TRANSCRIÇÃO E DISCIPLINA: GENÉTICA GERAL

PROFª DRA ADÉLIA CRISTINA

PROCESSAMENTO DO RNA MEDICINA - UNICERRADO
INTRODUÇÃO
 A bactéria Escherichia coli tem cerca de 3.200 genes;

 A levedura Saccharomyces cerevisiae, um eucarioto unicelular, tem cerca de

6.300 genes,

 A mosca das frutas Drosophila melanogaster tem cerca de 13.600 genes

 Espécie humana: 25.947 genes

 Apenas o dobro dos genes que um nematelminto e o mesmo número de

genes que a primeira planta a ter seu genoma sequenciado, a praga
Arabidopsis thaliana
INTRODUÇÃO
 Genes de eucariotos superiores em geral são compostos por éxons (termo
derivado da expressão em inglês expressed regions, ou seja, regiões expressas), que
codificam partes das proteínas, e íntrons (de intervening region, regiões
intercalares), que separam os éxons
 Uma cópia de RNA contendo tanto éxons quanto íntrons é sintetizada a partir de
um gene
 Uma estrutura biológica (chamada spliceossomo) remove os íntrons e une os éxons
para produzir um RNA maduro que contém a informação contínua necessária para
sintetizar uma proteína
 O que os éxons e os íntrons têm a ver com a baixa contagem de genes humanos?
Por enquanto, é suficiente dizer que o RNA transcrito de um gene pode ser
recomposto de modos alternativos
 Embora tenhamos apenas cerca de 20.000 genes, eles codificam mais de 100.000
proteínas, graças ao processo de recomposição alternativa do RNA
INTRODUÇÃO
 Primeira etapa da transferência de informações dos genes para os
produtos gênicos
 Na sequência do DNA do genoma de qualquer organismo, está codificada
a informação que especifica cada um dos produtos gênicos que o organismo
consegue fazer
 Essas sequências de DNA também contêm informações que especificam
quando, onde e como grande parte do produto é feita
 Entretanto, essa informação é estática, inserida na sequência do DNA
 Para a informação ser utilizada, é necessária a síntese de uma molécula
intermediária, que é uma cópia de um gene distinto com o uso da sequência
de DNA como um guia
 Essa molécula é o RNA, e o processo de sua síntese a partir do DNA é
chamado de TRANSCRIÇÃO
INTRODUÇÃO
 Nos eucariotos, a transcrição e a tradução ocorrem em locais
diferentes: a transcrição no núcleo e a tradução no citoplasma.
 Entretanto, antes que os RNA estejam prontos para serem
transportados para o citoplasma para tradução ou outros usos, eles
sofrem substancial processamento:
 remoção dos íntrons
 adição de um revestimento ( cap) especial em 5'
 e uma cauda de nucleotídios adenina em 3‘

 Um tipo de RNA totalmente processado, chamado de RNA

mensageiro (mRNA), é o intermediário na síntese de proteínas

 Além disso, tanto nos procariotos como nos eucariotos, há outros

tipos de RNA que nunca são traduzidos. Esses ncRNA desempenham
muitos papeis essenciais.
PROPRIEDADES DO RNA
 Cadeia de nucleotídeos unifilamentar
 Ribose
 Uracila
 Ribozima: atividade catalítica do RNA. Funcionam como enzimas
proteicas
 Obs.: uracila forma pontes de hidrogênio com a adenina do mesmo
modo que a timina e é capaz de parear com G.
 As bases U e G formam pares de bases apenas durante o dobramento
do RNA, e não durante a transcrição.
 As duas pontes de hidrogênio que podem ser formadas entre U e G
são mais fracas que as duas que se formam entre U e A.
 A capacidade de U parear-se com A e G é o principal motivo pelo
qual o RNA consegue formar estruturas complicadas, muitas delas
importantes em processos biológicos.
CLASSES DE RNA
 Agrupados em duas classes gerais:

 Uma codifica a informação necessária para fazer cadeias

polipeptídicas (proteínas) e é denominada RNA mensageiro (mRNA)
porque, como tal, serve como intermediário e passa a informação do
DNA para a proteína.

 As outras classes denominam-se RNA funcionais, porque o RNA não

codifica a informação para fazer proteínas. Em vez disso, ele próprio é o
produto funcional final.
CLASSES DE RNA
 RNA mensageiro - As etapas pelas quais um gene influencia o fenótipo
são chamadas de expressão gênica. Para a grande maioria dos genes, o
RNA transcrito é apenas um intermediário necessário para a síntese de
uma proteína, que é o produto funcional final que influencia o fenótipo.

