Insulin
0

01

01

01

01

01

01
0

5
0.

0.

0.

0.

0.

0.

(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1

PLIN1 PLIN2
3 2
F * * F
relative expression

relative expression
PLIN2 mRNA
PLIN1 mRNA

0 0
Insulin Insulin
0

0
01

01

01

5
0

0.

0.

0.
0.

0.

0.

(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
Figure 3

A CYP2E1 activity CYP3A4 activity


120

(nmol 6OH-testosterone / h / mg of proteins)


(pmol OH-CZX / h / mg of proteins) 150

100

CYP3A4 activity
CYP2E1 activity

100 # 80

60

50 40

20

0 0
0 0.01 5 0 0.01 5

Insulin (µg/ml) Insulin (µg/ml)

B CYP2E1 mRNA CYP3A4 mRNA


4 #
1.2

1.0
3
CYP2E1 mRNA
relative expression

CYP3A4 mRNA
relative expression

# 0.8

2
0.6

0.4
1

0.2

0
0 0.01 5 0.0
0 0.01 5
Insulin (µg/ml)
Insulin (µg/ml)

C SREBF1 mRNA ACACA mRNA FASN mRNA


5 3 10
#

4 8
SREBF1 mRNA

ACACA mRNA
relative expression

relative expression
relative expression

FASN mRNA

2
3 6

2 4
1

1 2

0 0 0
0 0.01 5 0 0.01 5 0 0.01 5
Insulin (µg/ml) Insulin (µg/ml) Insulin (µg/ml)

SCD1 mRNA PNPLA3 mRNA PDK4 mRNA


20 5 1.2

# 1.0
4
15
PNPL A3 mRNA
relative expression

relative expression
relative expression
SCD1 mRNA

PDK4 mRNA

0.8
3
10 0.6
# #
2
0.4
5
1
0.2

0 0 0.0
0 0.01 5 0 0.01 5 0 0.01 5
Insulin (µg/ml) Insulin (µg/ml) Insulin (µg/ml)
120 F, I 0 mM APAP
Figure 4 100 #

Cellular ATP (%)


80
# * #

60
#

40
0µg/ml insulin
20 0.01µg/ml insulin
5µg/ml insulin
0
no FA C18:0 C18:1
2.5 mM APAP
120 F, I F, I F
100
Cellular ATP (%)

80

* *
60

40
*

20

0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h

5 mM APAP
120 F, I F F

100
*
Cellular ATP (%)

80

60

40

20

0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h

10 mM APAP
120 F F F
100
Cellular ATP (%)

80

60

40

20

0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h

20 mM APAP
120 F F F

100
Cellular ATP (%)

80

60

40

20

0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h
Figure 5

50
ns 0 mM APAP
[GSH] nmol / mg protein

40

30

20

10
without insulin
with 5µg/ml insulin
0
no FA C18:0 C18:1

2.5 mM APAP
40
F F, I F
[GSH] nmol / mg protein

30

20

10 * *

0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h

20 mM APAP
40
ns F F, I
[GSH] nmol / mg protein

30

20

10

0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 12h 24h
Figure 6

NRF2 HMOX1

0 mM APAP 2,5 mM APAP 20 mM APAP 0 mM APAP 2,5 mM APAP 20 mM APAP


4 4 4 5 5 5
ns ns F F ns ns
4 4 4

relative expression
relative expression

3 3 3

HMOX1 mRNA
3 3 3
NRF2

2 2 2 *
2 2 2

1 1 1
1 1 1

0 0 0 0 0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1

GCLC GSTA1/2

0 mM APAP 2,5 mM APAP 20 mM APAP 0 mM APAP 2,5 mM APAP 20 mM APAP


3 3 3 6 6 6
ns ns ns I F F
relative expression
relative expression
GCLC mRNA

2 2 2 4 4 4
GSTA1/2

1 1 1 2 2 2
*
0 0 0 0 0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1

GSTA3 GSTM1

0 mM APAP 2,5 mM APAP 20 mM APAP 0 mM APAP 2,5 mM APAP 20 mM APAP


3.5 3.5 3.5 4 4 4
I F F ns ns ns
3.0 3.0 3.0
relative expression

relative expression

2.5 2.5 2.5 3 3 3


GSTM1
GSTA3

2.0 2.0 2.0


2 2 2
1.5 * 1.5 1.5 *
1.0 1.0 * 1.0 * 1 1 1
0.5 0.5 0.5

0.0 0.0 0.0 0 0 0


no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1

TRIB3 HSP70

0 mM APAP 2,5 mM APAP 20 mM APAP 0 mM APAP 2,5 mM APAP 20 mM APAP


12 12 12 20 20 20
F F F F F F
10 10 * 10
relative expression

relative expression

15 15 15
HSP70 mRNA
TRIB3 mRNA

8 * 8 8 **
6 6 6 10 10 * 10
* *
4 4 4
5 5 5
2 2 2

0 0 0 0 0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
Figure 7
25 F 0 mM APAP
ATP recovery with CMZ (%)

20

15

10

5 without insulin
* with 5µg/ml insulin
0
no FA C18:0 C18:1
2.5 mM APAP
60 F F ns
ATP recovery with CMZ (%)

50

40
* *
30

20

10

0 *
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 24h 48h

20 mM APAP
60 F, I ns ns
ATP recovery with CMZ (%)

50

40

*
30

20

10
#
0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
6h 24h 48h
Figure 8

APAP-Glucuronide after 1h APAP-Glucuronide after 6h

25 I I 250 ns I

APAP-glucuronide (µM)
APAP-glucuronide (µM)

20 200 #

15 150

10 100

5 50

0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
2.5 mM APAP 20 mM APAP 2.5 mM APAP 20 mM APAP

without insulin
with 5 µg/ml insulin
APAP-Sulfate after 1h APAP-Sulfate after 6h

6 ns ns 50
ns ns
APAP-sulfate (µM)

APAP-sulfate (µM)

40

4
30

20
2

10

0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1

2.5 mM APAP 20 mM APAP 2.5 mM APAP 20 mM APAP


Supplementary materials

Supplementary Table 1. Sequences of the primers used in the study.

