Enzimologia clinica

Las enzimas son:

Catalizadores biológicos

Las enzimas son proteínas altamente especializadas. Función: catálisis (o regulación de la

velocidad) de las reacciones químicas en los seres vivos.

Las enzimas son proteínas* que catalizan reacciones químicas

• Muchas reacciones requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH sin

catalizador, pero ocurren en condiciones fisiológicas con enzimas.

• Ej. Glc ----> CO2 + H2O en un calorímetro = Ø

• Las enz. aceleran a 1010 a 1014 veces más rápido que las reacciones no cataliza-das.
• Ureasa en orina = 1014 (significa que una reacción que catalizada toma 1 segundo podría
tomar 3 millones de años sin estar catalizada).

• * En su mayoría son proteínas, hay ARN con capacidad catalítica (ribozimas)

Estructura de una enzima

•Las proteínas enzimáticas están formadas por una gran cantidad de aminoácidos (aa), que
cumplen funciones diferenciadas:
• No esenciales, estructurales, de unión y catalíticas.
• Los aa no esenciales pueden ser reemplazados y, en algunos casos, eliminados sin
pérdida significativa en la función o conformación de una enzima.
• Los aa estructurales = conforma-ción de la enzima, "forman su esqueleto".
• Los aa de unión = asociación entre la enzima y el sustrato.
• Los aa catalíticos = transformación del sustrato.
Aspectos generales de las enzimas
• Las enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de
reacción y casi siempre actúa sobre
• un único sustrato o
• un grupo muy reducido de ellos.

• Sustrato: sustancia sobre la que actúa la enzima

Especificidad de función de las enzimas
Mecanismo de la reacción enzimática
• En toda reacción química se produce la transformación de una sustancia inicial,
denominada sustrato (S), en una sustancia final o producto (P), según la siguiente notación:

Reacción catalizada por una enzima:

El centro activo comprende

• un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato
y
• un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo
de la reacción
• Centro activo: Es el sitio donde están los AA de unión al S y los AA que median el efecto
catalítico de la enzima.
• (uniones intermoleculares de la enzima c/el S en una orientación tal que encajan
correctamente, como las piezas en un rompecabezas).

El sustrato se une a la enzima luego se inicia la catálisis

Sitio de unión: es el que le da la especificidad a la enzima
 Sitio catalítico

Nomenclatura
Hay varias formas de nombrar una enzima:
• nombres particulares
• nombre sistemático
• código de la comisión de enzimas (EC = Enzyme Comission) de la UIB
Nomenclatura: nombres particulares
Antiguamente, los enzimas recibían nombres particulares, asignados por su descubridor.
Ejemplos: amilasa (hidroliza el almidón)
glucocinasa
Glc + ATP  Glc-6P + ADP
Al ir aumentando el número de enzimas conocidas, se hizo necesaria una nomenclatura
sistemática que informara sobre la acción específica de cada enzima y los sustratos sobre los
que actuaba.

Nomenclatura: nombre sistemático

Consta actualmente de 3 partes:
• el sustrato preferente
• el tipo de reacción catalizada
• terminación "asa"
ejemplo: la glucocinasa
• ATP: glucosa fosfotransferasa
• Glc + ATP 🡪 Glc-6P + ADP
Comisión de Enzimas
Nomenclatura: E.C.__.__.__.__.
• El nombre es identificado por un código numérico:
• encabezado por las letras EC (enzyme commission)
• seguidas de cuatro números separados por puntos.
 • el primer número indica a cual de las seis clases pertenece la enzima,
• el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo,
• el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos específicos que intervienen en
la reacción y el nº de orden en la lista.

Clasificación y Nomenclatura: Comisión de Enzimas

Nomenclatura: Comisión de Enzimas

• EC 2.7.1.2.
• 2: transferasa
• 7: fosfotransferasa
• 1: el aceptor es un grupo OH
 • 2: es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato.
Ej.: la ATP: glucosa fosfotransferasa (glucocinasa)

Creatin fosfoquinasa
• Dímero: M (músculo) – B (cerebro) separables por electoforesis (método de estudio)
• Cerebro = BB (CPK1 - rápida)
• Músculo esquelético= MM (CPK3 - lenta)
• Corazón = MB (CPK2 - intermedia) h. 6% de la CPK total = 10-50 UI/L a 30ºC.