 RNA funcional - À medida que sabemos mais sobre os mínimos

detalhes da expressão e da regulação gênica, fica evidente que os RNA
funcionais pertencem a várias classes e têm papéis diversos. Novamente,
é importante enfatizar que os RNA funcionais são ativos como RNA; eles
nunca são traduzidos em polipeptídios.
CLASSES DE RNA
 Principais classes de RNA funcionais - contribuem para várias etapas na
transferência da informação do DNA para a proteína, no processamento de
outros RNA e na regulação do RNA e dos níveis de proteínas na célula.
 Duas são encontradas tanto em procariotos quanto em eucariotos:
 RNA transportador (tRNA) é responsável por levar o aminoácido correto
para o mRNA no processo de tradução.
 RNA ribossômico (rRNA) é o principal componente dos ribossomos, que
são grandes "máquinas" macromoleculares que conduzem a montagem da
cadeia de aminoácidos pelos mRNA e tRNA.
 Toda a coleção de tRNA e rRNA é codificada por um pequeno número de
genes (algumas dezenas a centenas, no máximo).
Embora os genes que os codificam estejam em pequeno número, os rRNA
representam uma grande porcentagem do RNA na célula, porque são
estáveis, e transcritos em muitas cópias.
CLASSES DE RNA
 Outra classe de RNA funcionais participa do processamento do RNA e é
específica dos eucariotos:

 Pequenos RNA nucleares (snRNA) - parte de um sistema que processa

os RNA transcritos nas células eucarióticas.

 Alguns snRNA unem-se a várias subunidades proteicas para formar o

complexo ribonucleoproteico de processamento (o spliceossomo) que
remove íntrons dos mRNA eucarióticos.
CLASSES DE RNA
 Um grupo grande de RNA funcionais suprime a expressão gênica em
muitos níveis e também mantém a estabilidade do genoma.
 Três classes desses RNA funcionais podem ser codificadas por grandes
frações dos genomas eucarióticos: microRNA, pequenos RNA de
interferência e RNA de interação piwi.
 MicroRNA (miRNA) recentemente foram reconhecidos pelos cientistas
por terem um amplo papel na regulação da quantidade de proteínas
produzidas por muitos genes eucarióticos.
 Pequenos RNA de interferência (siRNA) e RNA de interação piwi
(piRNA) ajudam a proteger a integridade dos genomas de plantas e
animais. Os siRNA inibem a produção de vírus, enquanto eles e os piRNA
impedem a dispersão de elementos de transposição para outros loci
cromossômicos.
 Os siRNA restringem os elementos de transposição em plantas, e os
piRNA exercem a mesma função em animais.
A TRANSCRIÇÃO
 Como a informação codificada na molécula de DNA é transferida para o
RNA transcrito?

 A transcrição baseia-se no pareamento complementar de bases.

 Considerando a transcrição de um segmento cromossômico que constitui um

gene.

 Primeiro, os dois filamentos da dupla hélice de DNA separam-se localmente,

e um dos filamentos separado atua como um molde para a síntese de RNA.

