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EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV

Les tests de détection de l’IFN-γ (IGRAs) dans l’aide au diagnostic de tuberculose


Le test ELISPOT dans l’hypersensibilité retardée aux médicaments

LAURE DENIS
Laboratoire d’Immunologie Pr. BIENVENU, CHLS

DES/DESC Immunologie 15 Mars 2012


EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV

LE TEST QUANTIFERON et T-SPOT-TB DANS L’AIDE AU


DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE LATENTE
INTRODUCTION - RAPPELS

Individus BK Première cause de


contagieux Contamination mortalité infectieuse dans
aérienne le monde (1 à 2 millions
de décès / an)
Individu(s)
contact(s) Incidence : 9 millions

Prévalence de la
Primo-infection
Tuberculose maladie >
Tuberculose Jeune âge (<4 ans) 14 M (1/3 de la
latente Quantité importante de
BK Immunodépression
population infectée
Guérison Tuberculose susceptible de
Réactivation
apparente maladie développer la maladie)
Immunodépression
Sujets âgés
La France pays de faible
Forme Forme extra endémie (Ile de France
pulmonaire pulmonaire
et Guyane +++)

- Dans 90-95% des tuberculoses infection récentes, la prolifération de M. tuberculosis


est contrôlée par les défenses immunitaires : tuberculose infection latente
- Dans 5 à 10% des cas, la TIL évolue en tuberculose active ou tuberculose maladie
(pulmonaire dans ¾ des cas) dont 50% dans les 2 ans suivant l’infection.
REPONSE IMMUNITAIRE (1)
REPONSE IMMUNITAIRE (2)
LES CELLULES

Les monocytes - macrophages

- Immunité non spécifique : phagocytose des bacilles


formation d’un foyer infectieux local
- Immunité spécifique : présentation antigénique aux LyT dans les
ganglions lymphatiques régionaux
réponse cellulaire Th1

Les lymphocytes

- Activation des Ly T CD4+ avec sécrétion d’IFN-γ et TNF-α


- Activation des Ly T CD8+ cytotoxiques (perforine, granzyme), sécrétion d’IFN-γ
- Ly γδ TCR+ limitent la multiplication précoces des bacilles (CK, cytotoxicité), jonction
immunité naturelle et immunité spécifique
- Ly TCD1 restreints reconnaissent les Ag de nature lipidique (CK, cytotoxicité)
- Ly T mémoires centraux : mémoire immunitaire durable
REPONSE IMMUNITAIRE (3)
LES CYTOKINES

IFN-γ

sécrété par les LyT spécifiques – activation des macrophages

IL-12

synthétisée par les macrophages activés. Orientation de la réponse T vers un profil Th1
(IFN-γ)

TNF-α

synthétisé par les macrophages, LyT, cellules dendritiques. Réaction inflammatoire


responsable de la formation du granulome, activation des macrophages
LES OUTILS DE DIAGNOSTIC INDIRECT

-Test cutané : Intradermoreaction à la tuberculine


-Tests de détection de l’IFN-γ (IGRAs Interferon-gamma-release Assays)

Measurement of induration and erythema

Measurement of IFN-γ production


INTRADERMOREACTION A LA TUBERCULINE (IDR)

Test cutané qui explore in vivo l’HSR LES LIMITES DE L’IDR


par l’injection de composants
antigéniques mycobactériens.
• l'IDR présente des problèmes de
performance et de logistique :
– Subjectivité
Source antigénique : > 200 protéines de – Sensibilité moyenne
M.tuberculosis – Effet “Booster”
– Nécessité de 2 visites
Lecture à 72h par mesure du diamètre
• La faible spécificité :
d’induration en mm
– Réaction croisée avec le BCG
– Mycobactéries non tuberculeuses
Seuil de positivité (NTM)
Virage tuberculinique
TESTS DE SECRETION DE L’IFN-γ (IGRAs)

Détection in vitro de la production d’IFN-γ par les lymphocytes T spécifiques de


M.tuberculosis après stimulation avec des protéines mycobactériennes

- Test ELISA QuantiFERON-TB Gold in tube (dernière version)


- Test ELISPOT T-SPOT-TB

Mesure de l’IFN-γ

• La production d’IFN- γ témoigne de la réponse cellulaire.


