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Faculté des Sciences Appliquées Ait Melloul TP de Génétique I S4 Pr.

Zahidi

TP 1 : MITOSE ET MÉIOSE
I- INTRODUCTION

Les cellules somatiques d'un organisme pluricellulaire dérivant par divisions


successives ou mitose d'une même cellule ou zygote.
La mitose est caractérisée par la réplication du matériel génétique ou chromosomes, et
sa répartition entre deux noyaux fils identiques. Elle est suivie de la cytokinèse ou la
division du cytoplasme qui en résulte deux cellules somatiques filles.
Dans une cellule diploïde (2n chromosomes), la taille et la forme d'un couple de
chromosomes homologues sont bien déterminées. Chacun de ces homologues porte
deux allèles de même position.
Au cours de la formation du zygote, deux lots de n chromosomes, l'un d'origine
maternelle, l'autre d'origine paternelle ; sont réunis dans un même noyau par l'union des
gamètes ou fécondation.
Les gamètes sont le résultat de la méiose au cours de laquelle le niveau de ploïdie
des cellules germinales est réduit de 2n à n chromosomes.
La fécondation, la mitose et la méiose sont les étapes du cycle biologique au cours
duquel, il y a perpétuation de l'espèce.
II- DESCRIPTION DES NOYAUX EN DIVISION

Au cours des divisions cellulaires les chromosomes sont visibles. Les différentes étapes
sont caractérisées par la disposition des chromosomes et leur condensation plus ou
moins forte. On distingue après coloration au carmin :
- L'interphase : noyau granuleux présentant de nombreux points colorés correspondant
à la substance chromatique hydrolysée.
- La prophase : noyau volumineux teinté de rose. Filaments rouges denses et confus
(début) aux chromosomes individualisés (fin).
- La métaphase : chromosomes dispersés dans le plan médian de la cellule. En vue
polaire on peut les dénombrer.
- L'anaphase : deux groupes identiques de chromosomes sont séparés l'un de l'autre.
- La télophase : deux lots de chromosomes sont groupés aux pôles de la cellule (début).
Parfois, il apparaît une membrane entre les deux cellules filles (fin).
Une explication détaillée, des différents stades mitotiques et méiotique,
est fournie par les planches du cours.
III- ÉTUDE DES CELLULES EN MITOSE.

On utilise la pointe de la racine jeune du bulbe de l'oignon Allium cepa.


Au préalable, le fragment a été :
- fixé dans une solution de 3/4 d'éthanol et 1/4 acide acétique pendant 24H à
4°C.
- placé dans une solution de carmin chlorhydrique pour hydrolyser les parois
squelettiques, disperser le cytoplasme et colorer les chromosomes.
- stocké dans de l'alcool à 70%.
- rincer dans l'eau distillée.
Ces étapes sont effectuées par le préparateur du laboratoire
- prélever les quelques millimètres du bout terminal où la mitose est active.
- placer sur une lame dans une goutte de carmin acétique

- chauffer très légèrement pendant quelques minutes pour renforcer le contraste (Ne pas
faire bouillir).

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- recouvrir avec une lamelle


- placer lame et lamelle entre les deux feuilles d'un buvard plié en deux et écraser légèrement
du doigt.
Plus les cellules sont dispersées, plus l'observation est meilleure.
Au grossissement (x10) rechercher la zone où les cellules contiennent des
chromosomes plus ou moins condensés. On observe :
- des cellules âgées, interphasiques, plus ou moins allongées.
- des cellules méristématiques, isodiamétriques, qui présentent des figures de mitose.
- passer au grossissement (x40) pour observer des figures de mitose.
1-Observer la présence et la taille du noyau par rapport à la cellule.
2-Pour chaque phase, quel est le nombre de chromatides?
3-Décrire par un schéma clairement annoté le devenir d'un gène porté par un chromosome de
l'espèce qui se trouve à l'état hétérozygote, pour chacune des phases.
4-Etude de la planche I : donner le nom de chaque stade mitotique présenté sur cette
planche.
IV- ÉTUDE DE LA MÉIOSE