 No cromossomo em geral, ambos os filamentos de DNA são usados

como moldes; mas, em qualquer gene, apenas um filamento é usado e, nesse
gene, é sempre o mesmo filamento (molde). O outro é chamado filamento
codificador
 TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
 INICIAÇÃO
 Em procariotos, a RNA polimerase geralmente se liga a uma sequência
específica do DNA chamada promotor, situada perto do início da região
transcrita
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
 A primeira base transcrita está sempre no mesmo local,
chamado de sítio de início de transcrição.
 O promotor é dito antecedente (upstream) ao sítio de
iniciação, porque está situado na frente desse sítio, no sentido
oposto ao da transcrição.
 Um sítio posterior (downstream) estaria situado depois da
região de transcrição.
 Por convenção, a primeira base do DNA a ser transcrita é
numerada +1. As posições dos nucleotídios antecedentes ao sítio
de início da transcrição são indicadas por sinal negativo (-) e as
posteriores o são por um sinal positivo (+).
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
 Como a mesma RNAm polimerase se liga a sequências promotoras desses
diferentes genes, as similaridades entre os promotores não são
surpreendentes.
 Duas regiões de grande similaridade aparecem em praticamente todos os
casos.
 Essas regiões foram denominadas -35 e -10
 As regiões -35 e -10 de genes diferentes não precisam ser idênticas para
desempenhar uma função similar.
 Sequência consenso - está de acordo com a maioria das sequências.
 Uma holoenzima RNA polimerase liga-se ao DNA nesse ponto e, então,
desenrola a dupla hélice do DNA, começando a síntese de uma molécula de
RNA.
 A parte do gene codificadora de proteínas em geral começa com uma
sequência ATG, mas o sítio de iniciação, onde começa a transcrição,
geralmente está bem anterior a essa sequência. A parte intercalar é chamada
de região 5' não traduzida ( 5' UTR).
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
ALONGAMENTO
 À medida que a RNA polimerase se move ao longo do DNA, desenrola o
DNA à frente dela e enrola de novo o DNA que já foi transcrito. Desse
modo, ela mantém uma região do DNA unifilamentar, chamada de bolha de
transcrição, dentro da qual o filamento que serve de molde é exposto
 Na bolha, a polimerase monitora a ligação de um ribonucleosídio trifosfato
livre à base exposta seguinte no molde de DNA e, se houver
complementaridade, adiciona-o à cadeia
 Dentro da bolha, os últimos oito ou nove nucleotídios adicionados à cadeia
de RNA formam um híbrido RNA-DNA por pareamento complementar de
bases com o filamento-molde.
 À medida que a cadeia de RNA aumenta em sua ponta 3', a ponta 5'
unifilamentar é liberada da polimerase. Os pares de bases complementares
se quebram na ponta de saída, liberando o filamento único
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
TÉRMINO
 A transcrição de um gene individual continua além do segmento do
gene codificador de proteína, criando uma região 3' não traduzida (3'
UTR) na ponta do transcrito.
 O alongamento continua até que a RNA polimerase reconheça
sequências especiais de nucleotídios que atuam como um sinal para o
término da cadeia
 O encontro com os nucleotídeos de sinal inicia a liberação do RNA
nascente e da enzima do molde
 Os dois mecanismos principais de término em E. coli (e outras bactérias)
são chamados de intrínsecos e rho-dependentes.
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
 Intrínseco: o término é direto
 As sequências de término contêm cerca de 40 pares de bases,
terminando em um trecho rico em GC que é seguido por uma fileira de
seis ou mais A.
 Essas bases C e G são capazes de formar pontes de hidrogênio
complementares uma à outra, resultando em uma alça em grampo
 As alças em grampo, que são na maior parte pares G-C, apresentam-
se mais estáveis que as alças que são constituídas principalmente por
pares A-U
 A alça é seguida por uma fileira de cerca de oito U, que correspondem
aos resíduos A no molde de DNA.
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
 No mecanismo intrínseco, acredita-se que a polimerase faz uma pausa
após a síntese das U (o que forma um híbrido DNA-RNA fraco).
 Entretanto, a polimerase ao retroceder encontra a alça em grampo. Esse
bloqueio é responsável pela liberação do RNA da polimerase e a liberação
desta do molde de DNA
 O segundo tipo de mecanismo de término exige a ajuda de uma
proteína chamada fator rho, que reconhece os sinais de término para a RNA
polimerase
 Não têm a fileira de resíduos U em sua ponta 3' e geralmente não têm
alças em grampo
 Têm uma sequência de cerca de 40 a 60 nucleotídios que é rica em
resíduos C e pobre em G, e inclui um segmento antecedente chamado de
sítio rut (do inglês rho utilization)
 Rho é um hexâmero que consiste em seis subunidades idênticas que se
ligam à cadeia de RNA nascente no sítio rut: rho facilita a liberação do RNA
da RNA polimerase.
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
 Mais complicada, mas muito similar à que ocorre nos
procariotos, por três motivos:

1) genomas eucarióticos são maiores - têm muito mais genes a

serem reconhecidos e transcritos. Há, também, muito mais DNA
não codificador nos eucariotos
 Por exemplo, enquanto a densidade de genes (número médio de genes por
comprimento de DNA) em E. coli é de 1 gene por 1.400 pb, esse número cai
para 1 gene por 9.000 pb na Drosophila, e é de apenas 1 gene por 100.000
pb nos seres humanos
 Nos genomas de eucariotos multicelulares, encontrar o começo de um gene
pode ser como procurar uma agulha em um palheiro.
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
 Como lidam com esse problema?
 3 polimerases: RNA pol I (rRNA), RNA pol II (mRNA), RNA pol III (tRNA)