Gene Forward primer Reverse primer


ACACA ACAGTGGAGCAAGAATCGG AATGGACAGAGTTGAGAGCAC
APO A4 CAGTGTGGCAAGAAACTCCT GTAGTCCCACATCACCGTG
CYP2E1 TTGAAGCCTCTCGTTGACCC CGTGGTGGGATACAGCAA
CYP3A4 CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
FABP4 GGAAAATCAACCACCATAAAGAGAA GGAAGTGACGCCTTTCATGAC
FASN GTACACACCCAAGGCCAAGTA GACGTGGACGGATACTTTCC
GCLC GGCGATGAGGTGGAATAC AGGATGGTTTGGGTTTGTC
GSTA1/2 TGCAACAATAAGTGCTTTACCTAAGTG TTAACTAAGTGGGTGAATAGGAGTTGTATT
GSTA3 AAGTCGCTATTTCCCTGCC GAAGTTGGAGATAAGGCTGGAG
GSTM1 CTCCACCGTATATTTGAGCCC AGCCATCTTTGAGAACACAGG
HMOX1 ACTTTCAGAAGGGCCAGGT TTGTTGCGCTCAATCTCCT
HSP70 AGC TGCTGCAGGACTTCTTC AAGATCTGCGTCTGCTTGGT
NRF2 TCAGCATGCTACGTGATGAAG TTTGCTGCAGGGAGTATTCA
PDK4 CTCGCGCTAGAGCCCG GCATTTTCTGAACCAAAGTCCAG
PLIN1 TGGTCCTCATGATCCTCCTC GTTGTCGATGTCCCGGAATT
PLIN2 CCATTCTACTGTTCACCTGATTGA ACCCATGAGAGGTAGAGCTTAT
PNPLA3 TTCTGGTGTCTGACTTTCGG ATGAAGGGTACGTTGTCACTC
SCD1 ACTATTTTGTCAGTGCCCTGG ACGAGCCCATTCATAGACATC
SREBF1 CAACACAGCAACCACAAACTC CTCCACCTCAGTCTTCACG
TBP GAGAGTTCTGGGATTGTACCG ATCCTCATGATTACCGCAGC
TRIB3 CCCTGCTCACAGAGATGACA GCAGCTGGTTTGTTTGTGAA

156
Legends to the supplementary figures

Supplementary Figure 1. Effects of 1 week of treatment with stearic acid (C18:0), oleic acid
(C18:1) and insulin on CYP2E1 protein expression in HepaRG cells. (A) Representative
western blot. (B) CYP2E1 levels were assessed in 5 independent cultures, and values were
normalized with HSC70. The letter I indicate a significant effect (P<0.05) of insulin with a two-
way ANOVA analysis.

Supplementary Figure 2. Activity of CYP2E1 and CYP3A4 in HepaRG cells in different


conditions of treatment. (A) CYP2E1 and CYP3A4 activity in HepaRG cells incubated during
one week with different concentrations of insulin and with or without 50 µM of stearic acid
(C18:0), or oleic acid (C18:1). Results are means ± SEM for 4 independent cultures. (B)
CYP2E1 and CYP3A4 activity in HepaRG cells incubated during 48 h with different
concentrations of insulin and with or without 100 µM of stearic acid (C18:0), or oleic acid
(C18:1). Results are means ± SEM for 3 independent cultures.

Supplementary Figure 3. PHH from 4 different donors 2 days after seeding and before the
one-week treatment with different concentrations of insulin and with or without 100 µM of
stearic acid, or oleic acid. Note the presence of numerous cytoplasmic fat droplets in the
PHH of these donors.

Supplementary Figure 4. Levels of ATP in HepaRG cells treated or not with various
concentrations of APAP. HepaRG cells were incubated for 1 week with different conditions of
incubation with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1) and insulin and subsequently treated
with concentrations of APAP ranging from 1 to 20 mM. ATP levels were measured 6, 24 or 48
hours after APAP treatment. Results are means ± SEM for 3 to 6 independent cultures, with
data in duplicates for each culture. †Significantly different from HepaRG cells incubated
without APAP (P<0.05).

157
Supplementary Figure 5. Total GSH levels in HepaRG cells pretreated or not with the CYP2E1
inhibitor CMZ and subsequently treated with APAP. HepaRG cells were incubated for 1 week
with different conditions of incubation with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1), insulin
and CMZ and subsequently treated or not with 2.5 and 20 mM APAP. GSH levels were
measured 24 hours after APAP treatment. Results are means ± SEM for 5 independent
cultures. Letters F and I indicate a significant effect (P<0.05) of fatty acids and insulin,
respectively and ns, not significant with a two-way ANOVA analysis.

Supplementary Figure 6. Effects of AMPK activation on APAP-induced toxicity in HepaRG


cells. Effects of metformin and AICAR on the recovery of ATP and total GSH levels in HepaRG
cells treated with 20 mM of APAP. Cells were incubated with different conditions of
incubation with stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1) and insulin. After 1 week, cells were
first preincubated for 6h with or without 500 µM of each activator and then treated for 24h
with 20 mM of APAP, with or without each AMPK activator. (A) ATP recovery with metformin
and AICAR. ATP recovery was determined by calculating the difference of ATP levels
measured with and without each AMPK activator. Results are means ± SEM for 4
independent cultures. The letters ns indicate that there was no significant effect of fatty
acids or insulin with a two-way ANOVA analysis. (B) Levels of total GSH in cells treated or not
with metformin and AICAR. Results are means ± SEM for 4 independent cultures. The letters
ns indicate that there was no significant effect of fatty acids or insulin with a two-way
ANOVA analysis.

158
Supplementary figure 1

no FA C18:0 C18:1
A Insulin
0 0.01 5 0 0.01 5 0 0.01 5
(µg/ml)

CYP2E1

HSC70

3.0
B I
2.5
CYP2E1 protein
relative expression

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
Insulin
0
01

0
01

0
01

(µg/ml)
0.

0.

0.

no FA C18:0 C18:1
Supplementary figure 2

A CYP2E1 activity after 7 days with 50µM FA CYP3A4 activity after 7 days with 50µM FA
60 40
ns

(nmol 6OH-testosterone / h / mg of proteins)


ns
(pmol OH-CZX / h / mg of proteins)

30
CYP2E1 activity

CYP3A4 activity
40

20

20
10

0 0
Insulin Insulin

01

01

01
0

5
0

01

01

01

0.

0.

0.
0.

0.

0.

(µg/ml) (µg/ml)
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1

B CYP2E1 activity after 48h with 100µM FA CYP3A4 activity after 48h with 100µM FA
80 25
ns ns
(nmol 6OH-testosterone / h / mg of proteins)
(pmol OH-CZX / h / mg of proteins)

20
60
CYP2E1 activity

CYP3A4 activity

15
40

10

20
5

0 0
Insulin Insulin
01

01

01
0

5
0

01

01

01

(µg/ml) (µg/ml)
0.

0.

0.
0.

0.

