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enzymatic activity
atividade enzimática
Recibido: (07/06/2019).
Resumen
Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos, es decir,
sustancias que, sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad, la
cual depende de diferentes factores.
Se analizó la actividad enzimática de la amilasa salival frente a almidón como sustrato en
condiciones distintas de temperatura, pH, inhibidores y activadores. Para concluir si la
actividad enzimática se ve afectada por estos factores se realizó la prueba de Lugol que da
positivo cuando en el medio de la reacción está presente el almidón y se observa una
coloración azul, de lo contrario se observa una coloración que puede ir de coloración azul
de muy baja intensidad hasta el color amarillo. Los resultados obtenidos arrojaron que la
actividad enzimática va a depender de las condiciones en las que se esté realizando la
reacción.
Resumo
Enzimas são proteínas que catalisam reações químicas em seres vivos, ou seja, substâncias
que, sem serem consumidas em uma reação, aumentam notavelmente sua velocidade, o que
depende de diferentes fatores. A atividade enzimática da amilase salivar foi analisada em
relação ao amido como substrato sob condições diferentes de temperatura, pH, inibidores e
ativadores. Para concluir se a atividade enzimática é afetada por esses fatores, foi realizado
o teste de Lugol, que é positivo quando o amido está presente no meio de reação e uma
coloração azul é observada, caso contrário pode ser observada uma coloração que pode ser
coloração azul de intensidade muito baixa até a cor amarela. Os resultados obtidos mostraram
que a atividade enzimática dependerá das condições em que a reação está sendo realizada.
Introducción
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que actúan como catalizadores que actúan
como catalizadores en todas las reacciones del metabolismo. Para que ocurran estas
reacciones es generalmente necesaria la presencia de un catalizador que, además, de debe ser
específico para determinada reacción, pues, de lo contrario podrían ocurrir reacciones no
deseadas. Las enzimas, por tanto, además de ser catalizadores, son capaces de reconocer
sobre que sustancia han de actuar (sustratos), provocando una transformación específica
sobre dicha sustancia. Al igual que ocurre con otros catalizadores, las enzimas no son
consumidas por las reacciones que catalizan, ni alteran su equilibrio químico. Sin embargo,
difieren de otros catalizadores por ser más específicas. Las enzimas catalizan alrededor de
4.000 reacciones bioquímicas distintas. No todos los catalizadores bioquímicos son
proteínas, pues algunas moléculas de ARN son capaces de catalizar reacciones (como la
subunidad 16S de los ribosomas en la que reside la actividad peptidil transferasa). También
cabe nombrar unas moléculas sintéticas denominadas enzimas artificiales capaces de
catalizar reacciones químicas como las enzimas clásicas.
La actividad enzimática puede ser afectada por otras moléculas. Los inhibidores enzimáticos
son moléculas que disminuyen o impiden la actividad de las enzimas, mientras que los
activadores son moléculas que incrementan dicha actividad. Asimismo, gran cantidad de
enzimas requieren de cofactores para su actividad. Muchas drogas o fármacos son moléculas
inhibidoras. Igualmente, la actividad es afectada por la temperatura, el pH, la concentración
de la propia enzima y del sustrato, y otros factores físico-químicos.
En este informe se muestran los resultados de las pruebas donde se estudiaron el tipo de
influencia de pH, temperatura, activadores e inhibidores en la actividad enzimática y
especificidad de la amilasa salival.
Materiales y métodos
Tabla A1. Reactivos que se utilizaron para la realización de las pruebas.
Sustancia Concentración Cantidad
Amilasa salival Diluida 25 mL.
