Seminario 5 - Enzimas 1 - 2020 PDF

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA HUMANA
MATERIA QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2020
SEMINARIO 5
ENZIMAS 1
Introducción
Cinética enzimática
Parámetros cinéticos
ENZIMAS
Las funciones vitales de una célula implican la existencia de un gran número de procesos y
vías metabólicas que consisten en secuencias de reacciones químicas que se llevan a cabo con la
presencia de una serie de catalizadores orgánicos denominados enzimas. Si las mismas
reacciones tuvieran que realizarse sin la presencia de dichos catalizadores, las velocidades con
las que ocurrirían serían tan lentas que serían incapaces de reconocer las necesidades
fisiológicas de la célula.
Una función tan compleja y específica como la de las enzimas, sólo podría ser cumplida
por moléculas estructuralmente también complejas y susceptibles a la acción de diversos factores
que modifiquen su actividad, como son las proteínas.
Una enzima es una proteína con propiedades catalíticas, elaborada por la célula,
susceptible de ser regulada y que además presenta, como veremos más adelante, un alto grado
de especificidad.
Como todo catalizador, aceleran notablemente la velocidad de una reacción química y
cumplen con las siguientes condiciones:
 Son efectivas en cantidades pequeñas.
 No sufren modificaciones ni cualitativas ni cuantitativas al final de la reacción. Es decir,
deben quedar químicamente inalteradas.
 No afectan la posición del equilibrio de la reacción que catalizan. Es decir, se llega mucho
más rápidamente al equilibrio, pero el mismo es igual al que se llegaría en ausencia del
catalizador.
Además de cumplir estas condiciones propias de todos los catalizadores, las enzimas
presentan una serie de características, derivadas de su naturaleza proteica, que las diferencia
netamente de los catalizadores inorgánicos:
 Son termolábiles.
 Presentan una mayor eficiencia, entendiendo por eficiencia en este caso al número de
moles de sustrato transformado por mol de catalizador en la unidad de tiempo.
 Alta especificidad en relación a la naturaleza de la reacción que catalizan y al sustrato que
utilizan.
 Están sujetas a una gran variedad de controles celulares.
Energía de activación
Para que ocurra una reacción química en un sentido determinado debe producirse con un
G negativo, pero además debe producirse a una velocidad adecuada. Un valor negativo de G
no implica necesariamente que la reacción ocurra en ese sentido a alta velocidad. Para que esto
último ocurra es necesario que las moléculas del sistema estén en un estado especial de reacción
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denominado estado activado o excitado o de transición. Tal activación de las moléculas involucra
cierta energía adicional que es necesario entregar al sistema antes de la reacción propiamente
dicha. Esta energía adicional se denomina energía de activación (Ea).
Una vez vencida esta barrera energética, el sistema reacciona de tal forma que se
recobrará la energía de activación, liberándose
la energía libre propia del sistema (G). La
Estado activado
forma de actuar de todo catalizador, y en
G (cal/mol)
sin enzima
particular de las enzimas, es disminuyendo la Ea sin
con
energía de activación, lo cual se traduce en un enzima enzima
incremento de la velocidad de la reacción. El Ea con enzima

catalizador (enzima) se combina con los
S G
reactantes (sustratos) para formar un complejo
intermedio en un estado de transición (complejo P
enzima-sustrato) que posee una energía libre
menor que la que caracteriza al estado de Grado de avance de la reacción
transición de la reacción no catalizada, por lo
que es más fácil vencer la barrera presentada por la energía de activación. Una vez que los
productos de la reacción se han formado se desprenden del catalizador, el que queda libre para
comenzar un nuevo ciclo catalítico.
Otra forma de proveer al sistema químico de la energía de activación necesaria es
calentando el sistema, con lo cual aumenta la energía de las moléculas. Pero los organismos
vivientes no pueden recurrir a cambios en la temperatura para acelerar sus procesos metabólicos
ya que las altas temperaturas que se requerirían serían incompatibles con la vida. Por esa razón
los organismos vivientes deben recurrir a las enzimas que actúan como catalizadores para
disminuir el valor de la Ea correspondiente. Por otra parte, si las reacciones biológicas importantes
pudieran realizarse sin las enzimas, la célula no podría ejercer ningún control sobre las
velocidades respectivas perdiéndose total posibilidad de que, como se dijo anteriormente, los
distintos procesos metabólicos actúen en forma concertada.
Centro activo de las enzimas

