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Rev Cubana Farm 2003;37(2)

Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana

Validación de los métodos analíticos empleados en el

estudio del inyectable de fosfato de disopiramida (13
mg/mL)
Gisela Gra Ríos,1 Sol Amalia Fernández Monagas,1 Mirta Castiñeira Díaz2 y María
Aurora Barrios Álvarez3
Resumen
Se realizó la validación de un método espectrofotométrico para ser utilizado en el control
de la calidad del inyectable fosfato de disopiramida (13 mg/mL), en la que se determinó
la absorbancia a 269 nm, y se empleó como disolvente una mezcla de metanol-sulfúrico.
También se realizó la validación de una técnica de cromatografía líquida de alta
resolución, en la que se utilizó una columna de Lichrosorb RP-8 y como fase móvil una
solución de fosfato de sodio monobásico (0,05 mol/L) pH 3:acetonitrilo (73:27 v/v).
Ambos métodos resultaron ser lineales, precisos y exactos, en el rango de
concentraciones estudiado. Para la técnica de cromatografía líquida de alta resolución se
comprobó, además, su especificidad.

DeCS: DISOPIRAMIDA; ESPECTOFOTOMETRIA; CONTROL DE CALIDAD.

En los países desarrollados y en Cuba, las enfermedades cardiovasculares constituyen la
primera causa de muerte, al ser controladas las enfermedades infecciosas. Esto hace que
el obtener medicamentos que resulten cada vez más eficaces en el tratamiento de este tipo
de afecciones constituya una de las tareas de la industria farmacéutica.
El fosfato de disopiramida es un medicamento utilizado en el tratamiento de la arritmia
cardíaca. Se comercializa con los nombres de Dirytmin, Durbis, Norpace, Rytmodan,
entre otros.
Al acometerse la producción de este medicamento en Cuba, en la forma farmacéutica de
inyectable (13 mg/mL), se hizo necesario, entre otros estudios, adaptar la técnica analítica
para el control de la calidad del producto terminado que aparece para otras formas
farmacéuticas del mismo principio activo, en las farmacopeas consultadas. De esta
adaptación surgió la necesidad de validar la técnica para el control de la calidad del
inyectable, así como la empleada en el estudio de estabilidad.
Métodos
Para el desarrollo del trabajo se utilizó un lote de fosfato de disopiramida de código
70931503 de procedencia finlandesa. También se empleó el estándar de referencia USP
(SR USP) de fosfato de disopiramida suministrado y avalado por el Centro de
Investigación y Desarrollo de Medicamentos y el lote 1001 del inyectable de
concentración 13 mg/mL.
El trabajo de validación de la técnica del control de la calidad del producto terminado se
realizó con un espectrofotómetro UV-VIS Philips PU-8720 fijado a una longitud de onda
de 269 nm. La solución patrón con una concentración de 0,052 mg/mL se preparó en una
mezcla de metanol-sulfúrico. La solución del inyectable también se preparó en metanol-
sulfúrico con una concentración aproximada de 0,052 mg/mL.1
Los análisis por HPLC se realizaron en cromatógrafo líquido de alta resolución de la
firma Knauer, con una columna Lichrosorb RP-8 (250 x 4 mm; 10 µm). Como fase móvil
se utilizó una mezcla de una solución de fosfato de sodio monobásico (0,05 mol/L) pH 3
y acetonitrilo (73:27 v/v), siendo la velocidad de flujo de 1,8 mL/min.2 Como detector se
empleó un equipo UV-VIS de longitud de onda variable fijado a una longitud de onda de
trabajo de 254 nm. El volumen de inyección fue de 20 µL la concentración del patrón de
260 µg/mL. El trabajo se desarrolló de forma isocrática a una temperatura de 25 ºC.3

Para ambas técnicas se evaluaron los parámetros de linealidad, precisión y exactitud. Por
HPLC también se consideró la especificidad.
La evaluación de la linealidad al utilizar la espectrofotometría UV-VIS se realizó en el
rango de concentraciones comprendido entre 62,40 y 124,80 µg/mL, lo que equivale a
valores del 60 al 120 %. Se efectuaron 3 réplicas para cada uno de los 5 puntos de la
curva en ambos métodos.
En el estudio de la precisión, para la repetibilidad, en ambos casos, se ensayaron 6
muestras, correspondientes al 100 % de la concentración. Para el análisis de la
reproducibilidad se estudiaron 3 muestras, por 2 analistas, 2 días diferentes.
Para la evaluación de la exactitud se realizó un ensayo de recuperación con
concentraciones de 80, 100 y 120 %. Los ensayos se realizaron por triplicado.
En el estudio de especificidad la muestra se sometió a condiciones drásticas de pH (1,7) y
temperatura (100 ºC) durante 2 semanas.
Resultados
La tabla 1 muestra los resultados obtenidos en la validación de la técnica
espectrofotométrica a utilizar en el control de la calidad del medicamento.
TABLA 1. Resultados de la validación de la técnica analítica realizada por UV
Resultad
Parámetro Criterio
o
0,9968
tr = 43,16 ≥ 0,99
Linealidad
Coeficiente de correlación (r) ttab = tr > ttab
2,16
 Coeficiente de determinación (r2) 0,9936 ≥ 0,98