Chez Lilium regale des inflorescences mâles (étamines) sont recueillies et fixées 5 à 10
jours avant la floraison en vue d'observer les phases de la méiose dans les anthères.
Les fleurs les plus basses sur l'inflorescence sont les plus intéressantes. Elles se
présentent en paires dont l'une est pédicellée et l'autre sessile, celle-ci étant la plus
âgée.
- Prélever une fleur et la placer sur une lame.
- Retirer les anthères avec des aiguilles en évitant les pressions trop fortes.
- Les couper en deux avec la lame de rasoir dans une goutte de carmin acétique,
tapoter légèrement avec l'aiguille pour forcer les sporocytes à l'extérieur par la partie
ouverte. Eviter de les briser.
- Piquer les anthères avec l'aiguille pour les enlever. Eviter les pousser de côté.
- recouvrir avec une lamelle.
- Chauffer légèrement pendant quelques minutes pour éclairer le cytoplasme et colorer
les chromosomes. Eviter l'ébullition.
- placer lame et lamelle entre les deux feuilles d'un buvard plié en deux et écraser
légèrement du doigt.
- Repérer les différents stades au grossissement x 10.
- Passer au grossissement x40 pour une meilleure observation.
Ce protocole expérimental vous est fourni à titre indicatif. L’étude des figures de
méiose s’effectuera sur des préparations microscopiques (lames) ainsi que des
planches.
Étude de la planche II
a- Donner le nom de chaque stade méiotique figurant sur cette planche.
b- Quel est le niveau de ploïdie des cellules figurant sur cette planche.
c- les stades méiotiques sont caractérisés par la présence des bivalents (les
chromosomes se groupent par deux).
1/ Quelles est le nombre de bivalent des stades c, d et e?
2/Quel est le nombre de chromosomes de l’espèce étudiée ?
d- En supposant qu’on a une cellule germinale hétérozygote pour deux gènes indépendants
avec deux allèles chacun (A/a et B/b). Indiquer les combinaisons possibles de leurs
allèles, au cours des différents stades méiotiques (cas de brassage
interchromosomique).
e- Si les deux gènes sont portés par le même chromosome en position trans
schématiser le devenir de ces deux gènes au cours des différents stades de la
méiose (avec absence ou présence de C.O. cas de brassage intrachromosomique).
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LA RECOMBINAISON GÉNÉTIQUE CHEZ Sordaria


macrospora
I- INTRODUCTION
Les gènes mutants sont des marqueurs chromosomiques qui permettent de réaliser
la carte génétique d'un organisme. Il est donc important de les distinguer du type
sauvage.
Il existe trois types de mutants :
- Morphologiques : affectant les organes végétatifs et reproducteurs.
- Biochimiques : affectant les besoins en un élément nutritif particulier pour se
développer.
- De coloration : sont largement étudiés chez les ascomycètes dont Neurospora crassa
ou Sordaria macrospora en vue de comprendre le mécanisme de l'échange génétique.
Pour la plupart des champignons, c'est la phase haploïde qui domine le cycle
biologique. La phase diploïde se réduit à une période très courte (Fig. 1, voir cycles de
Sordaria sp et de Neurospora crassa). Cette situation présente des avantages par
rapport aux organismes diploïdes :
- Les résultats de la ségrégation étant haploïde, le génotype est directement exprimé par
le phénotype.
- Les quatre produits de la méiose peuvent être isolés ou groupés en tétrade.
- La descendance est très nombreuse.
Comme Neurospora crassa, Sordaria macrospora présente le cas le plus favorable
pour l'analyse des tétrades : l'orientation spatiale des résultats de la méiose (tétrades)
dans les asques ce qui permet d'orienter les deux divisions de la méiose du sommet de
l'asque vers sa base.
II- DESCRIPTION DE LA FRUCTIFICATION
1- LE PERITHECE
Sordaria macrospora est un ascomycète de la classe des pyronomycètes. Il se
caractérise par une fructification en forme de ballon (Fig. 2) ou périthèce. Celui-ci s'ouvre
à maturité par un canal ou ostiole pour libérer les asques.
Le périthèce de Sordaria macrospora (ordre des sphaerialés, famille des
sordaréacés) est de couleur sombre. Il se développe en un minimum de 9 jours. Une
coupe transversale montre à la base du périthèce la juxtaposition de plusieurs asques à
différents stades de maturité. Les asques se développent à tour de rôle, un seul à la fois
occupe l'ostiole.
2- LES ASQUES
Les asques sont des structures cylindriques. Leurs parois sont fines et se terminent
par un anneau apical plus épais. Les ascospores de type sauvage sont de couleur très
sombre, les mutants sont blancs ou de couleur claire.
3- LE TYPE D'UNION
Sordaria macrospora est homothalique : la fécondation chez un mycélium de même
origine. En même temps, il a la capacité de s'hybrider ce qui permet les recombinaisons
génétiques.
Quand on inocule deux souches différentes sur un milieu de culture une proportion
des périthèces peut résulter de mycélium hétérothalique hybride. On peut alors
observer dans les asques une combinaison de couleur, de la base au sommet de
l'asque, montrant si la ségrégation a eu lieu en méiose I ou en méiose II (Fig. 3).