Anteriormente se había mencionado que una de las características
más importante de las enzimas es su alto grado de especificidad. Esa idea
de especificidad está relacionada con la interacción de la enzima con el
sustrato.
El mecanismo de acción catalítico de un enzima radica en su
estructura terciaria tridimensional que va hacer que la enzima sea
específica para el sustrato sobre el que actúa. La unión enzima-sustrato se
produce mediante fuerzas intermoleculares de carácter débil que tienen lugar en una zona
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específica de la enzima que se denomina centro activo. Es una zona relativamente pequeña y
restringida de la enzima que posee estructura tridimensional en forma de hueco. Es donde se
encuentran las cadenas laterales de los aminoácidos de unión al sustrato y los catalíticos.
El centro activo del enzima es el responsable directo de la acción catalítica y específica del
enzima, aunque el resto de la molécula de la enzima (constituida por los aminoácidos
estructurales) también tiene importancia en el mantenimiento de todo el conjunto.
Este centro activo es pues una zona relativamente pequeña y restringida de la molécula
proteica constituida por los grupos laterales de ciertos aminoácidos de la cadena polipeptídica
capaces de combinarse con diferentes partes de la molécula del o los sustratos y cofactores. Así
permiten una adaptación más o menos exclusiva de los mismos. A esos grupos responsables de
la unión del sustrato a la enzima se los denomina
sitios de unión. En la siguiente figura se muestra un
diagrama de la enzima fructosa 2,6 difosfatasa
(celeste claro) y la relación existente entre el sustrato
(azul) y los aminoácidos que conforman el centro
activo de la enzima. Los grupos laterales
responsables de la actividad catalítica propiamente
dicha reciben el nombre de sitios catalíticos. En
algunos casos esos grupos pueden corresponder a
los grupos prostéticos, de los cuales hablaremos más
adelante. Los grupos que constituyen el centro activo,
quizás situados bastante lejos unos de otros en la secuencia proteica, se aproximan y adoptan la
configuración característica del mismo. Por esa causa aquellos factores que hacen que la enzima
pierda su estructura terciaria nativa (por ejemplo en la desnaturalización proteica) producen una
alteración profunda del centro activo, y conducen a la pérdida de la actividad enzimática.
Agentes auxiliares o Cofactores

Algunas enzimas dependen para ser activas solamente de su estructura proteica. Mientras
que otras necesitan además estructuras no proteicas, denominadas cofactores. Los cofactores
pueden ser un ión metálico o bien una molécula orgánica compleja llamada coenzima.
El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de HOLOENZIMA.
Cuando se separa el cofactor, la proteína restante, que por sí misma es catalíticamente inactiva,
se denomina APOENZIMA.
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Recordar:
 Unidad funcional: HOLOENZIMA = Apoenzima (proteína) + grupo prostético o
cofactor
 APOENZIMA: Parte proteica de una holoenzima, no tiene actividad catalítica
Cofactores
- Iones metálicos
La forma en que dichos iones actúan en el proceso catalítico es más o menos compleja y
es imposible indicar un modo de acción común a todos ellos.
Cuando las enzimas requieren cationes para actuar, el requerimiento es estricto ya que en
su ausencia la actividad es prácticamente nula.
También los aniones (como sulfato, fosfato, cloruro, etc.) pueden actuar con ciertas
enzimas como activadores.
COFACTORES
ENZIMAS
(iones)
Alcohol deshidrogenasa
Zn2+
Anhidrasa carbónica
Hexoquinasa
2+
Mg Glucosa 6 fosfatasa
Piruvato quinasa (junto con K+)
Arginasa
Mn2+
Ribonucleótido reductasa
Citocromos
2+ 2+
Fe o Fe Peroxidasa
Catalasa
Tirosinasa
Cu2+
Citocromo oxidasa
2+
Ni Ureasa
Se Glutation peroxidasa
+
K Piruvato quinasa (junto con Mg2+)
Na+ ATPasa (junto con Na+ y Mg2+)
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- Coenzimas
Son moléculas orgánicas de estructura más o menos compleja que intervienen en la
reacción generalmente como transportadores de algún grupo químico. Se unen muy débilmente a
la enzima, por lo tanto, son fácilmente disociables. El proceso de asociación-disociación es
siempre reversible.7
Algunas coenzimas están unidas a la molécula de la enzima, y reciben entonces el nombre
de grupos prostéticos. Están fuertemente unidos a la proteína, a veces por uniones covalentes.
Son de difícil disociación y cuando esto ocurre, la enzima pierde su actividad.
Es interesante hacer notar que muchos grupos prostéticos y coenzimas están
estructuralmente relacionados con las denominadas vitaminas. Estas sustancias son utilizadas en
el organismo en esos casos como precursores de las coenzimas y grupos prostéticos respectivos
y, como el organismo carece de la capacidad de sintetizarlas, deben ser administradas en la dieta.
Coenzima o Vitamina ENZIMA