Almidon 1%
INFLUENCIA DE INHIBIDORES
ESPECIFICIDAD
Resultados y discusión
El tipo de actividad catalítica que presentan las enzimas está relacionado con centros
espaciales que poseen, que son responsables de la fijación y activación del sustrato. Estas
regiones espaciales son una combinación única de restos de aminoácidos de la cadena
polipeptídica situados a larga distancia uno del otro. La actividad catalítica de un enzima se
determina midiendo la velocidad inicial de reacción, que es la pendiente de la curva de
progreso (curva de producto formado o sustrato transformado frente al tiempo en el tiempo
cero) (Fig. 1). Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente, pudiéndose tomar la
pendiente de esta recta como velocidad inicial. A tiempos más largos, el progreso de la
reacción se aparta de la linealidad. Esta caída de la velocidad de reacción se debe a la
disminución significativa de la concentración de sustrato, aunque también pueden influir
otros factores como el aumento de la concentración de producto, cambios de pH, inactivación
del enzima, etc. La máxima fiabilidad en la determinación de la actividad de un enzima la
suministra el valor de velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial de progreso lineal
de la reacción. [1]
Labilidad térmica
Enzima
Sustrato Temperatura (°C) Resultado
Amilasa Almidón 90 (+)
Amilasa Almidón 37 (-)
Amilasa Almidon 0 (+)
Influencia de pH.
Enzima
Sustrato pH. Resultado
Amilasa Almidón 5,0 (+)
Amilasa Almidón 6,8 (-)
Amilasa Almidón 8,0 (+)
Figura 2. Influencia de pH
Influencia de activadores e inhibidores en la actividad enzimática de la amilasa salival
La actividad enzimática puede inhibirse, las moléculas que reducen la actividad de una
enzima, denominadas inhibidores, incluyen muchos fármacos, antibióticos, conservadores
alimentarios y venenos. La inhibición enzimática puede ser reversible o irreversible. La
inhibición reversible ocurre cuando el efecto inhibitorio de un compuesto puede
contrarrestarse incrementando la concentración de sustrato o retirando el compuesto
inhibidor mientras la enzima permanece intacta [4]. La inhibición reversible será competitiva
si el inhibidor se une a la enzima libre y compite con el sustrato por la ocupación del sitio
activo, y es no competitiva si el inhibidor se une solo al complejo enzima-sustrato. La
inhibición irreversible ocurre cuando la unión al inhibidor altera de manera permanente la
enzima, por lo común, a través de una reacción covalente que la modifica de manera
permanente. La figura 3 muestra un diagrama que compara la reacción enzimática en
presencia de un inhibidor y en ausencia del mismo.G
Figura 4.1 Representación del sistema llave- cerradura en una reacción enzimática.
En cada una de las pruebas realizadas por separado se observaron diferencias que no se
esperaban, o que no estaban previstas. Una diferencia que se observó fue el color al cual se
tornaba la solución (amilasas-almidon; sacarasa-almidon, amilasa-sacarosa, sacarasa-
sacarosa) una vez era agregado el reactivo de Lugol o el reactivo de Fehling. La actividad
enzimática de la amilasa en algunos casos fue diferente. Hay ciertos factores que aún no se
han tratado hasta el momento, y es que la cantidad de amilasa producida en cada ser
humano es diferente. Según estudios realizados en adultos la concentración de amilasa
salival es de 476 ± 120 μg/mL. Por otro lado, se ha demostrado que la concentración de la
amilasa aumenta rápidamente durante el estrés agudo, ya que su liberación, como la de
otros componentes salivales, está regulada por el sistema nervioso autónomo, en particular
por los nervios simpáticos. También se ha demostrado que la concentración de la amilasa
salival se incrementa en respuesta al ejercicio físico, hábitos alimenticios, y el tipo de
actividades que desarrollan las personas [5]. Todos estos factores inciden sobre los
resultados obtenidos en la práctica de laboratorio, factores que se mencionan en las
pruebas donde se observaron discrepancias.
Labilidad Térmica
Observando los datos de la tabla 5, en donde se encuentran los resultados de las pruebas
de la influencia de la temperatura sobre la actividad enzimática, se encuentran
discrepancias en resultados. La amilasa salival de los sujetos 1 y 5 no presentaron actividad
enzimática cuando las condiciones del medio no estaban dentro del rango óptimo de
actividad catalítica, lo cual es congruente con la teoría que se mencionó anteriormente, los
sujetos 2, 3, y 4 presentaron discrepancias solo cuando la amilasa salival fue llevada a una
temperatura de 0 °C, pues a diferencia de los sujetos 1 y 5 cuando se llevaron las muestras
a un temperatura baja siguieron presentando actividad enzimática, por lo que la prueba
para almidon fue negativa. Esto puede deberse a otro tipo de factores se mencionaron en
el inicio de esta sección. Debido a que la concentración de amilasa depende de la persona,
en los casos en los que se observó que la prueba fue negativa para almidon aun cuando las
condiciones no eran favorables, se puede inferir, que en esos casos particulares hay una
concentración de amilasa, y que a pesar de que la energía cinética fuera baja a esa
temperatura (0°C), la alta concentración favoreció su actividad enzimática. Estas diferencias
se pueden observar en la imagen 5, donde se observan las diferencias. En el caso en los que
se presentó una coloración roja, se sabe, que el tipo de coloración implica una alta o baja
concentración de amilasa, en el caso del color rojo, representa una deficiencia enzimática,
es decir, que no cumple con su función catalítica debido a su baja concentración.