Clasificación de enzimas
CK o CPK = EC 2.7.3.2: Creatina kinasa
• Clases
• Subclases
• Subsubclases
• Orden

Lactato deshidrogenasa ó LDH

• Tetramérica c/2 subunidades distintas: H de corazón y M de músculo, que se combinan de
5 formas.
• LDH1 – HHHH – Miocardio
• LDH2 – HHHM - Miocardio y GR
• LDH3 – HHMM – Cerebro y riñón
• LDH4 – HMMM – Hígado y Músculo esquelético
• LDH5 – MMMM – Músculo esquelético
Isoenzimas de Amilasa (AMI)
Alfa-amilasa (α-amilasa) EC 3.2.1.1
• 1,4-α-D-glucan glucanohidrolasa; glicogenasa) metaloenzima (dependiente de Ca).
• Corta enlaces glicosídicos alfa-1,4 al azar o at random.
• En animales es la mayor enzima digestiva y su pH óptimo es 6.7-7.0.
• En amilasa salivar y pancreática son alfa-amilasas. Esta forma es también hallada en plantas,
 hongos y bacterias (Bacillus).
Beta-amilasa (β-Amilasa) EC 3.2.1.2
• 1,4-α-D-glucan maltohidrolasa; glicogenasa
• es también sintetizada por bacterias, hongos y plantas.
• Cataliza la hidrólisis del segundo enlace α-1,4 glicosídico desde el extremo no reductor,
separando 2 unidades de glucosa (maltosa).
• Presente en semillas y granos de cereales; en muchos microorganismos que degradan el
almidón extracelular.
• Los tejidos animales no contienen β-amilasa, pero puede estar presente en
microorganismos del TD. El pH óptimo es 4.0-5.0.
• γ-Amilasa (EC 3.2.1.3) ó Glucan 1,4-alfa-glucosidasa ó amiloglucosidasa ó Exo-1,4-α-
glucosidasa ó glucoamilasa; α-glucosidasa lisosomal; 1,4-α-D-glucan glucohidrolasa.
• Rompe los enlaces α(1-6) glicosídicos, como también el último enlace α(1-4)glicosídico del
extremo no reductor de amilosa y amilopectina, produciendo glucosa. Es más activa a pH 3.

MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS

• La acción de los catalizadores consiste en disminuir la Energía de activación
• Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la Ea aún más
que los catalizadores inorgánicos.
• Por ej, la descomposición del agua oxigenada (H2O2) puede ocurrir
• sin catalizador Ea= 18 Kcal/mol
• con un catalizador inorgánico (platino) Ea= 12 Kcal/mol
• con una enzima específica (catalasa) Ea= 6 Kcal/mol
• Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción 20.000 veces, mientras que la
catalasa la acelera 370.000 veces.
• Dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima:
• el modelo llave-cerradura
• el modelo del ajuste inducido
MODELO LLAVE-CERRADURA
• La estructura del sustrato y la del centro activo son complementarias
• Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto

MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO

• el centro activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del sustrato.
• La unión del sustrato al centro activo de la enzima desencadena un cambio conformacional
que da lugar a la formación del producto.

Modelos de la interacción E - S

Cofactores - Coenzimas
• A veces, una enzima requiere p/su función la presencia de sustancias no proteicas que
colaboran en la catálisis:
• Los cofactores. Pueden ser iones inorgánicos como el Fe++,
Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas
conocidos requieren cofactores.
• Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama
coenzima.
• Muchas de estas coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas.
• Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos
covalentemente a la enzima se llaman grupos prostéticos.
• La forma catalíticamente activa de la enzima = holoenzima. La parte proteica de una
holoenzima se llama apoenzima (inactiva), de forma que:
apoenzima + grupo prostético = holoenzima

Coenzima: NAD+
Deriva de la Vitamina B5
(ácido nicotínico)

Coenzima: FAD
Es grupo prostético.Deriva de la Vitamina B2 (flavina)
CINÉTICA ENZIMÁTICA
• La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.
• La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad,
ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima.
• Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción
catalítica y de la especificidad de la enzima.

MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN

• Finales del siglo XIX: estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del
sustrato s/la actividad enzimática.
• En 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del
proceso de catálisis enzimática.
• En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una
de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas.
 V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima

Velocidad de reacción
• La v de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad
(en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima).
• La medida se realiza siempre en:
• Condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc,
• C/concentraciones saturantes de sustrato.
• En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima
(Vmax).
• Se expresa en aparición de los productos o la desaparición de los reactivos

MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN

ENZIMA

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten es una hipérbola . La Vmax

corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la Km corresponde a la
concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante por varias

razones:
• Km = [S] para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima.
• El valor de Km da idea de la afinidad de la enzima por el sustrato:
• a menor Km, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y
• a mayor Km, menor afinidad.
• Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética
no es Michaeliana.
• Esto ocurre con las enzimas alostéricas, cuya gráfica de v frente a [S] no es una hipérbola,
sino una sigmoide
• En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la
KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

Regulación de la actividad enzimática

Como ocurre con toda proteína, la actividad de una enzima depende de factores tales como:
• Temperatura, • Solventes,
• pH, • Activadores e inhibidores,
• Disoluciones salinas, • Tiempo de reacción.
Factores que afectan la cinética enzimática
La actividad puede estar afectada por:
pH - Temperatura - Fuerza iónica - Inhibidores