• Les lymphocytes T produisent de l’IFN-γ lorsqu’ils sont stimulés par des antigènes
• Sécrété, mesurable et stable
• Dans la plupart des cas, absent de la circulation
• Littérature démontrant le rôle important de l’IFN-γ dans l’infection tuberculeuse
SELECTION D’ANTIGENES SPECIFIQUES

Evolution du substrat antigénique grâce au séquençage complet de M.tuberculosis

Antigènes
specifiques de
M. tuberculosis Antigènes
communs
avec le
Codage par les BCG
gènes de la
région RD-1

• Codage par la région RD-1

• Absents du BCG
Antigènes spécifiques : • Absents dans la plupart des MNT
ESAT-6, CFP-10 et TB 7.7
• Induisent la sécrétion d’ IFN-γ

• Identifiés par immunologie, biologie moléculaire


Specificité d’ ESAT-6, CFP-10 et TB-7.7

Complex Antigènes Mycobactéries Antigènes


Tuberculosis non -TB
ESAT CFP TB-7.7 ESAT CFP TB-7.7
M abcessus - - -
M tuberculosis + + + M avium - - -
M branderi - - -
M africanum + + +
M celatum - - -
M bovis + + + M chelonae - - -
Souches BCG M fortuitum - - -
gothenburg - - - M gordonii - - -
moreau - - - M intracellulare - - -
M kansasii + + -
tice - - - M malmoense - - -
tokyo - - - M marinum + + -
danish - - - M oenavense - - -
glaxo - - - M scrofulaceum - - -
M smegmatis - - -
montreal - - - M szulgai + + -
pasteur - - - M terrae - - -
M vaccae - - -
M xenopi - - -
DIFFERENCES TESTS IGRAs / IDR

Avantages des tests IGRA sur l’IDR


Pas de seconde visite
Peu d’effet booster in vivo des réponses immunes
Reproductibilité des tests et réactifs
Résultat objectif
Spécificité +++ (BCG, Mb atypiques)
Contrôle + : mise en évidence des faux négatifs

Différence des cellules T détectées :

- IGRAs : T mémoires effectrices et T effectrices : infections récentes


- IDR : T mémoires effectrices et T effectrices + T mémoires centraux
LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (1)

LE TEST QUANTIFERON-TB GOLD IN TUBE


Le test QuantiFERON®-TB Gold IT

PRINCIPE

Test ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay)


Dosage sur sang total (prélevé sur tubes héparinés)
Incubation des cellules mononucléées du sang périphérique avec les protéines
mycobactériennes
Décantation du plasma
Dosage de l’IFN-γ par technique ELISA (UI/mL)
Validation du test avec un témoin négatif et un témoin positif
Le test QuantiFERON®-TB Gold IT
PHASE PREANALYTIQUE (1)
Le prélèvement

Stockage des tubes à


température ambiante

-Prélèvement : 3 x 1 mL
- Agitation douce par retournements (x5)
- Incubation à 37°C 16 à 24h
Le test QuantiFERON®-TB Gold IT
PHASE PREANALYTIQUE (2)
Conservation

Après 16 à 24 H à 37°C

Centrifugation des tubes : décantation

Réalisation du dosage ELISA immédiatement ou après


conservation à 4°C pendant plusieurs jours (IFN-γ
stable)
QuantiFERON®-TB Gold IT

Etape 1: incubation sur sang total hépariné

IFN-γ stable à 4°
pdt au moins 4
Nil ESAT-6 Mitogen semaines.
Control CFP-10 Control 2. Centrifugation pdt
1. 1mL de sang (X3) et 15 minutes.
incubation à 37ºC pdt 16-24 h.