0.

no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1


Supplementary figure 3

Donor 1 Donor 2

Donor 3 Donor 4
Supplementary figure 4

without insulin 0.01 µg/ml insulin 5 µg/ml insulin


120 120

120 A, F A, F A, F
100 100

100

Cellular ATP (%)


† Cellular ATP (%) 80 80
Cellular ATP (%)
6h APAP

80


† 60 †
60
60 †



40 40
40

20 20 20

0 0 0
0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20
APAP concentration (mM) APAP concentration (mM) APAP concentration (mM)

120
without insulin 120
0.01 µg/ml insulin 120
5 µg/ml insulin
A, F A, F A
100 100 100



Cellular ATP (%)
Cellular ATP (%)

Cellular ATP (%)

80 † 80 † 80 †
24h APAP


† †

† 60 †
60 60

† †


40 40 40
† †
† † †

20 20 20

0 0 0
0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20
APAP concentration (mM) APAP concentration (mM) APAP concentration (mM)

without insulin 0.01 µg/ml insulin 120


5 µg/ml insulin
120 120
A, F A A, F
100 100 100


Cellular ATP (%)
Cellular ATP (%)

80
Cell viability (%)
48h APAP

80 † 80 † †


60 † 60 † 60 †

† †
† † †
40 † 40 † 40


20 † 20 † 20

† †

0 0 0
0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20 0 1 2.5 5 10 20
APAP concentration (mM) APAP concentration (mM) APAP concentration (mM)
Supplementary figure 5
without insulin
with 5µg/ml insulin

0 mM APAP
50 ns ns
[GSH] nmol / mg protein

40

30

20

10

0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
without CMZ with CMZ

2.5 mM APAP
40 ns ns
[GSH] nmol / mg protein

30

20

10

0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
without CMZ with CMZ

20 mM APAP
40 F, I ns
[GSH] nmol / mg protein

30

20

10

0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
without CMZ with CMZ
Supplementary figure 6

A. ATP recovery with AMPK activators


Metformin AICAR
50 50
ns ns without insulin
recovery of ATP (%)

recovery of ATP (%)


40 40 with 5 µg/ml insulin

30 30

20 20

10 10

0 0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1

B. GSH Level 0 mM APAP


60 ns ns ns
[GSH] nmol / mg protein

40

20

0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
without AMPK activators with Metformin with AICAR

20 mM APAP
30 ns ns ns
[GSH] nmol / mg protein

20

10

0
no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1 no FA C18:0 C18:1
without AMPK activators with Metformin with AICAR
DISCUSSION, CLONCLUSION ET PERSPECTIVES

• NAFLD et hépatotoxicité des xénobiotiques

De nombreux médicaments, des plantes médicinales et des toxiques industriels


peuvent induire une hépatotoxicité (Biour et al., 2004; Seeff et al., 2015; Wahlang et al.,
2013). Dans les cas les plus graves, cette hépatotoxicité peut nécessiter une hospitalisation,
et éventuellement conduire à la mort du patient (Björnsson, 2009). De nombreux facteurs
peuvent favoriser la survenue d’une hépatotoxicité tels que la présence de certains
polymorphismes génétiques, la consommation excessive d’alcool, ou l’infection par des virus
hépatotropes comme le VHC (Begriche et al., 2011; Chalasani and Björnsson, 2010). De plus,
un nombre croissant d’études indique que la NAFLD est une pathologie hépatique pouvant
augmenter le risque et la sévérité des lésions hépatiques induites par certains médicaments
(e.g. paracétamol, halothane, méthotrexate) ou certains toxiques (e.g. alcool éthylique et
tétrachlorure de carbone) (Donthamsetty et al., 2007; Fromenty, 2013; Michaut et al., 2014;
Tarantino et al., 2007). Etant donné que la NAFLD est fréquemment associée à l'obésité et au
diabète de type 2, l’hépatotoxicité dans ces situations pathologiques est une problématique
importante pour la santé publique (Fromenty, 2013).

Cette problématique soulève cependant pour les toxicologues deux


questions importantes:
1) quels sont les principaux xénobiotiques capables d’induire une hépatotoxicité
accrue dans un contexte d’obésité et de NAFLD?
2) Quels sont les principaux mécanismes impliqués?

Malheureusement, il existe actuellement peu de réponses à ces deux questions.


Concernant les xénobiotiques pouvant présenter un risque particulier, différentes études
cliniques et expérimentales ont pu en identifier quelques-uns (Begriche et al., 2011;
Fromenty, 2013; Tarantino et al., 2007). Cependant, étant donné le grand nombre de

165
médicaments et de toxiques auxquels l’Homme est exposé, il y a encore de nombreuses
investigations à réaliser pour déterminer les molécules les plus problématiques.

Il existe aussi de nombreuses interrogations quant aux mécanismes impliqués dans la


plus grande sensibilité d’un foie stéatosique à l’hépatotoxicité de certains xénobiotiques,
même si quelques hypothèses ont été avancées. On suspecte par exemple les
dysfonctionnements mitochondriaux et le stress oxydant associés à la stéatose qui
pourraient sensibiliser les hépatocytes à une agression externe (Fromenty, 2013). De plus,
ces mécanismes pourraient être complexes et différents en fonction des molécules (Carmiel-
Haggai et al., 2003; Fromenty, 2013; Robin et al., 2005).

• Les modèles expérimentaux de NAFLD

L’identification des molécules particulièrement hépatotoxiques dans un contexte


d’obésité et de NAFLD et les mécanismes impliqués dans cette hépatotoxicité accrue
nécessite d’utiliser des modèles expérimentaux de NAFLD appropriés. Il peut être
intéressant par exemple de travailler sur différents modèles de rongeurs dont l’obésité est
d’origine génétique (souris ob/ob et db/db ou rats fa/fa), ou induite par un régime enrichi en
lipides (Aubert et al., 2011; Carmiel-Haggai et al., 2003; Massart et al., 2012; Xu et al., 2011).
Cependant, il existe de nombreuses différences entre les rongeurs et les humains
concernant le métabolisme hépatique des xénobiotiques (Martignoni et al., 2006), et les
expérimentations animales sont lourdes et éthiquement problématiques.

Concernant les modèles in vitro, de nombreux travaux ont proposé des modèles de
stéatose hépatique en utilisant différents types de cellules, qu’elles soient d’origine humaine
ou animale, incubées avec des acides gras ou plus rarement des émulsions de triglycérides
(Anthérieu et al., 2011; Damelin et al., 2007; De Gottardi et al., 2007; Donato et al., 2007;
Garcia et al., 2011; Janorkar et al., 2009; Liu et al., 2010; Luo et al., 2012; Nativ et al., 2013;
Tirosh et al., 2009). Cependant, ces travaux présentent dans leur ensemble des limitations
importantes qu’il faut souligner :

166
1) Les acides gras (en général, acide palmitique, acide oléique ou des mélanges de ces
deux acides gras) sont parfois utilisés à des concentrations de l’ordre du millimolaire (Donato
et al., 2007; Garcia et al., 2011; Liu et al., 2010), qui sont très supérieures aux concentrations
retrouvées dans la circulation sanguine. En effet, les concentrations plasmatiques des
principaux acides gras saturés (palmitate et stéarate) et monoinsaturés (palmitoléate et
oléate) sont en général inférieures à 200 µM (Fraser et al., 1999; Hagenfeldt et al., 1972;
Kangani et al., 2008; Kotani et al., 2000; Mitropoulos et al., 1994).