grupo prostético de la que deriva
NAD+ y NADP+ nicotinamida, o vitamina B3 Deshidrogenasas
FAD y FMN riboflavina o vitamina B2 Deshidrogenasas
Piridoxal fosfato vitamina B6 Transaminasas
glucógeno fosforilasa
Pirofosfato de tiamina tiamina o vitamina B1 α-cetoglutárico decarboxilasa
Piruvato decarboxilasa
Biotina Biotina Piruvato carboxilasa
Acetil-CoA carboxilasa
Ácido tetrahidrofólico ácido fólico Actúa como transportador
intermediario de grupos con un
átomo de carbono (formilo,
metenilo y metileno)
Coenzima A ácido pantoténico o vitamina Transferencia de grupos
B5 acetilo pirúvico decarboxilasa.
Especificidad enzimática
Se había mencionado anteriormente que una de las características distintivas que
presentan las enzimas con respecto a los catalizadores inorgánicos era su alto grado de
especificidad. Es ésta una propiedad de notable significación biológica, pues es la que hace
posible la coexistencia de diversas vías metabólicas perfectamente diferenciadas. Debemos
entender por especificidad enzimática a la limitación de acción de cada enzima hacia un sustrato
determinado (o un grupo de sustratos estructuralmente relacionados) y en relación a una reacción
química perfectamente definida. Así, por ejemplo, una enzima capaz de hidrolizar las uniones
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glicosídicas presentes en un polisacárido como el almidón, es incapaz de hidrolizar las uniones
peptídicas de una proteína, y viceversa. Más aún, una enzima como la α-amilasa pancreática,
principal responsable de la degradación del almidón y el glucógeno en el tracto gastrointestinal,
actúa hidrolizando las uniones α,1-4 glicosídicas de las mencionadas sustancias liberando
unidades del disacárido maltosa, pero es incapaz de hidrolizar a esta última en dos moléculas de
glucosa a pesar de que la unión también es α,1-4 glicosídica. Esa función es llevada a cabo
exclusivamente por otra enzima de origen intestinal, la maltasa.
Si bien todas las enzimas son específicas, el grado de especificidad puede variar de una
enzima a otra. Así, por ejemplo, algunas poseen especificidad absoluta. Estas enzimas tan sólo
pueden ejercer su acción sobre un sustrato determinado (o un par de sustratos, si la reacción es
bimolecular es decir donde la enzima utiliza dos sustratos). Como ejemplo podemos mencionar a
la ureasa, enzima que desdobla específicamente a la urea en amoníaco y CO2.
Ureasa
NH2-CO-NH2 + H2O CO2 + 2NH3
Otro ejemplo es la succinato deshidrogenasa, que oxida exclusivamente al succinato para

dar fumarato. Esta última enzima es una flavoproteína que contiene FAD covalentemente unido el
cual también actúa específicamente en la reacción como aceptor de hidrógeno.
succinato deshidrogenasa
Succinato + enzima-FAD fumarato + enzima-FADH2
En algunos casos de reacciones bimoleculares, la enzima es altamente específica para

uno de los sustratos de la reacción y no para el otro. Por ejemplo, la alcohol deshidrogenasa es
específica para la coenzima NAD+, pero no es tan específica con respecto al otro sustrato, que
puede ser un gran número de alcoholes primarios, secundarios o polialcoholes como el
etilenglicol.
alcohol deshidrogenasa
+
Alcohol + NAD aldehído (o cetona). + NADH + H+
Otras enzimas presentan especificidad de reacción. Es decir son específicas en relación al

tipo de reacción que catalizan pero no lo son tanto con respecto al sustrato involucrado. A este
grupo de enzimas pertenecen algunas enzimas hidrolíticas entre las cuales podemos mencionar
como ejemplo a la fosfomonoestearasa alcalina que cataliza específicamente hidrólisis de ésteres
fosfóricos de acuerdo a la reacción general, independientemente del carácter del grupo R.
fosfomonoesterasa alcalina
R-O-PO32- + H2O R-OH + PO4H2-
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Por último, debemos mencionar aquellas enzimas que actúan con

sustratos que pueden existir en dos formas isoméricas (ya se trate de
isómeros ópticos o geométricos). En esos casos la enzima actúa
preferentemente sobre uno de los isómeros y no sobre el otro.
Por ejemplo, existen dos enzimas capaces de

desaminar oxidativamente a los aminoácidos para dar
los cetoácidos respectivos (aminoácido oxidasa). Una
de ellas actúa específicamente con los L-aminoácidos
mientras que la otra lo hace exclusivamente con los D-
aminoácidos.
Expresión de las concentraciones enzimáticas