Etape 2: Dosage ELISA de l’IFN-γ

3. Plasma
+conjugué.
Incubation 2H
à température
ambiante.
4. Lavage puis addition du
5. Calcul et impression des
substrat.Lecture des DO après
résultats
30mn.
Le test QuantiFERON®-TB Gold IT

RESULTATS ET INTERPRETATION

Nul TB Ag – Nul Mit – Nul Résultat


Témoin – Tube patient Témoin +
Tube gris Tube rouge Tube violet
≤8 < 0.35 ≥ 0.5 NEGATIF
≤8 ≥ 0.35 ≥ 0.5 POSITIF
≤8 ≤ 0.5 ININTERPRETABLE
Abs ctrl positif

≥8 ININTERPRETABLE
Activation spontanée

CELLESTIS
LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (2)

LE TEST T-SPOT-TB
LE TEST T-SPOT-TB
Etape 1
Préparation des cellules

• Prélèvement de sang dans un tube


Vacutainer CPT™
• centrifugation du tube
• Pipetage de la bande correspondante aux
lymphocytes
• Lavage et comptage cellulaire (cellule ou
automate d’hématologie)
• Ajout des cellules aux plaques 96 pts
• Ajout des antigènes dans les puits (ESAT-
6, CFP-10)
• Incubation 16 à 24h

PBMC après extraction Ajout des PBMC et Ags TB. Capture de l’IFN-γ par les
Ficoll ou tubes BD CPT Les Ly T spé sécrètent l’IFN-γ. anticorps. Incubation.
LE TEST T-SPOT-TB
Etape 2
Révélation des spots




Premier lavage des plaques
Addition de réactif de détection 1h
Deuxième lavage des plaques
-
• Addition du substrat : les spots
apparaissent en 7 minutes
• Dernier lavage des plaques et
séchage +

Chaque spot correspond à


une cellule sécrétrice d’IFN-γ

Lavages et ajout de Ajout du substrat et


l’Ac conjugué comptage des spots
LE TEST T-SPOT-TB
Etape 3
Comptage des spots

- Comptage possible “à l’oeil” à l’aide d’une loupe binoculaire ou d’un microscope

- Comptage à l’aide d’un lecteur automatisé Elispot :

• Lecture automatisée des plaques


• Calcul du nombre de spots par puits
• Stokage des images sur PC
• Paramétrage automatique de la caméra et de l’analyse

Validation :

nb de spots panel A – Témoin nég et/ou panel B – Témoin nég ≥ 8 : POSITIF


nb de spots panel A – Témoin nég et/ou panel B – Témoin nég ≤ 4 : NEGATIF
nb de spots panel A – Témoin nég et/ou panel B – Témoin nég ≥ 5 et ≤ 7 : DOUTEUX
LE TEST T-SPOT-TB

EXEMPLES SUJETS TEMOINS/ SUJETS TUBERCULOSE

Témoin Témoin Panel A Panel B


négatif positif
LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (3)

INTERPRETATION CLINIQUE ET BIOLOGIQUE


Interprétation clinique et biologique

INTERPRETATION D’UN TEST POSITIF

- fréquence élevée de Ly T effecteurs/ T effecteurs


mémoires spécifiques de M. tuberculosis :
rencontre de M. tuberculosis
faux positifs rares (M. kansasii, M. marinum, M.szulgai <200
RESULTAT POSITIF = cas / an en France)

- Risque de réactivation M. tuberculosis si


immunodépression (infection VIH, tt anti-TNF)

Les IGRAs ne distinguent pas infection et maladie


ne sont pas des tests diagnostiques de la tuberculose maladie
Interprétation clinique et biologique

RESULTATS ININTERPRETABLES

• Absence d’activation dans le contrôle positif (PHA Phytohémagglutinine) :

– Indication sur la compétence immunitaire du patient (âge, déficit…)


– Validation de la conservation des prélèvements avant incubation et de la
manipulation.