2) Plusieurs de ces études utilisent la lignée cellulaire HepG2 (Damelin et al., 2007;
Liu et al., 2010; Luo et al., 2012)qui possède des capacités de métabolisation des
xénobiotiques très limitées, en particulier en ce qui concerne les CYPs (Aninat et al., 2006;
Gerets et al., 2012).

3) Le temps d’exposition des cellules aux acides gras est en général relativement
court, au maximum 48 heures (Damelin et al., 2007; Donato et al., 2007; Garcia et al., 2011;
Liu et al., 2010; Luo et al., 2012; Tirosh et al., 2009). Ainsi, ces modèles cellulaires ne peuvent
pas être utilisés pour étudier les effets cytotoxiques à long-terme de certains xénobiotiques.

4) Dans la plupart des cas, ces travaux n’ont pas évalué l’impact de l’accumulation
lipidique sur les activités du CYP2E1 et du CYP3A4, qui sont significativement modifiées au
cours de l’obésité et des NAFLD. En effet, plusieurs travaux expérimentaux et cliniques ont
montré que l’activité du CYP2E1 est augmentée au cours de ces pathologies, tandis que celle
du CYP3A4 est réduite (Aubert et al, 2011; Brill et al, 2012; Chalasani et al, 2003; Emery et
al., 2003; Kolwankar et al, 2007; Michaut et al, 2014). Une étude réalisée sur des
hépatocytes humains en culture primaire a étudié les effets d’un mélange oléate/palmitate
sur ces activités après 14 heures d’incubation. Cette étude montre cependant une
diminution significative des deux activités (Donato et al., 2007).

167
• NAFLD et hépatotoxicité du paracétamol

Comme il a été mentionné précédemment, des études expérimentales et cliniques


ont montré que l’obésité et la NAFLD pouvaient favoriser l’hépatotoxicité de certains
xénobiotiques, et notamment des médicaments. C’est le cas par exemple du paracétamol,
en particulier chez l’Homme dans le cadre de surdosages (qu’ils soient intentionnels ou non),
ou chez le rongeur après administration de fortes doses (Aubert et al., 2012 ; Corcoran and
Wong, 1987 ; Kon et al., 2010 ; Myers and Shaheen, 2009 ; Nguyen et al., 2008). Il est
important de noter que cette hépatotoxicité accrue dans le contexte de l’obésité ne
semblerait pas restreinte aux intoxications au paracétamol puisqu’elle a été décrite
également pour des doses thérapeutiques (Forget et al., 2009).

Le cas du paracétamol est très intéressant, en particulier pour les raisons suivantes :

1) C’est un antalgique qui est consommé par des millions de personnes, sans
nécessité de prescription médicale.

2) L’hépatotoxicité induite par un surdosage au paracétamol est une des premières


causes d’hépatite fulminante, une atteinte hépatique sévère pouvant entraîner le décès des
patients si les traitements symptomatiques ne sont pas efficaces (Larson et al., 2005;
Megarbane et al., 2007; Shi et al., 2011).

3) Une hépatotoxicité au paracétamol, parfois sévère, peut également s’observer


chez des patients prenant des doses thérapeutiques de cet antalgique, notamment sur des
périodes prolongées, allant plusieurs jours à quelques semaines de traitement) (Claridge et
al., 2010; Forget et al., 2009; Kurtovic and Riordan, 2003; Mitchell et al., 2011; Savino et al.,
2011; Zimmerman and Maddrey, 1995). Dans certaines de ces études, des facteurs
favorisant ont pu être suspectés ou identifiés, tels que le jeûne prolongé, une dénutrition, la
consommation excessive d’alcool ou plus rarement l’obésité et la stéatose associée. Ce point
est discuté plus longuement ci-dessous.

4) Le métabolisme et les mécanismes d’hépatotoxicité du paracétamol sont


globalement bien connus, surtout en ce qui concerne la génération du métabolite toxique
168
NAPQI via les CYP2E1 et CYP3A4 (Hinson et al., 2010; McGill and Jaeschke, 2013; Rumack,
2002). Or, comme cela a été déjà mentionné, l’activité de ces deux enzymes est
significativement modifiée au cours de l’obésité et de la NAFLD. Il est important de
mentionner également qu’une étude effectuée au laboratoire sur des souris wild-type et
génétiquement obèses db/db et ob/ob a apporté des arguments expérimentaux en faveur
du rôle de l’induction du CYP2E1 hépatique dans l’hépatotoxicité accrue du paracétamol
chez certaines des souris obèses (Aubert et al, 2012). Il est à noter enfin que différentes
études expérimentales et cliniques ont montré que l’obésité et la NAFLD étaient également
associées à une augmentation des capacités de glucurono-conjugaison pour le paracétamol
(Abernethy et al., 1983; Aubert et al., 2012; Barshop et al., 2011; Brill et al, 2012; Chaudary,
1993; Michaut et al, 2014).

Dans un article de synthèse récent, nous avons répertorié les différents facteurs qui,
dans un contexte d’obésité et de NAFLD, pourraient favoriser l’hépatotoxicité du
paracétamol, ou à l’inverse protéger les individus vis-à-vis de cette toxicité (Michaut et al.,
2014). Les facteurs qui favoriseraient l’hépatotoxicité au paracétamol sont l’augmentation
de l’activité du CYP2E1 hépatique, la diminution des stocks hépatocellulaires de GSH et la
présence d’une dysfonction mitochondriale significative, s’il existe des lésions de NASH. Les
facteurs qui protégeraient sont l’augmentation du volume de distribution du paracétamol et
des capacités hépatiques de glucuronidation plus importante, ainsi qu’une réduction de
l’activité du CYP3A4.