La detección de una enzima en un medio biológico involucra dos aspectos, uno cualitativo
y otro cuantitativo. Primero se debe poner de manifiesto la presencia de la enzima en el medio en
estudio para que, en caso afirmativo, determinar la cantidad en que se halle presente.
Para lo primero, se recurre a la determinación de la reacción específica por ella catalizada.
Para ello se hacen actuar alícuotas del medio en que se supone existe la enzima sobre el/los
sustrato/s específico/s en condiciones determinadas, y se observa la transformación de los
mismos en los productos correspondientes.
En cuanto a la cantidad de enzima presente, en la mayoría de los casos es imposible
determinar la cantidad de la misma en términos absolutos (miligramos o micromoles de enzima)
ya que, por lo general, se trata de medios que contienen una mezcla compleja de diversas
proteínas además de la enzima en estudio. Por lo tanto, se recurre a la medida de la velocidad de
la reacción catalizada por la misma, entendiéndose por velocidad de una reacción química a la
cantidad de reactivo que se transforma en producto en la unidad de tiempo, en condiciones
óptimas (v = P / t).
Esto es posible por el hecho de que, en condiciones adecuadas de medida, la velocidad de
la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima, por lo menos en un rango
determinado.
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V5
velocidad de reacción
V4
V3
V2
V1
0
0 E1 E2 E3 E4 E5
cantidad de enzima
Variaciones de la velocidad de la reacción en función del tiempo

En la práctica, cuando se quiere medir la velocidad de una reacción se agregan en un tubo
de ensayo la solución que contiene la enzima
y la solución que contiene el sustrato, y se lo Producto V0 = Pendiente a t0 =
P
a t0 =
AB
[P]
t 0B
incuba a una temperatura adecuada. De esta
manera, el sustrato puede unirse a la enzima
y formar el complejo ES que dará luego origen
al producto.
A
Así, es posible medir la cantidad de
producto que se va formando en intervalos de
tiempo sucesivos.
Si representamos en un gráfico la
cantidad de producto [P] formado en función
del tiempo (t), vemos que inicialmente (a 0 B t Tiempo
tiempos cortos) se observa una recta, pero
luego la formación de producto no es lineal con el tiempo debido a que se van modificando las
condiciones en las que se realiza la reacción (como por ejemplo cambios en el pH, comienza a
aumentar la formación de producto y por lo tanto la reacción inversa tiene una velocidad
considerable, puede haber aparición de subproductos, etc.).
En consecuencia, la velocidad de la reacción se mide por la PENDIENTE DE LA
TANGENTE A ESTA CURVA. Si esta velocidad se mide A TIEMPO CERO (t0), se la denomina
VELOCIDAD INICIAL (V0).
La velocidad inicial es dependiente de la cantidad de sustrato y de enzima presente.
Porque….
a) para una dada cantidad de enzima: a mayor número de moléculas de sustrato más
rápidamente se formarán el complejo ES y por lo tanto más rápido se formarán moléculas de
producto.
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b) para una dada concentración de sustrato: cuantas más moléculas de enzima tenga,
mayor será la cantidad de moléculas de ES formadas y, en consecuencia, mayor será la
formación de producto.
Es posible expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimáticas,
entendiéndose por unidad de una enzima, la cantidad de la misma que produce una cierta
velocidad de reacción bajo óptimas condiciones. Esa velocidad de reacción se expresa como la
cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo. Para evitar ambigüedades en la utilización de
distintas unidades, se ha definido por convención una unidad que puede ser aplicada a todas (o
casi todas) las enzimas, y que permite comparar las actividades de enzimas diferentes. La
definición recomendada es la siguiente:
Una unidad internacional (UI) de cualquier enzima es la cantidad de la misma que
cataliza la transformación de un micromol (mol) de sustrato por minuto bajo condiciones
definidas.
UI = mol / min
Existe otra unidad denominada Katal que se define como la cantidad de enzima que
transforma un mol de sustrato en producto en un segundo.
Katal = mol / seg
Otra unidad comúnmente usada es la actividad específica. Ésta se refiere a la actividad

de una enzima por miligramo (mg) de proteína, y se suele expresar en: μmol x min -1 x mg-1 de
proteína o UI / mg de proteína. La actividad específica da una idea de la pureza de la enzima en
una muestra. Este parámetro es una medida de la proporción de proteína enzimática con respecto
a la proteína total de una muestra. Durante la purificación de una enzima, el valor de la actividad
específica va aumentando a medida que se va eliminando otras proteínas contaminantes.
Actividad específica = UI /mg
En cuanto a las mencionadas condiciones “óptimas” de medida, debe establecerse la