Tabla 5. Comparación de los resultados obtenidos de la prueba de labilidad térmica para
muestras salivales de 5 sujetos
Sujeto 4 Sujeto 5
Imagen 5. Labilidad térmica
Influencia de pH.
En esta sección se observaron algunas diferencias, la amilasa salival del sujeto 1 y 2 dieron
resultados que concuerdan teóricamente, pero, el caso del sujeto 3 indica que la actividad
de la amilasa no fue afectada por el pH en el que se encontraba, La enzima del sujeto 4 no
fue afectada por un valor de pH más alto que el óptimo, y el sujeto 5 solo fue afectado a un
pH básico. Una vez más, aquí este hecho puede estar relacionado con la concentración de
amilasa en cada sujeto, en los casos en los que le pH era menor del óptimos, se espera que
la actividad enzimática disminuya, pero no fue así (Tabla 6, sujeto 3). Al haber mayor
concentración enzimática se requiere de pH más bajos para ocasionar variaciones
estructurales de la enzima, es decir que el pH no fue lo suficientemente bajo para afectar
su función catalítica y el caso de pH por encima del optimo (Sujeto 3,4 y 5) también se puede
relacionar de la misma manera, pues los grupos funcionales del centro activo no fueron
alterados. Los colores que presentaron fueron diversos, por factores que se mencionaron
en la sección de labilidad térmica (Ver imagen 6).
Sujeto 4 Sujeto 5
Imagen 7. Especificidad enzimática
Efecto inhibidor:
En esta sección, solo se observaron diferencias en coloración y en el caso del sujeto 4, la
enzima presento no presento actividad enzimática en presencia del Na+. Las variaciones de
color ya se asociaron a las distintas concentraciones. En el caso del sujeto 4, y observando
la tendencia de las muestras salivales de los demás sujetos, se puede inferir que existe algún
tipo de error en la prueba, pues como se mencionó antes, el sodio no interacciona de
ninguna manera con el centro activo de la enzima sino con el medio, por lo tanto, no hay
posibilidad de tal resultado, lo que implica algún error procedimental.
Tabla 8. Efecto de dos sales inorgánicas sobre la actividad enzimática de la amilasa salival
Sujeto 4 Sujeto 5
Imagen 8. Inhibición enzimática
Conclusiones
La actividad enzimática de la amilasa se ve afectada por factores tales como la temperatura,
pH del medio donde se está llevando a cabo la reacción, y el tipo de sustancias que rodeen
la enzima. Si se desea aumentar la velocidad de reacción entre la enzima y el sustrato se
debe hacer en condiciones donde la temperatura se óptima para el desarrollo eficaz de la
reacción, este valor se puede determinar experimentalmente. Los inhibidores o activadores
tienen la función de activar o inhibir los puntos o centros activos de las enzimas
favoreciendo o retardando dicha reacción, en este caso el Cu2+ actuó como inhibidor por el
tipo de interacciones y formaciones de complejos que desactivan a la enzima amilasa para
actuar como catalizador frente al sustrato almidon, el Na+ no influyo en la actividad
enzimática de la amilasa. La especificidad se logró comprobar mediante la reacción de las
enzimas amilasa y sacarasa frente a dos tipos de sustrato, encontrándose que la amilasa es
específica para el almidón y la sacarasa para la sacarosa. La concentración de amilasa salival
puede estar relacionada en la influencia del medio sobre la actividad catalítica de las
enzimas, por lo tanto, para confirmar este razonamiento es necesario realizar más pruebas
con muestras diferentes y analizar cada muestra de forma cualitativa y cuantitativa. El pH
tiene un papel fundamental en la actividad catalítica de las enzimas, pues de él depende la
forma en cómo están los grupos de su centro activo y de esa manera presentar o no
actividad enzimática.