 Muitos fatores auxiliam: fatores gerais de transcrição (GTF)

2) Diferença significativa entre eucariotos e procariotos - existência de um

núcleo nos eucariotos:
 Antes que o RNA deixe o núcleo, ele precisa ser modificado de vários modos.
Essas modificações são coletivamente chamadas de processamento do RNA.
 O RNA recém-sintetizado é chamado de transcrito primário ou pré-mRNA. O
termo mRNA para o transcrito totalmente processado que pode ser exportado
para fora do núcleo
 RNA polimerase II precisa sintetizar RNA e, simultaneamente, coordenar uma
gama diversa de eventos de processamento
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS

3) O molde para a transcrição, o DNA genômico, está organizado em

cromatina nos eucariotos

 algumas estruturas de cromatina conseguem bloquear o acesso da

RNA polimerase ao molde de DNA, característica da cromatina que
evoluiu em um mecanismo muito sofisticado para regular a expressão
gênica em eucariotos
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS

O cerne da RNA polimerase II também

não consegue reconhecer as sequências promotoras por si só

 Nas bactérias, o fator sigma é parte integrante da

holoenzima polimerase,

 Nos eucariotos demandam GTF para se ligarem às

regiões no promotor antes da ligação do cerne da enzima
 TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS

 GTF não participam da síntese de RNA

 Reconhecem as sequências no promotor e ligam-se a elas ou a outros GTF -

atraem o cerne da RNA polimerase II e posiciona-a no sítio correto para
começar a transcrição.

 GTF são designados TFIIA, TFIIB, e assim por diante (siglas do inglês
transcription factor, ou seja, fator de transcrição da RNA polimerase II)

 Os GTF e o cerne da RNA polimerase II - complexo de pré-iniciação (PIC)

TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
 PIC: Seis GTF, e cada um deles é um complexo multiproteico + o cerne da RNA
polimerase II formado por uma dúzia ou mais de subunidades proteicas

 Promotores eucarióticos também estão situados do lado 5' (antecedente) do ponto de

início da transcrição

 TATA geralmente pode ser vista situada cerca de 30 pares de bases (-30 pb) do ponto
de início da transcrição. Essa sequência, chamada de TATA boxe, é o sítio do primeiro
evento na transcrição: a ligação da proteína de ligação a TATA (TBP), parte do complexo
TFIID, um dos seis GTE

 Quando ligada ao TATA boxe, a TBP atrai outros GTF e o cerne da RNA polimerase II
para o promotor, formando assim o complexo de pré-iniciação.
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
 O alongamento ocorre dentro da bolha de transcrição, essencialmente
como descrito para a síntese de RNA procariótico.
 Entretanto, o RNA nascente tem destinos muito diferentes nos
procariotos e eucariotos.
 Nos procariotos, a tradução começa na ponta 5' do RNA nascente,
enquanto a metade 3' ainda está sendo sintetizada.
 RNA dos eucariotos precisa ser processado antes que possa ser
traduzido:
(1) o acréscimo de um revestimento (cap) na ponta 5',
(2) recomposição (splicing) para eliminar os íntrons e
(3) o acréscimo de uma cauda 3' de nucleotídios adenina
(poliadenilação)
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
 O processamento de fato ocorre durante a síntese de RNA, ou seja,
trata-se de processamento cotranscricional.

 Portanto, o RNA parcialmente sintetizado (nascente) está sofrendo

reações de processamento à medida que emerge do complexo da RNA
polimerase I

 O CTD está situado perto do sítio de onde o RNA nascente emerge da

polimerase - local ideal para orquestrar a ligação e a liberação das
proteínas necessárias para processar o transcrito de RNA nascente
enquanto a síntese do RNA continua
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
 Nas várias fases do processamento, os aminoácidos do CTD sofrem
modificação reversível - em geral pela fosforilação e desfosforilação

 O estado de fosforilação do CTD determina que proteínas de

processamento podem se ligar

 Desse modo - CTD determina a tarefa a ser desempenhada no RNA à

medida que ele emerge da polimerase

 PROCESSAMENTO DAS PONTAS 5' E 3 ‘:

 Cap (revestimento): adicionada à ponta 5' por várias proteínas que

interagem com o CTD. Consiste em uma 7-metilguanosina ligada ao transcrito
por três grupos fosfato
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
 Funções do cap: proteger o RNA da degradação. É necessário na
tradução

 O alongamento do RNA continua até que seja reconhecida a sequência

AAUAAA ou AUUAAA perto da ponta 3 ‘ por uma enzima que corta a
ponta do RNA aproximadamente 20 bases depois

 É adicionado a essa ponta um trecho de 150 a 200 nucleotídios

adenina chamados cauda poli(A)

 Sequência AAUAAA do mRNA dos genes codificadores de proteína -

sinal de poliadenilação.
REMOÇÃO DOS ÍNTRONS
 Íntrons estão presentes não apenas nos genes codificadores de proteínas,
mas também em alguns genes de rRNA e, até mesmo, de tRNA.