temperatura a la cual se define la unidad, además del pH del medio de reacción, la concentración
del o los sustratos y cofactores, etc. Es necesario establecer estrictamente las condiciones de
medida, debido al hecho de que todos los factores mencionados inciden en forma notable sobre la
actividad enzimática tal como se verá a continuación.
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Efecto de la temperatura
Cuando se estudia la variación de la actividad de
una enzima en función de la temperatura y los resultados
se representan en un sistema de coordenadas
cartesiana, se obtienen gráficos del tipo observado en la
siguiente figura.
Este tipo de curva es la resultante de dos factores
fundamentales. En primer lugar, las reacciones químicas,
catalizadas o no, aumentan su velocidad al aumentar la
temperatura. Pero en el caso particular de las reacciones
catalizadas por enzimas ese aumento tiene un límite:
debido a su naturaleza proteica, por encima de cierta temperatura (variable con cada enzima) las
mismas comienzan a desnaturalizarse convirtiendo ese proceso de inactivación térmica en un
factor más importante que el del incremento de la velocidad de la reacción. Por esa causa todas
las enzimas exhiben una temperatura, o un rango de temperaturas, a la cual la velocidad de la
reacción catalizada es máxima y se la denomina temperatura óptima. Para las enzimas de
animales de sangre caliente la temperatura óptima está por lo general comprendida entre 25º y
37ºC. Esta temperatura es lo suficientemente alta como para dar una actividad razonable, y lo
suficientemente baja como para evitar la desnaturalización térmica de la mayoría de ellas.
Efecto del pH
En general, cada enzima es activa tan sólo en un ámbito de pH más o menos restringido y
en la mayoría de los casos presenta un pH óptimo definido, es decir un pH para el cual la
actividad es máxima. A partir de ese punto, hacia un lado y hacia el otro en la escala de pH la
actividad disminuye. La curva de actividad enzimática en función del pH adopta, en general, una
forma característica de campana tal como se muestra en el ejemplo de la siguiente figura.
Tanto el rango del pH dentro del cual es activa una

enzima, así como su pH óptimo son características
de cada enzima y se adaptan a las condiciones
fisiológicas en las cuales actua. Así, por ejemplo, la
pepsina, enzima proteolítica del jugo digestivo,
tiene un pH óptimo de 1,5 a 2,5. Mientras, la
tripsina, enzima también proteolítica pero de origen
pancreático y que actúa a nivel de la luz intestinal,
tiene un pH óptimo de 9 a 11.
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Cabe destacar que no todas las enzimas presentan una curva de pH de tipo campana tan
característica. Por ejemplo, la papaína, una enzima fuertemente proteolítica que se encuentra en
el fruto de la papaya, tiene una actividad constante en el ámbito de pH de 4 a 9. La colinesterasa,
enzima que en el tejido nervioso hidroliza a la acetilcolina, mediador del impulso nervioso, en
ácido acético y colina, no presenta la rama descendente de la curva pH.
La dependencia de la actividad enzimática con el pH puede atribuirse a una serie más o
menos compleja de factores entre los cuales podemos mencionar a los siguientes:
1. Ionización directa de los residuos de

aminoácidos presentes en el centro
activo.
2. El pH puede alterar el o los sustratos
responsables de la reacción química, por
lo tanto, también en esos casos la
formación del complejo enzima-sustrato
será dependiente el pH.
3. También pueden modificarse los grupos
de la cadena laterales de los
aminoácidos de la proteína, lo que trae
aparejado la posible modificación de su
estructura espacial de tal manera que
facilite o dificulte su unión con el sustrato.
Fuerza iónica
La fuerza iónica de una solución está relacionada con la cantidad y el tipo de iones
presentes en la misma. Como ya mencionamos anteriormente, fundamentalmente algunos
cationes son necesarios en el centro activo de algunas enzimas para su normal funcionamiento.
Efecto de la concentración de sustrato

Este es uno de los factores más importantes que determinan la velocidad de las reacciones
enzimáticas. En la mayoría de los casos, cuando se representa la velocidad inicial (V0) de una
reacción enzimática en función de la concentración de sustrato [S], manteniendo la concentración
de la enzima, pH, temperatura y fuerza iónica constante, se obtiene una curva hiperbólica tal como
se indica en la siguiente figura.
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En dicha curva puede observarse
Vo Vmáx Velocidad máxima
Velocidad que para valores muy pequeños de la
inicial
concentración del sustrato [S], la
velocidad de la reacción (V0) es
Vmáx directamente proporcional a [S]. Es decir
2
al duplicarse o triplicarse la
concentración del sustrato se duplica o
triplica respectivamente la velocidad de
la reacción.
Km [S] Concentración
Al seguir aumentando [S], el
de sustrato inicial incremento de V0 deja de ser lineal y va
haciéndose cada vez menor hasta que llega un momento en que permanece constante, es decir,
no aumenta por más que se incremente [S]. La velocidad alcanzada en ese momento se
denomina velocidad máxima de la reacción (Vmáx) para esa cantidad de enzima y sólo puede ser
aumentada aumentando la concentración de la enzima.
Basándose en este fenómeno, Michaelis y Menten enunciaron en 1913 una teoría general
de la acción enzimática que fue la base del desarrollo posterior de la moderna cinética enzimática.
En esa teoría se adoptó la primitiva sugestión, hecha por Henri en 1902, de que la enzima forma
primero un complejo con su sustrato, el cual se desdobla subsecuentemente en la enzima libre y
los productos de la reacción. Esquemáticamente el mecanismo de la reacción podría
representarse en la siguiente forma:
E + S ↔ E-S  E + P
En las cuales: E, representa a la enzima; S, al sustrato; E-S, al complejo enzima-sustrato; y