Referencias
[1] A. Peña Diaz, A. Aroyo, R. Tapia, BIOQUIMICA, Mexico D. F, 2004, Pg 256.
[2] H. H. Montoya, MICROBIOLOGIA BASICA PARA EL AREA DE LA SALUD, Bogotá DC, pagina
[3] B. Gal, M. Lopez, A. Martinez,J. Prieto, BASES PARA LA BIOQUIMICA, Universidad
Europea de Mdrid, Madrid, España, 2011, pg 275.
[4] D. Freifelder, TECNICAS DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR, Barcelona, 2003, pg
471.
[5] Lamby CP, Gómez OL, Jaramillo L. LA AMILASA SALIVAL: relación con la caries dental
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. ¿Cuál es el objetivo de usar la tinción de Lugol y en que se fundamenta la reacción
general?
El objetivo por el cual se utilizó la tinción con el reactivo de Lugol, fue determinar la
presencia de almidon en el medio de reacción en el que se estaba efectuando el
análisis de la actividad enzimática de la amilasa salival, por lo tanto, una prueba que
da positiva implica que la enzima no está cumpliendo su función como catalizador.
utilizar para reconocer la presencia de almidón, porque esta sustancia adsorbe el yodo
produciendo una coloración azul intensa, coloración que desaparece al calentar, porque se
rompe la estructura que se ha producido, pero vuelve a aparecer al enfriar.
Nos permite reconocer la presencia de almidón en alimentos como el pan, las papas,
etc.
5. ¿En qué consiste la nomenclatura internacional para las enzimas? De por lo menos
dos ejemplos.
La Unión Internacional de Bioquímica (IUB) adoptó, en 1964, un sistema complejo pero inequívoco
de la nomenclatura enzimática basado en el mecanismo de reacción. El sistema se basa en la
reacción química catalizada que es la propiedad específica que caracteriza a cada enzima las cuales
se agrupan en clases, porque catalizan procesos semejantes, y en subclases que especifican con
mayor exactitud la reacción particular considerada.
En general, las enzimas reciben un nombre de acuerdo con el sustrato o los sustratos que
participan en la reacción seguida por el tipo de reacción catalizada y, por fin, la terminación -asa. A
menudo los nombres así obtenidos resultan largos y complejos, por lo que es muy difícil que en la
práctica se pueda excluir el uso de los nombres triviales, consagrados por la costumbre. Sin
embargo, con fines de sistematización, se reconoce la necesidad de aceptar el nuevo sistema.
1. Las reacciones y las enzimas que las catalizan se dividen en 6 clases principales, cada una con 4
a 13 subclases.
2. El nombre de la enzima tiene 2 partes: la primera es el nombre del o los sustratos; la segunda,
con terminación –asa, indica el tipo de reacción catalizada.
3. Información adicional, si es necesario aclarar la reacción, puede seguir el paréntesis. Por
ejemplo: la enzima que cataliza L-malato + NAD= = piruvato + CO2 NADH + H=, se denomina como
1.1.1.37 L-malato: NAD+ oxidorreductasa (descarboxilante).
4. Cada enzima tiene un numero clave (E.C.) que caracteriza al tipo de reacción según la clase
(primer digito), subclase (segundo digito) y subclase (tercer digito). El cuarto digito es para la
enzima específica. Así, E.C. 2.7.1.1 denota la clase 2 (una transferasa), subclase 7 (transferencia de
fosfato), sub-clase 1 (una función alcohol como aceptor de fosfato). El último digito denota a la
enzima hexocinasa o ATP: D-hexosa-6-fosforotransferasa, enzima que cataliza la transferencia de
fosfato desde el ATP al grupo hidroxilo de carbono 6 de la glucosa.
En resumen, se puede decir que para nombrar a las enzimas se deben tomar en cuenta los
siguientes parámetros
La nomenclatura enzimática está basada en 3 parámetros: Todas las enzimas deben de llevar el
nombre del sustrato Sustrato: parte del sistema enzimático, sustancia o compuesto químico sobre
la cual va actuar la enzima es la sustancia o compuesto químico que sufre la reacción química.