Coeficiente de variación de los factores

1,89 % <5%
respuesta (CVf)
Coeficiente de variación de la pendiente
1,78 % <2%
(CVb)

− 0,895 Debe
Intervalo de confianza del intercepto incluir
− 0,0535 el cero

Repetibilid
Media 99,67 %
ad
Desviación estándar (DE) 0,97
Coeficiente de variación (CV) 0,97 % < 1,5 %
Fexp =
Reproducib 1,25 Fexp <
Prueba de Fisher
ilidad Ftab = Ftab
5,05
texp =
0,082 texp <
Prueba t de Student
ttab = ttab
2,23
CV 0,77 % <3%
Gexp =
0,4791 Gexp <
Exactitud Prueba de Cochran
Gtab = Gtab
0,7997
% de recuperación 100,17 % 97-103
texp =
0,30 texp <
Prueba t de Student
ttab = ttab
2,31

Para la técnica de HPLC los resultados de la validación aparecen en la tabla 2.

TABLA 2. Resultados de la validación de la técnica analítica realizada por HPLC
Resultad
Parámetro Criterio
o
 0,9996
tr =
≥ 0,99
Linealidad 124,42
Coeficiente de correlación (r) tr > ttab
ttab =
2,16

Coeficiente de determinación (r2) 0,9992 ≥ 0,98

Coeficiente de variación de los factores

2,32 % <5%
respuesta (CVf)
Coeficiente de variación de la pendiente
0,80 % <2%
(CVb)
Debe
− 0,45
Intervalo de confianza del intercepto incluir
− 1,63 el cero
Repetibilid
Media 99,74 %
ad
Desviación estándar (DE) 0,82
Coeficiente de variación (CV) 0,82 % < 1,5 %
Fexp =
Reproducib 1,16 Fexp <
Prueba de Fisher
ilidad Ftab = Ftab
5,05
texp =
1,93 texp <
Prueba t de Student
ttab = ttab
2,23
CV 0,87 % < 2%
Gexp =
0,6932 Gexp <
Exactitud Prueba de Cochran
Gtab = Gtab
0,7997
% de recuperación 99,515 98-102 %
texp =
0,57 texp <
Prueba t de Student
ttab = ttab
2,31
Como puede apreciarse, en ambos casos los resultados se encuentran dentro de los límites
 establecidos.
El cromatograma obtenido en la determinación de la especificidad por HPLC se muestra
en la figura.