P, al producto o los productos.
Mediante un desarrollo matemático de dichas ecuaciones, Michaelis y Menten dedujeron
una ecuación que relaciona cuantitativamente la velocidad inicial de la reacción (V0) con la
concentración de sustrato [S] y que concuerda perfectamente con los datos experimentales.
La ecuación, conocida con el nombre de Michaelis-Menten es la siguiente:
Vmáx x [S]
V0 =
Km + [S]
Vmáx es la velocidad máxima a la que ya hemos hecho referencia, es un valor constante

para cada concentración de enzima.
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Km es una nueva constante denominada constante de Michaelis, que depende del
sustrato y es independiente de la concentración de enzima, y cuyo significado nos referiremos
más adelante.
Un ligero análisis de la ecuación de Michaelis-Menten nos permitirá comprobar cómo la
misma se adapta a la curva experimental observada.
[S] < Km [S] = Km [S] > Km
Vmáx x [S] Vmáx x Km Vmáx

V0 = V0 = = V0 = Vmáx
Km Km + Km 2
Si analizamos la zona de la curva para la cual la concentración de sustrato [S] es muy

pequeña con respecto al valor del Km, el valor de Km + [S] del denominador se hace muy
aproximadamente igual a Km.
Esto indica que Vo es directamente proporcional a [S] y ese trozo de la curva será muy
aproximadamente una recta, como se indicó oportunamente.
A la inversa, para concentraciones de [S] muy grandes con respecto a Km, el denominador
Km + [S] será ahora muy aproximadamente igual a [S]. Así se obtiene un valor constante e igual a
la Vmáx. En esas condiciones, toda la enzima presente está formando el complejo enzima-sustrato:
se dice que el sustrato está en condiciones saturantes o que la enzima está saturada.
Veamos ahora qué velocidad se obtiene cuando se toma un valor de [S] igual al valor de la
constante Km. Para ello se reemplaza [S] por Km en la ecuación de Michaelis-Menten, resultando
en que V0 =. Vmáx/2. Es decir que ahora le podemos asignar a Km un significado experimental
inmediato: es la concentración del sustrato para la cual la velocidad de la reacción es la
mitad de la velocidad máxima. Tiene una importancia fisiológica muy grande ya que cuando una
enzima tiene un valor muy pequeño de Km para un dado sustrato significa que con una
concentración muy baja de dicho sustrato se puede alcanzar la saturación de la enzima.
Desde otro punto de vista, se considera a Km como una medida indirecta e inversa de la
afinidad de la enzima por el sustrato. Es decir, cuanto menor es el valor de Km mayor será la
afinidad de la enzima por el sustrato y viceversa, a un valor muy grande del K m corresponderá una
afinidad muy pobre de la enzima por el sustrato.
El conocimiento de los valores de Km es muy útil, por ejemplo, en los casos de enzimas
que tienen una especificidad no muy estricta, es decir que pueden actuar sobre más de un
sustrato, al permitir tener una indicación de hacia cuál de ellos va a tener mayor afinidad y actuar
en esa forma preferentemente. Por ejemplo, la hexoquinasa de cerebro, enzima que puede
actuar sobre varias hexosas catalizando su fosforilación con ATP para dar sus ésteres 6-fosfato
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correspondientes, tiene distinta afinidad por cada uno de ellas según se desprende del análisis de
los valores de las Km respectivas, indicadas a continuación:
Hexosa Km (M)
Glucosa 8 x 10-6
Es evidente que su afinidad por glucosa y manosa es
Manosa 5 x 10-6
muchísimo mayor que por fructosa y galactosa.
Fructosa 1,6 x 10-3
Galactosa 1 x 10-1
También puede darse el caso de dos enzimas distintas que pueden catalizar una reacción
semejante como, por ejemplo, la ya mencionada hexoquinasa cerebral y la glucoquinasa hepática.
Ambas enzimas catalizan la formación de
glucosa-6-fosfato a partir de glucosa. Mientras
que la hexoquinasa tiene un Km hacia la
glucosa de 1 10-4 M, el de la glucoquinasa
(hepática) es 1 10-2 M, es decir
aproximadamente 100 veces mayor. Si se tiene
en cuenta además el valor de la concentración de glucosa en sangre (3,8 a 6,1 mM) se puede
deducir que, en condiciones normales, la hexoquinasa cerebral estará saturada de su sustrato y
por lo tanto actuará a su máxima velocidad. En cambio, la actividad de la glucoquinasa hepática
sólo será significativa cuando la concentración de glucosa se eleve por encima de lo normal, como
cuando hay una ingesta considerable de glúcidos dietarios.
Los casos mencionados ejemplifican además otra característica de las enzimas con
respecto a las Km y es que enzimas similares, pero de distintos órganos pueden diferenciarse en
la afinidad hacia el mismo sustrato como ocurre con las hexoquinasas de cerebro e hígado ya
mencionadas. Esas enzimas que catalizan la misma reacción y pertenecen a la misma especie,
pero se distinguen en algún parámetro cinético o estructural, se denominan isoenzimas.
Debemos mencionar que también el conocimiento de las Vmáx puede aportar datos útiles
para la evaluación de la importancia fisiológica de una dada enzima ya que, conjuntamente con el
conocimiento del Km (o de los Km si la reacción involucra más de un sustrato), nos permitirá
determinar cuan efectivamente está funcionando la misma en los tejidos de un organismo vivo.
Establecida la importancia de ambos parámetros cinéticos (Km y Vmáx), veamos ahora
cómo pueden determinarse fácilmente por un método gráfico. Para ello hallaremos la inversa de la
ecuación de Michaelis-Menten.
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Vmáx x [S]
V0 =
Km + [S]
Km + [S] Km [S]
1 / V0 = = +
Vmáx x [S] Vmáx x [S] Vmáx x [S]
Km 1 1
1 / V0 = x +
Vmáx [S] Vmáx
Esta ecuación, conocida con el nombre de ecuación de Lineweaver-Burk, corresponde a