• Activation spontanée dans le contrôle négatif :

– Infection, inflammation…
LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (4)

PERFORMANCES
Performances

EVALUATION CLINIQUE DU QuantiFERON®-TB Gold

• Pas de “Gold Standard” pour l’ITL


– Sensibilité calculée sur population de Tuberculose maladie non traitée.
• Confirmée par culture et/ou PCR (Gold Standard)
– Spécificité estimée sur population à bas risque (personnes saines non
vaccinées)

• Détection de l’ITL
– Corrélation avec facteurs de risque
• Etude autour d’un cas
• Dépistage des personnels soignants
Performances
PERFORMANCES DIAGNOSTIQUES

Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for


Detecting Active TB : A Metaanalysis

R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus


Chest 2010;137;952-968

Etudes analysées :
676 citations
124 études retenues
(exclusions : edito, medico-economique, revues, lettres, case report, données insuffisantes…)

Sensibilité : 40 études
Spécificité : 7 études
R. Indéterminés : 116 études
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis
R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus
Chest 2010;137;952-968

RESULTATS SENSIBILITE

Pays en développement
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis
R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus
Chest 2010;137;952-968

RESULTATS SPECIFICITE
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis
R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus
Chest 2010;137;952-968

RESULTATS INDETERMINES

Population
immunodéprimée
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis
R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus
Chest 2010;137;952-968

CONCLUSIONS

Meilleure performance diagnostique des tests IGRAs par rapport à l’IDR (supériorité des
IGRAs dans les pays développés)

Meilleure sensibilité du T-SPOT-TB par rapport au QFT TB Gold IT

Meilleure spécificité du QFT TB Gold IT par rapport au T-SPOT-TB

Résultats indéterminés T-SPOT-TB > QFT TB Gold IT

IDR avant IGRAs non recommandée


LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (5)

UTILISATIONS
RECOMMANDATIONS (1)
EN FRANCE

Recommandations de dépistage de l’infection tuberculeuse latente et de la


tuberculose maladie dans certaines populations considérées à risque d’être
infectées, malades et/ou contagieuses :

Les personnes infectées par le VIH


Les sujets contacts d’un cas index contagieux
Les professionnels de santé et autres professionnels exposés
à l’embauche
en cours d’activité professionnelle selon le niveau de risque
Les populations migrantes originaires de pays d’endémie
Les patients avant mise sous traitement anti-TNF alpha
RECOMMANDATIONS (2)
RECOMMANDATIONS HAS 2006

- Diagnostic de tuberculose-infection latente pour réaliser l’enquête autour d’un


cas (sujet > 15 ans)

- Lors de l’embauche, pour les professionnels de santé et ceux qui travaillent


dans un service à risque, c’est-à-dire dans les mêmes conditions que celles
préconisées par les recommandations sur l’IDR

- Aide au diagnostic des formes extrapulmonaires de la tuberculose maladie

- Avant mise en route d’un traitement par anti-TNFα


RECOMMANDATIONS (3)
RECOMMANDATIONS HCSP (Haut Conseil de la Santé Publique) 2011

Utilisation stricte des tests IGRA dans le seul diagnostic de l’ITL et uniquement dans
l’objectif de la traiter (sauf cas particulier)

- Diagnostic de TIL : réduire le réservoir de patients infectés :


- Enquête autour d’un cas : prise en charge des sujets contacts
enfants > 5 ans
sujets âgé > 80 ans
- Patients infectés par le VIH (bilan initial)
- Dépistage avant mise sous anti-TNF
- Personnel de santé (y compris stagiaires et étudiants) :
embauche (si IDR > 5 mm)
cas contact
- Migrants entre 5 et 15 ans

- Diagnostic de tuberculose maladie :


- Chez l’enfant
LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (6)

BIBLIOGRAPHIE
QFT-TB Gold IT chez les patients sous traitement immunosuppresseur

Matulis et al. American College of Rheumatology, San Diego, CA. November 2005

Comparison of in vitro-specific blood tests with tuberculin skin test for diagnosis of latent
tuberculosis before anti-TNF therapy
Sellam J. et al. Ann. Rheum Dis. 2007;66(12):1610-5