Ainsi, nous proposons que l’hépatotoxicité accrue de cet antalgique chez les sujets
présentant une NAFLD, rapportée principalement dans un contexte d’intoxication (Myers et
Shaheen, 2008; Nguyen et al, 2008), dépend de la balance entre ces différents facteurs
(Michaut et al., 2014). Ceci pourrait expliquer notamment pourquoi tous les sujets obèses ne
semblent pas susceptibles à l’hépatotoxicité du paracétamol et aussi pourquoi cette
hépatotoxicité accrue s’observerait principalement dans un contexte d’intoxication. Cette
situation contraste avec les sujets alcooliques chez lesquels l’hépatotoxicité du paracétamol
est fréquemment observée, que ce soit après une intoxication ou dans un contexte de prise

169
de doses thérapeutiques (Larson et al., 2005; Lesser et al., 1986; Manchanda et al., 2013;
McClain et al., 1980; Zimmerman and Maddrey, 1995). En effet, dans le cadre de
l’intoxication alcoolique, les facteurs qui pourraient protéger de la toxicité du paracétamol
sont peu nombreux, voire inexistants.

• Les deux grands objectifs des travaux de thèse

Dans ce contexte, mon travail de thèse a eu un double objectif :

1) Grâce à la lignée d'hépatome humain HepaRG, nous avons voulu mettre au point
un modèle cellulaire reproduisant un certain nombre de caractéristiques métaboliques de la
NAFLD, notamment en ce qui concerne les activités des CYP2E1 et CYP3A4, et l’expression
de gènes du métabolisme glucido-lipidique. Pour celà, des cellules HepaRG différenciées ont
été traitées pendant une semaine avec de l'acide stéarique (C18:0) ou de l'acide oléique
(C18:1), en présence de différentes concentrations d'insuline (0, 0.01 or 5µg/ml). Nous avons
étudié les effets de l’insuline car cette hormone joue un rôle central dans l’accumulation des
lipides au niveau hépatocytaire (Ferré and Foufelle, 2010; Xu et al., 2013). De plus,
différentes investigations réalisées sur des cellules hépatiques de rat ont montré que
l’insuline pouvait moduler l’expression du CYP2E1 (Moncion et al., 2002; Shukla et al., 2013;
Woodcroft and Novak, 1999a; Woodcroft et al., 2002).

2) Dans un deuxième temps, nous avons testé la validité de ce modèle cellulaire en


utilisant le paracétamol comme exemple de médicament dont l’hépatotoxicité est accrue
dans un contexte de NAFLD.

Avant de présenter les principaux résultats obtenus, il est important de rappeler


quelques points importants concernant la lignée HepaRG, une lignée cellulaire qui a été
découverte à Rennes par l’équipe de Christiane Guguen-Guillouzo et décrite initialement
pour ces capacités à être infectée par le virus de l’hépatite B (Gripon et al., 2002). Depuis ces
travaux pionniers, de nombreuses études ont montré que cette lignée était
métaboliquement compétente en ce qui concerne les enzymes du métabolisme des
xénobiotiques, avec en particulier des activités des principaux CYPs assez proches des
170
hépatocytes primaires humains (Aninat et al., 2006; Anthérieu et al., 2012; Gerets et al.,
2012; Guillouzo et al., 2007). De plus, il a été montré que la lignée HepaRG était un modèle
intéressant pour étudier les mécanismes d'hépatotoxicité aiguë, ou chronique, induite par
des médicaments (e.g. paracétamol, amiodarone, tétracycline) et différents dérivés toxiques
(e.g. endosulfan, aflatoxin B1, malathion) (Anthérieu et al., 2011; Josse et al., 2008, 2014;
McGill et al., 2011; Savary et al., 2014; Tobwala et al., 2015). Les cellules HepaRG ont été
également utilisées avec succès pour étudier les effets de nutriments, d’hormones ou de
médicaments sur l'expression de diverses enzymes impliquées dans le métabolisme des
glucides et des lipides (Anthérieu et al., 2011; Madec et al., 2011; Nagasawa et al., 2007;
Samanez et al., 2012).

• Principaux résultats obtenus

Les principaux résultats obtenus au cours de mon travail de thèse peuvent être
résumés de la façon suivante :

1) Le traitement des cellules HepaRG pendant une semaine avec de l'acide stéarique
est associé à une augmentation de l'activité du CYP2E1 et à une diminution de l'activité du
CYP3A4, reproduisant ainsi différents données cliniques et expérimentales obtenues dans un
contexte d’obésité et de NAFLD (Aubert et al, 2011; Brill et al, 2012; Chalasani et al., 2003;
Emery et al, 2003; Kolwankar et al, 2007). En revanche, l'acide oléique n'a aucun effet sur
l'activité du CYP2E1 et du CYP3A4.

2) Les expériences effectuées avec différentes concentrations d'insuline ont montré


que l'activité du CYP2E1 dans les cellules HepaRG est régulée négativement par l'insuline de
façon concentration-dépendante. Malgré cela, l'insuline est responsable d’une
augmentation de l’expression du CYP2E1, un effet qui est également dépendant de la
concentration de cette hormone. De plus, des expériences réalisées sur des cultures
primaires d’hépatocytes humains montrent que l'insuline réduit également l'activité de
CYP2E1 avec une augmentation concomitante des taux d'ARNm de ce CYP.

171
3) La stéatose induite dans les cellules HepaRG par l'acide stéarique ou oléique est
associée à une plus forte expression de différents gènes connus pour être régulés par les
lipides, comme APOA4, PLIN1 et PLIN2. En outre, comme attendu, l'insuline augmente
l'expression de différents gènes impliqués dans la synthèse des lipides tels que SREBF1, FASN
et SCD1 (Begriche et al, 2013; Postic and Girard, 2008). L'insuline induit également une
augmentation de l'expression de PNPLA3, en accord avec des études récentes (Dubuquoy et
al., 2011; Huang et al., 2010).

4) Nos investigations réalisées avec une large gamme de concentrations de


paracétamol (1 à 20 mM) montrent que la perte d'ATP cellulaire est presque toujours plus
forte en présence d'acide stéarique. En revanche, la cytotoxicité de ce médicament était à
peu près semblable entre les cellules HepaRG non stéatosiques et celles incubées avec de
l'acide oléique.

5) Les expériences avec le chlorméthiazole (CMZ, un inhibiteur du CYP2E1) indiquent


que la plus forte cytotoxicité observée avec 2,5 et 20 mM de paracétamol en présence
d'acide stéarique peut être attribué, au moins en partie, à l'activité du CYP2E1. Toutefois,
l'implication du CYP2E1 dans la cytotoxicité du paracétamol observée en absence d’insuline
ne semble significative qu’avec 20 mM de ce médicament. De façon intéressante, nos
expériences montrent également que dans les cellules HepaRG non traitées avec le
paracetamol, la perte (légère à modérée) de l'ATP cellulaire observée dans certaines
conditions est secondaire à l'activité basale du CYP2E1.

6) Alors que le CMZ protège les cellules HepaRG vis-à-vis de la perte d’ATP, cet
inhibiteur du CYP2E1 n’offre pas de protection concernant la diminution du GSH et la
génération des adduits du paracétamol avec les protéines cellulaires (adduits «APAP-
protéines»).