la ecuación de una recta del tipo:
y = aX + b
en la cual: y = 1 / V0
x = 1 / [S]
a = Km / Vmáx
b = 1 / Vmáx
Midiendo las velocidades enzimáticas para
distintas concentraciones de sustrato y 1/Vo
representando gráficamente 1/V0 en función de
1/[S] (también llamada gráfica de los dobles
recíprocos), se obtendrán recta tal como se indica
en la siguiente figura. Pendiente = Km/Vmáx
1/Vmáx
Es fácil demostrar que la intersección de la
recta con el eje de las ordenadas será igual a 1/Vmáx
y la intersección con el eje de las abscisas
corresponderá a (-1/Km), por lo tanto, una vez 1/(S)
-1/Km
trazada la recta podremos obtener directamente del
gráfico los valores correspondientes de Km y Vmáx.
Cuando se trata de reacciones enzimáticas con dos o más sustratos es necesario
determinar los Km para cada uno de ellos. Para esto se agregan los otros sustratos en exceso
(concentraciones saturantes) y se varía tan sólo la concentración de aquel cuyo Km se quiere
determinar.
Tener en cuenta que:
- En la práctica, la determinación de los parámetros cinéticos (Km y Vmáx) a partir de la
curva de saturación de sustrato (curva de Michaelis-Menten o de V0 en función de [S]) no es muy
precisa, debido a que la aproximación a Vmáx se hace asintóticamente. En cambio, a partir del
15
gráfico de Lineweaver-Burk (curva de dobles recíprocos o de 1/ V0 en función de 1/[S]), al ser una
recta, se pueden obtener valores precisos de Km y Vmáx a partir de pocos puntos experimentales.
- Para obtener los valores de Km y Vmáx para una
[S]1 < [S]2 < [S]3 < [S]4
determinada cantidad de enzima, se debe calcular la V0
[P]
para diferentes [S]: en un tubo de ensayo se colocan la
V0 4
solución con enzima y la solución que contiene el sustrato, y V0 3
se incuba a una temperatura adecuada. Se mide la cantidad V0 2

V0 1
de producto formado a diferentes tiempos y se grafica [P] en
función del tiempo. Se repite este procedimiento en
diferentes tubos, donde lo único que se variará es la [S] t
inicial. Se grafican los resultados y se calculan las V0 para cada [S].
Con estos datos experimentales puede realizarse directamente la gráfica de Michaelis-

Menten, para aproximar un valor de la Vmáx, calcular la Vmáx /2 y extrapolar en las abscisas para
obtener Km.
V0
Vmáx
V0 4 [S] V0
[S]1 V0 1
Vmáx V0 3
2 [S]2 V0 2
V0 2
[S]3 V0 3
V0 1 [S]4 V0 4
[S]1 [S]2 [S]3 [S]4 [S]

Km
1/V0 Si se desean determinar de

1/[S] 1/V0
1/V0 1
manera precisa los parámetros
1/[S]1 1/V0 1
cinéticos, se deben calcular las
1/V0 2
1/[S]2 1/V0 2
inversas de V0 y [S] y hacer el
1/Vmáx 1/V0 3 1/[S]3 1/V0 3
1/V0 4 gráfico de Lineweaver-Burk. Donde
1/[S]4 1/V0 4
la recta corta al eje de las
ordenadas será igual a 1/Vmáx y la
-1/Km 1/[S]4 1/[S]3 1/[S]2 1/[S]1 1/[S]
intersección con el eje de abscisas
será (-1/Km). Se calculan las inversas de esos valores y se obtienen Km y Vmáx.
16
Curiosidades (este recuadro es a título informativo, no será incorporado al parcial).
MAUD LEONORA MENTEN.