Detection of latent tuberculosis in immunosuppressed patients with autoimmune diseases:


performance of a Mycobacterium tuberculosis antigen-specific interferon gamma assay
Matulis G. et al. Ann Rheum Dis. 2008;67(1):84-90

• Les anti TNF-α réduisent la réactivité avec le tube mitogène. Les autres traitements
immunosuppresseurs n’ont pas ou peu d’effets (corticoides…)
• La performance du test QFT-TB Gold IT est meilleure que celle de l’IDR pour la détection
des LTBI chez les patients sous immunosuppresseur
• Bonne performance des IGRAs dans le diagnostic de LTBI dans les IMID (Immune
mediated inflammatory diseases)
• Le QFT-GIT peut être recommandé pour la détection de l’ITL avant traitement anti-TNF-α.
LES TESTS IGRA DANS LE DEPISTAGE DE LA TB LATENTE AVANT MISE SOUS ANTI-TNF
ETUDE ETAT

Objectif :
Evaluer l’impact thérapeutique (% de patients pour lesquels la décision thérapeutique antiTB a été
modifiée par les résultats des tests in vitro par rapport aux recommandations de l’AFSSAPS) du
dépistage de la TBIL par QFT ou T-SPOT-TB avant traitement par anti-TNF-α
20 centres, 400 patients, durée 24 mois / PR, spondylarthrite, maladie de Crohn

Résultats
31,8% PR, 45% SPA, 23,2% Crohn (60% immunosuppresseurs, 36,4% corticoides)
34,9% patients IDR > 5 mm / 16,7% patients IGRA positif
30,8% discordance IDR/IGRA (IDR+/IGRA- : 80% et IDR-/IGRA+ : 20%)
Bonne concordance pour les deux tests IGRA
Meilleure sensibilité du QFT/T-SPOT-TB
Résultats indéterminés : 7,3% T-SPOT-TB et 2,8% QFT (pas d’influence de la prise de corticoides
ou d’immunosuppresseurs)

Conclusion

Les tests IGRA permettent de diminuer de 50% le nombre de patients « TBLI »


Attention : cas de TB avec IGRA négatif
QFT-TB Gold IT chez les patients HIV positifs

Brock et al. Respiratory Research. 2006 Correlation between CD-4 cell


count and response to PHA
100
• 599 HIV positifs

Log 10 Response to
mitogen (IU/ml)
10
• 28 (4.8%) sont QFT-Gold positifs indiquant une ITL
1
• 87% ont au moins un facteur de risque de TB
0.1
• 22 (3.57%) ont un résultat indéterminé
0.01
• Forte corrélation entre le taux de CD4 et le taux de

00
9

19

30
IFN-γ dans le tube mitogéne (P<0.01)

>3
0-

0-

0-
10

20
• 2 QFT-Gold positifs ont développé une tuberculose CD 4 cell count (cells/microliter)

Interferon gamma release assay in people infected with immunodeficiency virus


Bua A. Clinical microbiology and infection : The official publication of the european society
of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2010

Performance of a Whole-Blood Interferon-Gamma Release Assay with Mycobacterium RD1-


Specific Antigens among HIV-infected Persons.
Fujita A. Clin. Dev. Immunol.2010

Le nombre de TCD4, leur pourcentage et le stade de la maladie affectent les performances


des tests IGRAs chez les patients HIV
LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (7)

CONCLUSIONS
CONCLUSIONS (1)
INTERETS DES IGRAs

Tests diagnostiques de l’infection tuberculeuse latente (LTBI)


Excellente valeur prédictive négative dans les TB latentes (pas besoin de suivi)
Excellente spécificité / élimination des faux positifs liés au BCG préalable
Intérêt dans les formes extra pulmonaires
Chez les immunodéprimés, même si la sensibilité est modérée chez ce groupe de
patients (ne peut exclure une TB ou LTBI)
CONCLUSIONS (2)
LIMITES DES IGRA