São removidos do transcrito primário enquanto o RNA ainda está sendo

transcrito e após o cap ter sido adicionado, mas antes de o transcrito ser
transportado para o citoplasma

 A remoção dos íntrons e a união dos éxons é chamada de recomposição

(splicing)

 Junta as regiões codificadoras, ou éxons, de modo que o mRNA agora

contenha a sequência codificadora que é completamente colinear à proteína
que ela codifica.
REMOÇÃO DOS ÍNTRONS
 O tamanho médio de um íntron de mamífero é de cerca de 2.000
nucleotídios, e um éxon médio tem cerca de 200 nucleotídeos
Assim, a maior porcentagem de DNA nos mamíferos codifica íntrons em
vez de éxons
 Recomposição alternativa - genes organizados em éxons e íntrons? O
número de genes no genoma humano - (agora estimado em cerca de
21.000 genes) corresponde a menos que o dobro do número de genes no
nematelminto
 Essas proteínas superam o número de genes de tal modo que indicam
que um gene pode codificar a informação para mais de uma proteína
 Recomposição alternativa (ou splicing alternativo) - diferentes mRNA e,
subsequentemente, diferentes proteínas são produzidos pelo mesmo
transcrito primário, recompondo diferentes combinações de éxons.
REMOÇÃO DOS ÍNTRONS
 Mais de 70% dos genes humanos são recompostos de
maneira alternativa.
 Muitas mutações com sérias consequências para o
organismo são devidas a defeitos de recomposição
 As proteínas produzidas pela recomposição alternativa
em geral estão relacionadas (porque costumam conter
subgrupos dos mesmos éxons do transcrito primário)
 Frequentemente são usadas em tipos diferentes de células
ou em estágios diferentes do desenvolvimento
REMOÇÃO DOS ÍNTRONS
 Nas junções íntron/éxon encontram-se alguns nucleotídios específicos quase
idênticos entre os genes e as espécies; eles têm sido altamente conservados,
porque participam das reações de recomposição

 Cada íntron é cortado em cada ponta, e as extremidades do íntron

geralmente têm GU na ponta 5' e AG na ponta 3‘ (a regra GU-AG)

 Outro sítio invariante é um resíduo de A entre 15 e 45 nucleotídios

antecedentes ao sítio de corte 3 ‘

 Sequências de nucleotídios nas junções de corte sugeriu que deveria haver

uma maquinaria que reconhecesse essas sequências e fizesse a recomposição
REMOÇÃO DOS ÍNTRONS
 Os nucleotídios conservados no transcrito são reconhecidos por cinco
pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP)

 snRNP – complexos de proteína e um dos cinco snRNA (U1, U2, U4, U5 e

U6)

 Essas snRNP e mais de 100 proteínas adicionais são parte do spliceossomo

- grande máquina biológica que remove os íntrons e une os éxons

 Os componentes do spliceossomo interagem com o CTD

 Esses componentes do spliceossomo ligam-se a sequências de íntron e éxon

REMOÇÃO DOS ÍNTRONS
 As snRNP ajudam a alinhar os sítios de corte tanto no final de um íntron,
formando pontes de hidrogênio com o íntron conservado, quanto com as
sequências de éxon.

 recrutam outros complexos e formam o spliceossomo - catalisa a

remoção do íntron por duas etapas consecutivas de recomposição

 A primeira etapa liga uma ponta de um íntron à adenina interna

conservada, formando uma estrutura que tem a forma de um laço de
cowboy.

 A segunda etapa libera o laço e junta os dois éxons adjacentes

REMOÇÃO DE ÍNTRONS

 Alguns RNAs podem remover íntrons de si mesmos

 Estudos mais recentes indicam que a remoção do íntron é catalisada

pelos snRNA e não pelo componente proteico do spliceossomo