Vous êtes sur la page 1sur 20

LICENCE BGS

SEMESTRE 3

UEP 1.3.1

Structures et Propriétés des


Biomolécules

Présentées par Nicole LAURENT


III - Purification des protéines
Tenir compte des paramètres de la protéine:
• La taille (filtration sur gel)
• La solubilité (précipitation séquentielle)
• La charges (chromatographie échangeuse d’ions
• La densité (centrifugation sur gradient, ultracentrifugation)
• Hydrophobicité (chromatographie en phase inverse)
• Si marqueur ajouté (chromatographie d’affinité )
(immunoblot – immunoélectrophorèse)
Suivre la purification de la protéine
- dosage
- mesure de l’activité
- marquage…..

Planifier les diverses étapes avec soin


!!!!!!!!!!! travailler à - 4°C
1 - La densité : centrifugation différentielle
Extraction : protéines solubles dans le
surnageant
La sédimentation en gradient de densité
2 - Solubilité des protéines

• La solubilité des protéines dans l’eau est complexe.


• les molécules d’eau interagissent
– par des liaisons hydrogènes avec les -CO-NH- de la
chaîne peptidique
– et les radicaux hydrophiles libres des résidus
(STYNQDREKH)
• Les radicaux hydrophiles s’orientent vers l'extérieur de
la molécule
• Les radicaux hydrophobes ont tendance à réagir entre
eux à l'intérieur de la molécule
• Les protéines globulaires sont en général plus
solubles dans l’eau que les hélicoïdales
• En solution saline,
la solubilité des protéines dépend:
des interactions électrostatiques ("salting in"),
à basse force ionique, la solubilité des protéines
augmente lorsque la concentration en sels croît,
jusqu'à un certain seuil.
Au delà, elle diminue avec l'addition de sels:
due à des interactions hydrophobes ("salting out").

Ces deux effets sont antagonistes


• Influence de la température:
la solubilité augmente avec la température,
!!!!!!!!!!!! Dénaturation des protéines
Pour éviter la dénaturation – 4°C

• Influence du pH :
la solubilité est minimale au pH isoélectrique
3 - Précipitation des protéines
a - Précipitation totale : dénature les protéines
- Par addition:
- 80% d’éthanol à -20°C
(certaines protéines sont solubles dans l’éthanol)
- 2 volumes d’acétone à -20°C
(protéines difficile à redissoudre)
- Phénol
Les protéines se dénaturent et se solubilisent
dans le phénol
(les acides nucléiques restent dans la phase aqueuse)
- Acide trichloracétique TCA
très corrosif
-4°C pour éviter la dénaturation
lavage à l’éther
redissolution difficile
- Acide perchlorique PCA
corrosif, explosif
-4°C pour éviter la dénaturation
insoluble dans KOH à -4°C
- Sulfate de Zn + base forte (NaOH )
………….
b - Précipitation fractionnée ou différentielle
- préserve l’intégrité les protéines
- Associe force ionique et pH à -4°C
Chaque protéine ayant des caractéristiques
hydrophiles, hydrophobes et pI particuliers,
et donc une solubilité propre, permet sa
précipitation

!!!!!! Plusieurs protéines de solubilité


similaires peuvent précipités
dans les mêmes conditions
• Précipitation au sulfate d’ammonium
- Le plus utilisé car peu dénaturant
- très soluble dans l’eau, permet des forces
ioniques très élevées
- très hydrophile, il déshydrate la protéine
- ions sulfates (SO4--) et ammonium (NH4+)
neutralisent la protéine qui est alors moins
soluble
associé avec le pH et à -4°C
• Redissolution facile des protéines précipités
dans l’eau
Dialyse
Membrane semi-
perméable

Permet d’enlever les sels


( ex : sulfate d’ammonium )
de la solution protéique
après redissolution

Les protéines restent


dans le sac

On utilise aussi la filtration


sur membrane semi-
perméable.
4 - La taille : chromatographie gel
filtration

Les « billes » du gel présentent


des « pores »
Les petites molécules traversent ces
pores et sont ralenties
Les billes ont des diamètres bien
définis formant un réseau où
circulent les molécules plus grosses
que les « pores »

Plus la molécule est grosse,


plus le chemin parcouru sera petit
et la traversée rapide.
Les protéines de masse
moléculaire les plus élevées
sont éluées en premier
Gels commercialisés:
Sephadex, Sepharose
or Sephacryl
Chromatographie : un peu d’ histoire…
• Réalisée en 1906 par le botaniste russe Mikhaïl
Tswett
• Séparation des pigments (en grec : "chromato") d'
une
feuille d'
épinard

• Chlorophylles en solution dans l'éther de pétrole,


« filtrées » sur une colonne de carbonate de calcium
montrent des zones colorées vertes et jaunes.

• Ces composantes colorées peuvent être analysées


qualitativement et quantitativement".

• Cette invention de la chromatographie d’adsorption


par Tswett reste ignorée jusqu'
en 1931.
Les différents principes de chromatographie :

Résultent du fait que l'


on privilégie l'
effet de l'
un des
facteurs suivants :
- la solubilité dans un solvant liquide :
chromatographie de partage
- la taille, la forme :
chromatographie d’exclusion ou gel filtration
- la polarité :
chromatographie en phase inversées
- la charge électrique :
chromatographie par échange d’ions
- la présence de groupements d'
atomes formant des sites
particuliers :
chromatographie d’affinité
La chromatographie de partage :
préférence pour les petites molécules
(acides aminés – sures – vitamines …..)

La phase stationnaire
est un liquide fixé sur
un support inerte.

Basée sur le partage du


soluté dans les deux
phases liquides.

CPL
Rapport frontal : RF

(ou référence front, coefficient de migration)

Distance parcourue par le soluté


/ Distance parcourue par le
solvant

RF = x / y

La révélation des plaques :


Colorations spécifiques suivant
la nature des molécules séparées.
Chromatographie bidimensionnelle