III- L'ANALYSE DES TETRADES


Une hybridation entre un mutant aux spores sombres (n) et un mutant aux spores claires
(c) a été effectuée (voir Fig. 3).

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Dans le périthèce hybride, la plupart des asques présentent quatre ascospores


blancs et quatre ascospores sombres. Les arrangements possibles figurent au
tableau 1.

Type de Phénotype des ascospores


ségrégation (de l’Apex vers la base)
1-2 3-4 5-6 7-8
Asques Pré-réduits I n n c c
: ségrégation en
première division.
II c c n n

Asques Post- III n c n c


réduits :
ségrégation en IV c n c n
deuxième division
(C.O. entre le gène V n c c n
et son centromère).
VI v n n c

Distance d'un gène au centromère = 1/2 (nombre d'asques post-réduits) X100


Total des asques
Distance gène - gène = ½ TT + DNP X 100 (DP> DNP donc gènes liés)
TOT des asques
IV- PARTIE EXPÉRIMENTALE
Ce TP se déroulera comme suit :
1- Réalisation d’un croisement :
Des croisements entre différentes souches de Sordaria macrospora ont étés réalisés. Le
phénotype étudié est la couleur des ascospores.
Pour réaliser un croisement, on tracer une ligne au marqueur sur le dos de la boite.
Toujours à proximité d’une flamme, on a placé le mycélium de chacune des souches à
croiser de part et d'autre de cette ligne. Le mycélium qui se développe le long de la zone
contenant les deux types du mycélium serait en principe un mycélium hybride
susceptible de former des périthèces où il y aurait ségrégation. On a marqué sur le dos
de la boite les numéros des lignées ainsi que la date.
Et enfin on a Laissé incuber à l'étuve à 25°C pendant au moins 10 Jours.
N.B. Cette partie a été réalisée par les enseignants.
2- L’observation de l’appareil végétatif :
- Prélever à l'aide d'une pince fine flambée à proximité d’une flamme un bout de
mycélium et le placer entre lame et lamelle dans une goutte d'eau distillée et
ensuite on écrase entre deux feuilles de papier absorbant.
- Observer au microscope au grossissement (x10) puis au (x40).
3- L’observation de l’appareil reproducteur :
- Prélever à l'aide d'une pince fine flambée à proximité d’une flamme quelques
périthèces et les placer entre lame et lamelle dans une goutte d'eau distillée et
ensuite on écrase délicatement entre deux feuilles de papier absorbant.
- Observer au microscope au grossissement (x10) puis au (x40).

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4- Analyse du croisement réalisé :


- Prélever à l'aide d'une pince fine flambée à proximité d’une flamme quelques
périthèces hybrides de la ligne médiane, les placer entre lame et lamelle dans une
goutte d'eau distillé et ensuite on écrase délicatement (pour ne pas sortir les spores des
asques) entre deux feuilles de papier absorbant.
- Observer au microscope au grossissement (x10) puis au (x40).
- Repérer un périthèce mûre et intact (asques contenant les 8 ascospores), ensuite
procéder au comptage (en respectant toujours le même sens ; c’est à dire de l’apex vers
la base des différents types d’asques présents (les classer par type de ségrégation).
5- Interprétation des résultats :
1- dresser un tableau de vos résultats.
2- Identifier les génotypes.
3- Les gènes sont-ils liés?
4- Positionner chaque gène par rapport au centromère.
5- Concluez en synthétisant les résultats de vos croisements.
Donner la (ou les) cartes factorielle (s) des gènes étudiés.

Figure 1.a : Appareil de fructification d'un ascomycète Sordaria sp.

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Figure 1.b : Cycle biologique de Neurospora Crassa

Figure 2 : Appareil de fructification d'un ascomycète Sordaria sp.


a) Schéma d’un périthèce avec un asque en cours de maturation ;
b) bouquets d'asques d’un périthèce mûr éclaté.