Dans la suite de la discussion, certains des résultats mentionnés ci-dessus seront plus
particulièrement développés.

172
• Effets des acides gras sur l’activité du CYP2E1 et du CYP3A4 dans les cellules
HepaRG

Dans notre travail, nous avons obtenu des résultats significatifs avec l’acide stéarique
sur les activités du CYP2E1 et CYP3A4 tandis que l’acide oléique n’avait aucun effet, alors
que le degré de stéatose hépatocytaire était similaire pour les deux acides gras. Ceci suggère
que la nature des acides gras accumulés est très importante, plutôt que la simple quantité
de lipides. Ce résultat important est en accord avec une étude réalisée récemment au
laboratoire sur des souris femelles wild-type, ob/ob et db/db (Aubert et al., 2012). En effet,
cette étude a montré que l’activité du CYP2E1 hépatique était significativement augmentée
chez les souris db/db par rapport au souris non obèses mais pas chez les souris ob/ob, alors
que la quantité de lipides et de triglycérides intra-hépatiques était bien moindre chez les
souris db/db par rapport au souris ob/ob (Aubert et al., 2012). Malheureusement, l’activité
du CYP3A4 n’a pas été évaluée dans cette étude. Il est à noter enfin que deux études
cliniques ont rapporté une corrélation positive et significative entre l’activité du CYP2E1 et le
degré de stéatose mais ces études n’ont pas évalué la nature des lipides intra-hépatiques
(Chtioui et al., 2007 ; Emery et al., 2003). Il serait intéressant à l’avenir de déterminer sur les
cellules HepaRG les effets d’autres acides gras sur les activités du CYP2E1 et CYP3A4 afin de
savoir notamment si les effets de l’acide stéarique peuvent être reproduits avec d’autres
acides gras saturés à longue chaîne. En outre, des investigations seraient nécessaires afin de
déterminer les mécanismes par lesquels l’acide stéarique augmente l’activité du CYP2E1 et
réduit celle du CYP3A4.

Concernant le CYP2E1, il semble que l’acide stéarique agisse à un niveau post-


traductionnel puisque l’augmentation de l’activité de ce CYP n’est pas associée à une
augmentation de son expression. Cependant la régulation post-traductionnelle du CYP2E1
est relativement peu documentée. Des investigations sur des hépatocytes de rat ont montré
que la phosphorylation du CYP2E1 via la protéine kinase A (PKA) diminue l’activité de
l’enzyme sans modifier l’expression protéique (Oesch-Bartlomovicz et al., 1998). Il serait
donc intéressant d’étudier les effets de l’acide stéarique sur l’état de phosphorylation du
CYP2E1, en particulier au niveau de la Ser129 qui semble importante pour la modulation de
173
l’activité enzymatique (Oesch-Bartlomovicz et al., 1998). Il serait intéressant également de
déterminer si l’acide stéarique est capable de réduire l’activité de la PKA au niveau
hépatocytaire, ce qui pourrait expliquer l’augmentation de l’activité du CYP2E1. Après
recherche bibliographique, nous n’avons pas retrouvé de données rapportant un effet de
l’acide stéarique sur l’activation de la PKA dans les hépatocytes. De façon surprenante,
plusieurs études réalisées sur des cellules non-hépatocytaires ont montré que d’autres
acides gras tels que des acides gras polyinsaturés à chaîne longue (acide eicosapentaenoïque
et acide arachidonique), l’acide 2-hydroxyoléique et l’acide butyrique pouvaient activer la
voie cAMP/PKA (Alemany et al., 2006; DeCastro et al., 2005; McClain et al., 1980; Petersen et
al., 2003; Szentandrássy et al., 2007). Ainsi, l’activation de la PKA par les acides gras pourrait
être dépendante de leur structure, et peut-être aussi du type cellulaire.

Contrairement au CYP2E1, l'activité du CYP3A4 dans les cellules HepaRG est réduite
par l'acide stéarique, mais pas par l'acide oléique. La diminution de l’activité du CYP3A4 est
associée à une expression plus faible de cette enzyme. De façon intéressante, une étude
réalisée sur des hépatocytes humains a montré qu'un mélange d'acide palmitique (C16:0) et
d'acide oléique réduisait l'activité du CYP3A4 (Donato et al, 2006). Cependant, ces effets
apparaissent assez rapidement (14 h) après l’ajout d’acides gras, et l’étude n’a pas
déterminé les taux d’ARNm (Donato et al, 2006). Ainsi, l'activité du CYP3A4 et peut-être son
expression pourrait être plus spécifiquement réduite par les acides gras saturés à longue
chaîne, mais des investigations avec différents acides gras seraient nécessaires afin de
répondre à cette question.

Les mécanismes par lesquels l’acide stéarique réduirait l’expression et l’activité du


CYP3A4 ne sont pas connus. Une première hypothèse pourrait être la présence d’un stress
du réticulum endoplasmique qui induirait secondairement l’activation de SREBP-1c (Ferré
and Foufelle, 2010). Des investigations réalisées sur des hépatocytes humains a montré que
ce facteur de transcription peut réduire significativement l’expression du CYP3A4 (Roth et
al., 2008). Une deuxième hypothèse possible serait le rôle du stress oxydatif comme
certaines études pourraient le suggérer (Anthérieu et al., 2013; Gallagher et al., 1995). Il est

174
intéressant de noter qu’une étude réalisée sur des hépatocytes humains a montré que
l’activation de la PKA était responsable d’une diminution de l’expression (mRNA) du CYP3A4
(Lichti-Kaiser et al., 2009). Cependant, bien que la piste de la PKA puisse être intéressante, il
serait difficile d’expliquer pourquoi l’augmentation de l’activité du CYP2E1 par l’acide
stéarique serait liée à une réduction de l’activité de PKA et la diminution de l’expression du
CYP3A4 à une activation de cette kinase.

• Effets de l’insuline sur l’activité du CYP2E1 dans les cellules HepaRG

Mis à part la nature des lipides accumulés dans le foie, d’autres facteurs pourraient
participer à l’augmentation de l’activité du CYP2E1 observée au cours de l’obésité et de la
NAFLD. En particulier, certaines investigations cliniques ont rapporté que cette induction du
CYP2E1 était associée à l'insulinorésistance et au diabète de type 2 (Chalasani et al., 2003;
Emery et al., 2003; Wang et al, 2003). Ainsi, des facteurs comme l’insuline et le glucose
pourraient jouer un rôle significatif. Dans notre travail, nous avons étudié les effets de
l’insuline pour des raisons déjà évoquées ci-dessus mais pas les effets du glucose car nous
avions déjà beaucoup de conditions de culture cellulaire à tester.