Les IGRAs :
ne sont pas des tests diagnostiques de la TB
Ne permettent pas de distinguer TB active et TB latente
Ne permettent qu’exceptionnellement d’exclure une TB active (recherches
bactériologiques)
Ne sont pas validés chez le jeune enfant (< 5 ans)
Ont une sensibilité diminuée chez la personne âgée
Données insuffisantes pour suivre l’efficacité d’un traitement pour TB active ou
latente
Ont une sensibilité diminuée chez les immunodéprimés
ETAT DES LIEUX DE LA PRESCRIPTION
DU TEST QUANTIFERON
AUX HOSPICES CIVILS DE LYON
EVOLUTION DES PRESCRIPTIONS DU TEST QUANTIFERON TB GOLD IT
DEPUIS 2008

6000
5344

5000
Nombre de tests réalisés

Total
4000
Moyenne/mois
3245
3000
2265
2000 1610

1000
270 445
134 189
0
2008 2009 2010 2011
REPARTITION DES PRESCRIPTIONS DU QFT PAR HOPITAL
EN 2010

HFME
1% A. CHARIAL
(PNEUMO- 0%
CARDIOLOGIQUE
PIERRE GARRAUD AUTRES LE VINATIER
3%
0% 1% 2%
NEUROLOGIQUE
1%
EDOUARD
HENRI GABRIELLE
HERRIOT
1%
24%
CHARPENNES
0%

LYON SUD CROIX ROUSSE


37% 14%
HOTEL DIEU
16%
REPARTITION DES PRESCRIPTIONS DU QFT PAR SERVICE AUX HCL
EN 2010

Gyneco Obstétrique Pédiatrie


Cardiologie 1% 1% Hématologie
Ophtalmologie 1%
1%
4% Neurologie
Néphrologie
1% Autres Médecine travail
1%
4% 21%
Pneumologie
4%
Médecine
statutaire
12%
Maladies
Infectieuses
11%

Hépato-Gastro-
Dermatologie
Entérologie Médecine Interne
5%
3% Rhumatologie 15%
Allergologie
2% 14%
REPARTITION DES RESULTATS
(POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (1)

POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE

5,6 2,42
4,15
100% 4,3
4,14

80%

60% 75,5 93,61 88,13

40%

20%
16,6
9,84 7,7
0%
2749 579 337

Total Médecine travail Médecine statutaire


REPARTITION DES RESULTATS
(POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (2)

POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE

100% 4,76 2,84 5


2,91 5,67 9
7,8
80%

60% 73,76 81,7


90,4 66,3

40%

20%
17,73 16,9 13,3
11,9
0%
378 141 89 60

Rhumatologie Dermatologie Hépato-Gastro- Allergologie


Entérologie
REPARTITION DES RESULTATS
(POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (3)

POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE

100% 2,88
11,55 9,2 8,7
3,7
5,89 9,56

80%

53,1
60% 49,56 82,7
67,57

40%

20% 33,9 32,17


14,99 14,42

0%
407 292 115 104

Médecine Maladies Pneumologie Ophtalmologie


Interne Infectieuses
REPARTITION DES RESULTATS
(POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (4)

POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE

100% 10,7 10 6,25 7,6


16,6 16 2,8
10
6,7
80%
72,7
60% 40 64,3 61,3
60 50 75

40%

20% 36,7
27,3 30 28,3
25 24 18,75

0% 30 28 25 22 20 16 106

Néphrologie Cardiologie Gyneco Neurologie Pédiatrie Hématologie Autres


Obstétrique
EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV

LE TEST ELISPOT DANS L’EXPLORATION DE


L’HYPERSENSIBILITE RETARDEE AUX MEDICAMENTS
Introduction (1)

HYPERSENSIBILITE RETARDEE AUX MEDICAMENTS

Diagnostic : démonstration de la présence de lymphocytes T spécifiques dans


la peau et le sang
• Tests in vivo cutanés : patch test et IDR à lecture retardée
• Tests biologiques in vitro :détection des LyT spécifiques du
médicament
Introduction (2)