Efecto el pH
 • La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH.
• Desviaciones de pocas décimas del pH óptimo pueden afectar drásticamente su
actividad. Por ello, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos
para mantener estable el pH intracelular
• Variaciones del pH del medio producen cambios en el estado de ionización de algunos
grupos de una enzima, afectando su estructura tridimensional y su actividad.
• El cambio en la ionización de grupos químicos del sitio activo puede alterar el
reconocimiento del sustrato o la reactividad de los AA del sitio activo.
• Todas las enzimas tienen dos valores límites de pH entre los cuales son efectivas, más allá
se desnaturaliza y deja de actuar.

Efecto de la Temperatura

Factor temperatura
Si aumenta la temperatura, aumenta la energía cinética de las partículas y su movilidad
produciéndose un aumento en el número de colisiones y la velocidad de la transformación. Si
la temperatura continúa aumentando, se comienzan a romper unio-nes intermoleculares
(responsables de la conformación) y, así, comienza a disminuir su actividad. Si la T (ºC) es
excesiva, la enzima se desnaturaliza perdiendo totalmente sus propiedades catalíticas.
Factores que afectan la cinética enzimática: INHIBIDORES
Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de una enzima: son los inhibidores.
Inhibidores Reversibles
• Pueden actuar de 3 modos:
• ocupan temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el S
original: inhibidor competitivo
• Se unen a otro sitio en la Enz y alteran su conformación espacial, impidiendo su
unión al S: inhibidor no competitivo
• Se unen al complejo E-S impidiendo la catálisis del sustrato: inhibidor
acompetitivo
Inhibidores Reversibles inhibidor competitivo

Inhibidores Reversibles: inhibidor no competitivo

Inhibidores Reversibles inhibidor acompetitivo

Se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones,
dependiendo de si el inhibidor se une a la enzima, al complejo enzima-sustrato o a ambos.

Regulación de la catálisis enzimática

• las concentraciones del sustrato y de los • modificación covalente
productos finales • activación por proteolisis (zimógenos)
• presencia de inhibidores • isoenzimas
• modulación alostérica
MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y
T (tensa).
R es la forma más activa porque se une al sustrato con más afinidad. Las formas R y T se
encuentran en equilibrio R <==> T

Enzima alostérica
Son enzimas que cambian su conformación al unirse un efector, lo que conduce a un cambio
aparente en la afinidad de unión de otro Ligando (bioquímica) en un sitio distinto de la
molécula.

ACTIVADORES ALOSTÉRICOS
• Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R
actuando s/una región de la Enz distinta del centro activo.
• Son los llamados moduladores positivos ó activadores
alostéricos.
• El propio S es a menudo un modulador positivo.

INHIBIDORES ALOSTÉRICOS
• Las sustancias que favorecen la forma T y actúan en lugares distintos del centro activo de la
enzima y disminuyen la actividad enzimática: son los moduladores alostéricos negativos.

•
Regulación de la actividad enzimática por MODIFICACIÓN COVALENTE
• Hay enzimas que pasan de la forma inactiva a la activa por unión covalente a un grupo
químico de pequeño tamaño como el Pi o el AMP.
• También se da el caso inverso (E activa -> E inactiva)

Regulación de la actividad enzimática por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA

• Algunos enzimas no se sintetizan como E activa, sino como proteínas precursoras sin
 actividad enzimática. Estas proteínas se llaman proenzimas o zimógenos.
• Para activarse, los zimógenos sufren hidrólisis que origina la liberación de uno o varios
péptidos.
• El resto de la molécula proteica adopta la conformación y las propiedades de la enzima
activa.
• Ej.: enzimas digestivas se secretan en forma de zimógenos y en el tubo digestivo se
convierten en la forma activa. Es el caso de la quimotripsina, que se sintetiza en forma de
quimotripsinógeno

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR MEDIO DE ISOENZIMAS

• Algunos enzimas tienen distinta estructura molecular aunque su función biológica es
similar. Se llaman isozimas o isoenzimas.
• Estas diferencias de estructura se traducen en ligeros cambios en sus propiedades, de
forma que cada isozima se adapta perfectamente a la función que debe realizar.
• Así, podemos observar la existencia de isoenzimas en función de:
• el tipo de tejido: Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa presenta isoezimas distintas
en músculo y corazón.
• el compartimento celular donde actúa: Por ejemplo, la malato deshidrogenasa del
citoplasma es distinta de la de la mitocondria.
• el momento concreto del desarrollo del individuo. Ej: algunos enzimas de la glicolisis
del feto son diferentes de los mismos enzimas en el adulto.
•