Une observation importante dans notre étude est que l'insuline réduit de façon
concentration-dépendante l'activité de CYP2E1 dans les cellules HepaRG et les hépatocytes
humains en culture primaire. Ainsi, plus les quantités d’insuline sont faibles, plus l’activité du
CYP2E1 est élevée dans les hépatocytes. Etant donné que l’obésité et la NAFLD sont souvent
associées à une insulinorésistance, en particulier au niveau hépatique (Asrih and Jornayvaz,
2015; Begriche et al., 2013), nos résultats suggèrent qu’une moindre signalisation insulinique
dans les hépatocytes pourrait, au moins en partie, expliquer l’induction du CYP2E1
hépatique au cours de ces pathologies dysmétaboliques. Il est à noter aussi que nos résultats
sont en accord avec certaines études réalisées chez l’animal. Des études ont montré que
l’insulinopénie induite chez les rongeurs traités par la streptozotocine était associée à une
augmentation du CYP2E1 hépatique, et que cette induction était corrigée par un traitement
à l'insuline (Ioannides et al., 1988; Raza et al., 2004).

175
De façon surprenante, alors que l'insuline réduit l'activité du CYP2E1 dans les HepaRG
et les hépatocytes humains en culture primaire, cette hormone est responsable d’une
augmentation des taux d’ARNm du CYP2E1. De plus, l'insuline augmente l'expression
protéique du CYP2E1 dans les 2 types cellulaires. Ceci suggère que l'activité du CYP2E1
pourrait être régulée de façon post-traductionnelle par l'insuline dans les hépatocytes
humains. Il est également intéressant de relever que les effet positifs de l'insuline sur les
taux d’ARNm du CYP2E1 observés contrastent avec les résultats d’études menées sur des
hépatocytes de rats dans lesquelles des effets inverses étaient observés (Moncion et al.,
2002; Woodcroft and Novak, 1999). Cependant, l'activité du CYP2E1 n'a malheureusement
pas été rapportée dans ces études. Ainsi, l'expression du CYP2E1 pourrait être régulée
différemment par l'insuline chez le rat et l'Homme. D'autres travaux de recherche seront
nécessaires pour déterminer les effets de l’insuline sur la transcription, la traduction et la
régulation post-traductionnelle du CYP2E1 dans les hépatocytes humains. Pour cela, les
cellules HepaRG pourraient être utiles comme modèle expérimental.

• Toxicité du paracétamol sur les cellules HepaRG stéatosiques ou non

Chez l’Homme, les concentrations sériques de paracétamol retrouvées dans


différentes situations cliniques correspondantes à des doses thérapeutiques, toxiques et
létales sont respectivement 10-25 mg/L (0,07-0,17 mM), 100-150 mg/L (0,66-1,0 mM) et
200-300 mg/L (1,32-2,0 mM) (Schulz and Schmoldt, 2003). Il y a donc un facteur
respectivement 10 ou 20 entre les concentrations « thérapeutiques » et les concentrations
retrouvées dans des situations de toxicité « classique » ou létale.

Dans notre travail, nous avons étudié une large gamme de concentrations de
paracétamol, allant de 1 à 20 mM, même si la plus faible de ces concentrations n’était pas
cytotoxique dans la plupart des conditions expérimentales testées. Ainsi, nous avons utilisé
une gamme de concentrations qui reproduit le facteur 20 retrouvé dans différentes
situations cliniques. Il est également important de souligner que les concentrations de
paracétamol que nous avons utilisées sont équivalentes à celles classiquement étudiées sur
des hépatocytes humains ou de rongeurs (Jemnitz et al., 2008; Saberi et al., 2014; Xie et al.,
176
2014a). Le travail de Jemnitz et coll. (2008) montre d’ailleurs que les hépatocytes humains
sont beaucoup moins sensibles à la toxicité du paracétamol comparés aux hépatocytes de
rongeurs. En effet, si l’on compare la cytotoxicité de ce médicament sur des hépatocytes de
souris, de rat et d’Homme, les EC50 sont respectivement de 3,8 mM, 7,6 mM et de 28,2 mM
(Jemnitz et al., 2008). Malheureusement dans cette étude, les auteurs n’ont pas retrouvé de
corrélation entre la sensibilité des hépatocytes au paracétamol et l’activité du CYP2E1 pour
les trois espèces étudiées.

Dans nos expériences réalisées sur les cellules HepaRG traitées avec le paracétamol,
l’inhibition du CYP2E1 par le prétraitement au CMZ est associée à une protection
significative vis-à-vis de la chute de l'ATP cellulaire. Celà confirme que le CYP2E1 est
important dans le mécanisme de cytotoxicité de ce médicament. Il est important de noter
que cette « récupération » (recovery) d’ATP à des temps précoces après le traitement au
paracétamol (6 heures) était significativement plus importante en présence d’acide
stéarique comparée aux autres conditions, que cela soit avec de faibles (2,5 mM) ou de
fortes (20 mM) concentrations de paracétamol. Ce résultat est intéressant car il suggère que
la NAFLD pourrait favoriser la cytotoxicité du paracétamol dans un contexte
«thérapeutique» en plus du contexte de surdosage. En absence d’insuline, la
« récupération » d’ATP induite par le CMZ n’est significative que pour les fortes
concentrations de paracétamol (20 mM), ce qui suggère que les sujets ayant le plus grand
risque d’hépatotoxicité sévère après une intoxication au paracétamol seraient ceux qui
présenteraient une signalisation insulinique altérée au niveau hépatique.

De façon surprenante, alors que le CMZ protége les cellules HepaRG de la chute
d’ATP induite par le paracétamol, cet inhibiteur du CYP2E1 n’offre pas de protection vis-à-vis
de la déplétion du GSH ou de l’apparition des adduits « APAP-protéines ». Nous n’avons pas
à l’heure actuelle d’explication définitive à ces résultats apparemment contradictoires.
Cependant, une hypothèse possible serait que l’inhibition du CYP2E1 dans les cellules
HepaRG diminue la formation de NAPQI dans le compartiment mitochondrial sans

177
retentissement significatif sur les concentrations cellulaires totales de GSH et les quantités
d’adduits « APAP-protéines ».