Maud Menten nació en Port Lambton, Ontario, Canadá, el 20 de marzo de 1879.
Se graduó en la universidad de Toronto en 1913. Menten fue una de las primeras
mujeres canadienses doctoradas en medicina. Dos años más tarde, ella y Leonor
Michaelis publicaron un artículo que describía la relación entre el índice de una reacción
enzimática y la concentración del sustrato de la enzima.La ecuación de Michaelis-Menten dio a
los científicos una manera por la cual podrían analizar matemáticamente sus observaciones y
descripciones de reacciones biológicas.Menten continuó su carrera brillante como patóloga en la
Universidad de Pittsburgh a partir de 1918, publicando extensivamente en temas médicos y
bioquímicos. Sus muchos logros incluyeron co-descubrimientos importantes referentes el azúcar
de la sangre, la hemoglobina y a las funciones del riñón. Publicó en 1944 el qué puede ser el
primer uso de la electroforesis en la separación de las proteínas. Entre 1951 y 1954 ella condujo
la investigación de cáncer en la Colombia británica. Maud Menten era una mujer interesada en
muchas cosas, incluyendo idiomas, música y las bellas artes. Realizó exposiciones de pintura
con otros artistas de Pittsburgh. Volvió a Ontario seis años antes de su muerte, el 20 de julio de
1960 en Leamington.
LEONOR MICHAELIS.
Fue un bioquímico y médico famoso nacido en Alemania el 16 de
enero de 1875. Estudió Medicina en Friburgo de Brisgovia, donde se
graduó en 1897. Luego se mudó a Berlín, donde recibió su doctorado.
Michaelis trabajó como asistente de Paul Ehrlich (1898-1899), Moritz
Litten (1899-1902) y Ernst Viktor von Leyden (1902-1906). En 1906
comenzó como director del laboratorio de bacteriología en el Hospital de la Charité en Berlín,
convirtiéndose en profesor extraordinario en la Universidad de Berlín en 1908. En 1922 se
trasladó a la Facultad de Medicina de la Universidad de Nagoya (Japón) como profesor de
bioquímica; en 1926 a la Universidad Johns Hopkins en Baltimore, Maryland como profesor
residente en la investigación médica; y en 1929, al Instituto Rockefeller de Investigación Médica
de Nueva York. Se retiró en 1941. Además de su papel en la formulación de la ecuación
Michaelis-Menten (1913) descubrió la tinción vital de la mitocondria con verde Jano y el cuerpo
de Michaelis-Gutmann en infecciones del tracto urinario (1902), y encontró que el ácido
tioglicólico podía disolver la queratina. Murió el 8 de octubre de 1849 en Nueva York.
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DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA HUMANA

MATERIA QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2020

incremento de la velocidad de la reacción. El Ea con enzima

Centro activo de las enzimas

Agentes auxiliares o Cofactores

Coenzima o Vitamina ENZIMA

Otro ejemplo es la succinato deshidrogenasa, que oxida exclusivamente al succinato para

En algunos casos de reacciones bimoleculares, la enzima es altamente específica para

Otras enzimas presentan especificidad de reacción. Es decir son específicas en relación al

Por último, debemos mencionar aquellas enzimas que actúan con

Por ejemplo, existen dos enzimas capaces de

Expresión de las concentraciones enzimáticas

Variaciones de la velocidad de la reacción en función del tiempo

Katal = mol / seg

Otra unidad comúnmente usada es la actividad específica. Ésta se refiere a la actividad

Actividad específica = UI /mg

En cuanto a las mencionadas condiciones “óptimas” de medida, debe establecerse la

Tanto el rango del pH dentro del cual es activa una

1. Ionización directa de los residuos de

Efecto de la concentración de sustrato

En las cuales: E, representa a la enzima; S, al sustrato; E-S, al complejo enzima-sustrato; y

Vmáx es la velocidad máxima a la que ya hemos hecho referencia, es un valor constante

[S] < Km [S] = Km [S] > Km

Vmáx x [S] Vmáx x Km Vmáx

Si analizamos la zona de la curva para la cual la concentración de sustrato [S] es muy

Esta ecuación, conocida con el nombre de ecuación de Lineweaver-Burk, corresponde a

se incuba a una temperatura adecuada. Se mide la cantidad V0 2

inicial. Se grafican los resultados y se calculan las V0 para cada [S].

Con estos datos experimentales puede realizarse directamente la gráfica de Michaelis-

[S]1 [S]2 [S]3 [S]4 [S]

1/V0 Si se desean determinar de

Curiosidades (este recuadro es a título informativo, no será incorporado al parcial).

MAUD LEONORA MENTEN.

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