TESTS BIOLOGIQUES UTILISEES DANS L’HSR AUX MEDICAMENTS

- Test de transformation lymphocytaire (TTL) : test de référence


Suivi de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine tritiée

- Test d’activation lymphocytaire en cytométrie

- Test ELISPOT (Enzyme-Linked-ImmunoSPOT assay)


Dosage de la sécrétion de cytokines après activation des LyT spécifiques de
ces médicaments
Tests Biologiques in vitro (1)

TEST DE TRANSFORMATION LYMPHOCYTAIRE

Sang hépariné
Ficoll
PBMC

PBMC Témoin Témoin The Lymphocyte transformation test in the


Culture Milieu de culture positif négatif diagnosis of drug hypersensitivity.
Médicaments à tester
5j Pichler WJ et al, Allergy, 2004

Ajout Thymidine tritiée


12 h Long-Lasting reactivity and high
frequency of drug-specific T cells after
Mesure de l’incorporation
severe systemic drug hypersensitivity
de thymidine reactions.
Beeler A et al, J Allergy Clinical Immunol, 2006

Index de stimulation (SI) = cpm avec l’antigène / cpm sans l’antigène


Avantages : Mesure de la prolifération cellulaire
Bonne spécificité 95%
Inconvénients : sensibilité 60-70% (β-lactames)
radioactivité
5 jours de culture
Tests Biologiques in vitro (2)

TEST D’ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE EN CYTOMETRIE

Utilisation de marqueurs d’identification et/ou d’activation


Mise en évidence des marqueurs de cytotoxicité

CD69 up regulation on T cells as an in vitro marker for delayed-type drug hypersensitivity


Beeler A et al, Allergy 2008

In vitro detection of cytotoxic T and NK cells in peripheral blood of patients with various drug-induced skin
diseases
Zawodniak A et al, Allergy, 2010
Tests Biologiques in vitro (3)

TEST ELISPOT - PRINCIPE -

Technique permettant la numération, même pour de très faibles fréquences, de cellules


spécifiques, d’un haptène ou d’un peptide.

Ac capture Ajout des cellules Activation des Elimination des Ajout du Ajout du substrat :
spécifique de (500000/pts) en cellules et cellules et ajout d’un conjugué précipité coloré
l’IFN-γ présence ou sécrétion d’IFN-γ Ac de détection streptavidin- insoluble
absence d’un qui se lie aux Ac biotinylé qui se lie à enzyme
Formation d’un spot
stimulus de capture l’IFN-γ capturé
= cellule
spécifique et
productrice d’IFN-γ
incubation 15-20h

Détermination du nombre de spots/puits (106)


- contrôle négatif,
- positif (PHA et FRIS)
- antigène (3 dilutions du médicaments)
Tests Biologiques in vitro (3)

TEST ELISPOT - CONCLUSION -

Avantages :
Méthode rapide
Bonne sensibilité 91 %
Bonne spécificité 95 %
Quantification du nombre de cellules productrices d’une cytokine

Aide au diagnostic d’HSR


Discrimination des patients allergiques aux médicaments des patients non allergiques
Validation réalisée sur l’amoxicilline . Technique élargie aux autres médicaments.
Résultats en cours d’évaluation.

A. Rozieres et al. Allergy 2009:64:534-542


EXPLORATION DE L’HSR
- CONCLUSION -

Tests biologiques : mise en évidence de lymphocytes T spécifiques

Difficultés :
- Patients rares
- faible fréquence de lymphocytes spécifiques
- Tableaux cliniques variés
- Acheminements des prélèvements délicats
- Absence de gold standard pour définir la sensibilité et spécificité des tests

Interrogations (ELISPOT) :
- Délai entre réactions et tests
- durée de stimulation des cellules
- Présentation du médicament aux lymphocytes
- Molécules variées, formes pharmaceutiques, concentrations
- Reproductibilité