Certains travaux suggèrent en effet que la toxicité du paracétamol pourrait être la


conséquence de la fixation covalente du NAPQI sur certaines protéines mitochondriales
(McGill and Jaeschke, 2013; Tirmenstein and Nelson, 1989), et plusieurs études ont rapporté
la présence d'une quantité importante de CYP2E1 dans les mitochondries du foie, en
particulier chez l'Homme (Bansal et al, 2013;. Knockaert et al., 2011). Ainsi, il est concevable
que l'inhibition de CYP2E1 par le CMZ ait pu empêcher la liaison du NAPQI à des protéines
mitochondriales critiques, et ainsi diminuer la chute secondaire d’ATP, sans modifier
significativement les quantités totales de GSH cellulaire. Il est à noter que le pool de GSH
mitochondrial ne représente effectivement qu’une petite partie (ca. 10 à 15%) des stocks
cellulaires totaux (Fernandez-Checa and Kaplowitz, 2005; Robin et al., 2005).
Finalement, comme le NAPQI est également formé par le CYP3A4, enzyme ayant une
localisation uniquement microsomale, le CMZ ne peut empêcher la génération d’une grande
partie des adduits « APAP-protéines » dans les cellules HepaRG.

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230
Résumé
L'obésité et les maladies du foie associées (NAFLD) augmentent le risque et la sévérité de l’hépatotoxicité induite par
certains xénobiotiques, mais les mécanismes impliqués sont encore mal compris. Pour l'éthanol et le paracétamol (APAP),
le rôle du cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) hépatique est suspecté car l'activité de cette enzyme est augmentée au cours
er
de ces pathologies dysmétaboliques. Le 1 objectif de notre travail expérimental a été de mettre au point un modèle
cellulaire de NAFLD caractérisé non seulement par l'accumulation de triglycérides mais aussi par l’augmentation de
l'activité du CYP2E1. Pour cela, des cellules humaines HepaRG différenciées ont été incubées pendant une semaine avec
de l'acide stéarique ou de l'acide oléique, en présence de 3 concentrations différentes d'insuline. Les triglycérides
cellulaires et l'expression de gènes induits au cours de la stéatose étaient similaires avec les deux acides gras. Cependant,
l'activité du CYP2E1 était significativement augmentée uniquement par le stéarate et ceci était associé à une diminution
de l'activité du CYP3A4, une autre caractéristique des NAFLD. L’activité du CYP2E1 dans les cellules HepaRG était réduite
par l'insuline d'une manière concentration-dépendante et cet effet était reproduit sur des hépatocytes humains en
culture primaire. Ainsi, l'activité du CYP2E1 était la plus élevée dans les cellules HepaRG cultivées avec du stéarate et sans
ème
insuline. Le 2 but de notre étude était ensuite d'évaluer la cytotoxicité de l’APAP sur des cellules HepaRG présentant
ou non une stéatose et une induction du CYP2E1. Des expériences avec une large gamme de concentrations d’APAP (de 1
à 20 mM) indiquaient que la perte cellulaire d'ATP et du glutathion (GSH) était presque toujours plus forte en présence de
stéarate. Dans les cellules prétraitées avec le chlorméthiazole (CMZ, un inhibiteur du CYP2E1), la moindre diminution
d’ATP était plus importante en présence de stéarate, avec de faibles (2,5 mM) ou de fortes (20 mM) concentrations
d’APAP. Cependant, en l'absence d'insuline, la moindre chute d’ATP induite par le CMZ était significativement plus forte
uniquement pour 20 mM d’APAP. Étonnamment, suite au prétraitement par le CMZ, il n'y avait pas de protection vis-à-vis
de la diminution du GSH et de la formation des adduits APAP-protéines. Enfin, les concentrations du métabolite APAP-
glucuronide étaient significativement augmentées en présence d'insuline. Ainsi, lorsqu’elle est étudiée dans des
conditions spécifiques de culture, la lignée cellulaire HepaRG semble être un modèle intéressant de NAFLD, notamment
en ce qui concerne les activités du CYP2E1 et du CYP3A4. Nos données suggèrent aussi que l’induction du CYP2E1
observée au cours des NAFLD pourrait être secondaire à l'accumulation de certains acides gras et à la présence d’une
faible signalisation insulinique dans le foie. Ainsi, ce modèle cellulaire peut être utilisé pour mettre en évidence les
principaux facteurs métaboliques et hormonaux favorisant hépatotoxicité de l’APAP chez les personnes obèses. Cette
thèse inclut également une revue de la littérature sur l’hépatotoxicité de l’APAP dans le contexte de l’obésité et des
NAFLD (Michaut et al., Liver Int 2014).

Abstract
Obesity and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) are able to increase the risk and the severity of hepatotoxicity
induced by some xenobiotics including drugs, but the involved mechanisms are still poorly understood. For toxic
compounds such as ethanol and acetaminophen (APAP), a role of hepatic cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) is suspected
since the activity of this enzyme is consistently enhanced during obesity and NAFLD. The first aim of our experimental
study was to set up a cellular model of NAFLD characterized not only by triglyceride accumulation but also by higher
CYP2E1 activity. To this end, differentiated human HepaRG cells were incubated during one week with stearic acid, or
oleic acid, in the presence of 3 different concentrations of insulin. Cellular triglycerides and the expression of lipid-
responsive genes were similar with both fatty acids. However, CYP2E1 activity was significantly increased only by stearate
and this was associated with lower CYP3A4 activity, another metabolic feature reported in NAFLD. CYP2E1 activity in
HepaRG cells was reduced by insulin in a concentration-dependent manner and this effect was reproduced in cultured
primary human hepatocytes. Hence, the highest CYP2E1 activity was observed in HepaRG cells with stearate and without
insulin. Next, the second aim of our study was to assess APAP cytotoxicity in HepaRG cells presenting or not lipid
accretion and CYP2E1 induction. Experiments with a large range of APAP concentrations (1 to 20 mM) showed that the
cellular loss of ATP and glutathione (GSH) was almost always stronger in the presence of stearic acid. In cells pretreated
with the CYP2E1 inhibitor chlormethiazole (CMZ), recovery of cellular ATP was significantly higher in the presence of
stearic acid with both low (2.5 mM) and high (20 mM) concentrations of APAP. However, in the absence of insulin, CMZ-
induced ATP recovery was significantly greater only for 20 mM of APAP. Surprisingly, there was no recovery of cellular
GSH and no reduction of APAP-protein adducts following CMZ pretreatment. Finally, levels of APAP-glucuronide were
significantly enhanced in the presence of insulin. Hence, when studied in specific conditions of culture, the HepaRG cell
line can be a valuable model of human NAFLD, especially regarding CYP2E1 and CYP3A4 activity. Our data also suggest
that higher CYP2E1 activity in NAFLD could be secondary to the hepatic accumulation of some fatty acids and to the
presence of low insulin signaling. This cellular model can be thus used to unveil the main metabolic and hormonal factors
favoring APAP hepatotoxicity in obese individuals. This thesis also includes a review on APAP hepatotoxicity in the context
of obesity and NAFLD (Michaut et al., Liver Int 2014).