FIG. (a) Cromatograma del estándar de referencia USP (SR USP) de fosfato de
disopiramida. (b) Cromatograma del inyectable de fosfato de disopiramida sometido a
pH ácido y 100 oC durante 2 semanas.
Discusión
Validación de la técnica espectrofotométrica UV-VIS utilizada en el control de la
calidad del inyectable. Atendiendo a los datos que aparecen en la tabla 1, el método
resultó lineal en el rango de concentraciones analizadas, ya que el valor de los
coeficientes de correlación y determinación resultaron mayores que 0,99, además, al
aplicar la prueba t de Student y obtener una texp > ttab se comprobó que existe una
correlación lineal significativa entre los valores de "x" y "y".
El coeficiente de variación de la pendiente fue menor que el límite máximo de este
parámetro (< 2 %).
Además, al considerar la variación de los factores respuesta, estos dieron similares entre
sí y cercanos al valor de la pendiente. El resultado hallado para el coeficiente de variación
de estos factores es menor que el valor máximo establecido (< 5 %), para una p = 0,05.
En el estudio de precisión, el coeficiente de variación para la repetibilidad fue de 0,97,
siendo el criterio establecido para la repetibilidad de un método analítico, por
determinaciones independientes a una concentración equivalente al 100 %, que dicho
coeficiente debe ser menor o igual a 1,5 % (Consejo de Expertos de México. Métodos
Analíticos. Validación. 1987).
Los resultados del estudio de reproducibilidad demuestran que no existe diferencia
significativa entre los resultados alcanzados por los analistas, ya que al aplicar la prueba
de Fisher se obtuvo una Fexp < Ftab para una probabilidad que 0,05. Al realizar la prueba
t de Student, el valor calculado resultó menor que el tabulado para el 95 % de confianza,
lo que demostró que no existe diferencia significativa entre las medias de los analistas.
En el análisis de los resultados del estudio de la exactitud a varias concentraciones,
fueron aplicadas 2 pruebas estadísticas. En la tabla 1 aparecen representados los
resultados de la prueba de Cochran (mediante el cálculo del estadístico G), donde se
observa que las varianzas no difieren significativamente, por lo que se puede plantear que
el parámetro concentración no afecta la exactitud del método.
Los resultados expresados como porcentaje de recuperación y de acuerdo con la prueba t
de Student, con p = 0,05, indican que no existe diferencia significativa entre la
recuperación media y el 100 % de recuperación.
Validación de la técnica de HPLC utilizada en el estudio de la estabilidad del
inyectable. La evaluación de la especificidad de las condiciones cromatográficas
seleccionadas indica que estas permiten separar el principio activo de sus productos de
degradación (fig.).
Atendiendo a los resultados que aparecen en la tabla 2, el método resultó lineal en el
rango de concentraciones estudiado (20-120 %), ya que el valor del coeficiente de
correlación resulta mayor que 0,99, el coeficiente de determinación superior a 0,98 y al
aplicar la prueba t de Student, se obtiene un valor de t experimental mayor que el
tabulado, lo que indica que existe una correlación lineal significativa entre los valores de
"x" y "y". Los restantes aspectos considerados en el análisis de la linealidad también
cumplen con los criterios establecidos.
En el estudio de la precisión se obtuvo un coeficiente de variación para la repetibilidad
del 0,82 % (tabla 2).
Los resultados del estudio de la reproducibilidad indican que no existe diferencia
significativa entre las precisiones alcanzadas por los analistas, ya que al aplicar la prueba
de Fisher se obtiene una F experimental menor que la F tabulada para una probabilidad
de 0,05. Con la prueba t de Student se comprueba, para el 95 % de confianza, que no
existe diferencia significativa entre las medias obtenidas por los analistas.
De la evaluación de la exactitud se puede concluir en primer lugar, que el factor
concentración no influyó en la variabilidad de los resultados, al determinarse que la G
calculada es menor que la tabulada para una probabilidad de 0,05. El valor obtenido para
la recuperación cumple con el criterio establecido para los métodos cromatográficos. Al
obtener una t experimental menor que la tabulada, es posible afirmar que no existe
diferencia significativa (para el nivel de confianza requerido) entre el 100 % y la
recuperación media, lo que confirma la buena exactitud del método.
Estos resultados, confirman la validez de los métodos analizados para ser empleados en el
control de la calidad y el estudio de estabilidad del inyectable (Fernández A. Validación
de métodos analíticos. II Taller de Validación, La Habana, 1996. González RH, Capote
RH, Nuevas LP, Paneque AQ, Alberto NP. Protocolo de validación de técnicas analíticas.
Centro de Química Farmacéutica, División de Calidad, La Habana, 1996:1-32.)
Summary
The validation of an spectrophotometric method, which will be used in the quality control
of injectable disopyramide phosphate (13 mg/mL), was made in which absorbance was
estimated at 269 nm and the dissolvent used was a sulfuric methanol mix. Also, the
validation of a high performance liquid chromatography technique was carried out in
which a Lichrosorb RP-8 column, and a solution of monobasic sodium phosphate (0,05
mol/L) ph3: acetonitrile (73:27 v/v) as mobile phase were employed. Both methods
turned out to be linear, precise and accurate, within the range of concentrations already
studied. Also, this paper proved the specificity of high performance liquid
chromatography technique.
Subject headings: DISOPYRAMIDE; SPECTROPHOTOMETRY; QUALTY CONTROL
Referencias Bibliográficas
United States Pharmacopoeia. National Formulary (USP XXII, NF 17). Rockville:
Marck Printing; 1990.
Ahokas JT, Davies C, Ravenscroft PJ. Simultaneous analysis of disopyramide and
quinidine by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr
1980;183:65-71.
Quattrochi OA, Abelaira S, Laba RF. Introducción al HPLC. Aplicación y práctica.
Buenos Aires: Artes Gráficas, 1992.p.302-28.
Recibido: 18 de enero de 2003. Aprobado: 24 de febrero de 2003.
M.C. Gisela Gra Ríos. Facultad de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana.
San Lázaro y L, El Vedado, municipio Plaza de La Revolución, Ciudad de La Habana,
Cuba.
1 Master en Ciencias. Profesora Auxiliar.
2 Doctora en Ciencias Farmacéuticas. Profesora Titular.
3 Doctora en Ciencias Farmacéuticas. Profesora Auxiliar.
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